具体实施方式
制备例1:
取红花生药,加入其重量10-15倍水,煮沸50分钟,过滤,滤液减压浓缩至相对密度为1.25,加乙醇至含醇量为80%,4℃沉淀24小时,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.20,加10倍量的水,4℃沉淀24小时,离心,取上清液,用重量为其40%的大孔吸附树脂吸附,用去离子水洗脱3个柱体积,然后继续用去离子水洗脱5个柱体积,收集洗脱液,用重量为其10%的聚酰胺吸附,先用去离子水洗至无色,然后用95%乙醇洗8个柱体积,收集洗脱液,旋转蒸发器上浓缩除去乙醇,冷冻干燥得到羟基红花黄色素A。
实验例1、羟基红花黄色素A对大鼠局部缺血损伤的影响。
1.材料和方法
受试样品;注射用羟基红花黄色素A,山东省天然药物工程技术研究中心提供,规格10mg/只,批号:20000525,临用前生理盐水配制成所需浓度的溶液;尼莫地平注射液(商品名尼立苏),山东新华制药股份有限公司,规格:10mg/50mL批号;00060211,批准文号(95)卫药准字X-121(2)号;血塞通,云南植物药业有限公司,1000mg/2ml批号:20000407滇卫药准字(1995)第000138号;赋形剂,甘露醇,青岛胶南明月海藻工业有限公司生产(符合药典标准),批号:9905026。红四氮唑,美国SIGMA公司产品,临用前用生理盐水配成4%溶液。
动物:普通级Wistar大鼠,雄性体重350-420g,山东医科大学实验动物中心提供,合格证号:鲁动质字200001003
插线法制备局部脑缺血模型
栓线选用直径0.24mm尼龙线,长度5.0cm。大鼠用水合氯醛(350mg/kg,i.p.)麻醉,分离左侧颈总动脉,于颈内、颈总动脉处用动脉夹夹闭,颈外动脉近心端及远心端结扎,中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线,将尼龙绳由颈外动脉插入颅内,遇轻微阻力时停止,插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口,并打开颈总动脉夹,消毒缝合伤口,造成左侧大脑中动脉缺血模型。以上实验均为在23℃-25℃进行,缺血24小时后观察大鼠的行为和脑的梗塞面积,以此作为缺血程度的指标。
缺血24小时后的动物评分行为指标:1、提鼠尾观察前肢曲伸情况,如双前肢对称伸向地面,计为0分,如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分,肘屈曲计为2分,肩内旋计为3分,既有腕屈曲和/或肘屈曲,又有肩内旋者,计为4分;2、将动物至于平地面上分别推双肩相对侧移动,检查阻力。如双侧阻力对等且有力,计为0分,如向手术对侧推动时阻力下降,根据下降的程度不同,分为轻、中、重三度,分别计为1、2、3分;3、物双前肢置一金属网上,观察双前肢的肌张力。双前肢张力对等且有力者计为0分;同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1、2、3分;4、动物有不停地向一侧转圈者,计为1分;根据标准评分,满分为11分,分数越高,表示动物行为障碍越严重。
实验动物分组和用药:动物随机分为9组,假手术组、生理盐水组(NS)、注射用羟基红花黄色素A1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg组,注射用羟基红花黄色素A6.0mg/kg口服组,赋形剂组、尼莫地平0.2mg/kg组,血塞通36.0mg/Kg组,每组10只。除假手术组和注射用羟基红花黄色素A6.0mg/kg口服组,各组动物分别于缺血后30min舌下静脉给予相应药物(给药体积:1mi/Kg)。注射用红花黄色素6.0mg/Kg口服组动物于手术前禁食12小时,缺血后30min灌胃给药(给药体积:1ml/Kg)
脑缺血面积测定:动物行为评分后处死取脑,去掉嗅球、小脑、低位脑干、冠状切成5片。脑片用红四氮唑(TTC)染色。正常组织染色后呈红色,梗塞组织呈白色,染色后照相,用中国航空航天大学病理图象分析软件求梗塞面积比。数据分析:数据用
X±S表示,以组间t检验进行统计学处理。
2结果:
2.1羟基红花黄色素A(S-A)对脑缺血大鼠行为的影响。
结果显示:大脑中动脉栓塞大鼠,给予生理盐水,表现出明显的行为障碍。给予不同剂量的羟基红花黄色素A注射液,动物行为明显低于NS对照组,且成剂量依赖。统计学分析表明,羟基红花黄色素A中剂量(3.0mg/kg)组的动物行为评分与血塞通组相比无显著性差异,羟基红花黄色素A大剂量(6.0mg/kg)组的动物行为评分低于血塞通组,与尼莫地平组相比无显著性差异,羟基红花黄色素A大剂量组口服给药的动物行为评分低于羟基红花黄色素A小剂量组(1.5mg/kg)静脉给药组,高于羟基红花黄色素A大、中剂量静脉给药组。
表明羟基红花黄色素A静脉给药具有明显改善脑缺血动物行为障碍的作用,口服给药作用弱于静脉给药(表1)。
表1羟基红花黄色素A对局部脑缺血大鼠行为的影响
剂量 降低率
组别 行为评分
(mg/kg) %
假手术 - 0 0
NS 等容量 10.20±0.92 0
S-A小剂量 1.5 9.30±1.06*##++ 8.7
S-A中剂量 3.0 7.20±0.63**## 29.4
S-A大剂量 6.0 5.80±1.4**++ 43.1
S-A灌胃给药 6.0 8.20±0.63**##+ 19.7
赋形剂 24 10.1±0.88 0.9
尼莫地平 0.2 4.90±1.45** 51.9
血塞痛 36 7.50±0.85** 26.5
n=10与生理盐水相比*P<0.05,**P<0.01;与尼莫地平组比较#P<0.05,##P<0.01;与血塞通比较+P<0.05,++P<0.01
2.2羟基红花黄色素A对脑缺血面积的影响
结果显示,大鼠脑缺血后24小时,脑组织出现明显的缺血区,其面积达全脑的30%以上,脑缺血30分钟后给予羟基红花黄色素A治疗,脑缺血区明显低于NS对照组,且呈剂量依赖性。统计学分析,羟基红花黄色素A注射液中剂量(3.0mg/kg)组的大鼠脑缺血面积与血塞通相比无显著性差异,羟基红花黄色素A注射液大剂量(6.0mg/kg)组的大鼠脑缺血面积与血塞通相比较小,与尼莫地平组相比无显著性差异,羟基红花黄色素A灌胃给药(6.0mg/kg)缺血面积明显小于羟基红花黄色素A小剂量(1.5mg/kg)静脉给药组,与血塞通组相似,表明羟基红花黄色素A具有显著的抗脑缺血作用,静脉注射给药作用强于口服给药。
表2羟基红花黄色素A对脑缺血面积的影响
组别 剂量(mg/kg) 缺血比(%)
假手术 -- 1.2±0.55
NS 等容量 3.19±9.2
S-A小剂量 1.5 30.1±12.9##+
S-A中剂量 3.0 13.4±6.3**+##
S-A大剂量 6.0 4.8±2.9**++
S-A灌胃给药 6.0 19.4±5.1**##
赋形剂 24 33.7±8.9##
尼莫地平 0.2 4.9±2.6**
血塞痛 36 19.1±7.7**##n=10与生理盐水相比*P<0.05,**P<0.01;与尼莫地平组比较#P<0.05,##P<0.01;与血塞通比较+P<0.05,++P<0.01
结论:表明羟基红花黄色素A可明显改善脑缺血大鼠的行为障碍,缩小缺血区范围,对缺血性脑损伤有明显的保护作用。
实验例2、羟基红花黄色素A对麻醉犬脑血管的影响。
1材料与方法
受试样品:注射用羟基红花黄色素A,山东省天然药物工程技术研究中心提供,规格:10mg/支,批号:2000525临用前用生理盐水配制成所需浓度的溶液;溶剂对照组:2%甘露醇,石家庄制药有限集团公司,批号:00033165;阳性对照组:血栓通注射液,内蒙古旗卡制药厂。批号2000091112,批准文号:内卫药准字(1996)第001945号。
动物:健康犬36只,雌雄兼用,体重12-16Kg,由北京市海淀区通利实验动物养殖厂提供,动物合格证编号:京动管犬子(96)第024号
仪器:TA-4000多道生理记录仪:美国Gould Inc公司产品;MF-27电磁流量计:日本光电公司产品。
实验分组及用药:犬分为6组,空白对照组,溶剂对照组(甘露醇组),注射用羟基红花黄色素A3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg组,及血栓通注射液25mg/kg组。给药时,各组药物均溶于100ml的生理盐水中,30分钟静脉滴注完毕。
脑血流量指标的测定:动物称重后戊巴比妥钠30mg/Kg麻醉,用右颈总动脉插管法测定动脉血压。分离左颈总动脉,结扎颈外动脉,将电磁流量计探头(2mm)插入颈总动脉,垂直于颈总动脉固定,记录颈内动脉流量以代脑血流量。滴加生理盐水防止探头干燥。安放电极,记录标准肢体II导联心电图。手术后稳定30min记录各项指标,作为给药前对照。各组犬分别静脉滴注低、中、高浓度的注射用羟基红花黄色素A及血栓通注射液(30分钟滴完),滴注5min时开始测定,每隔5min记录一次,观察记录时间为1小时,即记录给药后5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min时的颈内动脉血流量、动脉血和心率。按下列公式计算脑血管阻力:脑血管阻力(Kpa/ml/min)=血压/脑血流量。
数据分析:数据用
X±S表示,实验结果进行组内给药前后作用比较和给药组与对照组比较,以t检验进行统计学处理。
2结果
2.1羟基红花黄色素A对犬脑血流量的影响
结果显示,甘露醇组各项指标与同时间段空白组比较无显著差异。注射用羟基红花黄色素A12mg/Kg、6mg/Kg组给药后,犬脑血流量明显增加,与给药前和甘露醇组比均有显著意义,(p<0.05或p<0.01),血压、血管阻力和心率无明显变化;注射用羟基红花黄色素A3mg/Kg对脑血流量、血压、和血管阻力均无明显作用。血栓通25mg/Kg组10-30分钟时也可增加脑血流量(表3-6)
结果表明:注射用羟基红花黄色素A12mg/Kg、6mg/Kg组静脉给药均可明显增加麻醉犬的脑血流量,但对麻醉犬血压、血管阻力和心率无明显影响。
表3、注射用红花明苷A对犬脑血流量的影响(
X±S)
组别 | 剂量(mg/kg) |
动物数 |
脑血流量(ml/min) |
给药后时间(min) |
药前 |
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
30 |
35 |
40 |
45 |
50 |
55 |
60 |
空白对照 |
等容量 |
6 |
112.3±4.23 |
112.2±6.46 |
111.8±5.34 |
110.8±7.73 |
110.3±8.62 |
108.2±10.59 |
108.0±8.67 |
110.3±7.89 |
111.8±8.16 |
108.8±7.96 |
107.5±8.17 |
109.3±8.31 |
109.5±9.03 |
2%甘露醇 |
等容量 |
6 |
112.0±6.48 |
111.8±6.65 |
111.3±6.19 |
111.8±5.78 |
110.8±5.49 |
112.0±5.10 |
113.2±4.54 |
112.5±5.09 |
111.2±6.34 |
112.0±5.59 |
110.2±4.58 |
109.8±6.49 |
109.3±4.68 |
红花明苷-A |
12 |
6 |
111.5±4.64 |
123.0±5.40**## |
131.0±5.06**## |
137.8±5.27**## |
141.2±7.19**## |
13.97±7.53**## |
141.5±8.92**## |
137.2±9.17**## |
134.5±7.71**## |
130.5±8.09**## |
127.5±9.85**## |
128.8±7.47**## |
126.2±7.63**## |
红花明苷-A |
6 |
6 |
111.5±4.55 |
122.3±5.4*# |
128.0±10.16**# # |
129.0±6.81**## |
131.0±10.26**# # |
133.0±10.30**## |
134.3±10.75**# # |
133.5±8.31**## |
133.8±8.28**## |
131.2±8.11**## |
131.2±6.46**## |
126.7±4.72**## |
126.7±4.72**## |
红花明苷-A | 3 | 6 | 110.3±3.88 | 112.2±4.49 | 1113.8±3.06 | 113.2±4.17 | 111.3±4.72 | 113.5±5.09 | 112.2±4.49 | 112.3±3.39 | 110.5±4.14 | 110.5±3.02 | 110.8±3.97 | 1108±5.12 | 111.3±7.09 |
血栓通 |
25 |
6 |
113.0±5.66 |
119.2±8.01 |
127.5±7.29** |
128.0±8.51** |
128.7±9.40** |
132.2±12.97** |
137.2±16.01** |
131.7±16.02* |
129.5±15.07* |
127.8±15.17* |
127.2±15.74 |
125.8±13.48 |
126.0±13.51 |
与给药前相比*P<0.05,**P<0.01;与溶剂比较#P<0.05,##P<0.01
表4红花明苷A对犬血压的影响(
X±S)
组别 | 剂量(mg/kg) |
动物数 |
血压(kPa) |
给药后时间(min) |
药前 |
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
30 |
35 |
40 |
45 |
50 |
55 |
60 |
空白对照 |
等容量 |
6 |
15.7±16.1 |
15.8±2.94 |
1.58±2.84 |
15.9±2.83 |
16.0±2.75 |
16.2±2.77 |
16.3±2.59 |
16.1±2.40 |
16.2±2.46 |
16.2±2.34 |
16.2±2.41 |
16.3±2.41 |
16.4±2.41 |
2%甘露醇 |
等容量 |
6 |
13.9±1.71 |
13.9±1.72 |
14.0±1.75 |
13.8±2.00 |
14.0±1.74 |
14.1±1.78 |
14.2±1.62 |
14.2±1.63 |
14.1±1.74 |
14.0±1.79 |
14.0±2.05 |
14.0±2.18 |
13.9±2.06 |
红花明苷-A |
12 |
6 |
15.4±1.24 |
15.5±1.29 |
15.7±1.40 |
15.8±1.61 |
15.8±1.56 |
15.9±1.58 |
1.58±1.64 |
15.8±1.51 |
15.6±1.53 |
15.5±1.76 |
15.4±1.66 |
15.4±1.67 |
15.3±1.70 |
红花明苷-A |
6 |
6 |
16.0±1.01 |
15.3±123 |
15.3±1.37 |
15.4±1.21 |
15.4±1.29 |
15.3±1.14 |
15.3±1.21 |
15.3±1.47 |
15.7±1.76 |
15.2±1.55 |
15.2±1.30 |
15.0±1.49 |
15.1±1.39 |
红花明苷-A |
3 |
6 |
16.5±2.78 |
1.71±2.14* |
16.9±2.6* |
16.8±2.26* |
17.0±2.17* |
16.8±2.35 |
17.0±2.34* |
16.9±2.28* |
16.8±2.30 |
16.7±2.57 |
16.5±2.57 |
1.66±2.55 |
16.5±2.27 |
血栓通 |
25 |
6 |
17.1±3.06 |
1.70±3.04 |
16.9±3.25 |
17.0±3.14 |
17.0±3.20 |
17.3±2.77 |
17.3±2.44 |
16.8±2.62 |
17.2±2.49 |
17.1±2.64 |
17.2±2.48 |
17.1±2.67 |
17.1±2.76 |
溶剂比较*P<0.05
表5注射用红花明苷对犬脑血管阻力的影响(
X±S)
组别 | 剂量(mg/kg) |
动物数 |
血管阻力(kpa/ml/min) |
给药后时间(min) |
药前 |
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
30 |
35 |
40 |
45 |
50 |
55 |
60 |
空白对照 |
等容量 |
6 |
0.14±0.14 |
0.14±0.03 |
0.14±0.03 |
0.14±0.03 |
0.15±0.03 |
0.15±0.03 |
0.15±0.02 |
0.15±0.02 |
0.15±0.02 |
0.15±0.02 |
0.15±0.02 |
0.15±0.02 |
0.15±0.03 |
2%甘露醇 |
等容量 |
6 |
0.13±0.02 |
0.12±0.02 |
0.13±0.02 |
0.12±0.02 |
0.13±0.02 |
0.13±0.02 |
0.13±0.02 |
0.13±0.02 |
0.13±0.02 |
0.13±0.02 |
0.13±0.02 |
0.13±0.03 |
0.13±0.02 |
红花明苷-A |
12 |
6 |
0.14±0.01 |
0.13±0.02 |
0.12±0.01 |
0.11±0.01 |
0.11±0.01 |
0.12±0.01 |
0.11±0.01 |
0.12±0.02 |
0.12±0.02 |
0.12±0.02 |
0.12±0.02 |
0.12±0.02 |
0.12±0.02 |
红花明苷-A |
6 |
6 |
0.15±0.01 |
0.13±0.01 |
0.12±0.02 |
0.12±0.01 |
0.12±0.01 |
0.12±0.01 |
0.12±0.01 |
0.12±0.01 |
0.12±0.02 |
0.12±0.02 |
0.12±0.01 |
0.12±0.02 |
0.12±0.01 |
红花明苷-A |
3 |
6 |
0.15±0.03 |
0.15±0.02 |
0.15±0.02* |
0.15±0.02* |
0.15±0.02 |
0.15±0.03 |
0.15±0.02 |
0.15±0.02* |
0.15±0.02 |
0.15±0.02 |
0.15±0.03 |
0.15±0.02 |
0.15±0.03 |
血栓通 |
25 |
6 |
0.15±0.03 |
0.15±0.03 |
0.13±0.03 |
0.13±0.03 |
0.14±0.03 |
0.13±0.03 |
0.13±0.03 |
0.13±0.03 |
0.13±0.03 |
0.14±0.04 |
0.14±0.04 |
0.14±0.03 |
0.14±0.03 |
溶剂比较*P<0.05
表6、注射用红花明苷对犬心率的影响(X±S)
组别 | 剂量(mg/kg) |
动物数 |
心率(bcat/min) |
给药后时间(min) |
药前 |
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
30 |
35 |
40 |
45 |
50 |
55 |
60 |
空白对照 |
等容量 |
6 |
190.8±19.43 |
193.3±21.37 |
190.8±16.86 |
191.7±16.33 |
190.8±14.97 |
196.7±13.66 |
198.3±18.07 |
195.8±13.57 |
200.0±15.49 |
195.0±18.17 |
198.3±18.35 |
203.3±16.33 |
16.4±2.41 |
2%甘露醇 |
等容量 |
6 |
180.0±13.78 |
175.8±17.44 |
178.3±14.72 |
182.5±8.80 |
183.3±10.33 |
183.3±10.33 |
182.5±8.80 |
188.3±7.53 |
18.75±11.73 |
186.7±8.16 |
191.7±4.08 |
188.3±7.53 |
13.9±2.06 |
红花明苷-A |
12 |
6 |
193.3±23.17 |
186.7±23.38 |
1883.3±24.43 |
185.8±22.00 |
184.2±23.33 |
185.8±22.00 |
188.3±25.03 |
185.8±25.96 |
183.3±2.51 |
189.2±20.60 |
185.8±23.75 |
186.7±22.73 |
15.3±1.70 |
红花明苷-A |
6 |
6 |
197.5±20.43 |
194.2±21.08 |
195.8±27.28 |
199.2±22.89 |
200.8±20.60 |
199.2±19.60 |
197.5±21.85 |
196.7±199.6 |
200.0±15.81 |
201.7±21.37 |
203.3±19.66 |
201.7±21.37 |
15.1±1.39 |
红花明苷-A |
3 |
6 |
198.3±41.49 |
203.3±39.45 |
198.3±40.08 |
199.2±42.24 |
200.0±41.35 |
201.7±42.03 |
204.2±42.24 |
206.7±38.82 |
203.3±45.35 |
202.5±43.33 |
205.0±43.59 |
203.3±43.32 |
16.5±2.27 |
血栓通 |
25 |
6 |
209.2±18.55 |
211.7±14.72 |
207.5±16.66 |
208.3±18.35 |
211.7±21.37 |
211.7±21.37 |
210.0±17.89 |
205.8±18.55 |
211.7±19.66 |
215.0±14.83 |
212.5±17.82 |
2092.2±19.08 |
207.5±18.37 |
溶剂比较*P<0.05
实验例3、羟基红花黄色素A对大鼠体内血栓形成的影响
1、材料和方法:
受式样品:注射用羟基红花黄色素A,山东省天然药物工程技术中心提供,规格:10mg/支,批号20000525,临用前用生理盐水配制成所需浓度的溶液;阳性对照组:肝素钠,规格:1g/支,江苏省常州市光明生物化学研究所产品,批号:991008,分子量:6000-20000,效价:每1mg不少于140单位。
动物:普通级WISTAR大鼠,雄性,体重230-250克,山东绿叶制药股份有限公司动物实验中心,合格证号:鲁动质字9803号。
仪器:YBZ-Z真空恒温干燥箱:天津药典标准仪器厂产品
2、注射用羟基红花黄色素A对大鼠体内血栓形成的影响响实验方法
2.1、对动-静脉旁路血栓形成的影响
将大鼠用水合氯醛(350mg/Kg,I.p.)麻醉,分离右侧颈总动脉及左颈外静脉,在聚乙烯管中放入一跟长5cm已称重的七号丝线。以含肝素钠(50U/Ml)的生理盐水溶液充满聚乙烯管,聚乙烯管的一端插入左颈外动脉,另一端插入右颈总动脉。打开夹闭的血管的动脉夹,使血液从右总静脉流入聚乙烯管后返回左颈外静脉。开放血流15min后迅速取出丝线称重,减去丝线重量即血栓湿重。
实验分组及用药:动物随机分为5组,生理盐水,羟基红花黄色素A1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg、肝素钠0.2mg/kg,每组10只。各组动物分别于术前15min舌下静脉给予相应的药物(给药体积:1ml/kg)
2.2对大鼠静脉血栓形成的影响
大鼠用水合氯醛(350mg/kg,i.p.)麻醉后开腔分离下腔静脉,与左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉,缝合腹部。24小时后重新开腹,在结扎处下方2cm处夹闭血管,剖开管腔,取出血栓,60度真空干燥24小时后,称重。
实验分组及用药:动物随机分为5组,生理盐水,羟基红花黄色素A1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg、肝素钠0.2mg/kg,每组10只。各组动物分别于术前6小时舌下静脉给予相应的药物(给药体积:1ml/kg)
数据分析:数据用
X±S表示,以组间t检验进行统计学处理。
3.结果
3.1羟基红花黄色素A对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响。
表7羟基红花黄色素A对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响组别 剂量 血栓 抑制率
(mg/Kg) (mg) (%)NS 等容量 31.80±1.97 0S-A小剂量 1.5 25.63±5.86**## 20.3S-A中剂量 3.0 17.94±2.39**## 43.6S-A大剂量 6.0 14.59±1.31**# 54.2肝素钠 0.2 12.08±1.99** 62.1n=10与生理盐水相比*P<0.05,**P<0.01;与肝素钠组比较#P<0.05,##P<0.01
结果显示:羟基红花黄色素A可呈剂量依赖性抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成6.0mg/kg羟基红花黄色素的作用尤为明显,抑制率达到了54.2%,当于肝素钠作用强度的87.3%(表7)
3.2羟基红花黄色素A对大鼠血栓形成的影响
结果显示羟基红花黄色素A可成剂量依赖性减轻大鼠静脉血栓的重量,6.0mg/kg羟基红花黄色素的作用尤为明显,抑制率达到了64.5%,当于肝素钠作用强度的86.2%(表8)
表8羟基红花黄色素A对大鼠血栓形成的影响组别 剂量 血栓 抑制率
(mg/Kg) (mg) (%)NS 等容量 15.29±2.54 0S-A小剂量 1.5 11.21±1.41**## 26.7S-A中剂量 3.0 8.17±0.77**## 48.3S-A大剂量 6.0 5.43±1.30**# 64.5肝素钠 0.2 3.84±1.30** 74.9n=10与生理盐水相比*P<0.05,**P<0.01;与肝素钠组比较#P<0.05,##P<0.01
实验例4羟基红花黄色素A对血小板功能和数目的影响
1材料和方法:
受试样品:注射用羟基红花黄色素A,山东省天然药物工程技术中心提供,规格:10mg/支,批号:20000525,临用前用生理盐水配制成所需浓度的溶液;阳性对照组:乙酰水杨酸,烟台第二制药厂,鲁卫药准字(1995)第111011号批号:2000502,规格:25mg/片;二磷酸腺苷(ADP):美国SIGMA公司产品,生理盐水配置,100μl;枸橼酸钠:天津天河化学试剂厂,分析纯,以蒸馏水配制3.8%溶液备用。
动物:清洁级Wistar大鼠,雄性,体重230-250g,青岛实验动物中心提供,合格证号:鲁动质字200002004号。
仪器:DL-4000B型低速冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂;LBY-NJ2血小板计数仪:北京普利生公司产品;JT-IR血细胞计数仪:美国库尔特公司产品。
2羟基红花黄色素A对大鼠血小板聚集的影响
大鼠随机分为5组,即生理盐水,羟基红花黄色素A 25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml;乙酰水杨酸30μg/ml、每组10只。每只大鼠心脏取血3ml,以3.8%枸橼酸钠抗凝。650r/min离心10分钟,移出上层血浆即富血小板血浆(PRP)0.5ml,余下部分再以3000r/min离心10分钟,上层泛请即为富血小板血浆(PPP)。调整PRP的血小板数<20000万个/ml,移取0.3ml调整好浓度的血小板至比浊管内,将比浊管放入用PPP调零后的血小板聚集仪中,加入10μl相应的药物,37度温育3min后加入10μl的ADP,同时开启血小板聚集仪进行记录,记录时间为6min,打印记录结果。
3、羟基红花黄色素A对大鼠给药前、后血小板数目的影响
大鼠随机分为4组,生理盐水、羟基红花黄色素A 1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg。水合氯醛麻醉(350mg/kg,i.p.)后,先从尾静脉取血0.45ml;再于舌下静脉给药30min后,尾静脉采血0.45ml。两次所取血样均加入0.05ml 3.8%的枸橼酸钠抗凝。全部血样用血细胞计数仪测定大鼠给药前、后血小板数目。
数据分析:数据用
X±S表示,以组间t检验进行统计学处理。
4结果
4.1羟基红花黄色素A对大鼠给药前、后血小板聚集的影响。
结果显示,不同剂量的注射用羟基红花黄色素A(S-A)均可抑制由ADP诱导的大鼠血小板聚集,与生理盐水比较有高度显著性差异,小、中、大剂量的羟基红花黄色素A对血小板聚集的抑制率分别为19.5%、36.5%、41.8%,其中大剂量的羟基红花黄色素A的作用强度达到乙酰水杨酸作用强度的77.5%(表9)
表9.注射用羟基红花黄色素对大鼠血小板聚集的影响(
X±S)
组别 终浓度 最大聚集率 抑制率
(μg/ml) % (%)
NS 等容量 39.03±6.00 0
S-A小剂量 25.0 31.43±2.27**## 19.5
S-A中剂量 50.0 24.79±4.61**## 36.5
S-A大剂量 100.0 22.72±4.22**# 41.8
乙酰水杨酸 30.0 15.26±2.23** 60.9n=10与生理盐水相比*P<0.05,**P<0.01;与乙酰水杨酸组比较#P<0.05,##P<0.01
4.2对大鼠给药前后血小板数目的影响。
结果显示:给药前与给药后大鼠自身血小板数目无显著性差异,表明S-A对大鼠血小板数目无明显影响。(表10)。
表10羟基红花黄色素A对大鼠给药前后血小极数目的影响(
X±S)组别 剂量 动物数 血小板数目(×109/L)
(mg/Kg) (n) 给药前 给药后NS 等容量 7 666±152 649±118S-A小剂量 1.5 10 632±84 670±82S-A中剂量 3.0 10 641±113 626±120S-A大剂量 6.0 8 705±122 705±95
结论:不同剂量的注射用羟基红花黄色素A均可抑制ADP诱导的血小板聚集,对血小板数目无明显影响。
实验例5、红花命苷A对小鼠凝血时间的影响。
1、材料和方法:
受式样品:注射用羟基红花黄色素A,山东省天然药物工程技术中心提供,规格:10mg/支,批号20000525,临用前生理盐水配制成所需浓度的溶液:阳性对照组:肝素钠,规格:1g/支,江苏省常州市光明生物化学研究所产品,批号:991008,分子量:6000-20000,效价:每1mg不少于140单位。
动物:普通级昆明小鼠,雄性,体重18-22克,山东绿叶制药股份有限公司动物实验中心,合格证号:鲁动质字9803号。
2、羟基红花黄色素A对小鼠凝血时间的影响
昆明种80只,称重,标记,按体重随机分为5组:生理盐水组(NS)羟基红花黄色素-A 4.5mg/kg、9.0mg/kg、18.0mg/kg,肝素钠:0.6mg/kg。各组动物分别于尾静脉注射相应的药物,(给药体积:10mg/kg)。15min后,眼眶取血,用玻片法测定凝血时间;数据分析:数据用X±S表示,以组间t检验进行统计学处理。
结果显示,注射用羟基红花黄色素A可呈剂量依赖性明显延长小鼠凝血时间,18.0mg/kg注射用羟基红花黄色素的作用尤为明显,相当于肝素钠作用强度的76.0%(表11)。
表11羟基红花黄色素A对小鼠凝血时间的影响(
X±S)
组别 剂量(mg/Kg) 凝血时间(秒)
NS 等容量 54.87±9.52
S-A小剂量 4.5 110.25±12.11**##
S-A中剂量 9.0 139.38±26.59**##
S-A大剂量 18.0 289.69±50.50**##
肝素钠 0.2 405.56±38.15**n=10与生理盐水相比*P<0.05,**P<0.01;与肝素钠组比较#P<0.05,##P<0.01
结论:羟基红花黄色素A明显延长小鼠凝血时间且呈剂量依赖性。
实验例6、羟基红花黄色素A对大鼠血液流变性的影响
1、材料和方法
受式样品:注射用羟基红花黄色素A,山东省天然药物工程技术中心提供,规格:10mg/支,批号20000525,临用前生理盐水配制成所需浓度的溶液;阳性对照药:注射用降酰酶,中美合资烟台北方制药有限公司产品,规格:5U/支,批号:991128,临用前生理盐水配制成所需浓度的溶液。
动物:普通级WISTAR大鼠,雄性,体重350-430克,山东绿叶制药股份有限公司动物实验中心,合格证号:鲁动质字9803号。
仪器:LBY-N6A血小板计数仪:北京普利生公司产品。
2、大鼠血液流变性指标测定
WISTAR大鼠50只,称重,标记,按体重随机分为五组:生理盐水组(NS)羟基红花黄色素A(S-A)1.5mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg,降纤酶0.45U/kg。各组动物水合氯醛(350mg/kg)麻醉,分别于舌下静脉注射相应药物(给药体积:1ml/kg)。15min后,心脏采血5ml/只,以0.5%肝素抗凝,用血液流变学测试仪测定全血粘度、血浆粘度等指标。
数据分析:数据分析数据
X±S表示,以组间t检验进行统计学处理。
结果显示:不同剂量的羟基红花黄色素A均可降低大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积,6.0mg/kg注射用羟基红花黄色素A作用尤为明显,其降低血粘度的作用强度与降纤酶相当(表12)。
表12羟基红花黄色素A对大鼠血液流变性的影响(
X±S)组别 剂量 全血粘度(mPa.S) 血浆粘度 红细胞压积
低切变率 低切变率 (mPa.S)NS 等容量 21.71±4.77 9.23±2.13 2.73±0.53 57.38±4.68S-A小剂 1.5mg/kg 13.57±2.50**## 4.73±0.43**## 1.30±0.08** 51.43±3.46**##S-A中剂量 3.0mg/kg 13.34±2.19**## 4.92±0.65**## 1.28±0.07** 49.13±4.29**#S-A大剂量 6.0mg/kg 11.61±0.90**# 4.51±0.40**# 1.22±0.07** 47.01±2.32**#降纤酶 0.45U/kg 9.85±1.78** 4.25±0.49** 1.27±0.05** 43.92±3.64**
n=10与生理盐水相比*P<0.05,**P<0.01;与肝素钠组比较#P<0.05,##P<0.01
结论:不同剂量的注射用羟基红花黄色素A均可降低大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积。实验例7、羟基红花黄色素A的抗自由基的活性研究
1、药物与试剂
羟基红花黄色素A:由山东天然药物工程技术研究中心提供;1,1,3,3-四乙氧基丙烷(JEP),NADH,PMS,NBT,为SIGMA产品;硫代巴比妥酸(TBA)三氯乙酸(TCA)为国产分析纯。
动物:SD雄性大鼠数只,200-250克昆明种小鼠20只,18-22克,雌雄各半,由陕西省中医药研究院提供。
2、方法:
O·2 -生成及测定
O·2 -由NADH-PMS-NBT系统(16mmol/L,PH8.0的Tris-HCL缓冲液,内含NADH 73μmol/L,PMS 15μmol/L,NBT 50μmol/L)产生,空白管不加PMS,对照管不加羟基红花黄色素A(S-A)。S-A的终浓度为25、50、100、200、400μg/ml总体积为3ml于560nm处比色测定,并计算抑制率。
·OH生成及测定:
由于·OH可特异的是碱性桃红T腿色,据腿色的幅度可衡量·OH的生成量,实验按文献进行,反应总体积5ml其中碱性桃红T(70μg/ml)1ml,3%H2O21ml,2mmol/LEDTANa-Fe(II)2ml,再加一定量羟基红花黄色素A(S-A)和0.15mmol/L PH7.4的PBS,混匀,37℃保温30min,对照组以H2O代替药品,空白组以H2O代替药品和EDTANa2-Fe(II),520nm处比色,并计算抑制率。
3、肝微粒体脂质过氧化物LPO的测定
昆明种小鼠20只,处死,迅速分离肝组织,用冰冷的0.25mol/L的蔗糖溶液制成20%的匀浆,9800g离心20min分钟沉淀再洗一次,合并上清夜,并于96000g离心40min,沉淀用冰冷的0.15mol/L KCl洗两次,最后悬浮与0.15mol/L KCl中,LOWRRY法测定蛋白。在0.2mol/L磷酸钾缓冲液(PH7.4)含微粒体蛋白200-400μg/ml,硫酸亚铁10μmol/L,VITC 0.1mmol/L及不同浓度的羟基红花黄色素A(S-A),37℃振荡温浴1h。测定LPO。
结果
SAF-A的体外清除O·2 -作用
SAF-A能明显清除NADH-PMS-NBT系统产生的O·2 -,560nm处吸收值明显降低,呈量效关系(表13)
表13 Scavenging activities of saf-A for superoxide O·2 -,produced by NADH-PMS-
NBTsystem
Concn/ O·2 -generation/ lnhibition rate
μg/ml A560 %
control 0483±0.017
25 0.330±0.013* 31.68
50 0.311±0.008* 35.61
100 0.206±0.010** 57.35
200 0.116±0.009** 75.98
400 0.055±0.006*** 88.61
N=4 X±S,*P<0.05**P<0.001 ***P<0.001 VS control
S-A的体外清除·OH作用
S-A对能明显清除EDTANa2-Fe(II)-H2O2系统产生的·OH,且呈量效关系。
(表14)
表14 Scavenging activities of saf-A for by·OH EDTANa2-Fe(II)-H2O2systemConcn/ O·2 -generation/ lnhibition rateμg/ml A520 %basal 0.881±0.016***control 0.052±0.00725 0.088±0.013 4.3450 0.122±0.009* 8.44100 0.196±0.012** 17.37200 0.317±0.006** 31.97400 0.603±0.012*** 69.72N=4 X±S,*P<0.05 **P<0.001 ***P<0.001 VS control
3.3 S-A对小鼠肝微粒体脂质过氧化的影响
S-A能明显抑制Fe2++VitC系统产生·OH对小鼠肝微粒体刺激所引起的脂质过氧化反应,LPO含量降低,且呈量效关系(表15)
表15 Effect of Saf-A on microsomal lipid peroxidationConch/ LPOformation/ lnhibition rateμg/ml Nmol/g
%basal 39.32±3.68***control 188.54±12.265 176.32±13.39 8.211.0 168.47±11.66* 13.472.0 151.49±12.92** 24.854.0 113.64±9.24** 50.218.0 55.72±7.86*** 89.01N=4 X±,*P<0.05 **P<0.001 ***P<0.001 VS control
实验例8、羟基红花黄色素A对脑缺血所致大鼠脑线粒体损伤的保护作用
1、材料与方法
药品、试剂与仪器:
羟基红花黄色素A:由山东省天然药物工程技术研究中心提供;邻苯二甲醛(o-phthalaldekhyde,OPT)为Fluka产品;二苯基己三烯(diphenylhexa-triene,DPH)为Sigma产品。
低温高速离心机:美国Backman公司751;分光光度计:上海第三仪器厂;原子吸收分光光度计:日本岛津公司Z28000型;SOD)、GSH-Px、MDA测定试剂盒:南京建成生物科技公司;Ca2+测定试剂盒:北京中生生物工程高技术公司。
1、实验动物分组、模型建立及大脑皮层线粒体(Mit)的制备
取40只Wistar大鼠(♂)随机分为对照组(iv NS)、模型组(iv NS)、尼莫地平组(iv Nim,0.3mg·Kg-1)、羟基红花黄色素A(iv S-A,20mg·Kg-1)。每组10只,结扎双侧颈总动脉造成脑缺血,对照组只作颈总动脉分离手术,各组均于手术前15min iv相应药物,手术后24h再同剂量给药一次,60min后处死动物,迅速取大脑,以冰浴的PBS(10mmol·L-1pH7.4,含250mmol·L-1蔗糖,5mmol·L-1EDTA),冲洗干净,小心剥取大脑皮层,精确称重,并以PBS为介质制备1%匀浆,800rpm低温离心15min,取上清14000rpm离心15min,沉淀即为Mit。再以PBS洗涤二次,Lowrry法进行蛋白定量(4℃操作,-20℃保存)。
脑Mit膜脂流动性的测定:膜脂流动性采用荧光偏振度法测定,取脑Mit悬液1ml(蛋白含量0.5mg·mL-l),加入2μmol·L-1DPH溶液3ml,25℃温浴30min,测定荧光偏振度P,激发波长362nm,发射波长432nm.按下式计算:P=(I-GI⊥)/(I+GI⊥);η=2P/0.46-P式中:I和I⊥分别代表与激发偏振光振动方向平行垂直时的荧光偏振光强度,G为校正因子。膜流动性用荧光偏振度P,微粘度η表示[5]。微粘度越大,膜流动性越小。
脑Mit膜总磷脂(PL)和胆固醇的测定:总PL按Chien法测定[6],CH按文献[7]测定;脑Mit抗氧化酶及MDA含量的测定,采用试剂盒法测定。
脑Mit Ca2+测定:取脑Mit悬液2mL,14000rpm离心15min得沉淀,在沉淀中加入HNO3lmol·L-1,室温振荡24h,1500rim离心10min,取上清适当稀释,原子分光光度计422.7nm测Ca2+(以CaCO3为标准)[8]。
结果
1、脑Mit膜流动性的变化
结果显示,脑缺血可导致Mit膜的流动性显著降低,而羟基红花黄色素A(S-A)可明显抑制Mit膜流动性的降低(表16)。
表16羟基红花黄色素A对脑缺血.大鼠脑Mit膜流动性的影响(
X±S,n=10)
组别 荧光偏振度P 微粘度η
Pa·s
对照组 0.225±0.02 2.09±0.18
模型组 0.344±0.02** 4.31±0.58**
Nim组 0.246±0.03Δ 2.74±0.32Δ
S-A组 0.253±0.02Δ 2.46±0.37Δ
**P<0.01 VS 对照组;ΔP<0.05 VS 模型组
2、脑Mit膜总磷脂(PL)和胆固醇(CH)的变化
结果显示,脑缺血损伤导致Mit膜磷脂层破坏,表现为PL含量降低,CH含量升高,PL/CH数值降低,而S-A对此有明显的拮抗作用。提示S-A能降低膜磷脂的降解(表17)。表17羟基红花黄色素A对脑缺血大鼠脑Mit膜总磷脂(PL)和胆固醇(CH)的影响(
X±
s,n=10)
组别 膜总磷脂 胆固醇 膜总磷脂/胆固醇
mol·g-1Pro mol·g-1Pro
对照组 408.73±45.66 62.45±11.352 6.44±1.06
模型组 287.78±20.81** 92.15±10.54** 2.633±0.08**
Nim组 364.24±25.12Δ 73.78±9.64Δ 4.86±1.21Δ
S-A组 382.36±43.29ΔΔ 70.47±11.47Δ 5.01±1.33Δ
**P<0.01 VS对照组;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01 VS 模型组
3、脑Mit SOD、GSH-Px活性、MDA含量的变化
结果显示,脑缺血损伤可降低脑Mit SOD、GSH-Px活性,升高MDA含量;而S-A可明显抑制SOD、GSH-Px活性的降低、MDA含量的升高,说明S-A有抗氧化活性(表18)。表18羟基红花黄色素A对脑缺血大鼠脑Mit SOD、GSH-Px、MDA的影响(
X±s,n=10)
组别 SOD GSH-Px MDA
nu·mg 1Pro U·mg Pro.min-1 nmol·L 1mg-1Pro
对照组 32.36±5.58 19.64±3.72 11.73±1.82
模型组 15.24±4.46** 10.08±1.13** 28.56±2.66**
Nim组 26.47±6.38ΔΔ 13.26±3.01Δ 17.32±2.01Δ
S-A组 28.16±8.12ΔΔ 15.64±1.86Δ 18.29±1.36Δ
**P<0.01 VS 对照组ΔP<0.05,ΔΔP<0.01 VS 模型组
4、脑Mit Ca2+含量的变化
结果显示,脑缺血可导致Mit Ca2+摄入量增加,而S-A可拮抗Ca2+的摄入,提示S-A可能具Ca2+拮抗剂样作用(表19)。
表19 羟基红花黄色素A对脑缺血大鼠脑Mit Ca2+的影响(
X±s,n=10)
组别 Ca2+(nmol·g-1Pro)
对照组 13.38±1.64
模型组 34.16±5.68**
Nim组 20.39±6.21Δ
Saf-A组 24.57±3.34ΔΔ
**P<0.01 VS对照组;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01 VS 模型组
实验例9、羟基红花黄色素A对大鼠缺血后脑细胞凋亡的影响
1材料与方法
羟基红花黄色素A:由山东省天然药物工程技术研究中心提供(含量为95%);蛋白酶K:由Sigma公司出品;Tunel法试剂盒:南京聚力医学研究所,进口分装;Wistar雄性大鼠40只,200~250g,由陕西省中医药研究院提供。
实验方法:取40只Wistar大鼠(♂)随机分为对照组(iv NS)、模型组(ivNS)、尼莫地平组(iv Nim,0.3mg·Kg-1)、羟基红花黄色素A(iv S-A,20mg·Kg-1)。每组10只,结扎双侧颈总动脉造成脑缺血,对照组只作颈总动脉分离手术,各组均于手术前15min iv相应药物,手术后24h再同剂量给药一次,60min后处死动物,在固定部位取双侧大脑皮质组织,一侧脑皮质组织10%甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,每例切片二张,分别进行HE染色镜检和Tunel法测凋亡细胞数。另一侧皮质匀浆后测DNA片端含量百分率。[3]石蜡切片HE染色脑皮质组织10%甲醛固定,常规石蜡包埋,4μm切片,脱蜡至水后,苏木素染色5min,双蒸水洗片1min,盐酸乙醇分化30s,温水浸泡5min后置伊红液2min,干燥封片,光镜下观察。Tunel法测定细胞凋亡[4]按试剂盒提供方法操作。干燥封片后置显微镜下观察分析被染成蓝紫色的凋亡细胞(灶状分布的阳性细胞是坏死细胞,散在分布的为凋亡细胞),每张切片计数10个不同高倍视野中凋亡细胞数。
DNA片端百分率测定:100g脑皮质组织加入1ml冰冷的的细胞裂解液(含5.0g.L-1 Tritox x-100,1.0g.L-1 EDTA,40mg.L-1蛋白酶K,5mmol.L-1 Tris,pH7.8)制成匀浆液,室温下20min后离心(20000r.min-1,30min),将上清液取出后,在沉淀物中加入细胞裂解液重新使沉淀物悬浮(体积与上清液相等)。用二苯胺试剂在959nm处分别测定上清液片端DNA和沉淀物中高相对分子质量DNA的吸光度,计算片端DNA占高相对分子质量DNA的百分率。
2结果
2.1羟基红花黄色素A(S-A)对脑缺血致脑皮质细胞凋亡的影响
HE染色光镜观察 大鼠双侧CCA结扎24h,其脑组织常规石蜡切片,HE染色后,胞浆呈淡红色,核呈蓝色,其间有单个散在凋亡细胞,表现为细胞萎缩,核固缩,染色质凝集呈致密浓染块状或颗粒状。NS组凋亡细胞数明显多于S-A组。
Tunel法大鼠双侧CCA结扎24h后,脑组织中有凋亡细胞出现,光镜下表现为阳性细胞为淡红色胞浆中有被染成兰紫色的细胞核,而阴性细胞仅见淡红色的胞浆。阳性细胞为散在分布的凋亡细胞。与NS组比较,S-A组缺血后脑细胞凋亡数有显著减少(表20)。
表20羟基红花黄色素A对脑缺血大鼠脑细胞凋亡数的影响(
X±s,n=10)
组别 细胞凋亡数(10个视野)
对照组 2.1±0.5
模型组 48.7±16.8*
Nim组 20.3±12.6ΔΔ
S-A组 23.7±13.4ΔΔ
**P<0.01 VS对照组;ΔΔP<0.01 VS模型组
S-A对脑缺血DNA碎片的影响:结果如表16所示,与正常不缺血大鼠组比较,缺血组脑细胞DNA碎片含量百分率有显著增高,而S-A则能显著降低DNA碎片的百分率。(表21)
表21羟基红花黄色素A对脑缺血大鼠脑细胞凋亡数的影响(
X±s,n=10)
组别 DNA碎片%
对照组 3.9±2.5
模型组 20.6±6.3**
Nim组 10.4±3.6ΔΔ
S-A组 12.7±5.2ΔΔ
**P<0.01 VS对照组;ΔΔP<0.01 VS 模型组
实验例10、羟基红花黄色素-A对犬急性心肌缺血的影响
将实验犬用戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉,气官插管,连接人工呼吸机,开胸,结扎冠脉15分钟后记录各项指标,舌静脉给药,给药180分钟后取出心脏,切片染色,数码相机照相后以计算机计算梗死面积及梗死百分率。结果显示羟基红花黄色素S-A可明显减少结扎冠状动脉引起的心脏梗死面积,尤以6mg/kg给药更为明显。见表22
表22羟基红花黄色素-A对犬心肌缺血面积的影响(n=10.X±SD)
组别 剂量 梗死区/心脏(%) 梗死区/心室(%)
生理盐水 5ml/kg 8.53±3.31 13.81±3.97
心得安 1mg/kg 3.04±1.63※※ 4.60±2.04※
羟基红花黄色素-A 3mg/kg 3.89±0.59※ 7.69±0.53※
羟基红花黄色素-A 6mg/kg 2.27±0.62※※ 4.50±1.11※※
与生理盐水组比较:※P<0.05,※※P<0.01
实验例11、羟基红花黄色素(S-A)对垂体后叶素所致离体大鼠心脏心肌缺血的影响
取体重200±20g的大鼠80只(雌雄各半),随机分为4组。乌拉坦麻醉后,记录II导联与胸前导联心电图。舌静脉注射受试药物后30分钟,再舌静脉注射0.5U垂体后叶素,连续记录给垂体后叶素前及后5分钟内的心电图,出现下列指征之一者为心肌缺血阳性:(1)T波升高1.5mv以上;(2)T波低平(降低原T波高度50%以上);(3)T波双向倒置;(4)S-T水平下移0.5mv;(5)心率不齐。结果显示,与硝酸甘油作用相似,羟基红花黄色素(S-A)可明显降低垂体后叶素所致大鼠心肌缺血的阳性率。(见表23)
表23羟基红花黄色素-A对大鼠心肌缺血的影响(n=20,X±SD)
组别 剂量 心肌缺血阳性率(%)
生理盐水 5ml/kg 80
硝酸甘油 5mg/kg 35※※
羟基红花黄色素-A 3mg/kg 40※
羟基红花黄色素-A 6mg/kg 35※※
与生理盐水组比较:即※P<005,※※P<0.01