CN104513290A

CN104513290A - 雷醇内酯衍生物及其应用

Info

Publication number: CN104513290A
Application number: CN201310463847.9A
Authority: CN
Inventors: 张东明; 陈晓光; 王超; 郎立伟; 李创军; 来芳芳; 牛非
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-10-08
Also published as: CN104513290B

Abstract

本发明公开了雷醇内酯衍生物及其应用。具体而言，如通式(Ι)所示的化合物及其光学异构体和药学上可接受的盐；这类新的雷醇内酯衍生物的制备方法；含有这类雷醇内酯衍生物的药物组合物；以及这类雷醇内酯衍生物在制备抗肿瘤药物上的应用。

Description

雷醇内酯衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及活性天然产物的化学结构改造以及抗肿瘤生物活性研究。具体涉及雷公藤中的活性二萜内酯类成分雷醇内酯(Triptolidenol)衍生物的合成及抗肿瘤生物活性的研究。

技术背景

雷公藤(lei gong teng)Tripterygium wilfordii HooK.F.，是卫矛科(Celastraceae)雷公藤属植物，别名黄藤根、黄药、水莽草、断肠草、南蛇根、旱禾花、黄藤木、红药等，生于背阴多湿稍肥的山坡、山谷、溪边灌木林和次生杂木林中，分布于浙江、安徽、江西、湖南、广东、福建、台湾等地。雷公藤夏、秋季节采集，以根、叶、花及果入药，性凉，味苦、辛，有大毒，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒等功效。主要用于治疗类风湿性关节炎、麻风反应、肺结核等，也用于杀蛆虫、孑孓，灭钉螺，毒鼠。药理研究表明雷公藤具有抗炎、免疫抑制、抗排异、抗肿瘤、抗雄性生育、抗HIV病毒、神经组织保护等作用。化学成分主要有倍半萜多醇酯、倍半萜生物碱、二萜内酯、三萜以及木脂素、环肽等。

目前，以雷公藤根提取物为主要有效成分的雷公藤多苷、雷公藤总萜等药物均已应用于临床，治疗类风湿性关节炎、肾炎、皮肤病，子宫肌瘤、白血病等。研究表明，松香烷型二萜内酯类成分是雷公藤提取物的主要有效成分之一。但是，还未有该类单体成分作为药物应用于临床。

雷醇内酯(Triptolidenol)，又名15-羟基雷公藤甲素，是具有3个三元氧环片断，1个α,β-不饱和五元内酯环的松香烷型二萜，在雷公藤叶中的含量约为万分之一。本发明研究发现雷醇内酯具有较强的肿瘤细胞缺氧诱导因子-1抑制活性，肿瘤细胞毒活性（表1）。文献报道雷醇内酯具有显著的抗炎、免疫抑制以及雄性抗生育活性（表2）。但是，雷醇内酯的毒性也较大，小鼠急性毒性实验显示半数致死量LD₅₀值为3.26mg/kg，严重制约了其在临床上的使用。

表1雷醇内酯的抗肿瘤活性

表2雷醇内酯的抗炎、免疫抑制及抗生育活性

AIA：抗炎活性；ISA：免疫抑制活性；TI：治疗指数；CSF：安全系数；LSD：最低有效剂量；AFA：抗生育活性

本发明通过对雷醇内酯以及雷公藤中活性二萜的构效关系的深入研究，通过一系列的氧化、还原，脱水，酯化等反应对雷醇内酯进行了多个位点的结构改造，得到了一批新型的雷醇内酯衍生物，并通过动物模型、细胞模型以及靶点模型对所得到的衍生物进行了抗肿瘤活性研究，从而完成了本发明。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是，提供一种新的雷醇内酯衍生物。

本发明要解决的第二个技术问题是，提供这类新的雷醇内酯衍生物的制备方法。

本发明要解决的第三个技术问题是，提供含有这类新的雷醇内酯衍生物的药物组合物。

本发明要解决的第四个技术问题是，提供这类新的雷醇内酯衍生物在制备抗肿瘤药物上的应用。

发明概述

本发明所提供的雷醇内酯衍生物是通式(Ι)所示的化合物或其药学上可接受的盐或光学异构体:

R₁表示连接于C-14位上的氢、氧、羟基、卤素、C_1-6烷氧基、C_1-6烷胺基、巯基、C_1-6烷巯基、式-OCOR所示基团、式-OSO₂R所示基团，其中R表示-(CH₂)_nCH₃、-Ar、-CH=CH-Ar、-(CH₂)_nCOONa、-(CH₂)_nCOOK，n为选自0-12的整数，Ar表示五元、六元芳香环。

当C-5和C-6以双键连接时，R₂不存在，R₃表示连接于C-6位上的氢。

当C-5和C-6以单键连接时，R₂和R₃分别表示连接于C-5、C-6位上的氢、氧、羟基、卤素、C_1-6烷氧基、C_1-6烷胺基、巯基、C_1-6烷巯基、式-OCOR所示基团、式-OSO₂R所示基团，R表示-(CH₂)_nCH₃、-Ar、-CH=CH-Ar、-(CH₂)_nCOONa、-(CH₂)_nCOOK，n=0-12，Ar表示五元、六元芳香环。

通式(Ι)中R₁、R₂、R₃分别连接于C-14、C-5、C-6，其立体构型分别包括R或S。

优选的Ar选自苯基。

发明详述

本发明优选的一个方案是通式(Ι)中R₁=β-OH(R)、R₂为α(R)构型、R₃为R或S构型的雷醇内酯衍生物，即通式(Ⅱ)所示化合物：

其中R₂、R₃定义如下：

本发明优选的另一个方案是通式(Ι)中R₁=α-OH(S)、R₂为α(R)构型、R₃为R或S构型的雷醇内酯衍生物，即通式(Ⅲ)所示化合物：

其中R₂、R₃定义如下：

本发明优选的再一个方案是通式(Ι)中R₁=β-OAc(R)、R₂为α(R)构型、R₃为R或S构型的雷醇内酯衍生物，即通式(Ⅳ)所示化合物：

其中R₂、R₃定义如下：

本发明优选的又一个方案是通式(Ι)中R₁=β-O-Cinnamoyl(R)、R₂为α(R)构型、R₃为R或S构型的雷醇内酯衍生物，即通式(Ⅴ)所示化合物：

其中R₂、R₃定义如下：

本发明优选的又一个方案是通式(Ι)中R₁=β-O-4-F-Cinnamoyl(R)、R₂为α(R)构型、R₃为R或S构型的雷醇内酯衍生物，即通式(Ⅵ)所示化合物：

其中R₂、R₃定义如下：

本发明优选的又一个方案是通式(Ι)中R₁=O、R₂为α(R)构型、R₃为R或S构型的雷醇内酯衍生物，即通式(Ⅶ)所示化合物：

其中R₂、R₃定义如下：

本发明优选的还有一个方案是通式(Ι)中C-5、C-6为双键连接，R₁为R或S构型或者R₁=O的雷醇内酯衍生物，即通式(Ⅷ)所示化合物：

其中R₁定义如下：

优选的Ar选自苯基。

本发明所提供雷醇内酯衍生物的制备方法，其合成示意图如下：

本发明以雷醇内酯(Triptolidenol)为原料，通过下图所示的反应路线，得到了雷醇内酯衍生物B1-B13，分别为15-羟基雷公藤内酯酮(B1)、表雷醇内酯(B2)、5α,15-二羟基-雷公藤内酯酮(B3)、5α-羟基表雷醇内酯(B4)、5α-羟基雷醇内酯(B5)、Δ^5,6-脱氢-15-羟基雷公藤内酯酮(B6)、Δ^5,6-脱氢表雷醇内酯(B7)、5α,6α-环氧-15-羟基-雷公藤内酯酮(B8)、14-O-乙酰基-雷醇内酯(B9)、14-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B10)、14-O-桂皮酰基-雷醇内酯(B11)、5α-羟基-14-O-乙酰基-雷醇内酯(B12)、5α-羟基-14-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B13)。

本发明再一方面还涉及以本发明雷醇内酯衍生物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量%。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂（包括真溶液和胶体溶液）、乳剂（包括o/w型、w/o型和复乳）、混悬剂、注射剂（包括水针剂、粉针剂和输液）、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂（包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片）、胶囊剂（包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊）、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气（粉）雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明优选的再一个方案是这类雷醇内酯衍生物或含有它们的药物组合物在治疗肿瘤疾病的应用。

具体实施方法

通过以下具体实施方法将有助于理解本发明，但并不限制于本发明的内容。

雷醇内酯衍生物的合成

实施例115-羟基雷公藤内酯酮(B1)

75mg雷醇内酯(0.2mmol)溶解于10mL无水二氯甲烷中，加入等当量的Dess-Matin氧化剂，加热回流，搅拌4小时，TLC检测，至原料反应完全，停止搅拌，过滤，滤液依次用饱和Na₂S₂O₃水溶液洗，水洗，无水Na₂SO₄干燥，减压蒸干，得淡黄色固体，过硅胶柱层析，环己烷-丙酮(2:1)洗脱，得到产物15-羟基雷公藤内酯酮(B1)，收率为90%。

白色粉末，¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ_H1.31(1H,m,H-1a),1.61(1H,dd,J=12.0,5.0Hz,H-1b),1.99(1H,t,J=14.0Hz,H-2a),2.20(1H,m,H-2b),2.82(1H,m,H-5),2.23(1H,m,H-6a),2.37(1H,brd,J=16.5Hz,H-6b),3.42(1H,d,J=5.5Hz,H-7),4.20(1H,d,J=2.5Hz,H-11),4.06(1H,d,J=2.5Hz,H-12),1.33(3H,s,H-16),1.38(3H,s,H-17),4.67(1H,d,J=17.0Hz,H-19a),4.73(1H,d,J=17.0Hz,H-19b),1.08(3H,s,H-20);¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ_C30.5,17.1,1125.8,159.2,40.6,26.3,55.5,59.2,61.4,35.3,60.5,65.2,66.8,197.3,68.8,23.3,24.5,173.0,69.9,13.8;ESIMS m/z397.0[M+Na]⁺。

实施例2表雷醇内酯(B2)

15mg15-羟基雷公藤内酯酮(B1)(0.04mmol)混悬于3mL甲醇中，冰水浴下，加入6mg(0.16mmol)NaBH₄，搅拌3小时，TLC检测原料反应完全，用稀盐酸调至中性，减压蒸干，丙酮溶解，过滤，滤液减压蒸干，得白色固体，经HPLC分析，主产物明确，与雷醇内酯对照，可以确定B2为异雷醇内酯，经纯化得到5mg表雷醇内酯(B2)，产率为50%。

白色粉末，¹H NMR(CD₃COCD₃,400MHz)δ_H1.35-1.45(2H,m,H-1a,b),1.95(1H,t,J=14.4Hz,H-2a),2.05(1H,m,H-2b),2.77(1H,m,H-5),2.18(1H,m,H-6a),2.32(1H,m,H-6b),3.70(1H,d,J=4.0Hz,H-7),4.79(1H,d,J=4.8Hz,H-11),4.61(1H,d,J=4.8Hz,H-12),1.18(3H,s,H-16),1.42(3H,s,H-17),4.82(2H,m,H-19a,b),1.08(3H,s,H-20);¹³C NMR(CD₃COCD₃,100MHz)δ_C173.0,162.3,124.9,71.9,70.7,67.8,66.7,66.1,62.6,56.7,55.7,54.8,41.2,36.5,30.8,28.1,25.1,23.9,17.8,14.0;ESIMS m/z751.2[2M-H]^-。

实施例35α,15-二羟基-雷公藤内酯酮(B3)

0.1mmol15-羟基雷公藤内酯酮(B1)溶解于10mL1,4-二氧六环中，加入10当量的SeO₂，加热回流，搅拌24小时，仍有少量原料未反应，，反应液过滤，滤液减压蒸干，得到白色固体，用二氯甲烷溶解，依次用饱和Na₂S₂O₃水溶液洗，水洗，饱和NaCl水溶液洗，无水Na₂SO₄干燥，减压蒸干，得淡黄色固体，过硅胶柱层析，环己烷-丙酮(2:1)洗脱，得到产物5α,15-二羟基-雷公藤内酯酮(B3)，收率为58%。

白色粉末，¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)δ_H1.11(1H,m,H-1a),1.85(1H,m,H-1b),2.03(1H,m,H-2a),2.21(1H,m,H-2b),2.13(2H,m,H-6a,b),3.40(1H,d,J=5.4Hz,H-7),4.28(1H,d,J=3.0Hz,H-11),4.14(1H,d,J=3.0Hz,H-12),1.22(3H,s,H-16),1.24(3H,s,H-17),4.90(2H,m,H-19a,b),0.93(3H,s,H-20),4.68(1H,s,15-OH),5.67(1H,s,5-OH);¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)δ_C198.0,173.1,161.9,124.4,69.9,68.7,66.4,66.3,64.3,61.5,58.9,58.4,55.8,39.9,29.7,26.1,25.6,24.2,16.8,16.3;ESIMS m/z429.5[M+K]⁺。

实施例45α-羟基表雷醇内酯(B4)、5α-羟基雷醇内酯(B5)

39mg5α,15-二羟基-雷公藤内酯酮(0.1mmol)溶解于10mL甲醇中，冰水浴下，加入4当量的NaBH₄，搅拌反应3小时，TLC检测，原料基本反应完全，停止搅拌，用稀盐酸调节PH值至中性，减压蒸干，用乙酸乙酯萃取，过滤，滤液减压蒸干，得白色固体，经HPLC纯化，得到5α-羟基表雷醇内酯(B4)、5α-羟基雷醇内酯(B5)，收率分别为31%、50%。

化合物B4白色粉末，¹H NM R(DMSO-d₆,600MHz)δ_H1.03(1H,dd,J=12.0,6.0Hz,H-1a),1.77(1H,m,H-1b),1.97(1H,m,H-2a),2.15(1H,m,H-2b),2.10(2H,m,H-6a,b),3.57(1H,d,J=5.4Hz,H-7),3.72(1H,d,J=3.0Hz,H-11),3.68(1H,d,J=3.0Hz,H-12),4.30(1H,d,J=6.6Hz,H-14),1.14(3H,s,H-16),1.25(3H,s,H-17),4.88(2H,m,H-19a,b),0.99(3H,s,H-20),4.58(1H,s,15-OH),5.35(1H,s,5-OH),5.47(1H,d,J=6.0Hz,14-OH);¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)δ_C173.3,162.9,124.0,69.7,69.6,68.7,66.3,66.1,63.8,62.2,56.4,53.8,53.6,39.5,30.1,27.6,25.8,23.7,16.9,16.2;ESIMS m/z430.9[M+K]⁺。

化合物B5白色粉末，¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)δ_H1.04(1H,dd,J=12.0,6.0Hz,H-1a),1.77(1H,m,H-1b),2.00(1H,m,H-2a),2.09(1H,m,H-2b),2.09-2.17(2H,m,H-6a,b),3.34(1H,d,J=5.4Hz,H-7),3.77(1H,d,J=2.4Hz,H-11),3.63(1H,d,J=2.4Hz,H-12),3.54(1H,d,J=6.6Hz,H-14),1.13(3H,s,H-16),1.16(3H,s,H-17),4.87(2H,m,H-19a,b),0.98(3H,s,H-20),4.27(1H,s,15-OH),4.67(1H,d,J=6.6Hz,14-OH),5.31(1H,s,5-OH);¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)δ_C173.3,162.7,124.2,71.2,69.7,69.4,68.7,64.1,62.7,61.7,58.9,55.7,53.0,40.0,30.4,27.0,25.9,23.1,16.8,16.3;ESIMS m/z414.9[M+Na]⁺。

实施例5Δ^5,6-脱氢-15-羟基雷公藤内酯酮(B6)

15mg5α,15-二羟基-雷公藤内酯酮(B3)(0.038mmol)加入4mL无水二氯甲烷，2mL吡啶，搅拌溶解，滴加100μL三氟乙酸酐，室温搅拌10小时，TLC检测原料点消失，停止搅拌，加入5mL二氯甲烷稀释，依次用稀盐酸洗去吡啶，饱和NaHCO3水液洗，饱和NaCl水液洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，得淡黄色固体，HPLC分析，以55%甲醇-水制备纯化，得到目标产物Δ^5,6-脱氢-15-羟基雷公藤内酯酮(B6)，收率约为40%。

白色粉末，¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ_H1.52(2H,m,H-1a,b),2.34(1H,m,H-2a),2.48(1H,m,H-2b),3.49(1H,d,J=3.6Hz,H-5),6.02(1H,d,J=3.6Hz,H-6),4.21(1H,d,J=2.8Hz,H-11),4.03(1H,d,J=2.8Hz,H-12),1.36(3H,s,H-16),1.40(3H,s,H-16),4.91(2H,m,H-19a,b),1.33(3H,s,H-20).¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)δ_C196.5,172.6,152.3,141.2,127.9,119.7,68.8,68.7,66.6,65.4,64.9,59.8,56.0,55.6,37.1,30.3,26.2,24.5,22.8,17.1;ESIMS m/z767.3[2M+Na]⁺.

实施例6Δ^5,6-脱氢表雷醇内酯(B7)

15mgΔ^5,6-脱氢-15-羟基雷公藤内酯酮(B6)(0.04mmol)溶解于2mL甲醇中，冰水浴下，加入6mg(0.16mmol)NaBH4，搅拌3小时，TLC检测原料反应完全，用稀盐酸调PH值至中性，减压蒸干，用丙酮溶解，过滤，滤液减压蒸干，得白色粉末，经HPLC分析，确定目标产物，纯化后得到Δ^5,6-脱氢表雷醇内酯(B7)，收率较低，约为30%。

白色粉末，¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ_H1.41-1.53(2H,m,H-1a,b),2.30(2H,m,H-2a,b),6.32(1H,d,J=4.0Hz,H-6),3.74(1H,d,J=4.4Hz,H-7),4.87(1H,d,J=4.0Hz,H-11),4.74(1H,d,J=4.0Hz,H-12),3.89(1H,d,J=3.2Hz,H-14),1.30(3H,s,H-16),1.44(3H,s,H-17),5.09(1H,m,H-19a),4.91(1H,m,H-19b),1.21(3H,s,H-20);ESIMS m/z413.4[M+K]⁺。

实施例75α,6α-环氧-15-羟基-雷公藤内酯酮(B8)

49mgΔ^5,6-脱氢-15-羟基雷公藤内酯酮(B6)(0.13mmol)溶解于5mL无水二氯甲烷中，加入68mg75%间氯过氧苯甲酸(mCPBA,0.39mmol)，加热回流，搅拌6小时，TLC检测原料反应完全，停止搅拌，用二氯甲烷稀释，依次用饱和NaHCO3水液、饱和NaCl水液洗，无水NaSO4干燥，减压蒸干，白色粉末，经HPLC分析，以45%甲醇-水纯化，得到5α,6α-环氧-15-羟基-雷公藤内酯酮(B8)20mg，收率为39.5%。

白色粉末，¹H NMR(CD₃COCD₃,400MHz)δ_H1.53(1H,m,H-1a),1.77(1H,m,H-1b),2.42(1H,m,H-2a),2.33(1H,m,H-2b),4.19(1H,d,J=2.4Hz,H-6),3.79(1H,d,J=2.4Hz,H-7),4.34(1H,d,J=2.8Hz,H-11),4.18(1H,d,J=2.84Hz,H-12),1.30(3H,s,H-16),1.32(3H,s,H-17),4.88(1H,m,H-19a),4.68(1H,m,H-19b),1.28(3H,s,H-20);¹³C NMR(CD₃COCD₃,100MHz)δ_C196.8,172.4,155.6,133.8,68.8,68.2,67.9,64.3,63.7,60.9,60.4,59.0,57.5,56.5,37.1,30.6,28.3,25.9,18.0,17.8.

实施例814-O-乙酰基-雷醇内酯(B9)

30mg雷醇内酯溶解于2mL吡啶、2mL乙酸酐中，室温搅拌6小时，加入二氯甲烷稀释，用稀盐酸洗去吡啶，无水NaSO4干燥，减压蒸干，得黄色油状物，经Rp C-18柱层析40%甲醇-水系统洗脱，得到30mg白色粉末，即为14-O-乙酰基-雷醇内酯(B9)，收率为90%。

白色粉末，¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ_H1.24(1H,m,H-1a),1.58(1H,m,H-1b),1.93(1H,m,H-2a),2.15(1H,m,H-2b),2.69(1H,brd,J=13.5Hz,H-5),2.32(1H,m,H-6a),1.86(1H,m,H-6b),3.49(1H,d,J=5.7Hz,H-7),3.87(1H,d,J=3.0Hz,H-11),3.82(1H,d,J=3.0Hz,H-12),5.14(1H,s,H-14),1.24(6H,s,H-16,17),4.68(2H,m,H-19a,b),1.07(3H,s,H-20),2.18(3H,s,14-Ac);¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)δ_C173.1,170.2,159.7,125.7,70.2,69.9,69.1,64.1,63.6,61.3,60.2,54.7,54.2,40.4,35.7,29.9,26.2,26.0,23.5,21.1,17.1,13.7;ESIMS m/z441.1[M+Na]⁺。

实施例914-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B10)

45mg雷醇内酯(0.12mmol)与220mg(1.2mmol)4-氟桂皮酰氯，溶解于10mL无水二氯甲烷中，加入1mL无水吡啶，室温搅拌20小时，TLC检测，原料反应完全，停止搅拌，用稀盐酸洗去吡啶，饱和NaHCO3水溶液调至中性，饱和NaCl水溶液洗，无水NaSO₄干燥，减压蒸干，得到白色粉末，用硅胶柱层析（环己烷-丙酮5:1）纯化，得到38mg白色粉末，即14-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B10)，收率为59%。

白色粉末，¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ_H1.26(2H,m,H-1a,b),1.92(1H,t,J=14.0Hz,H-2a),2.33(1H,m,H-2b),2.71(1H,d,J=13.2Hz,H-6),2.19(2H,m,H-6a,b),3.55(1H,d,J=5.2Hz,H-7),3.91(1H,d,J=3.2Hz,H-11),3.86(1H,d,J=3.2Hz,H-12),5.28(1H,s,H-14),1.25(3H,s,H-16),1.29(3H,s,H-17),4.68(2H,m,H-19a,b),1.07(3H,s,H-20),7.57(2H,m,H-3′,5′),7.40(3H,m,H-2′,4′,6′),7.82(1H,d,J=16.0Hz,H-7′),6.54(1H,d,J=16.0Hz,H-8′);ESIMS m/z529.2[M+Na]⁺。

实施例1014-O-桂皮酰基-雷醇内酯(B11)

取10mg雷醇内酯与10当量的桂皮酰氯，溶解于10mL无水二氯甲烷中，加入1mL吡啶，室温搅拌8小时，TLC检测，原料反应完全，用稀盐酸洗去吡啶，依次用饱和NaHCO₃水液、饱和NaCl水液洗涤，无水NaSO₄干燥，减压蒸干，硅胶柱层析（环己烷-丙酮5:1）纯化，得到白色粉末24mg，收率90%，即为14-O-桂皮酰基-雷醇内酯(B11)。

白色粉末，¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ_H1.60(2H,m,H-1a,b),1.92(1H,t,J=14.4Hz,H-2a),2.19(1H,m,H-2b),2.72(1H,brd,J=12.4Hz,H-5),2.19(1H,m,H-6a),2.34(1H,m,H-6b),3.55(1H,d,J=5.2Hz,H-7),3.91(1H,s,H-12),3.87(1H,s,H-12),5.27(1H,s,H-14),1.25(3H,s,H-16),1.29(3H,s,H-17),4.68(2H,m,H-19a,b),1.07(3H,s,H-20),7.08,7.10(each1H,d,J=8.4Hz,H-2′,6′),7.56(2H,m,H-3′,5′),7.77(1H,d,J=16.0Hz,H-7′),6.63(1H,d,J=16.0Hz,H-8′);ESIMS m/z547.2[M+Na]⁺。

实施例115α-羟基-14-O-乙酰基-雷醇内酯(B12)

20mg14-O-乙酰基-雷醇内酯(B9)溶解于5mL1,4-二氧六环中，加入110mgSeO₂(1mmol)，加热回流，搅拌16小时，经TLC检测仍有少量原料未反应，停止搅拌，反应液过滤，滤液减压蒸干，得到白色固体，用二氯甲烷溶解，依次用饱和Na₂S₂O₃水溶液洗，水洗，饱和NaCl水溶液洗，无水Na₂SO₄干燥，减压蒸干，得淡黄色固体，过硅胶柱层析，环己烷-丙酮(3:1)洗脱，得到产物5α-羟基-14-O-乙酰基-雷醇内酯(B12)，收率为43%。

白色粉末，¹H NMR(CD₃COCD₃,500MHz)δ_H1.20-1.25(2H,m,H-1a,b),1.91(1H,m,H-2a),2.09(1H,m,H-2b),2.05(1H,m,H-6a),2.20(1H,m,H-6b),3.46(1H,t,J=2.5Hz,H-7),3.90(1H,d,J=3.0Hz,H-11),3.76(1H,d,J=3.0Hz,H-12),5.22(1H,s,H-14),1.14(3H,s,H-16),1.21(3H,s,H-17),4.86(1H,m,H-19a),4.93(1H,m,H-19b),1.09(3H,s,H-20),2.05(3H,s,Ac);ESIMS m/z457.2[M+Na]⁺。

实施例125α-羟基-14-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B13)

10mg14-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B10)溶解于5mL1,4-二氧六环中，加入10当量的SeO₂，加热回流，搅拌24小时，TLC检测，至原料反应完全，减压蒸干，用甲醇及二氯甲烷溶解，滤掉不溶物，经制备液相纯化，得到5α-羟基-14-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B13)，收率为58.3%。

白色粉末，¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)δ_H1.06(1H,dd,J=12.6,5.4Hz,H-1a),1.79(1H,m,H-1b),1.98(1H,m,H-2a),2.11(1H,m,H-2b),2.10-2.14(2H,m,H-6a,b),3.50(1H,d,m,H-7),3.85(1H,d,J=2.4Hz,H-11),3.71(1H,d,J=2.4Hz,H-12),5.28(1H,s,H-14),1.01(3H,s,H-16),1.14(3H,s,H-17),4.88(2H,m,H-19a,b),0.93(3H,s,H-20),4.52(1H,s,15-OH),5.43(1H,s,5-OH),7.25,7.26(each1H,d,J=9.0Hz,H-2′,6′),7.82,7.83(each1H,d,J=9.0Hz,H-3′,5′),7.65(1H,d,J=16.2Hz,H-7′),6.60(1H,d,J=16.2Hz,H-8′);¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)δ_C173.2,165.0,164.1,162.5,143.9,130.9,130.8,130.6,124.2,118.1,116.0,115.9,70.2,69.6,68.9,68.7,63.0,62.0,60.6,59.8,55.4,53.2,40.0,30.1,26.7,26.6,23.4,16.8,16.4;ESIMSm/z563.2[M+Na]⁺。

药理实验

实验例1本发明化合物对肿瘤细胞缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的抑制活性

本发明抗肿瘤活性研究所涉及的靶点为缺氧诱导因子-1(Hypoxia induciblefactor-1,HIF-1)，是肿瘤缺氧最为相关的核转录调控因子。HIF-1由120KD的α亚单位(HIF-lα)和91KD的β亚单位(HIF-1β)组成，HIFα/β二聚体与p300/CBP等结合到缺氧应答元件（HRE）上，可诱导激活超过70种基因的转录。HIF-1调控下游基因表达产物大多对肿瘤发生发展密切相关，如VEGF、Glut1、Cyclin、TGF-α、MMP2及P-gp等。HIF-1β在细胞内稳定存在，HIF-1α在氧气参与下其氧依赖降解区域（ODD）通过泛素化被蛋白酶体迅速降解，缺氧条件下使得HIF-1α含量迅速增高，稳定的HIF-1α在核内与β二聚化后结合p300/CBP等启动下游基因转录。研究显示抑制HIF-1后可导致肿瘤细胞代谢紊乱，凋亡发生，新生血管的生成抑制，肿瘤生长进程的延缓。正常组织内HIF-1α因翻译后被及时降解，特异性的HIF-1抑制剂将对肿瘤组织特别是缺氧肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，可以单独或联合细胞毒类等药物应用，对彻底杀灭肿瘤细胞、提高肿瘤患者的预后具有重要意义。

U251-HRE和U251-pGL3细胞株用含10%FBS，penicillin(100U·mL^-1)，streptomycin(100mg·L^-1)的RPMI-1640进行培养。U251-HRE和U251-pGL3细胞分别接种于96孔细胞培养板，1×10⁴个/孔，21%O₂，5%CO₂培养24小时。加入不同浓度的待测化合物，30min后在低氧（1%O₂，5%CO₂）或常氧条件（1%O₂，5%CO₂）继续培养20小时，弃去培养液，加入100μL Steady-Glo荧光素酶分析系统底物液，2min后将液体转入96孔Costar白板，检测相对荧光强度(RLU)。按一下公式计算抑制率，

抑制率=(RLU_对照组-RLU_给药组)/RLU_对照组×100%。

研究结果显示B10、B11具有非常显著的HIF-1抑制活性IC₅₀分别为5.5×10^-8mol/L、3.13×10^-7mol/L，具体结果见表3。

实验例2本发明所提供化合物的肿瘤细胞毒活性

5种人肿瘤细胞株：BGC-823（人胃癌细胞）、A2780（人卵巢癌细胞）、A549（人肺腺癌细胞）、HCT-8（人结肠癌细胞）、Bel-7402（人肝癌细胞）

采用含有10%牛胎血清、100U/mL青霉素和100mg/L的RRMI1640培养基，将细胞在37℃、5%CO₂饱和湿度培养箱中传代培养，实验选用对数生长周期细胞。取对数生长期细胞，消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1×10⁴cell/mL，接种于96孔培养板中，100μL/孔。每一样品设4-5个浓度级别，然后在实验孔中加入100μL不同浓度级别样品的培养基，每一浓度级别平行3孔。对照组加入等体积溶剂。将96孔培养板置于37℃、5%CO₂饱和湿度培养箱中培养96小时后，弃去培养液，每孔加入新鲜配制的含0.20mg/mL MTT的无血清培养基，37℃下继续培养4小时后，离心，除去上清液。每孔加入150μL DMSO溶解formazan沉淀，置微量振荡5分钟，使其充分溶解。在BIORAD550型酶标仪上测定570nm处的光密度值。按下列公式计算肿瘤细胞生长抑制率，再以药物浓度对肿瘤细胞生成抑制率作图，得到计量曲线，从曲线上读取药物的半数抑制浓度(IC₅₀)值。

肿瘤细胞生长抑制率(%)=（1-实验孔测定值/对照孔测定值）×100%

研究结果表明除了B3、B12外，其它衍生物均表现出了显著的肿瘤细胞毒活性，尤以B11针对5种肿瘤细胞的抑制活性最强，IC₅₀均小于1.0×10^-7mol/L，具体结果见表3。

表3雷醇内酯衍生物B1-B13HIF-1抑制活性及肿瘤细胞毒活性评价

实验例35α-羟基-14-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B13)针对小鼠黑色素瘤的抗肿瘤药效学实验

5α-羟基-14-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B13)是雷醇内酯C-5位氧化、14-羟基酯化后的衍生物，结构较为新颖，具有本发明所提供衍生物的综合特点。结合上述活性评价结果，本发明选择了B13进行小鼠黑色素瘤的抗肿瘤药效学实验，结果显示B13对黑色素瘤具有较强的抑制作用，1.5mg/kg剂量组达到了50.35%的抑瘤率，具体结果见表4。

表4B13对小鼠黑色素瘤B16的抗肿瘤药效学实验

**P<0.01,***P<0.001,与阴性对照组比较。

Claims

1.如通式(Ι)所示的化合物及其光学异构体和药学上可接受的盐:

R₁表示连接于C-14位上的氢、氧、羟基、卤素、C_1-6烷氧基、C_1-6烷胺基、巯基、C_1-6烷巯基、式-OCOR所示基团、式-OSO₂R所示基团，其中R表示-(CH₂)_nCH₃、-Ar、-CH=CH-Ar、-(CH₂)_nCOONa、-(CH₂)_nCOOK，n为选自0-12的整数，Ar表示五元、六元芳香环；

当C-5和C-6以双键连接时，R₂不存在，R₃表示连接于C-6位上的氢；

当C-5和C-6以单键连接时，R₂和R₃分别表示连接于C-5、C-6位上的氢、氧、羟基、卤素、C_1-6烷氧基、C_1-6烷胺基、巯基、C_1-6烷巯基、式-OCOR所示基团、式-OSO₂R所示基团，R表示-(CH₂)_nCH₃、-Ar、-CH=CH-Ar、-(CH₂)_nCOONa、-(CH₂)_nCOOK，n=0-12，Ar表示五元、六元芳香环；

2.根据权利要求1的化合物及其光学异构体和药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物如通式(Ⅱ)所示：

其中R₂、R₃定义如下：

3.根据权利要求1的化合物及其光学异构体和药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物如通式(Ⅲ)所示：

其中R₂、R₃定义如下：

4.根据权利要求1的化合物及其光学异构体和药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物如通式(Ⅳ)所示：

其中R₂、R₃定义如下：

5.根据权利要求1的化合物及其光学异构体和药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物如通式(Ⅴ)所示：

其中R₂、R₃定义如下：

6.根据权利要求1的化合物及其光学异构体和药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物如通式(Ⅵ)所示：

其中R₂、R₃定义如下：

7.根据权利要求1的化合物及其光学异构体和药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物如通式(Ⅶ)所示：

其中R₂、R₃定义如下：

8.根据权利要求1的化合物及其光学异构体和药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物如通式(Ⅷ)所示：

其中R₁定义如下：

9.根据权利要求1-8中任一项的化合物及其光学异构体和药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物选自：

15-羟基雷公藤内酯酮(B1)、

表雷醇内酯(B2)、

5α,15-二羟基-雷公藤内酯酮(B3)、

5α-羟基表雷醇内酯(B4)、

5α-羟基雷醇内酯(B5)、

Δ^5,6-脱氢-15-羟基雷公藤内酯酮(B6)、

Δ^5,6-脱氢表雷醇内酯(B7)、

5α,6α-环氧-15-羟基-雷公藤内酯酮(B8)、

14-O-乙酰基-雷醇内酯(B9)、

14-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B10)、

14-O-桂皮酰基-雷醇内酯(B11)、

5α-羟基-14-O-乙酰基-雷醇内酯(B12)、

5α-羟基-14-O-(4-氟桂皮酰基)-雷醇内酯(B13)。

10.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1-9中任一项的化合物和制药学上可接受的载体。

11.权利要求1-9中任一项的化合物在制备抗肿瘤药物上的应用。