CN101559065B - 南酸枣提取物及其所含酚酸类化合物的制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药用植物南酸枣的植物提取物及其所含酚酸类化合物的制备方法，以及这些提取物和酚酸类化合物用于制备抗缺氧药物、抗缺氧保健品等功能性食品的用途。

Description

南酸枣提取物及其所含酚酸类化合物的制备和用途

技术领域：

本发明涉及药用植物南酸枣的植物提取物及其所含酚酸类化合物的制备方法，以及这些提取物和酚酸类化合物用于制备抗缺氧药物、抗缺氧保健品等功能性食品的用途。

背景技术：

氧在人的生命活动中是不可或缺的，在体内组织和细胞的能量代谢中氧分子发挥着重要作用。多种因素可导致人体组织和细胞的供氧不足，如某些疾病或身处特殊低氧环境(如高原)等，而缺氧又反过来可造成细胞、组织损伤乃至各种严重疾病，如严重的呼吸系统疾病以及并发的心脑血管疾病、免疫机能低下等。严重缺氧往往还成为许多相关危重病人死亡的直接原因。因此，抗缺氧剂的研究与开发受到关注。

南酸枣Choerospondias axillaries(Roxb.)Burtt.et Hill.为漆树科南酸枣属植物，其树皮和果实入药(江苏新医学院编，中药大辞典，上册，上海，上海人民出版社，1977年，第397-398页和第1564页)，干燥果实已作为中药“广枣”收入我国2005年版药典(国家药典委员会，中华人民共和国药典，一部，北京，化学工业出版社，2005年，第29-30页)。南酸枣的化学成分有些已有报道，其粗提物、总黄酮或某些单体化合物的抗菌、抑制血小板聚集等活性也有报道(樊海燕等；蒙药广枣的研究进展：中草药，2004年第35卷第3期，第353-355页)。此外，南酸枣果实总黄酮的缺氧保护作用也曾有文献记载(李增晞等；广枣总黄酮对动物耐缺氧和急性心肌缺血的保护作用：中草药，1984年第15卷第6期，第25-27页)，但其中抗缺氧活性成分尚未阐明。南酸枣提取物以及从中分离制备的酚酸类化合物的抗缺氧活性及其用途至今未见有报道。

发明内容：

本发明旨在提供具有抗缺氧活性的药用植物提取物及其中所含的具有抗缺氧活性的酚酸类化合物的制备方法，以及这些提取物和化合物作为抗缺氧剂的用途。

本发明人首次发现某些药用植物如南酸枣(特别是南酸枣树皮等药用部位)的含水醇浸膏、含水醇浸膏的乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及柱层析组分等具有很好的抗缺氧活性，并从中首次发现并分离得到了具有抗缺氧活性的儿茶素(化合物I)、二氢山奈酚-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(化合物II)、二氢槲皮素-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(化合物III)、没食子酸(化合物IV)、1，6-二-O-没食子酰基葡萄糖(化合物V)、1，4-二-O-没食子酰基葡萄糖(化合物VI)等六个酚酸类化合物。

因此，本发明的第一个方面涉及药用植物如南酸枣的提取物，或上述酚酸类化合物I、II、III、IV、V、VI或其药学上可接受的盐类用于制备抗缺氧药物、抗缺氧保健品等功能性食品的用途。

本发明的第二个方面涉及上述植物提取物的制备方法，所述方法包括用醇或含水醇浸提植物原料获得粗浸膏，再经液-液萃取、柱层析等分离手段，制备得到目标提取物。

本发明的第三个方面涉及上述酚酸类化合物I、II、III、IV、V、VI或其药学上可接受的盐类的制备方法，所述方法包括用醇或含水醇对植物原料如南酸枣进行提取，再经过分离纯化得到目标化合物。

本发明的第四个方面涉及抗缺氧药物组合物，其含有上述植物提取物，或一种或多种酚酸类化合物I、II、III、IV、V、VI或其药学上可接受的盐类，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的第五个方面涉及抗缺氧保健品等功能性食品，其含有上述提取物，或上述一种或多种酚酸类化合物I、II、III、IV、V、VI或其药学上可接受的盐类。

具体来说，本发明的提取物可按照如下方法制备：以某些药用植物为原材料，经用不同浓度的含水醇浸泡提取，获得各种含水醇浸膏，再经对所得浸膏进行液-液萃取、柱层析分离等操作，制取萃取物、层析组分等各种提取物。

上述作为原材料的药用植物可以是一年生或多年生草本植物，也可以是木本植物或藤本植物，例如漆树科南酸枣属的药用木本植物南酸枣等，只要是含有上述提取物和化合物的药用植物均可供作原材料。而可作为原材料使用的部位可以是全植物如全草，也可以是植物的地上或地下部分等局部材料，还可以是植物的根、茎、皮、叶、花、果实等，只要是含有上述提取物和化合物的药用部位均可供用，例如南酸枣的果实或树皮等。

所述醇是甲醇或乙醇，所述含水醇是60％(v/v)～95％(v/v)的含水甲醇或乙醇，优选的是60％(v/v)～95％(v/v)的含水乙醇。

上述酚酸类化合物I、II、III、IV、V、VI的制备方法如下：用含水醇浸泡提取药用植物材料，获得含有上述化合物的粗浸膏，再用常规分离手段纯化得到粗浸膏中的上述化合物。

所述含水醇是的含水乙醇，优选的是60％(v/v)～95％(v/v)的含水乙醇。所述的常规分离手段包括天然产物化学领域的专业人士所熟知的液-液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析及重结晶等。

本发明采用人脐带静脉内皮细胞ECV304，利用MTT比色法测试评价了上述各种提取物和化合物I、II、III、IV、V、VI的抗缺氧活性。经实验证实，上述提取物和化合物对ECV304细胞的缺氧损伤均具有很好保护作用。

因此，本发明的上述各种提取物和化合物I、II、III、IV、V、VI均可作为抗缺氧剂用于防治各种缺氧性疾病或改善和减轻低氧环境下与缺氧相关的各种不适症状。

本发明提取物和化合物可以单独使用或组合使用，也可与药学上可接受的各种载体、赋形剂或辅料配伍，制成抗缺氧药物用于防治缺氧引起的各种病症，或可以制成具有抗缺氧功能的保健品或食品添加剂，用于预防、改善或减轻缺氧条件下的各种症状。

本发明中的术语“药学上可接受的盐”是指药用无机或有机盐。化合物I、II、III、IV、V、VI中所含羧基、酚羟基等酸性基团可以使化合物与碱金属或碱土金属形成药用盐，也可以形成药用铵盐，优选但不限于铵(或胺)盐、钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。

本发明的提取物或化合物可以单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。

本发明提取物和化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服用药时，本发明提取物和化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当皮肤局部施用时，本发明提取物和化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

本发明提取物和化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明提取物和化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、各种提取物或各种化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。

具体实施方式：

下列实施例将进一步说明本发明，但并不对本发明构成任何限制。

在以下实施例中，称为化合物I的是黄烷类化合物“儿茶素”；称为化合物II的是二氢黄酮苷类化合物“二氢山奈酚-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷”；称为化合物III的是另一个二氢黄酮苷类化合物“二氢槲皮素-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷”；称为化合物IV的是多酚羟基有机酸类化合物“没食子酸”；称为化合物V的是多酚羟基有机酸酯苷类化合物“1，6-二-O-没食子酰基葡萄糖”；称为化合物VI的是另一个多酚羟基有机酸酯苷类化合物“1，4-二-O-没食子酰基葡萄糖”。

实施例1.南酸枣提取物的制备

南酸枣Choerospondias axillaries(Roxb.)Burtt.et Hill.的干燥树皮3.2kg(1999年8月采自云南勐腊地区)粉碎后用市售医用乙醇室温浸提，每次用60％(v/v)的含水乙醇25升浸泡7天，共提4次，合并提取液，减压浓缩干燥，得乙醇提取物750g。该乙醇提取物750g悬浮于3升水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各种溶剂每次用3升，分别各萃取4次，合并相同萃取液，减压浓缩干燥，得到氯仿萃取物60g、乙酸乙酯萃取物310g、正丁醇萃取物300g和水层残留物80g。

上述乙醇提取后的药渣进一步用60％(v/v)的含水乙醇室温浸提，每次用含水乙醇25升浸泡7天，共提3次，合并提取液，减压浓缩干燥，得60％(v/v)乙醇浸膏90g。

实施例2.南酸枣乙酸乙酯萃取物中化合物I和IV的制备

乙酸乙酯萃取物的柱层析分离

将在实施例1中得到的南酸枣乙酸乙酯萃取物100g用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床7.0cm×50cm)，用如下所述不同体积比的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到四个层析粗组分：E-1(4g，乙酸乙酯洗脱部分)、E-2(35g，乙酸乙酯-甲醇9∶1洗脱部分)、E-3(25g，乙酸乙酯-甲醇1∶1洗脱部分)和E-4(15g，甲醇洗脱部分)。

将组分E-2(35g)溶于适量甲醇中，在室温放置过程中析出大量白色结晶型沉淀，将沉淀过滤并用适量甲醇洗净、干燥，得柚皮素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷18g(白色结晶状粉末)。另将滤液和洗涤液合并，减压浓缩干燥，得残留物17克。将该残留物(17g)用适量甲醇溶解，再加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床3.8cm×50cm)并用如下所述不同体积比的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得到五个组分：E-2-1(2.3g，乙酸乙酯洗脱部分)、E-2-2(3.2，乙酸乙酯洗脱部分)、E-2-3(2.7g，乙酸乙酯-甲醇9∶1洗脱部分)、E-2-4(3.4g，乙酸乙酯-甲醇7∶3洗脱部分)和E-2-5(6.4g，甲醇洗脱部分)。

化合物I的制备

E-2-4(3.4g)用适量甲醇溶解，上Sephadex LH-20柱(水中柱床2.8cm×50cm)，用不同体积比的水-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并含化合物I的水-甲醇30∶70洗脱组分，减压浓缩干燥，并经甲醇中重结晶精制，得化合物I(白色针晶，754mg)。

化合物I的正离子ESI-MS m/z：291[M+H]⁺，313[M+Na]⁺；负离子ESI-MS m/z：289[M-H]^-，与其分子组成C₁₅H₁₄O₆相应分子量290一致。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ：6.82(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.75(1H，d，J＝8.0Hz，5′-H)，6.70(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz，6′-H)，5.91(1H，d，J＝2.4Hz，8-H)，5.84(1H，d，J＝2.4Hz，6-H)，4.56(1H，d，J＝7.6Hz，2-H)，3.97(1H，m，3-H)，2.83(1H，dd，J＝16.0，5.2Hz，4-He)，2.49(1H，dd，J＝16.0，8.0Hz，4-Ha).¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ：157.5(C-7)，157.2(C-5)，156.6(C-8a)，145.9(2C，C-3′and C-4′)，131.8(C-1′)，119.7(C-6′)，115.7(C-5′)，114.9(C-2′)，100.4(C-4a)，95.9(C-8)，95.1(C-6)，82.5(C-2)，68.4(C-3)，28.2(C-4)。

化合物IV的制备

E-2-3(2.7g)用适量甲醇溶解，上Sephadex LH-20柱(水中柱床1.8cm×50cm)，用不同体积比的水-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，根据薄层检测结果合并含化合物IV的水-甲醇10∶90洗脱组分，减压浓缩干燥，并经甲醇中重结晶精制，得化合物IV(白色棱状结晶，86mg)。

化合物IV的正离子TOF-MS m/z：171[M+H]⁺，193[M+Na]⁺，209[M+K]⁺；负离子TOF-MS m/z：169[M-H]^-，与其分子组成C₇H₆O₅相应分子量170相符。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ：7.03(2H，s，2，6-H)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ：170.4(C＝O)，146.4(2C，C-3，5)，139.6(C-4)，121.9(C-1)，110.3(2C，C-2，6)。

实施例3.南酸枣正丁醇萃取物中化合物I至化合物VI的制备

正丁醇萃取物的柱层析分离

将在上述实施例1中得到的南酸枣正丁醇萃取物300g用适量甲醇溶解，加适量大孔树脂AB-8吸附、干燥，上大孔树脂AB-8柱(水中柱床8.5cm×48cm)，用不同体积比的水-乙醇(100∶0→0∶100)梯度洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，依洗脱流出顺序得两个水洗组分B-1(20g)、B-2(38g)和若干后续流出含水乙醇洗脱组分(共计230g，水-乙醇90∶10→0∶100洗脱部分)。

组分B-1(20g)用适量水溶解，直接上Sephadex LH-20凝胶柱(水中柱床3.6cm×50cm)，用不同体积比的水-乙醇梯度洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，得五个组分：B-1-1(13g，水洗脱部分)、B-1-2(1.1g，水洗脱部分)、B-1-3(1.4g，水-乙醇80∶20洗脱部分)、B-1-4(0.25g，水-乙醇60∶40洗脱部分)、B-1-5(4g，乙醇洗脱部分)。

组分B-2(38g)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(水中柱床7.5cm×18.5cm)，用不同体积比的水-丙酮梯度洗脱，根据薄层检测结果合并所收集的洗脱液，减压浓缩，得八个组分：B-2-1(10g，水洗脱部分)、B-2-2(2g，水洗脱部分)、B-2-3(1.5g，水-丙酮9∶1洗脱部分)、B-2-4(1.7g，水-丙酮9∶1洗脱部分)、B-2-5(2g，水-丙酮9∶1洗脱部分)、B-2-6(5g，水-丙酮7∶3洗脱部分)、B-2-7(5g，水-丙酮5∶5洗脱部分)和B-2-8(5g，丙酮洗脱部分)。

化合物I的制备

组分B-2-6(5g)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床2.8cm×30cm)，用乙酸乙酯-甲醇(体积比4∶1)洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，按洗脱流出先后顺序得到两个组分B-2-6-1(1.2g)和B-2-6-2(3.1g)。B-2-6-1(1.2g)用适量甲醇溶解，上Sephadex LH-20柱(体积比70∶30的甲醇-水溶液中柱床2.8cm×45cm)，用相同体积比70∶30的甲醇-水洗脱，根据薄层检测结果，收集含化合物I的洗脱液，减压浓缩干燥，并经甲醇中重结晶精制，得化合物I(白色针晶，330mg)。所得化合物I的正负离子ESI-MS、¹H-NMR以及¹³C-NMR数据与实施例2中所述化合物I的相关数据一致。

化合物II和化合物III的制备

组分B-2-2(2g)用适量水溶解，直接上Sephadex LH-20柱(水中柱床2.8cm×47cm)，用不同体积比的水-甲醇洗脱，分为3个组分B-2-2-1(350mg，水-甲醇7∶3洗脱部分)、B-2-2-2(1.4g，水-甲醇4∶6洗脱部分)和B-2-2-3(200mg，甲醇洗脱部分)。B-2-2-2(1.4g)用适量水-甲醇(90∶10)溶解，再上Sephadex LH-20柱(水-甲醇90∶10溶液中柱床2.8cm×50cm)，用相同水-甲醇(90∶10)溶剂洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，按洗脱流出先后顺序分为B-2-2-2-1(850mg)、B-2-2-2-2(120mg)和B-2-2-2-3(400mg)。

B-2-2-2-1(850mg)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(柱床3.2×27cm)，用甲醇-乙酸乙酯(体积比1∶6)洗脱，根据薄层检测结果，收集含化合物II的洗脱组分，减压浓缩干燥并经甲醇中重结晶，得化合物II(白色结晶状粉末，35mg)，另收集含化合物III的洗脱组分，减压浓缩干燥并经甲醇中重结晶，得到化合物III(白色结晶状粉末，520mg)。

化合物II的正离子TOF-MS m/z：451[M+H]⁺，473[M+Na]⁺，489[M+K]⁺；负离子TOF-MS m/z：449[M-H]^-，与其分子组成C₂₁H₂₂O₁₁相应分子量450吻合。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ：7.26(2H，d，J＝8.2Hz，2′，6′-H)，6.73(2H，d，J＝8.2Hz，3′，5′-H)，6.12(1H，d，J＝2.0Hz，8-H)，6.10(1H，d，J＝2.0Hz，6-H)，4.92(1H，d，J＝11.6Hz，2-H)，4.86(1H，d，J＝7.2Hz，1″-H)，4.50(1H，d，J＝11.6Hz，3-H)，3.76(1H，dd，J＝12.0，1.6Hz，6″-Ha)，3.57(1H，dd，J＝12.0，5.2Hz，6″-Hb)，3.38-3.24(4H，m，2″-H～5″-H).¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ：199.3(C-4)，167.2(C-7)，164.7(C-8a)，164.2(C-5)，159.2(C-4′)，130.3(2C，C-2′，6′)，128.9(C-1′)，116.0(2C，C-3′，5′)，103.4(C-4a)，101.1(C-1″)，98.2(C-6)，96.9(C-8)，85.0(C-2)，78.1(C-3″)，77.6(C-5″)，74.5(C-2″)，73.7(C-3)，71.0(C-4″)，62.1(C-6″)。

化合物III的正离子TOF-MS m/z：467[M+H]⁺，489[M+Na]⁺，505[M+K]⁺；负阴离子TOF-MS m/z：465[M-H]^-，与其分子组成C₂₁H₂₂O₁₂相应分子量466相符。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ：6.96(1H，d，J＝2.0Hz，2′-H)，6.84(1H，dd，J＝8.2，2.0Hz，6′-H)，6.79(1H，d，J＝8.2Hz，5′-H)，6.21(1H，d，J＝2.2Hz，8-H)，6.19(1H，d，J＝2.2Hz，6-H)，4.55(1H，d，J＝12.0Hz，3-H)，3.86(1H，dd，J＝12.4，2.0Hz，6″-Ha)，3.66(1H，dd，J＝12.4，5.6Hz，6″-Hb)，3.32-3.48(4H，m，2″-H～5″-H)，2-H和1″-H信号包埋在宽大的水峰中(水峰以δ4.94为中心覆盖δ4.85-5.05信号区域)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ：199.4(C-4)，167.4(C-7)，164.8(C-5)，164.3(C-8a)，147.3(C-4′)，146.4(C-3′)，129.7(C-1′)，121.1(C-6′)，116.1(C-5′)，116.0(C-2′)，103.5(C-4a)，101.3(C-1″)，98.3(C-6)，97.1(C-8)，85.4(C-2)，78.3(C-3″)，77.8(C-5″)，74.7(C-2″)，73.9(C-3)，71.2(C-4″)，62.3(C-6″)。

化合物IV的制备

组分B-1-4(0.25g)用适量甲醇-水(体积比80∶20)溶解，直接上Sephadex LH-20柱(体积比80∶20的甲醇-水中柱床1.8×50cm)，用相同体积比80∶20的甲醇-水洗脱，根据薄层检测结果收集合并含化合物IV的洗脱液，减压浓缩干燥，并经甲醇中重结晶精制，得化合物IV(白色棱状结晶，19mg)。所得化合物IV的正负离子ESI-MS、¹H-NMR以及¹³C-NMR数据与实施例2中所述化合物IV的相关数据一致。

化合物V和化合物VI的制备

组分B-2-5(2g)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床2.8cm×30cm)，用如下所述不同体积比的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩干燥，得B-2-5-1(1g，乙酸乙酯-甲醇6∶1洗脱部分)、B-2-5-2(0.6g，乙酸乙酯-甲醇4∶1洗脱部分)和B-2-5-3(0.4g，乙酸乙酯-甲醇2∶1洗脱部分)。

B-2-5-1(1g)用适量体积比70∶30的甲醇-水溶解，直接上SephadexLH-20柱(甲醇-水70∶30中柱床2.8cm×45cm)，用相同体积比70∶30的甲醇-水溶剂洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并含化合物V的洗脱组分，减压浓缩并经甲醇中重结晶精制，得化合物V(白色针晶，270mg)。

B-2-5-2(0.6g)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床1.8cm×33cm)，用体积比20∶10的乙酸乙酯-甲醇洗脱，根据薄层检测结果收集洗脱液，减压浓缩干燥，依洗脱流出先后顺序分为B-2-5-2-1(350mg)和B-2-5-2-2(200mg)两个组分。B-2-5-2-2(200mg)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(乙酸乙酯中柱床1.8cm×33cm)，用乙酸乙酯-甲醇(体积比4∶1)洗脱，根据薄层检测结果收集含化合物VI的洗脱液，减压浓缩干燥，再次同法用相同聚酰胺柱层析分离，收集含化合物VI的洗脱组分，减压浓缩干燥，并经甲醇中重结晶精制，得化合物VI(结晶型粉末，27mg)。

化合物V的正离子TOF-MS m/z：507[M+H]⁺，523[M+K]⁺；负离子TOF-MS m/z：483[M-H]^-，与其分子组成C₂₀H₂₀O₁₄相应分子量484吻合。¹H-NMR(400 MHz，CD₃OD)δ：7.12和7.06(各2H，s，两个没食子酰基上的芳香氢2′，6′-H和2″，6″-H)，5.68(1H，d，J＝7.6Hz，葡萄糖1-H)，4.54(1H，dd，J＝12.2，2.0Hz，葡萄糖6a-H)，4.39(1H，dd，J＝12.2，4.8Hz，葡萄糖6b-H)，3.70(1H，m，葡萄糖5-H)，3.48～3.54(3H，m，葡萄糖2，3，4-H)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ：168.0和166.6(两个没食子酰基上的C＝O)，120.9和120.2(两个没食子酰基上的C-1′和C-1″)，146.1(4C，两个没食子酰基上的C-3′，5′和C-3″，5″)，140.1和139.5(两个没食子酰基上的C-4′和C-4″)，110.2和109.8(各2C，两个没食子酰基上的C-2′，6′和C-2″，6″)，95.5(葡萄糖C-1)，77.6(葡萄糖C-3)，76.1(葡萄糖C-5)，73.7(葡萄糖C-2)，70.8(葡萄糖C-4)，64.1(葡萄糖C-6)。

化合物VI的正离子TOF-MS m/z：507 [M+Na]⁺；负离子TOF-MSm/z：483[M-H]^-，与其分子组成C₂₀H₂₀O₁₄相应分子量484一致。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ：7.14和7.10(各2H，s，两个没食子酰基上的芳香氢2′，6′-H和2″，6″-H)，5.75(1H，d，J＝9.0Hz，葡萄糖1-H)，5.04(1H，t，J＝9.0Hz，葡萄糖4-H)，3.79(1H，t，J＝9.0Hz，葡萄糖3-H)，3.73(1H，m，葡萄糖5-H)，3.52～3.66(2H，m，葡萄糖2，6-H)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ：167.6和166.9(两个没食子酰基上的C＝O)，146.5(4C，两个没食子酰基上的C-3′，5′和C-3″，5″)，140.4和140.1(两个没食子酰基上的C-4′和C-4″)，121.0和120.5(两个没食子酰基上的C-1′和C-1″)，110.5和109.3(各2C，两个没食子酰基上的C-2′，6′和C-2″，6″)，95.8(葡萄糖C-1)，77.0(葡萄糖C-3)，76.0(葡萄糖C-5)，74.3(葡萄糖C-2)，72.0(葡萄糖C-4)，62.0(葡萄糖C-6)。

实施例4.南酸枣60％(v/v)含水乙醇浸膏中化合物I的制备

南酸枣60v/v％含水乙醇浸膏的柱层析分离

上述实施例1中得到的南酸枣60v/v％乙醇提取浸膏80g用适量甲醇溶解，加聚酰胺150g吸附、干燥，上聚酰胺柱(水中装填250克聚酰胺，柱床8.5cm×22cm)，用水-乙醇-丙酮系统洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，得到五个组分：WE-1(10g，水洗脱部分)、WE-2(17g，水洗脱部分)、WE-3(2g，水-乙醇体积比75∶25溶剂洗脱部分)、WE-4(15g，乙醇洗脱部分)和WE-5(20g，丙酮洗脱部分)。

WE-4(15g)用适量甲醇溶解，加适量聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(柱床4.5cm×50cm)，用不同体积比的乙酸乙酯-甲醇溶剂梯度洗脱，根据薄层检测结果收集合并洗脱液，减压浓缩干燥，得到七个组分：WE-4-1(2.2g，乙酸乙酯洗脱部分)、WE-4-2(300mg，乙酸乙酯-甲醇20∶1洗脱部分)、WE-4-3(520mg，乙酸乙酯-甲醇20∶1洗脱部分)、WE-4-4(1.5g，乙酸乙酯-甲醇20∶1洗脱部分)、WE-4-5(2.8g，乙酸乙酯-甲醇15∶1洗脱部分)、WE-4-6(0.7g，乙酸乙酯-甲醇15∶1洗脱部分)、WE-4-7(4.5g，甲醇洗脱部分)。

化合物I的制备

组分WE-4-4(1.5g)用适量甲醇溶解，加约3g聚酰胺吸附、干燥，上聚酰胺柱(体积比10∶1的乙酸乙酯-甲醇中柱床2.8cm×30cm)，用相同体积比10∶1的乙酸乙酯-甲醇溶液洗脱，根据薄层检测结果收集洗脱液，减压浓缩干燥，得到含化合物I的层析组分。将该层析组分用适量体积比70∶30的甲醇-水溶解，直接上Sephadex LH-20柱(体积比70∶30的甲醇-水中柱床2.8cm×45cm)，用相同体积比70∶30的甲醇-水洗脱，根据薄层检测结果收集合并含化合物I的洗脱液，减压浓缩干燥，并从甲醇中重结晶精制，得到化合物I(白色针晶，612mg)。所得化合物I的正负离子ESI-MS、¹H-NMR以及¹³C-NMR数据与实施例2中所述化合物I的相关数据一致。

实施例5.化合物IV的钠盐和铵盐的制备

将上述实施例2得到的化合物IV(2.1mg)用约0.2mL饱和碳酸氢钠水溶解，直接上Sephadex LH-20柱(水中柱床7mm×70mm)，用水加压洗脱，收集洗脱液并根据薄层检测结果合并，减压浓缩并氮气吹干，得化合物IV的钠盐2mg。聚酰胺薄层用乙醇-水体积比80∶20溶剂展开，层析斑点用三氯化铁试剂喷洒检测，在此条件下化合物IV呈深蓝色、其钠盐呈淡蓝色，游离化合物IV的R_f值为0.51，其钠盐的R_f值为0.22。硅胶薄层层析用体积比2∶1的氯仿-甲醇展开，层析斑点用钼酸铵硫酸铈试剂喷洒加热检测，结果游离化合物IV呈R_f值0.54的条状拖尾斑点，而其钠盐则未被展开(R_f值为0)。

化合物IV(2mg)用约0.2mL氨水溶解，直接上Sephadex LH-20柱(水中柱床7mm×70mm)，用水加压洗脱，收集洗脱液并根据聚酰胺薄层检测结果合并，减压浓缩并氮气吹干，得化合物IV的铵盐2mg。聚酰胺薄层用乙醇-水体积比80∶20溶剂展开，层析斑点用三氯化铁试剂喷洒检测，在此条件下化合物IV及其铵盐均呈蓝色，游离化合物IV的R_f值为0.51，其铵盐的R_f值为0.22。采用上述相同硅胶薄层层析检测，游离化合物IV的R_f值为0.54，而其铵盐则未被展开(R_f值为0)。

实施例6.抗缺氧活性测试

细胞系与细胞培养：活性测试采用人脐带静脉内皮ECV304细胞系，细胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃通入5％CO₂和95％空气的培养箱中常规培养和维护。

被测样品与样品溶液配制：实施例1中南酸枣的乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、60％(v/v)乙醇浸膏，实施例1～实施例4中化合物I、II、III、IV、V和VI。以黄芩苷作阳性对照。精密称量被测样品适量，用含10％胎牛血清的新鲜RPMI-1640培养基溶解，配制成50μg/mL的样品溶液，供活性测试用。

活性测试方法：取对数生长期的ECV304细胞，用新鲜RPMI-1640培养基配成细胞密度为每毫升1×10⁵个的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔150μL，于37℃通入5％CO₂和95％空气的培养箱中培养48h，吸引弃去培养液，分成正常对照组、缺氧对照组和缺氧给药组。正常对照组和缺氧对照组每孔加含10％胎牛血清的新鲜RPMI-1640培养基各150μL，缺氧给药组每孔加样品溶液各150μL。缺氧对照组和缺氧给药组于自制缺氧培养箱中在37℃通入5％CO₂和95％N₂的条件下培养24h，造成对细胞的缺氧损伤，而正常对照组则于37℃通入5％CO₂和95％空气的培养箱中正常培养24h。培养结束后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液(用0.01M的PBS液配制)各15μL，混匀，37℃孵育4h，翻板法弃去孔内培养液，每孔加DMSO各150μL，振荡10min使MTT紫色产物充分溶解，用酶标仪测量每孔于490nm处的OD值。数据以正常对照组为100％，取各组OD平均值按下式计算缺氧对照组和缺氧给药组的细胞存活率：细胞存活率(％)＝缺氧对照组或缺氧给药组OD平均值/正常对照组OD平均值×100％。取10次实验数据，计算相应细胞存活率(％)，并用Student-t检验法，统计检验缺氧对照组和缺氧给药组两组间细胞存活率的显著性差异。

实验结果

南酸枣提取物的抗缺氧活性

以黄芩苷作为阳性对照，在所测试的南酸枣提取物样品中，本发明的乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和60％(v/v)乙醇浸膏对ECV304细胞的缺氧损伤均具有显著保护作用，结果见表1。

表1.南酸枣提取物和化合物I对ECV304细胞缺氧损伤的保护作用

本发明化合物I、II、III、IV、V、VI的抗缺氧活性

仍以黄芩苷(5μg/mL)作为阳性对照，本发明化合物I、II、III、IV、V和VI在所测试浓度下对ECV304细胞的缺氧损伤亦均具有显著保护作用，结果分别见表1(化合物I)和表2(化合物II、III、IV、V和VI)。

表2.化合物II、III、IV、V、VI对ECV304细胞缺氧损伤的保护作用

结论：

本发明的南酸枣60％(v/v)乙醇浸膏、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物等植物提取物和本发明化合物I、II、III、IV、V、VI对ECV304细胞的缺氧损伤具有显著的保护作用。因此，本发明的上述提取物和化合物可作为抗缺氧活性成分用于制备抗缺氧药物以及抗缺氧保健品等功能性食品。

Claims (8)

1.酚酸类化合物儿茶素，即化合物I、二氢山奈酚-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷，即化合物II、二氢槲皮素-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷，即化合物III、没食子酸，即化合物IV、1，6-二-O-没食子酰基葡萄糖，即化合物V、1，4-二-O-没食子酰基葡萄糖，即化合物VI用于制备抗缺氧药物以及抗缺氧保健品等功能性食品的用途。

2.权利要求1所述化合物I、II、III、IV、V、VI的制备方法，该方法包括以南酸枣为原料，经含水醇浸泡提取，获得含有上述化合物的粗浸膏，然后用乙酸乙酯或正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，再用常规分离手段，分离纯化得到上述化合物。

3.权利要求2所述的制备方法，其中所述含水醇是60％(v/v)～95％(v/v)的含水乙醇。

4.权利要求2所述的制备方法，所述常规分离手段包括液-液萃取、柱层析、薄层层析、高效液相层析及重结晶。

5.南酸枣的含水醇浸膏，该含水醇浸膏的乙酸乙酯萃取物、或正丁醇萃取物，其特征在于，其中含有至少一种或一种以上权利要求1所述化合物I、II、III、IV、V或VI。

6.权利要求5所述的南酸枣的含水醇浸膏，该含水醇浸膏的乙酸乙酯萃取物、或正丁醇萃取物的制备方法，其特征是：用含水醇浸提原料获得提取浸膏，再经液-液萃取分离，制得萃取物。

7.权利要求6所述的制备方法，其中所述含水醇是60％(v/v)～95％(v/v)的含水乙醇。

8.权利要求5所述的南酸枣含水醇浸膏，该含水醇浸膏的乙酸乙酯萃取物、或正丁醇萃取物用于制备抗缺氧药物以及抗缺氧保健品等功能性食品的用途。