KR100639273B1 - 홍두삼 유래 리그난류를 포함하는 혈당 강하제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍두삼에 포함되는 리그난류인 탁시레지놀, (7'R)-7'-히드록시라리시레지놀, 세코이소라리시레지놀, 이소탁시레지놀을 유효 성분으로 하는 의약을 제공한다. 또한, 본 발명은 홍두삼의 식물체를 물로 추출하고, 얻어진 물 추출물을 유기 용매에 의해 추출하여 얻어지는 추출물을 유효 성분으로 하는 의약을 제공한다. 이들은 특히 혈당 강하제, 간장 보호제, 항암제로서 유용하다.

혈당 강하제, 간장 보호제, 항암제, 홍두삼, 탁시레지놀, 히드록시라리시레지놀, 세코이소라리시레지놀, 이소탁시레지놀

Description

홍두삼 유래 리그난류를 포함하는 혈당 강하제 {Hypoglycemic Agent Containing Lignans Originating in Hongdoushan}

본 발명은 리그난류 화합물을 포함하는 의약, 특히 혈당 강하제, 간장 보호제, 항암제에 관한 것이다.

진성 당뇨병은 탄화수소, 지질 및 단백질의 대사 장해이다. 전세계의 약 10 ％의 사람들에게 진성 당뇨병이 발증하고 있다는 보고도 있다. 당뇨병에 대하여 인슐린이나 여러가지 부작용을 수반하는 몇가지 혈당 강하제를 제외하고는, 그 밖에 유효한 약제는 여전히 발견되고 있지 않다.

또한, 간장은 자연 치유력이 강하고 약간의 장해로는 표면화된 증상이 나타나지 않기 때문에 "침묵의 장기"라고도 불리우며, 물질 대사, 혈당 조절, 해독, 담즙 순환 조절, 영양소 저장 등 인간의 생명 유지에 불가결한 기능을 담당하고 있다. 간기능 장해의 병인, 병태는 여러가지 다양한데, 치료제의 개발이 가장 요구되고 있는 것은 의료 필요성이 높은 만성 활동성 간염이다. 상기 질환을 표적으로 하여 간 보호제를 비롯하여 원인 요법으로서의 항바이러스제나 면역 조절제 등의 치료제 연구가 행해지고 있다.

또한, 항암제는 현재 약 60개가 알려져 있으며, 약 40개가 임상에 사용되고 있다. 그럼에도 불구하고, 암은 인간 사망 원인의 상위에 올라 있으며, 새로운 의약 개발이 요구되고 있다.

한편, 중국 운남성의 고산 지대 등에 서식하고 있는 상록수목인 홍두삼(학명 Taxus yunnanensis)은 소염, 이뇨, 혈압 강하, 혈중 지질 감소 등에 효과가 있는 약용 식물로서 알려져 있다. 또한, 홍두삼의 식물체에는 항암제인 파클리탁셀(택솔)이 포함되어 있는 것이 확인되었다.

이러한 약효에 착안하여 일본 특허 공개 (평)10-120582호에는 홍두삼의 줄기부를 분쇄한 수목차가 개시되어 있다. 또한, 일본 특허 공개 제2000-236835호, 일본 특허 공개 제2000-236836호에는 홍두삼의 줄기 분쇄물, 및 특정한 약용 식물을 혼합한 식품이 개시되어 있다.

또한, 중국 정부가 최근 일본과 미국용으로 한정적인 홍두삼 수출을 허가한 적도 있어 홍두삼의 성분과 약리 작용의 연구가 진행되고 있다.

본 발명의 목적은 홍두삼에 포함된 성분에 대하여 미지의 생물 활성을 발견하고, 해당 활성에 기초하는 해당 성분의 신규한 의약 용도를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 홍두삼의 추출 분획에 대한 신규한 의약 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자는 홍두삼에 포함된 리그난류 화합물이 시험관 내ㆍ생체 내에서 생물 활성을 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 화학식 1의 화합물의 의학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 유효 성분으로 하는 의약이다.

식 중, R¹은 수소 또는 수산기이고, R²는 탄소수 1 내지 4의 알킬옥시기 또는 수산기이며, R³은 탄소수 1 내지 4의 알킬옥시기를 나타낸다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 또는 화학식 2의 화합물의 의학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 유효 성분으로 하는 의약이다.

식 중, R⁴, R⁵는 탄소수 1 내지 4의 알킬옥시기를 나타낸다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 또는 화학식 3의 화합물의 의학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 유효 성분으로 하는 의약이다.

식 중, R⁶은 탄소수 1 내지 4의 알킬옥시기를 나타낸다.

본 발명의 제1 실시 양태에 있어서, 청구 범위 제1항에 기재된 의약은 혈당 강하제, 간장 보호제 또는 항암제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제2 실시 양태에 있어서, 청구 범위 제2항에 기재된 의약은 혈당 강하제, 간장 보호제 또는 항암제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제3 실시 양태에 있어서, 청구 범위 제3항에 기재된 의약은 혈당 강하제, 간장 보호제 또는 항암제인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서 에스테르란 화학식 1, 2, 3 중의 메틸올기(CH₂OH)의 수산기가 유기산 또는 무기산과 결합하여 물 분자가 이탈한 화합물을 의미한다. 화학식 2, 3의 화합물에서는 1 분자 중에 메틸올기가 2개 있으며, 그 중 하나만 에스테르화될 수도 있고, 둘 모두가 에스테르화될 수도 있다. 의학적으로 허용되는 에스테르는 의학ㆍ약학 분야에서 공지된 것을 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 유기산으로서 아세트산을, 무기산으로서 인산을 사용할 수 있다.

염은 무기 및 유기 염기로부터 유도되는 모든 염일 수 있으며, 화합물 중의 페놀기가 페녹시드 이온(phenoxide ion)기가 되는 염 및(또는) 메틸올기가 메틸옥 시드 이온(methyloxide ion)기가 되는 염을 포함한다. 의학적으로 허용되는 염은 의학ㆍ약학 분야에서 공지된 것을 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 아민의 염을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 홍두삼 식물체를 물로 추출하고, 얻어진 물 추출물을 유기 용매에 의해 추출하여 얻어지는 추출물을 유효 성분으로 하는 의약이다.

본 발명의 바람직한 실시 양태에 있어서, 청구 범위 제7항에 기재된 의약은 혈당 강하제, 간장 보호제 또는 항암제인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 혈당 강하제란 당뇨병의 치료ㆍ예방에 이용하는 약제를, 간장 보호제란 간장 기능의 회복, 보전에 이용하는 약제를, 항암제란 암의 치료ㆍ예방ㆍ재발 방지에 이용하는 약제를 의미한다.

화학식 1의 화합물에 있어서, R¹이 H이고, R²가 OH이며, R³이 CH₃ O일 때, 즉 하기 화학식 4의 화합물은 탁시레지놀(Taxiresinol) (이하, "TAX"라고 함)이다.

화학식 1의 화합물에 있어서, R¹이 OH이고, R²가 CH₃O이며, R³이 CH₃O일 때, 즉 하기 화학식 5의 화합물은 (7'R)-7'-히드록시라리시레지놀((7'R)-7'- Hydroxylariciresinol) (이하, "HYL"이라고 함)이다.

화학식 2의 화합물에 있어서, R⁴가 CH₃O이고, R⁵가 CH₃O일 때, 즉 하기 화학식 6의 화합물은 세코이소라리시레지놀(Secoisolariciresinol) (이하, "SIL"이라고 함)이다.

화학식 3의 화합물에 있어서, R⁶이 CH₃O일 때, 즉 하기 화학식 7의 화합물은 이소탁시레지놀(이하, "ITX"라고 함)이다.

TAX, HYL, SIL, ITX는 홍두삼 식물체(잎, 수피, 목재부, 심부, 뿌리 등)에 포함되어 있으며, 다음과 같이 하여 추출, 단리할 수 있다. 우선, 식물체를 열수 추출하여 물 추출물을 얻는다. 이어서, 상기 물 추출물을 유기 용매(예를 들면, 아세트산 에틸)로 추출하여 유기 용매 분획을 얻는다. 또한, 그 유기 용매 분획으로부터 크로마토그래피(칼럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, HPLC 등)를 이용하여 이들 화합물을 단리한다.

또한, 이들 화합물로부터 유기 합성에 의해 화학식 1, 2, 3의 화합물을 합성할 수 있다.

TAX의 메톡시기(CH₃O)는 에톡시기(C₂H₅O), 프로피옥시기(C₃H ₇O), 부틸옥시기(C₄H₉O)로 치환될 수도 있다. HYL의 2개의 메톡시기는 각각이 에톡시기, 프로피옥시기, 부틸옥시기로 치환될 수도 있고, 2개의 알킬옥시기는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. SIL의 2개의 메톡시기는 각각이 에톡시기, 프로피옥시기, 부틸옥시기로 치환될 수도 있고, 2개의 알킬옥시기는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. ITX의 메톡시기는 에톡시기, 프로피옥시기, 부틸옥시기로 치환될 수도 있다.

본 발명의 홍두삼의 물 추출물의 유기 용매 추출물을 얻기 위해서는, 우선 홍두삼 식물체(잎, 수피, 목재부, 심부, 뿌리 등)를 물로 추출하여 수추출액을 얻는다. 식물체로서 목재부와 수피(합쳐서 "목부"라고 함)를 사용하는 것이 바람직하다. 수추출은 열수 추출로 하는 것이 바람직하다. 추출 조작의 보다 구체적인 일실시 양태는, 예를 들면 식물체 분쇄물, 및 해당 분쇄물의 약 2배 내지 20배량의 순수한 물을 혼합(식물체 분쇄물 1 kg에 대하여 순수한 물 2 ℓ 내지 20 ℓ)하고, 실온 또는 가열하, 바람직하게는 가열하, 보다 바람직하게는 100 ℃에서 1 분 내지 2 시간, 바람직하게는 20 분 내지 1 시간 추출하여 여과 또는 원심 분리에 의해 상청을 회수하는 방법을 들 수 있다.

이어서, 상기 수추출액을 유기 용매로 추출하여 유기 용매 추출액을 얻는다. 추출 전에 수추출액을 감압 농축 등에 의해 부피 축소할 수도 있다. 또한, 수추출 액에 무기염을 용해시킨 후, 유기 용매로 추출할 수도 있다. 유기 용매로서는 수용액으로부터 화합물을 추출하는 경우에 통상적으로 이용되는 유기 용매를 사용할 수 있으며, 예를 들면 아세트산 에틸, 알코올류, 에테르류, 지방족 탄화수소류, 방향족 탄화수소류(벤젠, 톨루엔 등), 피리딘 등을 사용할 수 있다. 바람직한 유기 용매는 극성을 갖는 것이며, 예를 들면 분자 내에 산소 원자, 질소 원자를 갖는 유기 용매이고, 가장 바람직하게는 아세트산 에틸, 디에틸에테르이다. 이어서, 정법에 따라 유기 용매 추출액으로부터 유기 용매를 제거하여 유기 용매 추출물을 얻는다.

본 발명의 의약은 경구, 비경구, 또는 경피 투여할 수 있다. 투여 형태는 통상적으로 의약 투여에 이용되는 형태가 제한없이 사용되며, 예를 들면 정제 또는 피복정, 캡슐, 용액, 시럽, 분말, 좌약을 들 수 있다.

정제는 화합물 또는 추출물을 부형제(락토오스, 포도당, 수크로오스, 만니톨 등), 붕괴제(옥수수 전분, 알긴산 등), 결합제(전분, 젤라틴 등), 윤활제(스테아르산 마그네슘, 활석 등) 및(또는) 지연 방출을 제공하는 제제(카르복시메틸셀룰로오 스, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 폴리비닐알코올 등)를 혼합함으로써 제조할 수 있다. 정제는 몇개의 층으로 구성될 수도 있다.

피복정은 정제와 동일하게 하여 제조한 심을 정제 피복에 통상적으로 이용되는 물질, 예를 들면 콜리돈(collidone), 셸락(shellac), 아라비아 고무, 활석, 이산화티탄, 수크로오스 등으로 피복함으로써 제조할 수 있다. 지연 방출을 얻기 위해 심은 몇가지 층으로 이루어질 수도 있고, 정제에 대한 상기 부형제를 사용할 수도 있다.

액제, 시럽제 형태로 하기 위해서는 리그난류 화합물에 물, 당류(에리스리톨, 크실리톨, 만니톨, 수크로오스, 트레할로스, 말토오스, 프룩토오스, 소르비톨, 벌꿀 등), 방부제(파라벤 등), 각종 향료, 착색료, 유류(대두유 등)를 적절하게 첨가, 혼합하여 제조할 수 있다.

본 발명의 의약을 함유하는 캡슐은 화합물 또는 추출물을 젤라틴 캡슐에 봉입하거나, 또는 화합물 또는 추출물과 예를 들면 락토스, 소르비톨 등의 불활성 담체를 혼합하고, 혼합물을 젤라틴 캡슐에 봉입, 또는 젤라틴막으로 피복 성형하여 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물 또는 추출물의 투여량은 통상 1 mg 내지 1000 mg/1인/1일이다. 그러나, 처음에 소량을 투여하고, 이어서 의도한 효과가 달성될 때까지 증량함으로써 적당한 투여량을 결정하는 것도 의도되고 있다.

상기 리그난류는 종래부터 안전하게 섭취되고 있는 약용 식물인 홍두삼의 성분이며, 안전한 물질이다.

본 발명에 의해 여러가지 질병 치료나 건강 증진에 유용한 신규한 의약을 얻을 수 있다. 특히, 혈당 강하제, 간장 보호제 또는 항암제로서 유용한 의약을 얻을 수 있다.

도 1은 홍두삼 목부로부터의 성분 추출ㆍ분획 과정의 설명도이다.

도 2는 래트를 이용한 SIL의 혈당치 강하 작용의 시험 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 래트를 이용한 ITX의 혈당치 강하 작용의 시험 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 TAX, HYL 투여 마우스 혈청 중의 아미노기 전이 효소량의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 SIL, ITX 투여 마우스 혈청 중의 아미노기 전이 효소량의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 아세트산 에틸 가용 분획 투여 마우스 혈청 중의 아미노기 전이 효소량의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 TAX, HYL 투여 마우스 혈청 중의 TNF-α의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 8은 SIL, ITX 투여 마우스 혈청 중의 TNF-α의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 9는 배양 간세포사에 대한 TAX, HYL의 억제 활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 10은 배양 간세포사에 대한 SIL, ITX의 억제 활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

TAX: 탁시레지놀

HYL: (7'R)-7'-히드록시라리시레지놀

SIL: 세코이소라리시레지놀

ITX: 이소탁시레지놀

SI: 실리마린

이하에 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 본 발명의 실시예에 기재되어 있는 원재료, 화합물의 추출 방법 등은 본 발명의 범위가 이들만으로 한정된다는 것을 의미하는 것은 아니며, 단순한 설명예에 지나지 않는다.

(단리)

홍두삼의 목재부 및 수피(합쳐서 목부)를 분쇄기로 분쇄하여 30 메쉬 통과의 분말을 얻었다. 이 분말을 건조하였다. 건조 분말 850 g을 4 ℓ의 순수한 물로 45 분간 환류 추출하였다. 여과 후, 잔사에 4 ℓ의 순수한 물을 첨가하여 45 분간 환류 추출하였다. 또한, 동일한 환류 추출 조작을 1회 반복하였다. 3회의 수추출액을 합쳐 감압 농축하여, 물 추출물 52.5 g을 얻었다. .

이어서, 물 추출물 52.5 g을 500 ㎖의 아세트산 에틸로 추출하고, 아세트산 에틸층을 분리하였다. 분리 후, 잔사에 500 ㎖의 아세트산 에틸을 첨가하여 추출하였다. 또한, 동일한 추출 조작을 1회 반복하였다. 3회의 추출 조작으로 얻은 아세트산 에틸층을 합쳐 감압 농축하여, 아세트산 에틸 분획 34.1 g을 얻었다.

이어서, 실리카 겔 칼럼(내경 3.5 cm, 길이 60 cm, 충전물: 실리카 겔 60(나까라이 테스크 가부시끼가이샤))에 상기 아세트산 에틸 분획 34.1 g을 첨가하고, 클로로포름에 메탄올을 첨가한 용매를 사용하여 용출 조작을 행하여 500 ㎖ 마다 9 분획을 얻었다. 용매의 조성, 및 각 분획 액체를 감압 농축하여 얻은 유출물의 중량, 분획 중에 포함되는 성분을 하기 표 1에 나타내었다.

제5 분획의 용출 용액을 감압 농축한 후 결정화한 SIL(840 mg)을 얻었다. 이어서, 그 잔사를 분취 박층 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 박층판은 두께 0.5 mm의 Kiesel gel 60F 254(머크사)를 사용하고, 전개 용매는 메탄올:클로로포름=10:90의 용액을 사용하였다. Rf값은 TAX가 0.25이고, HYL이 0.21이었다. 또한, 동일한 조건에서 SIL의 Rf값은 0.36이었다. 분취 결과, TAX(38.9 mg) 및 HYL(10.2 mg)을 얻었다.

TAX, HYL, SIL, ITX의 구조식은 분광학적 및 화학적인 분석에 기초하여 결정, 확인하였다. 이하에 주요 분석 데이타를 기술한다.

결정한 TAX, SIL의 구조식은 문헌[Mujumdar, R.B.; Srinivasan, R.& Venkataraman, K., Taxiresinol, A New Lignan in the Heartwood of Taxus baccata; Indian J. Chem., 40, 677-680(1972)]에 기재된 구조식과 일치하였다. HYL의 구조식은 문헌[Barrero, A.F,; Haidour, A.; Dorado, M.M.; Gravalos, D. & Quesada, T.G., Lignans from the wood of Abies pinsapo; J. Nat. Prod., 57, 713-719(1994)]에 기재된 구조식과 일치하였다. ITX의 구조식은 문헌[King, F.E.; L.Jurd & King, T.J., isoTaxiresinol(3'-Dimethylisolariciresinol), A New Lignan extracted from the Heartwood of the English Yew, Taxus baccata; J. Chem. Soc., 17-24(1952)]에 기재된 구조식과 일치하였다.

(추출ㆍ분획)

도 1을 참조하여 홍두삼 목부로부터의 성분 추출ㆍ분획 조작을 설명한다.

홍두삼의 건조 목부 분말(30 메쉬 통과) 850 g을 4 ℓ의 물로 45 분간 환류 추출하였다. 여과 후, 잔사에 4 ℓ의 물을 첨가하여 45 분간 환류 추출하였다. 또한, 동일한 환류 추출 조작을 1회 반복하였다. 3회의 수추출액을 합쳐 감압 농축하여, 물 추출물 52.5 g을 얻었다.

이어서, 물 추출물 52.5 g을 500 ㎖의 아세트산 에틸로 추출하고, 아세트산 에틸층을 분리하였다. 분리 후 잔사에 500 ㎖의 아세트산 에틸을 첨가하여 추출하였다. 또한, 동일한 추출 조작을 1회 반복하였다. 3회의 추출 조작으로 얻은 아세트산 에틸층을 합쳐 감압 농축하여, 아세트산 에틸 분획 34.1 g을 얻었다.

잔사인 수용액을 감압 농축하여, 아세트산 에틸 불용 분획 16.1 g을 얻었다.

상기 물 추출물을 추출 후의 잔사(목부 분말)에 메탄올과 물(1:1)의 혼합액 4 ℓ를 첨가하여 45 분간 환류 추출하였다. 여과 후, 동일한 환류 추출 조작을 2회 반복하였다. 3회의 추출액을 합쳐 감압 농축하여, 메탄올/물 추출물 32.3 g을 얻었다.

이어서, 잔사(목부 분말)에 메탄올 4 ℓ를 첨가하여 45 분간 환류 추출하였다. 여과 후, 동일한 환류 추출 조작을 2회 반복하였다. 3회의 추출액을 합쳐 감압 농축하여, 메탄올 추출물 7.2 g을 얻었다.

<시험예 1-혈당치 강하 활성>

래트를 이용하여 리그난류 화합물과 홍두삼 분획의 혈당치 강하 활성을 시험하였다.

혈중 글루코스 농도는 채혈한 전혈을 혈구 분리하여 혈청을 이용해서 측정하였다. 시약은 글루코스 CII-테스트 와꼬(와꼬 쥰야꾸 고교 가부시끼가이샤)를 사용하고, 흡광도 측정에는 UV-160A(가부시끼가이샤 시마즈 세이사꾸쇼)를 사용하였다.

5 내지 6 주령의 체중 180 내지 200 g의 웅성 위스터 래트를 16 시간 절식시킨 후, 스트렙토조신(이하, "STZ"라고 함)(55 mg/kg(래트의 체중))의 시트르산 완충액(pH 4.2)을 복강 내에 주사하였다. STZ를 주사한 후, 5일 후에 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈중 글루코스 농도를 측정하였다. 또한, 혈중 글루코스 농도가 250 mg/dl 이상인 래트를 당뇨 래트로서 시험에 이용하였다.

당뇨 래트에 화합물 또는 분획을 100 mg/kg(래트의 체중)의 양으로 12 시간 간격으로 5회 주사에 의해 복강 내 투여하고, 그 후 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈중 글루코스 농도를 측정하였다. 시험은 4마리의 래트를 1군으로서 행하고, 측정치의 평균치와 표준 편차를 산출하였다. 음성 대조군으로서 생리 식염수를 투여한 군을 설정하였다. 양성 대조군으로서 상기 당뇨 래트에 톨부타마이드(tolbutamide) 200 mg/kg(래트의 체중)과 부포르민(buformin) 1 mg/kg(래트의 체중)의 혼합물을 동일하게 복강 내 투여한 군을 설정하였다.

SIL의 시험 결과를 도 2에 나타내었다. 각 그래프는 평균치와 표준 편차의 값을 나타내고, * 표시는 스튜던트의 t 검정(Student's t-test) 결과, *p<0.05 ** p<0.01에서 대조군과의 사이에 유의차가 있음을 나타낸다. 그래프의 표시와 t 검정 결과의 표시는 도 3 내지 도 10에 대해서도 동일하다.

SIL은 혈당치를 33.4 ％ 감소시켰다. 이것은 혈당치를 24.0 ％ 감소시킨 양성 대조군과 동등한 효과였다.

ITX의 시험 결과를 도 3에 나타내었다. ITX는 혈당치를 23.6 ％ 감소시켰다. 이것은 혈당치를 24 ％ 감소시킨 양성 대조군과 동등한 효과였다.

TAX 및 홍두삼 분획의 시험 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

TAX는 혈당치를 20.9 ％ 감소시켰다. 이것은 혈당치를 24 ％ 감소시킨 양성 대조군과 동등한 효과였다.

또한, 아세트산 에틸 가용 분획은 혈당치를 12.1 ％ 감소시켰다.

<시험예 2-간장 보호 활성>

리그난류 화합물 및 홍두삼 분획의 간 장해에 대한 예방, 치료 활성을 이하의 방법에 의해 시험하였다.

(D-갈락토사민(이하, "D-GalN"이라고 함)/리포폴리사카라이드(이하, "LPS"라고 함) 유발 간 장해 모델(J.Wang et al., Biochem. Pharm., 39, 267(1990), A. Wendel et al., Biochem. Pharm., 35, 2115(1986))에 의한 평가)

12 시간 절식한 ddY계 웅성 마우스(6 주령)의 복강 내에 D-GalN(700 mg/kg)/LPS(10 ㎍/kg)를 주사하여 간 장해를 야기하였다. 피검제는 D-GalN/LPS를 주사하기 12 시간 및 1 시간 전에 총 2회 피하 투여하였다. 2군의 피검제 투여군을 설정하고, 1 군은 피검제 투여량을 50 mg/kg(마우스 체중)으로 하고, 다른 군은 피검제 투여량을 10 mg/kg(마우스 체중)으로 하였다. 대조군에는 생리 식염수를 마찬가지로 투여하였다. 또한, 약효 비교를 위해 기존의 간장 보호제인 실리마린 투여군(피하 투여: 100 mg/kg)을 설정하였다. D-GalN/LPS 주사의 90 분 후에 혈중의 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor alpha, 이하 "TNF-α"라고 함)의 값을 측정하였다. 또한, 8 시간 후에 혈중 아미노기 전이 효소(GPT(glutamic pyruvic transaminase)와 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase))의 값을 측정하였다.

TNF-α는 TNF-α 항체(anti-mouse TNF-α antibody, Endogen, Inc., USA)를 이용하는 ELISA법에 의해 측정하였다. GPT, GOT는 Transaminase CII-Test kit(와꼬 쥰야꾸 고교 가부시끼가이샤)를 사용하여 측정하였다.

본 장해 모델에서 유발되는 간 장해 기구는 면역 담당 세포의 활성화, 간 조직에의 침윤, 류코트리엔 D4나 TNF-α 등의 오타코이드, 사이토카인의 분비, 간세포의 아포토시스 등 일련의 과정을 경유하기 때문에 면역학적 간 장해 발생의 모델로서 임상 성적과의 상관성이 높다고 여겨진다.

아미노기 전이 효소량의 측정 결과를 도 4와 도 5에 나타내었다. 그래프의 종축은 혈청 중의 아미노기 전이 효소량을 IU/L로 나타내었다. 정상군은 D-GalN/LPS 비처리군을 나타낸다. 대조군은 생리 식염수를 투여한 군을 나타낸다. TAX50 내지 ITX10은 리그난류의 화합물명과 투여량을 나타낸다. SI는 실리마린 투여군을 나타낸다. 대조군의 마우스 개체수는 3이고, 그 밖의 실험군의 마우스 개체수는 6이었다.

TAX, HYL, SIL, ITX는 10 mg/kg과 50 mg/kg의 투여량으로 혈청 중 GPT와 GOT 상승을 억제하고, 용량 의존적으로 의미있는 간 장해 억제 작용을 나타내었다.

도 6에 홍두삼의 아세트산 에틸 가용 분획(그래프 중에 So라고 기재함)을 투여한 아미노기 전이 효소량의 측정 결과를 나타내었다. 아세트산 에틸 가용 분획은 리그난류 화합물과 마찬가지로 혈청 중 GPT와 GOT 상승을 억제하고, 용량 의존적으로 의미있는 간 장해 억제 작용을 나타내었다.

TNF-α의 측정 결과를 도 7과 도 8에 나타내었다. 그래프의 종축은 혈청 중의 TNF-α 양을 pg/㎖의 단위로 나타내었다. 대조군은 생리 식염수를 투여한 군을 나타낸다. TAX50 내지 ITX10은 리그난류의 화합물명과 투여량을 나타낸다. SI는 실리마린 투여군을 나타낸다. 각 실험군의 마우스 개체수는 6이었다. 또한, D-GalN/LPS 비처리군(마우스 개체수: 3)의 혈청 TNF-α 양은 검출 한계(10 pg/㎖) 이하였기 때문에 도시하지 않았다.

TAX, HYL, SIL, ITX는 10 mg/kg과 50 mg/kg의 투여량으로 혈청 중 TNF-α 상승을 억제하고, 용량 의존적으로 의미있는 간 장해 억제 작용을 나타내었다.

또한, SIL, ITX를 투여한 마우스 및 대조군의 마우스에 대하여 D-GalN/LPS 주사 8 시간 후에 간장 세포의 병리 조직학적 관찰을 행하였다. 대조군의 마우스에 대해서는 세포 내의 아포토시스 소체가 다수 관찰되었고, 세포핵 내의 크로마틴의 응축이 다수 관찰되었다. 즉 다수 세포의 아포토시스가 관찰되었다. 한편, SIL, ITX를 투여한 마우스에서는 보다 적은 수의 세포 내 아포토시스 소체, 세포핵 내의 크로마틴의 응축이 관찰되었다. 따라서, 간장 세포의 병리 조직학적 관찰로부터도 리그난류 화합물의 간 장해 억제 작용이 뒷받침되었다.

<시험예 3-TNF-α 유발 마우스 초대 배양 간세포사에 대한 억제 활성>

ddY계 웅성 마우스의 간장으로부터 콜라게나제 관류법의 요법으로 분리한 간 실질 세포를 10 ％ 소 혈청, 페니실린 G100 IU/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖, 덱사메타존 100 μM, 인슐린 50 ng/㎖를 보충한 윌리암스 E(William's E) 배지에서 현탁하고, 96 웰의 플라스틱 플레이트에 1 웰당 1.5×10⁴ 셀(cel1)을 배포하였다. 2 시간 예비 배양한 후, D-갈락토사민 0.5 mM 및 리그난류를 포함하는 신선한 배지로 대체하였다. 30 분 후, TNF-α 100 ng/㎖를 첨가하였다. 18 시간 후, MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디메틸테트라졸륨 브로마이드) 발색 반응을 이용하여 생존 간세포수를 계측하였다.

측정 결과를 도 9와 도 10에 나타내었다.

그래프의 종축은 세포 생존 비율을 백분율로 나타낸다. 정상군은 TNF-α 비첨가 배지 중에서의 세포 생존 비율을 나타낸다. 대조군은 피검제 비첨가의 배지 중에서의 세포 생존 비율을 나타낸다.

TAX, HYL, SIL, ITX는 배지 중에 200, 100, 50, 10 μM의 농도로 첨가하였다. 각각의 세포 생존 비율을 4개의 막대 그래프로 나타내었다.

TAX를 배지에 첨가하면, 간세포의 생존 비율은 대조군과 비교하여 용량 의존적으로 의미있게 상승하였다. HYL, SIL, ITX를 배지에 첨가한 경우에도 TAX의 첨가와 동일한 시험 결과를 얻을 수 있었다.

<시험예 4-배양 암세포에 대한 세포 독성 활성>

인간 HT-1080 섬유 육종 세포와 마우스 장암 Colon26-L5의 2종의 암세포를 이용하여 리그난류 화합물 및 홍두삼 분획의 세포 독성 활성 시험을 행하였다. 인간 HT-1080 섬유 육종 세포는 10 ％ FCS(불활성화한 소 태아 혈청)와 0.1 ％ 탄산수소나트륨 및 2 mM 글루타민을 포함한 EMEM 배지에서 배양하였다. 한편, 마우스 장암 Colon26-L5 세포는 상기 EMEM 배지와 동일한 부가물을 포함한 RPMI 배지에서 배양하였다. 세포 생존율은 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디메틸테트라졸륨 브로마이드)법에 의해 결정하였다.

지수 함수적으로 증식하는 세포는 9.6 웰 플레이트 중에서 100 ㎕ 중에 약 2000 세포를 포함하고 있는 세포 현탁 배지액으로서 첨가하여 배양하였다.

24 시간 후, 세포가 플레이트에 접착된 후 배지액을 제거하고, 농도가 상이한 피검제 배지 용액(100, 50, 10, 5, 1 ㎍/㎖) 100 ㎕를 첨가하여 5 ％ 이산화탄소 분위기하에 37 ℃에서 72 시간 배양하였다. 피검제는 우선 DMSO에 용해하고, 그 후 배지로 희석하여 사용하였다. DMSO의 최종 농도는 0.25 ％ 이하가 되도록 조정하였다.

그 후, 배지액을 제거하고, 배지에 용해한 MTT 100 ㎕를 첨가하여 3 시간 배양하고, 형성된 포르마잔의 양을 플레이트 판독기(퍼킨 엘머사 HTS-7000)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1의 농도에서의 시험은 4 웰로 행하고, 4 측정치의 평균치를 시험 결과로 하였다. 또한, 시험 결과로부터 IC₅₀(50 ％ 유효 농도) 값을 산출하였다.

시험 결과를 하기 표 3과 표 4에 나타내었다.

SIL은 HT-1080 세포에 대하여 현저한 세포 독성을 나타내었다. TAX, ITX는 HT-1080과 Colon26-L5에 대하여 세포 독성을 나타내었다.

아세트산 에틸 가용 분획은 HT-1080과 Colon26-L5에 대하여 세포 독성을 나타내었다.

<시험예 5-DPPH 유리 라디칼 소거 활성>

DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴히드라질) 에탄올 용액(농도 60 μM) 500 ㎕, 및 피검제의 에탄올 또는 수용액 500 ㎕를 혼합하고, 실온에서 30 분간 방치한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시험은 피검제의 농도를 변경하여 행하고, 그 측정 치로부터 EC₅₀(50 ％ 유효 농도) 값을 산출하였다.

측정 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

아세트산 에틸 가용 분획은 현저한 DDPH 유리 라디칼 소거 활성을 나타내었다.

유리 라디칼 소거능은 항산화 활성 중 하나이다. 유리 라디칼 소거 활성이 강한 물질은 항산화 활성이 강하다고 여겨진다. D-GalN/TNF-α 유발 간 장해에 대한, 아세트산 에틸 가용 분획의 작용 기구는 항산화 활성에 의한 TNF-α 생산의 억제에 있다고 여겨지며, 그 결과 간세포가 아포토시스가 되는 것을 억제한다고 여겨진다.

또한, 당뇨병에 의해 유발되는 백내장 등의 합병증에 항산화 물질이 유효하다는 보고도 있다. 본 발명의 아세트산 에틸 가용 분획과 리그난류는 당뇨병의 합병증에 대해서도 효과를 갖는다고 여겨진다.

이상과 같이 본 발명의 화합물과 홍두삼의 유기 용매 추출 분획은 의약으로 서 유용하며, 특히 혈당 강하제, 간장 보호제 또는 항암제로서 적합하다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 화학식 1의 화합물의 의학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 하는 혈당 강하제.

   <화학식 1>

   

   식 중, R¹은 수소 또는 수산기이고, R²는 탄소수 1 내지 4의 알킬옥시기 또는 수산기이며, R³은 탄소수 1 내지 4의 알킬옥시기를 나타낸다.
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