CN101279965B - 从红花中分离出的化合物、其制法和药物组合物与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从红花中分离出的新化合物如式I、II、III和IV所示，这类化合物的制备方法，含有这类化合物的药物组合物，还涉及其在预防和治疗脑血管疾病中的医药用途。
Description
技术领域
本发明涉及从红花中分离出的新化合物，及其制备方法，含有这类化合物的药物组合物，还涉及其在预防和治疗脑血管疾病中的医药用途，。
背景技术
红花系菊科植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥管状花，始载于《开宝本草》。其栽培与药用的历史已长达2100多年，具有活血祛瘀，通经止痛之功效。在现代临床中成为预防和治疗冠心病、心肌梗死和脑血栓等中老年疾病的重要中药。近年来对红花的化学成分及药理作用的研究十分活跃，已有报道的红花化学成分主要包括黄酮类、多糖及挥发油等，特别是黄酮类成分具有显著的心血管系统活性，目前从红花中分离得到的黄酮类成分有山柰酚、槲皮素、6-羟基山柰酚、6-羟基山柰酚-3-O-葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-7-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-葡萄糖苷、槲皮素-7-葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、山柰酚-3-芸香糖苷、芦丁；红花中还含有红花苷，新红花苷和红花醌苷及重要的活性成分红花黄色素中的红花黄色素A(SY-A)、羟基红花黄色素A(HSYA)等。红花中水溶性成份红花黄色素是近年来药效学研究的热点，表现出广泛的药理活性：(1)心肌保护作用，(2)降血压作用，(3)抗凝血、抑制血栓形成的作用，(4)抗氧化的作用。
本发明所涉及的一种新化合物的的制备方法及其医药用途未见文献报道。
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发明内容
本发明提供了从红花中分离出的一种新化合物，如式(I、II、III、IV)所示，及其衍生物。
本发明的新化合物是可以通过下列方法得到的：
步骤1制备红花提取液
红花药材，加水热回流提取或冷浸提取，提取液减压浓缩至适当体积，加入乙醇沉淀，静置，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，水沉，静置，滤液减压浓缩至适当体积，加入碱液调pH8-12，热回流，放冷 后以盐酸调pH至中性，即得红花提取液。
具体而言，
红花药材，加4-10倍量水，优选是6-8倍，更优选是7倍；
提取温度是从室温到溶剂回流的温度，优选是溶剂回流的温度；
提取时间是1-24小时，
提取液过滤，滤液减压浓缩至适当体积，加入乙醇沉淀，醇浓度为75％-95％，优选的的醇浓度是80％-90％，更优选的醇沉浓度为85％，静置12-48h，优选18-36h，更优选是24h，
过滤，滤液减压浓缩至无醇味，加入水沉淀，
水的加入量为6-10倍量，优选为7-9倍量，最优选的水量为8倍量，在静置12-48h，优选18-36h，更优选是24h，
滤液减压浓缩至适当体积，加入氢氧化钠调pH7-12，优选的pH9-11，更优选的pH10，
热回流0.5-2h，优选是1h，
放冷后以盐酸调pH7，即得红花提取液。
步骤2制备红花提取物粗粉
步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，进行柱分离，优选的分离柱选自大孔树脂柱、反相C18及C8柱、葡聚糖凝胶柱、聚酰胺柱，以水洗脱，收集相应的流份，冻干，即得提取物粗粉。
具体而言，
1，当使用大孔吸附树脂柱分离时，优选的大孔吸附树脂选自D101，D201、D301、XAD16、XAD1600、XAD7HP、XAD761、HP、SP、HP2MG系列，以水作为洗脱液，提取液与填料的重量比为1：20-50，优选为1：25—40；洗脱3-5个柱体积后，开始收集流份6-11个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
2、当使用反相C18柱分离时，以水洗脱，提取液与填料的重量比为1：10-20，洗脱2-4个柱体积后，开始收集流份收集相应的流份5-11个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
3、当使用反相C8柱分离时，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：20-50，洗脱1-3个柱体积后，优选的洗脱体积为2个柱体积，开始 收集流份2-6个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
4、当使用葡聚糖凝胶柱分离时，优选的葡聚糖凝胶选自G-10、G-25、G-50、LH-20，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：20-50，优选为1：25-40，更优选的比例为1：30，洗脱1-3个柱体积后，优选的洗脱体积为2个柱体积，开始收集流份2-6个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
5、当使用聚酰胺柱分离时，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：20-50，优选为1：25-40，更优选的比例为1：30，洗脱1-3个柱体积后，优选的洗脱体积为2个柱体积，开始收集流份2-6个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
步骤3分离纯化
将步骤2所得的提取物粗粉用水溶解，上分离柱进行化合物的分离纯化，优选的分离柱选自葡聚糖凝胶、TSKgel Toyopearl HW-40柱、上反相硅胶ODS柱、上聚酰胺柱、硅胶柱。优选的葡聚糖凝胶选自G-10、G-25、G-50、LH-20。
具体而言，将步骤2所得的提取物粗粉用水溶解，
1、当使用葡聚糖凝胶LH-20柱分离时，样品与葡聚糖凝胶LH-20重量比(1：50-200)，用水洗脱，洗脱2-4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
2、当使用葡聚糖凝胶G-25柱分离时，样品与葡聚糖凝胶重量比(1：50-200)，用水洗脱，洗脱2-4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
3、当使用葡聚糖凝胶G-10柱分离时，样品与葡聚糖凝胶重量比(1：50-200)，用水洗脱，洗脱2-4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
4、当使用TSKgel Toyopearl HW-40柱分离时，样品与树脂重量比(1：50-200)，用水洗脱，洗脱1-3个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
5、当使用反相硅胶ODS-18柱分离时，样品与反相硅胶ODS-18重量比(1：50-200)，用水洗脱，洗脱3-5个柱体积后，开始收集相应的色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
6、当使用反相硅胶ODS-8柱分离时，样品与反相硅胶ODS-18重量比(1：50-200)，用洗脱，洗脱3-5个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
7、当使用上硅胶柱(200-300目)分离时，样品与硅胶重量比(1：30-100)，用乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:0.1-0.5)洗脱，洗脱4-6个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
本发明还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、 软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。
为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有 大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
与给予生理盐水的模型组大鼠相比，受试品红花新苷在6mg/kg的剂量下静脉注射给药可明显改善脑缺血大鼠的神经行为症状，缩小缺血区范围，证明红花新苷对实验性脑缺血有保护作用。说明本发明的化合物红花新苷具有预防和/或治疗脑血管缺血疾病的作用。
具体实施方式
以下通过实施例及试验例对本发明作进一步说明，但本发明并不受限于这些实施例。
步骤1、红花提取液的制备
实施例1、红花药材，加10倍量水，室温提取12h，提取液过滤，滤液减压浓缩至适当体积，加入乙醇沉淀，醇浓度为75％，静置48h，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，10倍量水沉淀，静置48h，滤液减压浓缩至适当体积，加入氢氧化钠调pH7，热回流2h，放冷后以盐酸调pH7，即得红花提取液。
实施例2、红花药材，加4倍量水，室温提取24h，提取液过滤，滤液减压浓缩至适当体积，加入乙醇沉淀，醇浓度为95％，静置12h，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，6量水沉淀，静置12h，滤液减压浓缩至适当体积，加入氢氧化钠调pH11，热回流0.5h，放冷后以盐酸调pH7，即得红花提取液。
实施例3、红花药材，加6倍量水，回流提取2h，提取液过滤，滤液减压浓缩至适当体积，加入乙醇沉淀，醇浓度为80％，静置36h，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，7量水沉淀，静置36h，滤液减压浓缩至适当体积，加入氢氧化钠调pH9，热回流1h，放冷后以盐酸调pH7，即得红花提取液。
实施例4、红花药材，加7倍量水，热回流1h，提取液过滤，滤液减压浓缩至适当体积，加入乙醇沉淀，醇浓度为85％，静置24h，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，8倍量水沉淀，静置24h，滤液减压浓缩至适当体积，加入氢氧化钠调pH10，热回流1h，放冷后以盐酸调pH7，即得红花提取液。
实施例5、红花药材，加9倍量水，热回流3h，提取液过滤，滤液减压浓缩至适 当体积，加入乙醇沉淀，醇浓度为90％，静置18h，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，9倍量水沉淀，静置18h，滤液减压浓缩至适当体积，加入氢氧化钠调pH12，热回流1.5h，放冷后以盐酸调pH7，即得红花提取液。
步骤2、制备红花提取物粗粉
实施例6、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上大孔吸附树脂柱，可选择的大孔吸附树脂为D101，，以水作为洗脱液，提取液与填料的重量比为1：50，用水洗脱，洗脱3个柱体积后，开始收集流份6个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例7、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上大孔吸附树脂柱，可选择的大孔吸附树脂为D301，以水作为洗脱液，提取液与填料的重量比为1：20，用水洗脱，洗脱5个柱体积后，开始收集流份11个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例8、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上大孔吸附树脂柱，可选择的大孔吸附树脂为XAD1600，以水作为洗脱液，提取液与填料的重量比为1：40，用水洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集流份9个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例9、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上大孔吸附树脂柱，可选择的大孔吸附树脂为HP2MG，以水作为洗脱液，提取液与填料的重量比为1：30，用水洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集流份8个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例10、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上反相C18柱，以水洗脱，提取液与填料的重量比1：20，洗脱2个柱体积后，开始收集流份收集相应的流份5个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例11、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上反相C18柱，以水洗脱，提取液与填料的重量比1：10，洗脱4个柱体积后，开始收集流份收集相应的流份11个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例12、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上反相C18柱，以水洗脱，提取液与填料的重量比1：15，洗脱3个柱体积后，开始收集流份收集相应的流份8个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例13、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上反相C8柱，以水洗脱，提取液减与填料的重量比1：50，洗脱1个柱体积后，开始收集流份2个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例14、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上反相C8柱，以水洗脱，提取液减与填料的重量比1：20，洗脱3个柱体积后，开始收集流份6个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例15、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上反相C8柱，以水洗脱，提取液减与填料的重量比1：40，洗脱2个柱体积后，开始收集流份4个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例16、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上葡聚糖凝胶柱(G-10)，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：50，洗脱1个柱体积后开始收集流份2个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例17、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上葡聚糖凝胶柱(G-25)，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：20，洗脱2个柱体积后开始收集流份6个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例18、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上葡聚糖凝胶柱(G-50)，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：30，洗脱3个柱体积后开始收集流份5个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例19、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上葡聚糖凝胶柱(LH-20)，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：40，洗脱2.5个柱体积后开始收集流份4个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例20、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上聚酰胺柱，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：20，洗脱3个柱体积后，开始收集流份6个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例21、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上聚酰胺柱，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：30，洗脱2个柱体积后，开始收集流份4个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例22、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上聚酰胺柱，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：40，洗脱2个柱体积后，开始收集流份3个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
实施例23、步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，上聚酰胺柱，以水洗脱，提取液减与填料的重量比为1：50，洗脱1个柱体积后，开始收集流份2个柱体积，冻干，即得提取物粗粉。
步骤3、分离纯化
实施例24、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上葡聚糖凝胶LH-20柱，样品与葡聚糖凝胶LH-20重量比1：50，用水洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例25、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上葡聚糖凝胶LH-20柱，样品与葡聚糖凝胶LH-20重量比1：200，用水洗脱，洗脱2个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例26、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上葡聚糖凝胶LH-20柱，样品与葡聚糖凝胶LH-20重量比1：150，用水洗脱，洗脱3个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例27、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上葡聚糖凝胶G-25柱，样品与葡聚糖凝胶重量比1：50，用水洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例28、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上葡聚糖凝胶G-25柱，样品与葡聚糖凝胶重量比1：200，用水洗脱，洗脱2个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例29、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上葡聚糖凝胶G-25柱，样品与葡聚糖凝胶重量比1：150，用水洗脱，洗脱3个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例30、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上葡聚糖凝胶G-10柱，样品与葡聚糖凝胶重量比1：50，用水洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例31、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上葡聚糖凝胶G-10柱，样品与葡聚糖凝胶重量比1：200，用水洗脱，洗脱2个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例32、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上葡聚糖凝胶G-10柱，样品与葡聚糖凝胶重量比1：150，用水洗脱，洗脱3个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例33、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上TSKgel Toyopearl HW-40柱，样品与树脂重量比1：50，用水洗脱，洗脱3个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例34、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上TSKgel Toyopearl HW-40柱，样品与树脂重量比1：200，用水洗脱，洗脱1个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例35、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上TSKgel Toyopearl HW-40柱，样品与树脂重量比1：150，用水洗脱，洗脱2个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例36、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上反相硅胶ODS-18柱，样品与反相硅胶ODS-18重量比1：50，用水洗脱，洗脱3个柱体积后，开始收集相应的色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例37、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上反相硅胶ODS-18柱，样品与反相硅胶ODS-18重量比1：200，用水洗脱，洗脱5个柱体积后，开始收集相应的色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例38、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上反相硅胶ODS-18柱，样品与反相硅胶ODS-18重量比1：150，用水洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集相应的色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例39、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上反相硅胶ODS-8柱，样品与反相硅胶ODS-18重量比1：50，用洗脱，洗脱5个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例40、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上反相硅胶ODS-8柱，样品与反相硅胶ODS-18重量比1：200，用洗脱，洗脱3个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例41、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上反相硅胶ODS-8柱，样品与反相硅胶ODS-18重量比1：150，用洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例42、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上硅胶柱200目，样品与硅胶重量比1：30，用乙酸乙酯-甲醇-水(体积比1:1:0.1)洗脱，洗脱6个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例43、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上硅胶柱200目，样品与硅胶重量比1：100，用乙酸乙酯-甲醇-水(体积比1:1:0.5)洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例44、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上硅胶柱200目，样品与硅胶重量比 1：60，用乙酸乙酯-甲醇-水(体积比1:1:0.3)洗脱，洗脱5个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例45、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上硅胶柱200目，样品与硅胶重量比1：70，用乙酸乙酯-甲醇-水(体积比1:1:0.4)洗脱，洗脱5个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例46、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上硅胶柱300目，样品与硅胶重量比1：30，用乙酸乙酯-甲醇-水(体积比1:1:0.1)洗脱，洗脱5个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例47、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上硅胶柱300目，样品与硅胶重量比1：80，用乙酸乙酯-甲醇-水(体积比1:1:0.5)洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例48、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上硅胶柱300目，样品与硅胶重量比1：60，用乙酸乙酯-甲醇-水(体积比1:1:0.3)洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
实施例49、步骤2所得红花粗粉用水溶解，上硅胶柱300目，样品与硅胶重量比1：70，用乙酸乙酯-甲醇-水(体积比1:1:0.4)洗脱，洗脱4个柱体积后，开始收集色带，60℃下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥，即得红花新苷，其含量大于90％。
新化合物红花新苷的理化数据：
分子式：C20H22O10；分子量：422；比旋光度：[a]D 20(c，CH3OH)；紫外光谱UV：λmaxnm(logε)：202，246，363(CH3OH)；203，230，418(+Al3Cl)；203，231，411(+Al3Cl+HCl)；红外光谱IR(KBr)：vmax cm-1：3373，2924，1670，1626，1514，1446，1269，1169，1090；核磁共振氢谱1HNMR(D2O+CD3OD，ppm)：δ7.77(1H，d，J＝15.5Hz，H-7)，7.48(1H，d，J ＝15.5Hz，H-8)，7.37(2H，d，J＝7.5Hz，H-10，14)，6.73(2H，d，J＝7.5Hz，H-11，13)，4.40(1H，brs，H-4)，2.77(1H，brs，H-3)，3.83(1H，d，J＝8.5Hz，H-1′)，3，20-3.29(2H，m，H-4′，5′)，3.60(1H，brd，J＝11.5Hz，H-6′)，3.49(1H，m，H-6′)，3.40-3.46(2H，m，H-2′，3′)；核磁共振碳谱13C NMR(D2O+CD3OD，ppm)：δ202，203，186.4，158.7，142.8，130.9(2C)，127.7，122.9，116.2(2C)，113.9，79.9，78.2，76.4，71.5，70.4，70.1，61.4，53.4；高分辨质谱HR-ESI(FT MS)(+)m/z445.1101[M+Na]+(calcd445.1111)。结构解析：
化合物为黄色粉末，高分辨质谱FT-MS显示准分子离子峰m/z：445.1101[M+Na]+(calcd 445.1111)，推出分子式为C20H22O10。紫外光谱UV紫外光谱显示特征吸收带λmax(logε)：202(4.03)，246(4.13)，363(4.25)nm(MeOH)，加AlCl3带I红移55nm，加AlCl3+HCl同AlCl3，无芳香邻二羟基取代。
分析其1H NMR谱，δ7.77(1H，d，J＝15.5Hz，H-7)，7.48(1H，d，J＝15.5Hz，H-8)提示分子中含有反式双键，在δ7.37(2H，d，J＝7.5Hz)，6.73(2H，d，J＝7.5Hz)提示分子中存在AB系统，表明分子中含有对位二取代的芳环。在δ4.40(1H，brs)，2.77(1H，brs)各有一个氢。此外，在δ3.83-3.20有七个氢，表明分子中含有一个糖，由于其端基质子出现在3.83(1H，d，J＝8.5Hz)，可以推断该糖不是以氧苷形式存在。13C NMR谱显示20个碳信号，除6个糖碳信号(δ79.9，78.2，76.4，71.5，70.1，61.4)和一个桂皮酰基外[186.4，158.7，142.8，130.9(2C)，127.7，122.9，116.2(2C)]，剩余5个碳信号(δ202，203，113.9.2，70.4，53.4)。结合二维核磁共振1H-1H COSY，HMQC和HMBC谱确定化合物的结构如式所示。
药理实验
实验例1
实验方法参考《药理实验方法学》1066页主编：徐叔云汴如濂陈修
1、实验材料：
(1)受试品
受试品红花新苷，为褐色固体颗粒，共17mg，易溶于生理盐水。受试品红花新苷，为中国医学科学院药物研究所张金兰教授提供。使用前用生理盐水配制成所需浓度的溶液(6mg/kg)。
(2)试剂
戊巴比妥钠：北京化学试剂公司产品(德国进口分装)批号：020919蒸馏水配置(0.8mg/100ml)。磷酸二氢钠：北京北化精细化学品有限责任公司，批号：990293，蒸馏水配置成3.1202g/100ml溶液，常温冷藏。磷酸氢二钠：北京北化精细化学品有限责任公司，批号：990308，蒸馏水配置成7.01628g/100ml溶液，常温冷藏。氯化钠：北京北化精细化学品有限责任公司，批号：20040220，蒸馏水配置成0.9g/100ml溶液，常温冷藏。红四氮唑(TTC)：北京化学试剂公司产品(德国进口分装)批号：040919。4％TTC配制方法：分别取0.7ml磷酸二氢钠、1.8ml磷酸氢二钠、22.5ml生理盐水、1g TTC配置而成。(3)动物雄性SD大鼠，体重250—270g，北京大学医学部实验动物科学部提供，合格证号：SCXK(京)2002-0001。
(4)器材大鼠手术台、手术器械、尼龙鱼线(直径0.24mm)、缝线、秒表等。
2、实验方法：
(1)动物分组：
大鼠随机分为3组，分别为假手术组、脑缺血模型组红花新苷6mg/kg给药组和和，
(2)中动脉阻塞所致局灶性脑缺血(MCAO)模型及组织的制备[1]：
选用直径0.24mm鱼线，一端加热使成光滑球形，大鼠用水合氯醛(350mg/kg，，i.p.)麻醉，仰卧位固定，颈部正中切口，分离右侧颈总及颈内、外动脉，将颈外动脉近心端结扎。结扎颈总动脉近心端，用银夹夹闭颈内动脉，在颈总动脉近分叉处剪一小口，将鱼线插入颈内动脉，遇轻微阻力时即停止，插入深度约1.8cm左右。结扎颈总动脉插线处，固定鱼线。消毒缝合伤口。动物放回笼中饲养。以上实验操作均在23～25℃进行。动物入组标准：(1)大鼠大脑中动脉闭塞同侧 出现Honers征。(2)大鼠苏醒后出现左前肢屈曲、内收，左侧转圈，或向左侧倾倒。
(3)给药方式：给药组于手术后30分钟经舌下静脉给药，假手术组和模型组给予等容量的生理盐水。
(4)神经行为评分和脑缺血面积测定
术后24小时测定行为评分，动物行为评分标准为
(a)提鼠尾观察前肢屈曲情况，双前肢对称向地面计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。
(b)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。
(c)将动物双前肢置于一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者及为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。
(d)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。
根据标准评分，满分为11分。分数越高表示动物行为障碍越严重。
术后24小时测定行为评分后，将动物断头取脑，去掉绣球、小脑脑干和低位脑干，然后冠状切4刀共5片。5片脑组织用TTC染色，正常组织为红色，梗死部位为白色，求算梗死面积及比值。同法操作，记录各组梗死面积及比值，进行t检验。
3、实验结果
(1)与假手术组大鼠相比，模型组大鼠表现出明显的神经行为障碍；缺血30分钟后静脉注射给于红花新苷6mg/kg，动物神经行为症状则得到明显改善，经统计学分析，红花新苷组动物的行为评分与模型组动物相比都有高度显著性差异(P<0.01)
(2)TTC染色显示，大鼠脑缺血24小时后，脑组织出现明显缺血区。缺血30分钟后给与红花新苷治疗，脑缺血区明显小于模型组。红花新苷6mg/kg给药组的大鼠脑缺血面积与模型组相比有显著性差异 (P<0.05)。
表1.红花新苷对局部脑缺血大鼠行为的影响(mean±SD)
与假手术组比较▲P<0.01，与模型组比较**P<0.01。
表2.受试品红花新苷对大鼠局部脑缺血面积的影响(mean±SD)
与假手术组比较▲P<0.01，与模型组比较*P<0.05。
4、实验结论
与给予生理盐水的模型组大鼠相比，受试品红花新苷在6mg/kg的剂量下静脉注射给药可明显改善脑缺血大鼠的神经行为症状，缩小缺血区范围，提示受试品红花新苷对实验性脑缺血有保护作用。
Claims (10)
1.一种化合物，其特征在于，如式I、II、III和IV所示
并且，
分子式：C20H22O10；
分子量：422；
比旋光度：[a]D20(c，CH3OH)；
紫外光谱UV：λmax nm(logε)：202，246，363(CH3OH)；203，230，418(+Al3Cl)；203，231，411(+Al3Cl+HCl)；
红外光谱IR(KBr)：vmax cm-1：3373，2924，1670，1626，1514，1446，1269，1169，1090；
核磁共振氢谱1H NMR(D2O+CD3OD，ppm)：δ7.77(1H，d，J＝15.5Hz，H-7)，7.48(1H，d，J＝15.5Hz，H-8)，7.37(2H，d，J＝7.5Hz，H-10，14)，6.73(2H，d，J＝7.5Hz，H-11，13)，4.40(1H，brs，H-4)，2.77(1H，brs，H-3)，3.83(1H，d，J＝8.5Hz，H-1′)，3,20-3.29(2H，m，H-4′，5′)，3.60(1H，brd，J＝11.5Hz，H-6′)，3.49(1H，m，H-6′)，3.40-3.46(2H，m，H-2′，3′)；
核磁共振碳谱13C NMR(D2O+CD3OD，ppm)：δ202，203，186.4，158.7，142.8，130.9(2C)，127.7，122.9，116.2(2C)，113.9，79.9，78.2，76.4，71.5，70.4，70.1，61.4，53.4。
2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1制备红花提取液
红花药材，加水提取，提取液浓缩至适当体积后，加入乙醇沉淀，静置，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，水沉，静置，滤液减压浓缩至适当体积，加入碱液调pH8-12，热回流，放冷后以盐酸调pH至中性，制得红花提取液；
步骤2制备红花提取物粗粉
步骤1所得红花提取液减压浓缩至适当体积，进行柱分离，以水洗脱，收集相应的流份，冻干，即得提取物粗粉；
步骤3分离纯化
将步骤2所得的提取物粗粉用水溶解，上分离柱进行化合物的分离纯化。
3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，步骤2中所述的分离柱选自大孔树脂柱、反相C18及C8柱、葡聚糖凝胶柱、聚酰胺柱。
4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于，所述的大孔树脂选自D101，D201、D301、XAD16、XAD1600、XAD7HP、XAD761、HP、SP、HP2MG系列。
5.根据权利要求3的制备方法，其特征在于，所述的葡聚糖凝胶柱选自G-10、G-25、G-50、LH-20。
6.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，步骤3中所述的分离柱选自葡聚糖凝胶柱、TSKgel Toyopearl HW-40柱、聚酰胺柱、硅胶柱。
7.根据权利要求6的制备方法，其特征在于，所述的葡聚糖凝胶柱选自G-10、G-25、G-50、LH-20；所述的硅胶柱选自反相硅胶ODS柱。
8.根据权利要求2的制备方法，其特征在于，步骤1中乙醇沉淀时，醇浓度为75％-95％。
9.一种药物组合物，包括常规的载体，其特征在于，还含有有效剂量的权利要求1所述的化合物。
10.权利要求1所述化合物在制备预防和/或治疗脑血管缺血疾病药物中的应用。
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| GR01 | Patent grant |