JP4290119B2

JP4290119B2 - 紅豆杉由来リグナン類を含む血糖降下剤、肝臓保護薬、抗ガン剤

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Publication number: JP4290119B2
Application number: JP2004522787A
Authority: JP
Inventors: 重利門田; 高寛信川
Original assignee: 株式会社紅豆杉
Priority date: 2002-07-24
Filing date: 2003-07-23
Publication date: 2009-07-01
Anticipated expiration: 2023-07-23
Also published as: KR20060086458A; KR100639273B1; CN100350902C; KR100625138B1; KR20050025641A; HK1075213A1; US20080146659A1; JPWO2004009065A1; US20060035964A1; CN1665493A; AU2003248097A1; WO2004009065A1

Description

本発明は、リグナン類化合物を含む医薬、特に血糖降下剤、肝臓保護薬、抗ガン剤に関するものである。

真性糖尿病は炭化水素、脂質、及びタンパク質の代謝障害である。世界中の約１０％の人々が真性糖尿病を発症しているとの報告もある。糖尿病に対して、インシュリンや様々な副作用を伴ういくつかの血糖降下剤を除いてほかに有効な薬剤は依然として現れていない。
また、肝臓は自然治癒力が強く少々の障害では表立った症状が表れないことから「沈黙の臓器」とも呼ばれ、物質代謝、血糖の調節、解毒、胆汁循環の調節、栄養素の貯蔵等、人の生命の維持に不可欠な機能を担っている。肝機能障害の病因、病態は多種多様であるが、治療薬の開発が最も求められているのは医療ニーズの高い慢性活動性肝炎である。本疾患を標的として肝保護薬をはじめ原因療法としての抗ウイルス剤や免疫調節薬など治療薬の研究が行われている。
さらに、抗ガン剤は現在約６０知られていて、約４０が臨床に使用されている。にもかかわらず、ガンは人の死亡原因の上位にあり、新たな医薬の開発が待たれている。
一方、中国雲南省の高山地帯などに生息している常緑樹木である紅豆杉（学名Ｔａｘｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）は、消炎、利尿、血圧降下、血中脂質減少などに効果のある薬用植物として知られている。また、紅豆杉の植物体には抗ガン剤であるパクリタキセル（タキソール）が含まれていることが確認されている。
このような薬効に着目して、特開平１０−１２０５８２には紅豆杉の幹部を粉砕した樹木茶が開示されている。また、特開２０００−２３６８３５、特開２０００−２３６８３６には、紅豆杉の幹の粉砕物と、特定の薬用植物を混合した食品が開示されている。
そして、中国政府が、近年、日本とアメリカ合衆国向けに、限定的な紅豆杉の輸出を許可したこともあり、紅豆杉の成分と薬理作用の研究が進みつつある。
本発明の目的は、紅豆杉に含まれる成分について未知の生物活性を見出し、当該活性に基づく当該成分の新規医薬用途を提供することである。また、本発明の目的は、紅豆杉の抽出画分についての新規医薬用途を提供することである。

本発明の発明者は、紅豆杉に含まれるリグナン類化合物が、インビトロ・インビボにおいて生物活性を示すことを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、式（１）

（式中Ｒ^１は水素または水酸基、Ｒ^２は炭素数１〜４のアルキルオキシ基または水酸基、Ｒ^３は炭素数１〜４のアルキルオキシ基を表す）
で示される化合物、または式（１）化合物の医学的に許容される塩またはエステルを有効成分とする医薬である。
また、本発明は、式（２）

（式中Ｒ^４、Ｒ^５は炭素数１〜４のアルキルオキシ基を表す）
で示される化合物、または式（２）化合物の医学的に許容される塩またはエステルを有効成分とする医薬である。
さらに、本発明は、式（３）

（式中Ｒ^６は炭素数１〜４のアルキルオキシ基を表す）
で示される化合物、または式（３）化合物の医学的に許容される塩またはエステルを有効成分とする医薬である。
本発明の１の実施態様において、請求の範囲第１項記載の医薬は、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする。
本発明の他の実施態様において、請求の範囲第２項記載の医薬は、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする。
本発明の更なる他の実施態様において、請求の範囲第３項記載の医薬は、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする。
本発明においてエステルとは、式（１）、式（２）、式（３）中のメチロール基（ＣＨ_２ＯＨ）の水酸基が有機酸または無機酸と結合し、水分子が脱離した化合物を意味する。式（２）、式（３）の化合物においては、一分子中にメチロール基が２つあり、その一方のみがエステル化されてもよく、また、両者がエステル化されてもよい。医学的に許容されるエステルは、医学・薬学の分野で公知のものが制限なく使用できる。例えば、有機酸として酢酸、無機酸としてリン酸が使用できる。
塩は、無機及び有機の塩基から誘導されるいかなる塩でもよく、化合物中のフェノール基がフェノキシドイオン（ｐｈｅｎｏｘｉｄｅｉｏｎ）基となる塩及び／またはメチロール基がメチロキシドイオン（ｍｅｔｈｙｌｏｘｉｄｅｉｏｎ）基となる塩を含む。医学的に許容される塩は、医学・薬学の分野で公知のものが制限なく使用できる。例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アミンの塩が使用出来る。
さらに本発明は、紅豆杉の植物体を水で抽出し、得られた水抽出物を有機溶媒により抽出して得られる抽出物を有効成分とする医薬である。
本発明の好ましい実施態様にあっては、請求の範囲第７項記載の医薬は、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤であることを特徴とする。
本発明において血糖値降下剤とは、糖尿病の治療・予防に用いる薬剤を、また、肝臓保護薬とは、肝臓機能の回復、保全に用いる薬剤を、さらに、抗ガン剤とは、ガンの治療・予防・再発防止に用いる薬剤を意味する。
式（１）の化合物において、Ｒ^１がＨ、Ｒ^２がＯＨ、Ｒ^３がＣＨ_３Ｏであるとき、すなわち式（４）

の化合物はタキシレシノール（Ｔａｘｉｒｅｓｉｎｏｌ）（以下ＴＡＸという）である。
式（１）の化合物において、Ｒ^１がＯＨ、Ｒ^２がＣＨ_３Ｏ、Ｒ^３がＣＨ_３Ｏであるとき、すなわち式（５）

の化合物は（７’Ｒ）−７’−ヒドロキシラリシレシノール（（７’Ｒ）−７’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）（以下ＨＹＬという）である。
式（２）の化合物において、Ｒ^４がＣＨ_３Ｏ、Ｒ^５がＣＨ_３Ｏであるとき、すなわち式（６）

の化合物はセコイソラリシレシノール（Ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）（以下ＳＩＬと記す）である。
式（３）の化合物において、Ｒ^６がＣＨ_３Ｏであるとき、すなわち式（７）

の化合物はイソタキシレシノール（Ｉｓｏｔａｘｉｒｅｓｉｎｏｌ）（以下ＩＴＸと記す）である。
ＴＡＸ、ＨＹＬ、ＳＩＬ、ＩＴＸは紅豆杉の植物体（葉、樹皮、材部、芯部、根など）に含まれており、次のようにして抽出、単離することができる。まず、植物体を熱水抽出し水抽出物を得る。次に、その水抽出物を有機溶媒（例えば酢酸エチル）で抽出し有機溶媒画分を得る。さらに、その有機溶媒画分からクロマトグラフィー（カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなど）を用いてこれら化合物を単離する。
さらに、これら化合物から有機合成により、式（１）、式（２）、式（３）の化合物を合成することが出来る。
ＴＡＸのメトキシ基（ＣＨ_３Ｏ）は、エトキシ基（Ｃ_２Ｈ_５Ｏ）、プロピオキシ基（Ｃ_３Ｈ_７Ｏ）、ブチロキシ基（Ｃ_４Ｈ_９Ｏ）に置換されても良い。ＨＹＬの２つのメトキシ基は、各々がエトキシ基、プロピオキシ基、ブチロキシ基に置換されても良く、また、２つのアルキルオキシ基は同一でも良く、異なっていても良い。ＳＩＬの２つのメトキシ基は、各々がエトキシ基、プロピオキシ基、ブチロキシ基に置換されても良く、また、２つのアルキルオキシ基は同一でも良く、異なっていても良い。ＩＴＸのメトキシ基は、エトキシ基、プロピオキシ基、ブチロキシ基に置換されても良い。
本発明にかかる紅豆杉の水抽出物の有機溶媒抽出物を得るには、まず、紅豆杉の植物体（葉、樹皮、材部、芯部、根など）を水で抽出し水抽出液を得る。植物体として材部と樹皮（あわせて木部という）を使用することが好ましい。水抽出は、熱水抽出とすることが好ましい。抽出操作のより具体的な一実施態様は、例えば、植物体粉砕物と、当該粉砕物の約２倍から２０倍量の純水を混合（植物体粉砕物１ｋｇに対し純水２Ｌから２０Ｌ）し、室温又は加熱下、好ましくは加熱下、より好ましくは１００℃で、１分〜２時間、好ましくは２０分〜１時間抽出し、濾過または遠心分離により、上清を回収する方法が挙げられる。
次に、その水抽出液を有機溶媒で抽出し有機溶媒抽出液を得る。抽出前に水抽出液を減圧濃縮などにより減容してもよい。また、水抽出液に無機塩を溶解させた後に、有機溶媒で抽出してもよい。有機溶媒としては、水溶液から化合物を抽出する場合に、通常用いられる有機溶媒を使用することが出来、例えば、酢酸エチル、アルコール類、エーテル類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類（ベンゼン、トルエンなど）、ピリジンなどが使用できる。好ましい有機溶媒は極性を有するものであり、例えば分子内に酸素原子、窒素原子を有する有機溶媒であり、もっとも好ましくは酢酸エチル、ジエチルエーテルである。続いて、定法に従い、有機溶媒抽出液から有機溶媒を除去し、有機溶媒抽出物を得る。
本発明にかかる医薬は経口、非経口、又は経皮投与することができる。投与形態は、通常医薬の投与に用いられる形態が制限なく使用可能であり、例えば錠剤もしくは被覆錠、カプセル、溶液、シロップ、粉末、座薬が挙げられる。
錠剤は化合物または抽出物を、賦形剤（乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなど）、崩壊剤（コーンスターチ、アルギン酸など）、結合剤（スターチ、ゼラチンなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）および／または遅延放出を与える剤（カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルアルコールなど）を混合することにより製造できる。錠剤はいくつかの層からなっていてもよい。
被覆錠は錠剤と同様にして製造した芯を錠剤被覆に通常用いられる物質、例えばコリドン（ｃｏｌｌｉｄｏｎｅ）、シェラック（ｓｈｅｌｌａｃ）、アラビアゴム、タルク、二酸化チタン、ショ糖などで被覆することにより製造できる。遅延放出を得るべく芯はいくつかの層からなっていてもよく、また錠剤についての上記賦形剤を用いることができる。
液剤、シロップの剤型にするには、リグナン類化合物に、水、糖類（エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ショ糖、トレハロース、マルトース、フラクトース、ソルビット、蜂蜜など）、防腐剤（パラベンなど）、各種香料、着色料、油類（大豆油など）を適宜添加、混合して調製することができる。
本発明にかかる医薬を含有するカプセルは、化合物または抽出物をゼラチンカプセルに封入し、または、化合物または抽出物と例えばラクトース、ソルビトールなどの不活性担体を混合し、混合物をゼラチンカプセルに封入、またはゼラチン膜で被包成形して製造することができる。
本発明に係る化合物または抽出物の投与量は、通常、１ｍｇ〜１０００ｍｇ／人／日である。しかしながら、最初に少量を投与し、次いで、意図した効果が達成されるまで増量することにより、適当な投与量を決定することも意図されている。
本リグナン類は、従来から安全に摂取されている薬用植物である紅豆杉の成分であり、安全な物質である。
本発明により様々な疾病治療や健康増進に有用な新規な医薬を得ることができる。特に、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤として有用な医薬を得ることができる。

第１図は、紅豆杉木部からの成分の抽出・分画過程の説明図である。
第２図は、ラットを用いたＳＩＬの血糖値降下作用の試験結果を示すグラフであり、第３図は、ラットを用いたＩＴＸの血糖値降下作用の試験結果を示すグラフである。
第４図は、ＴＡＸ、ＨＹＬ投与マウス血清中のアミノ基転移酵素量の測定結果を示すグラフであり、第５図は、ＳＩＬ、ＩＴＸ投与マウス血清中のアミノ基転移酵素量の測定結果を示すグラフであり、第６図は、酢酸エチル可溶画分投与マウス血清中のアミノ基転移酵素量の測定結果を示すグラフである。
第７図は、ＴＡＸ、ＨＹＬ投与マウス血清中のＴＮＦ−αの測定結果を示すグラフであり、第８図は、ＳＩＬ、ＩＴＸ投与マウス血清中のＴＮＦ−αの測定結果を示すグラフである。
第９図は、培養肝細胞死に対する、ＴＡＸ、ＨＹＬの抑制活性測定結果を示すグラフであり、第１０図は、培養肝細胞死に対するＳＩＬ、ＩＴＸの抑制活性測定結果を示すグラフである。

符号の説明

ＴＡＸタキシレシノール（Ｔａｘｉｒｅｓｉｎｏｌ）
ＨＹＬ（７’Ｒ）−７’−ヒドロキシラリシレシノール（（７’Ｒ）−７’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）
ＳＩＬセコイソラリシレシノール（Ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）
ＩＴＸイソタキシレシノール（Ｉｓｏｔａｘｉｒｅｓｉｎｏｌ）
ＳＩシリマリン（Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）

以下に実施例により本発明をさらに説明する。この発明の実施例に記載されている原材料、化合物の抽出法などは、この発明の範囲をそれらのみに限定する趣旨のものではなく、単なる説明例にすぎない。
（単離）
紅豆杉の材部及び樹皮（合わせて木部）を粉砕機で粉砕し、３０メッシュパスの粉末を得た。この粉末を乾燥した。乾燥粉末８５０ｇを４Ｌの純水で４５分間還流抽出した。濾過後、残渣に４Ｌの純水を加えて４５分間還流抽出した。さらに同じ還流抽出操作を１回繰り返した。３回の水抽出液を合わせて減圧濃縮し、水抽出物５２．５ｇを得た。
次に、水抽出物５２．５ｇを５００ｍＬの酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を分離した。分離後、残渣に５００ｍＬの酢酸エチルを加えて抽出した。さらに同じ抽出操作を１回繰り返した。３回の抽出操作で得た酢酸エチル層を合わせて減圧濃縮し、酢酸エチル画分３４．１ｇを得た。
続いて、シリカゲルカラム（内径３．５ｃｍ、長さ６０ｃｍ、充填物：Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０（ナカライテスク株式会社）に前記酢酸エチル画分３４．１ｇを添加し、クロロホルムにメタノールを添加した溶媒を使用して、溶出操作を行い５００ｍＬ毎の９画分を得た。溶媒の組成と、各画分液体を減圧濃縮して得た流出物の重量、画分中に含まれる成分を表１に示した。

第５画分の溶出溶液を減圧濃縮後に、結晶化したＳＩＬ（８４０ｍｇ）を得た。続いて、その残渣を分取薄層クロマトグラフィーにより分離した。薄層板はＫｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ２５４厚さ０．５ｍｍ（メルク社）を使用し、展開溶媒はメタノール：クロロホルム／１０：９０溶液を使用した。Ｒｆ値は、ＴＡＸ：０．２５、ＨＹＬ：０．２１であった。また、同条件でＳＩＬのＲｆ値は０．３６であった。分取の結果、ＴＡＸ（３８．９ｍｇ）、ＨＹＬ（１０．２ｍｇ）を得た。
ＴＡＸ、ＨＹＬ、ＳＩＬ、ＩＴＸの構造式は、分光学的および化学的な分析に基づき、決定、確認した。以下に、主要な分析データを記述する。
ＴＡＸ（Ｔａｘｉｒｅｓｉｎｏｌ）：淡褐色無定形固体（ｌｉｇｈｔｂｒｏｗｎａｍｏｒｐｈｏｕｓｓｏｌｉｄ）
^１ＨＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ６．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０，Ｈｚ，Ｈ−２），６．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ−２’），６．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−５），６．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ５’），６．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．０Ｈｚ，Ｈ−６’），６．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．０Ｈｚ，Ｈ−６），４．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｈ−７’），３．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，８．３Ｈｚ，Ｈ−９’），３．８０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−ＯＭｅ），３．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，１０．５Ｈｚ，Ｈ−９’），３．６８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．９，８．３Ｈｚ，Ｈ−９’），３．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，１０．５Ｈｚ，Ｈ−９’），２．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１３．４Ｈｚ．，Ｈ−７），２．７０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），２．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．５，１３．４Ｈｚ，Ｈ−７），２．３５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８’）；
^１３ＣＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ１４８．９（Ｃ−３’），１４６．３（Ｃ−３），１４５．７（Ｃ−４’），１４５．７（Ｃ−４），１３５．８（Ｃ−１’），１３３．５（Ｃ−１），１２２．１（Ｃ−６），１１８．６（Ｃ−６’），１１６．１（Ｃ−５），１１６．１（Ｃ−５’），１１４．１（Ｃ−２’），１１３．４（Ｃ−２），８３．９（Ｃ−７’），７３．４（Ｃ−９），６０．４（Ｃ−９’），５６．３（Ｃ−ＯＭｅ），５４．０（Ｃ−８’），４３．８（Ｃ−８），３３．６（Ｃ−７）．
［α］_Ｄ ^２５＋２３．０°（ｃ＝０．３２ｉｎＥｔｈａｎｏｌ）
ＨＹＬ（（７’Ｒ）−７’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）：無色無定形固体（ｃｏｌｏｒｌｅｓｓａｍｏｒｐｈｏｕｓｓｏｌｉｄ）
^１ＨＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ６．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ−２），６．８６（１Ｈ，２，Ｈ−２’，６．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．０Ｈｚ，Ｈ−６），６．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−５），６．７３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’ａｎｄＨ−６’），４．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｈ−７），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−７’），４．２３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，４．４Ｈｚ，Ｈ−９’），３．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，７．８Ｈｚ，Ｈ−９’），３．８４（３Ｈ，ｓ，Ｈ−ＯＭｅ），３．８２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−ＯＭｅ），３．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，５．９Ｈｚ，Ｈ−９），３．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，４．６Ｈｚ，Ｈ−９），２．５４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８’），１．８８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８）；
^１３ＣＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ１４８．９（Ｃ−３），１４８．９（Ｃ−３’），１４７．１（Ｃ−４），１４７．１（Ｃ−４’），１３６．１（Ｃ−１’），１３４．７（Ｃ−１），１２０．７（Ｃ−６’），１２０．２（Ｃ−６），１１５．９（Ｃ−５’），１１５．９（Ｃ−５），１１１．５（Ｃ−２’），１１１．０（Ｃ−２），８５．０（Ｃ−７），７６．６（Ｃ−７’），７１．４（Ｃ−９’），６２．２（Ｃ−９），５６．４（Ｃ−ＯＭｅ），５６．３（Ｃ−ＯＭｅ），５３．３（Ｃ−８），５０．７（Ｃ−８’）．
［α］_Ｄ ^２５＋４．６°（ｃ＝０．１８ｉｎＭｅｔｈａｎｏｌ）
ＳＩＬ（Ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）：無色結晶（ｃｏｌｏｒｌｅｓｓｃｒｙｓｔａｌ）
^１ＨＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ），δ６．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−５），６．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ−２），６．５３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．０Ｈｚ，Ｈ−６），３．７１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−ＯＭｅ）；３．５３（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｈ−９），２．５６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．３，１３．７Ｈｚ，Ｈ−７），２．５２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．７，１３．７Ｈｚ，Ｈ−７），１．８８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−８）；
^１３ＣＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ１４８．６（Ｃ−３），１４５．３（Ｃ−４），１３３．７（Ｃ−１），１２２．６（Ｃ−６），１１３．３（Ｃ−２），１１５．７（Ｃ−５），６１．９（Ｃ−９），５６．１（Ｃ−ＯＭｅ），４４．０（Ｃ−８），３６．０（Ｃ−７）
［α］_Ｄ ^２５−３２．０°（ｃ＝０．１ｉｎＡｃｅｔｏｎｅ）
ＩＴＸ（Ｉｓｏｔａｘｉｒｅｓｉｎｏｌ）：無色無定形固体（ｃｏｌｏｒｌｅｓｓａｍｏｒｐｈｏｕｓｓｏｌｉｄ）^１ＨＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ），δ６．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−５’），６．６１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−５），６．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ−２’），６．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０，８．０Ｈｚ，Ｈ−６’），６．１９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２），４．６７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−９），４．６７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９’），４．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｈ−７’），３．７７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−ＯＭｅ），３．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．３，１１．１Ｈｚ，Ｈ−９’），２．７３（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−７），１．９７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），１．７１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８’）
^１３ＣＮＭＲ（ＣＤ^３ＯＤ）δ１４７．１（Ｃ−３），１４６．２（Ｃ−３’），１４５．２（Ｃ−４），１４４．６（Ｃ−４’），１３８．７（Ｃ−１’），１３４．３（Ｃ−１），１２８．９（Ｃ−６），１２２．０（Ｃ−６’），１１７．４（Ｃ−２），１１７．３（Ｃ−２’），１１６．１（Ｃ−５’），１１２．３（Ｃ−５），６６．０（Ｃ−９），６２．４（Ｃ−９’），５６．４（Ｃ−ＯＭｅ），４８．１（Ｃ−８’），４７．８（Ｃ−７’），４０．１（Ｃ−８），３３．５（Ｃ−７）
［α］_Ｄ ^２５＋４７．３°（ｃ＝０．４ｉｎＥｔｈａｎｏｌ）
決定したＴＡＸ、ＳＩＬの構造式は、Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｒ．＆Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｋ．，Ｔａｘｉｒｅｓｉｎｏｌ，ＡＮｅｗＬｉｇｎａｎｉｎｔｈｅＨｅａｒｔｗｏｏｄｏｆＴａｘｕｓｂａｃｃａｔａ；ＩｎｄｉａｎＪ．Ｃｈｅｍ．，４０，６７７−６８０（１９７２）に記載された構造式と一致した。ＨＹＬの構造式は、Ｂａｒｒｅｒｏ，Ａ．Ｆ，；Ｈａｉｄｏｕｒ，Ａ．；Ｄｏｒａｄｏ，Ｍ．Ｍ．；Ｇｒａｖａｌｏｓ，Ｄ．＆Ｑｕｅｓａｄａ，Ｔ．Ｇ．，ＬｉｇｎａｎｓｆｒｏｍｔｈｅｗｏｏｄｏｆＡｂｉｅｓｐｉｎｓａｐｏ；Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５７，７１３−７１９（１９９４）に記載された構造式と一致した。ＩＴＸの構造式は、Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．；Ｌ．Ｊｕｒｄ＆Ｋｉｎｇ，Ｔ．Ｊ．，ｉｓｏＴａｘｉｒｅｓｉｎｏｌ（３’−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ），ＡＮｅｗＬｉｇｎａｎｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅＨｅａｒｔｗｏｏｄｏｆｔｈｅＥｎｇｌｉｓｈＹｅｗ，Ｔａｘｕｓｂａｃｃａｔａ；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１７−２４（１９５２）に記載された構造式と一致した。
（抽出・分画）
第１図を参照して、紅豆杉木部からの成分の抽出・分画操作を説明する。
紅豆杉の乾燥木部粉末（３０メッシュパス）８５０ｇを４Ｌの水で４５分間還流抽出した。濾過後、残渣に４Ｌの水を加えて４５分間還流抽出した。さらに同じ還流抽出操作を１回繰り返した。３回の水抽出液を合わせて減圧濃縮し、水抽出物５２．５ｇを得た。
次に、水抽出物５２．５ｇを５００ｍＬの酢酸エチルで抽出し酢酸エチル層を分離した。分離後、残渣に５００ｍＬの酢酸エチルを加えて抽出した。さらに同じ抽出操作を１回繰り返した。３回の抽出操作で得た酢酸エチル層を合わせて減圧濃縮し、酢酸エチル画分３４．１ｇを得た。
残渣である水溶液を減圧濃縮し、酢酸エチル不溶画分１６．１ｇを得た。
前記水抽出物を抽出後の残渣（木部粉末）に、メタノールと水（１対１）の混合液４Ｌを加え４５分間還流抽出した。濾過後、同じの還流抽出操作を２回繰り返した。３回の抽出液を合わせて減圧濃縮し、メタノール／水抽出物３２．３ｇを得た。
続いて、残渣（木部粉末）にメタノール４Ｌを加え４５分間還流抽出した。濾過後、同じの還流抽出操作を２回繰り返した。３回の抽出液を合わせて減圧濃縮し、メタノール抽出物７．２ｇを得た。
（試験例１−血糖値降下活性）
ラットを用いて、リグナン類化合物と紅豆杉画分の血糖値降下活性を試験した。
血中グルコース濃度は、採血した全血を血球分離し血清を用いて測定した。試薬はグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を使用し、吸光度測定にはＵＶ−１６０Ａ（株式会社島津製作所）を使用した。
５−６週齢、体重１８０−２００ｇの雄性ウイスターラットを１６時間絶食した後、ストレプトゾシン（以下ＳＴＺと記す）（５５ｍｇ／ｋｇ（ラットの体重））のクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を腹腔内に注射した。ＳＴＺを注射した後、５日後に尾静脈より採血し血中グルコース濃度を測定した。そして、血中グルコース濃度が２５０ｍｇ／ｄＬ以上のラットを糖尿ラットとして試験に用いた。
糖尿ラットに化合物または画分を１００ｍｇ／ｋｇ（ラットの体重）の量で、１２時間間隔で５回注射により腹腔内投与し、その後尾静脈より採血し血中グルコース濃度を測定した。試験は４匹のラットを１群として行い、測定値の平均値と標準偏差を算出した。ネガティブコントロール（対照）として生理食塩水を投与した群を設けた。ポジティブコントロールとして、前記糖尿ラットにトリブタマイド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）２００ｍｇ／ｋｇ（ラットの体重）とブホルミン（ｂｕｆｏｒｍｉｎ）１ｍｇ／ｋｇ（ラットの体重）の混合物を同様に腹腔内投与した群を設けた。
ＳＩＬの試験結果を図２に示す。各グラフは平均値と標準偏差の値を表示し、また、＊印は、スチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔ）の結果、＊ｐ＜０．０５＊＊ｐ＜０．０１でＣｏｎｔｒｏｌ群との間の有意差があることを示す。グラフの表示とｔ検定結果の表示は、第３図〜第１０図についても同様である。
ＳＩＬは血糖値を３３．４％減少した。これは血糖値を２４．０％減少した陽性コントロールと同等の効果であった。
ＩＴＸの試験結果を図３に示す。ＩＴＸは血糖値を２３．６％減少した。これは血糖値を２４％減少した陽性コントロールと同等の効果であった。
ＴＡＸおよび紅豆杉画分の試験結果を表２に示す。

ＴＡＸは血糖値を２０．９％減少した。これは血糖値を２４％減少した陽性コントロールと同等の効果であった。
また、酢酸エチル可溶画分は、血糖値を１２．１％減少した。
（試験例２−肝臓保護活性）
リグナン類化合物及び紅豆杉画分の肝障害に対する予防、治療活性を以下の方法により試験した。
（Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ：以下Ｄ−ＧａｌＮと略す）／リポポリサッカライド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：以下ＬＰＳと略す）誘発肝障害モデル（Ｊ．Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．，３９，２６７（１９９０）、Ａ．Ｗｅｎｄｅｌｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．，３５，２１１５（１９８６））による評価）
１２時間絶食したｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）の腹腔内にＤ−ＧａｌＮ（７００ｍｇ／ｋｇ）／ＬＰＳ（１０μｇ／ｋｇ）を注射して肝障害を惹起した。被検薬はＤ−ＧａｌＮ／ＬＰＳを注射する前の１２時間及び１時間前に計２回皮下投与した。２群の被検薬投与群を設け、１群は被検薬投与量５０ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）とし、他群は被検薬投与量１０ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）とした。対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）には生理食塩水を同様に投与した。また、薬効比較のために既存の肝臓保護薬であるシリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）投与群（皮下投与：１００ｍｇ／ｋｇ）を設けた。Ｄ−ＧａｌＮ／ＬＰＳ注射の９０分後に血中の腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌｐｈａ）（以下ＴＮＦ−αと略す）の値を測定した。また、８時間後に血中のアミノ基転移酵素（ＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃｐｙｒｕｖｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）とＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ））の値を測定した。
ＴＮＦ−αはＴＮＦ−α抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＴＮＦ−α ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いるＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＧＰＴ、ＧＯＴはＴｒａｎｓａｍｉｎａｓｅＣＩＩ−Ｔｅｓｔｋｉｔ（和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。
本障害モデルにおいて誘発される肝障害機構は、免疫担当細胞の活性化、肝組織への浸潤、ロイコトリエンＤ４やＴＮＦ−α等のオータコイド、サイトカインの分泌、肝細胞のアポトーシスなど一連の過程を経由するため、免疫学的肝障害発生のモデルとして臨床成績との相関性が高いと考えられる。
アミノ基転移酵素量の測定結果を第４図と第５図に示す。グラフの縦軸は血清中のアミノ基転移酵素量をＩＵ／Ｌで示す。ＮｏｒｍａｌはＤ−ＧａｌＮ／ＬＰＳ非処理群を表す。Ｃｏｎｔｒｏｌは生理食塩水を投与した群を表す。ＴＡＸ５０〜ＩＴＸ１０はリグナン類の化合物名と投与量を表す。ＳＩはシリマリン投与群を表す。Ｎｏｒｍａｌ群のマウス個体数は３であり、その他の実験群のマウス個体数は６である。
ＴＡＸ、ＨＹＬ、ＳＩＬ、ＩＴＸは、１０ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの投与量で、血清中ＧＰＴとＧＯＴ上昇を抑制し、用量依存的かつ有意義な肝障害抑制作用を示した。
第６図に、紅豆杉の酢酸エチル可溶画分（グラフ中にＳｏと記載）を投与したアミノ基転移酵素量の測定結果を示す。酢酸エチル可溶画分は、リグナン類化合物と同様に、血清中ＧＰＴとＧＯＴ上昇を抑制し、用量依存的かつ有意義な肝障害抑制作用を示した。
ＴＮＦ−αの測定結果を第７図と第８図に示す。グラフの縦軸は血清中のＴＮＦ−α量をｐｇ／ｍＬの単位で示す。Ｃｏｎｔｒｏｌは生理食塩水を投与した群を表す。ＴＡＸ５０〜ＩＴＸ１０はリグナン類の化合物名と投与量を表す。ＳＩはシリマリン投与群を表す。各実験群のマウス個体数は６である。また、Ｄ−ＧａｌＮ／ＬＰＳ非処理群（マウス個体数：３）の血清ＴＮＦ−α量は検出限界（１０ｐｇ／ｍＬ）以下であったため、図示していない。
ＴＡＸ、ＨＹＬ、ＳＩＬ、ＩＴＸは、１０ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの投与量で、血清中ＴＮＦ−α上昇を抑制し、用量依存的かつ有意義な肝障害抑制作用を示した。
また、ＳＩＬ、ＩＴＸを投与したマウスおよび対照群のマウスについて、Ｄ−ＧａｌＮ／ＬＰＳ注射の８時間後に肝臓細胞の病理組織学的観察を行った。対照群のマウスについては、細胞内のアポトーシス小体が多数観察され、また、細胞核内のクロマチンの凝縮が多数観察された。すなわち多数の細胞のアポトーシスが観察された。一方、ＳＩＬ、ＩＴＸを投与したマウスでは、より少ない数の細胞内のアポトーシス小体、また、細胞核内のクロマチンの凝縮が観察された。よって、肝臓細胞の病理組織学的観察からもリグナン類化合物の肝障害抑制作用が裏付けられた。
（試験例３−ＴＮＦ−α誘発マウス初代培養肝細胞死に対する抑制活性）
ｄｄＹ系雄マウスの肝臓からコラゲナーゼ灌流法の変法で分離した肝実質細胞を、１０％ウシ血清、ペニシリンＧ１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、デキサメタゾン１００μＭ、インスリン５０ｎｇ／ｍＬを補充したウイリアムスＥ（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓＥ）培地に懸濁し、９６ウェルのプラスチックプレートに１ウェル当たり１．５×１０^４セル（ｃｅｌｌ）を配布した。２時間予備培養した後、Ｄ−ガラクトサミン０．５ｍＭおよびリグナン類を含む新鮮な培地に置き換えた。３０分後、ＴＮＦ−α１００ｎｇ／ｍＬを加えた。１８時間後、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）発色反応を用いて生存肝細胞数を計測した。
測定結果を第９図と第１０図に示す。
グラフの縦軸は細胞生存割合を百分率で示す。ＮｏｒｍａｌはＴＮＦ−α非添加の培地中での細胞生存割合を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌは被検薬非添加の培地中での細胞生存割合を示す。
ＴＡＸ、ＨＹＬ、ＳＩＬ、ＩＴＸは培地中に２００，１００，５０，１０μＭの濃度で添加した。それぞれの細胞生存割合を４本の棒グラフで示す。
ＴＡＸを培地に添加すると、肝細胞の生存割合はＣｏｎｔｒｏｌに比較して用量依存的、かつ有意義に上昇した。ＨＹＬ、ＳＩＬ、ＩＴＸを培地に添加した場合も、ＴＡＸの添加と同様な試験結果が得られた。
（試験例４−培養ガン細胞に対する細胞毒性活性）
ヒトＨＴ−１０８０繊維肉腫細胞とマウス腸癌Ｃｏｌｏｎ２６−Ｌ５の２種のガン細胞を用いてリグナン類化合物及び紅豆杉画分の細胞毒性活性試験を行った。ヒトＨＴ−１０８０繊維肉腫細胞は１０％ＦＣＳ（非働化したウシ胎児血清）と０．１％炭酸水素ナトリウム及び２ｍＭグルタミンを含んだＥＭＥＭ培地で培養した。一方、マウス腸癌Ｃｏｌｏｎ２６−Ｌ５細胞は、前記ＥＭＥＭ培地と同様なサプリメントを含んだＲＰＭＩ培地で培養した。細胞生存率はＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）法によって決定した。
指数関数的に増殖する細胞は９６穴プレート中に、１００μＬ中に約２０００細胞を含んでいる細胞懸濁培地液として加え、培養した。
２４時間後、細胞がプレートに接着した後に、培地液を除去し、濃度の異なる被検薬培地溶液（１００，５０，１０，５，１μｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、５％二酸化炭素雰囲気下３７℃で７２時間培養した。被検薬は、まずＤＭＳＯに溶解し、その後培地で希釈して用いた。ＤＭＳＯの最終濃度は０．２５％以下になるように調整した。
その後、培地液を除去し、培地に溶解したＭＴＴ１００μＬを加え、３時間培養し、形成されたホルマザンの量をプレートリーダ（パーキンエルマー社ＨＴＳ−７０００）を用いて、５５０ｎｍで吸光度を測定した。１の濃度での試験は４穴で行い、４測定値の平均値を試験結果とした。そして、試験結果からＩＣ_５０（５０％有効濃度）値を算出した。
試験結果を表３と表４に示す。

ＳＩＬはＨＴ−１０８０細胞に対して顕著な細胞毒性を示した。ＴＡＸ、ＩＴＸはＨＴ−１０８０とＣｏｌｏｎ２６−Ｌ５に対して細胞毒性を示した。

酢酸エチル可溶画分はＨＴ−１０８０とＣｏｌｏｎ２６−Ｌ５に対して細胞毒性を示した。
（試験例５−ＤＰＰＨフリーラジカル消去活性）
ＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）エタノール溶液（濃度６０μＭ）５００μＬと、被検薬のエタノールあるいは水溶液５００μＬを混合し、室温で３０分間放置後に５２０ｎｍで吸光度を測定した。試験は被検薬の濃度を変更して行い、その測定値からＥＣ_５０（５０％有効濃度）値を算出した。
測定結果を表５に示す。

酢酸エチル可溶画分は、顕著なＤＤＰＨフリーラジカル消去活性を示した。
フリーラジカル消去能は、抗酸化活性の一つである。フリーラジカル消去活性の強い物質は抗酸化活性が強いと考えられる。Ｄ−ＧａｌＮ／ＴＮＦ−α誘発肝障害に対する、酢酸エチル可溶画分の作用機序は、抗酸化活性によるＴＮＦ−α産生の抑制にあると考えられ、その結果肝細胞がアポトーシスになるのを抑制すると考えられる。
また、糖尿病によって引き起こされる白内障などの合併症に抗酸化物質が有効であるとの報告がなされている。本発明にかかる酢酸エチル可溶画分とリグナン類は糖尿病の合併症に対しても効果を有すると考えられる。

以上のように、本発明にかかる化合物と紅豆杉の有機溶媒抽出画分は、医薬として有用であり、特に、血糖降下剤、肝臓保護薬または抗ガン剤に適している。

Claims

式（１）

（１）
（式中Ｒ^１は水素または水酸基、R^２は炭素数１〜４のアルキルオキシ基または水酸基、Ｒ^３は炭素数１〜４のアルキルオキシ基を表す）
で示される化合物、または式（１）化合物の医学的に許容される塩を有効成分とする肝臓保護薬。