CN112999233B - 一类来源于赤芍的单萜苷类化合物及其制法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及一类赤芍中单萜苷类化合物及其制备方法以及该类化合物在防治过敏类疾病中的应用。经药理学实验证明，该类化合物能够有效的抑制致敏RBL‑2H3细胞中β‑氨基糖苷酶(β‑HEX)以及组胺(HIS)的释放，且可以显著降低RBL‑2H3细胞上清中炎性介质的含量，具有良好的抗过敏、抗类过敏以及抗炎作用，有效剂量可达5μmol/L。可以用于制备成防治过敏类、炎症疾病的药物。

Description

一类来源于赤芍的单萜苷类化合物及其制法和应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一类从中药赤芍中分离得到的化合物及其在防治过敏类疾病中的应用。

背景技术

过敏类疾病作为一种慢性疾病，严重影响患者的工作效率，使其生产能力下降，从而导致社会成本的提高。因此，过敏类疾病的有效安全治疗是公共卫生面临的主要挑战之一。过敏类疾病包括过敏反应(allergic reaction)和类过敏反应(anaphylactoidreaction)。其中过敏反应是过敏类疾病最紧急和潜在的严重表现，是指机体对抗原物质初次应答后，再次接受相同的抗原刺激时，发生的一种以机体生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的生理变化。据《世界变态反应组织》报告披露，全球伴有过敏类症状的人占总人口的30％～40％；患者人数众多，由于过敏反应早中期未出现严重损害生命健康的症状，这些数据往往被低估。目前在售的一些抗过敏药物大多数具有很严重的不良反应，如心律失常，精神功能障碍，胃肠道紊乱和感染等。因此探寻新的有效治疗方案迫在眉睫。

I型超敏反应和类过敏反应在临床上的症状相似，但目前对两者作用机制的区别于联系尚未完全明了。但大量的研究表明，类过敏反应与过敏反应均能引起机体释放β-氨基糖苷酶和组胺，引起平滑肌收缩，血管通透性增加等，从而引发一系列的过敏症状。RBL-2H3细胞细胞质内含有丰富的嗜碱性颗粒，当细胞发生I型过敏反应或是类过敏反应时都可以引起脱颗粒现象,即包裹着组胺、β-氨基糖苷酶的碱性颗粒逐渐向细胞膜靠近，囊泡膜与细胞膜融，内容物释放于细胞外，诱导相应过敏症状的产生。鉴于此，许多学者认为：抑制过敏性介质的释放可以成为抗过敏及抗类过敏新药研发的可行性方向。

I型超敏反应和类过敏反应在临床诊断上很难通过症状相区别，二者的主要病理改变为平滑肌收缩，毛细血管扩张，血管通透性增加，腺体分泌增加，因此消除和缓解上述症状就成为了抗过敏类疾病的必要环节。而上述一系列症状均由机体释放的一系列炎性介质导致的，其中起主要作用的介质包括HIS和β-HEX,因此，抑制上述两种介质的释放就成了过敏类疾病的治疗关键。天然产物以其毒副作用小、疗效持久、整体调节和协同效果好等优势，己成为近年来治疗过敏类疾病新药的研究热点。尽管这些天然产物的疗效评估、机制探讨仍基于实验室研究阶段，临床研究尚未提供确定性的结论，但大量的数据己奠定了一定的理论基础，为进一步优选抗过敏类疾病新药夯实了基础。

赤芍(Paeoniae Rubra Radix)，为毛茛科植物赤芍(Paeonia lactiflora)或川赤芍(Paeonia veitchii Lynch)的干燥根。归肝经。中医临床常配伍用于治疗温毒发斑，目赤肿痛，肝郁胁痛，经闭痛经，跌扑损伤，痈肿疮疡等症。现代药理学发现赤芍具有抗菌、抗炎、止痛、的药效作用。赤芍中化学成分复杂，主要为单萜类、脂肪酸类、苯酚类、木脂素类以及其它类化合物。

申请者研究发现，从赤芍中分离得到了一类单萜苷类化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，化学结构如下，经药理学实验证明该类化合物能够有效降低过敏原诱导的RBL-2H3细胞组胺以及β-氨基糖苷酶的释放量，具有良好的抑制细胞脱颗粒的作用，从而表现出良好的抗过敏类疾病的潜能，有效剂量可达5μmol/L。目前，尚未见有将上述赤芍提取物用于治疗过敏类疾病的研究报道，也未见具有抑制RBL-2H3脱颗粒的上述赤芍化合物单体的制备方法专利文献。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种抗过敏类疾病的药物。

本发明第一方面提供一类来源于赤芍的化合物；

本发明第二方面提供了这类化合物的制备方法；

本发明第三方面提供了含有这类化合物的药物组合物；

本发明第四方面提供了这类化合物在治疗过敏类疾病中的应用。

为解决上述技术问题，采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了一类来源于赤芍的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，其结构如下：

本发明第二方面提供上述赤芍化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：赤芍药材经蒸馏水浸泡后超声提取，浓缩后浸膏通过有机溶剂萃取、大孔吸附树脂层析、凝胶柱层析、反相硅胶柱层析及制备型HPLC分离纯化，得到上述化合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，经UV、IR、NMR、MS及CD等谱学手段分析鉴定其结构，为一类单萜与单糖或双糖相连的苷类加合物。

本发明第三方面涉及一种含有药物有效剂量的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1％～96％重量的本发明化合物。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg，优选的单元剂型含有5～60mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、滴眼、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季胺盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、棚酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有很大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围：本发明的化合物的用量为0.001～100mg/Kg体重，优选为0.01～75mg/kg体重，更优选为0.05～50mg/kg体重，最优选为0.06～10mg/kg体重。成人患者服用的本发明化合物每日为1～300mg，优选为4～150mg，可一次服用或分2～3次服用；儿童服用的剂量按照每kg体重0.01～15mg，优选为0.06～5mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。

本发明第四方面涉及上述赤芍化合物抗过敏类疾病方面的应用。体外抗过敏及抗类过敏药理试验结果显示该类化合物能够有效抑制RBL-2H3细胞组胺以及β-氨基糖苷酶的释放，给药浓度达50μM时，RBL-2H3细胞存活率分别为98.12％、98.34％、72.22％、76.59％。对于过敏反应，化合物可将组胺释放率由55.51％变为27.13％、39.12％、25.02％、33.61％；化合物可将β-氨基糖苷酶释放率从43.73％变为16.20％、30.38％、20.85％、44.08％。对于类过敏反应，化合物可将组胺释放率由49.23％分别降低到36.89％、32.34％、43.96％、24.08％；化合物可将β-氨基糖苷酶释放率从12.73％降低到6.74％、5.22％、7.06％、3.9％。因此上述药物通过选择性的抑制组胺以及β-氨基糖苷酶的释放来达到良好的抑制I型超敏反应和类过敏反应的目的。

有益技术效果：

1.本发明的一类赤芍化合物具有明显的抗过敏以及抗类过敏的作用，其一，能够显著抑制组胺的释放，药效可达5μmol/L。其二，能够显著抑制β-氨基糖苷酶的释放，药效也达5μmol/L。

2.本发明的一类赤芍具有进一步开发成防治过敏及类过敏疾病药物的潜力。

附图说明

图1、赤芍部位CS-1、CS-2、CS-3、CS-4的制备流程。

具体实施方式

下面的实例及药理活性实验用于进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

1.赤芍单体化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的制备方法

实施例1、化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的制备

赤芍饮片50kg，蒸馏水浸泡后超声提取3次，每次1小时。水提液直接经大孔吸附树脂进行分离，使用50％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩。50％乙醇洗脱部分继续经MCI柱分离，依次以30％乙醇、50％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，其中30％乙醇洗脱样品即为CS-3(2000g)，50％乙醇洗脱样品即为CS-4(316g)。残渣经95％乙醇提取液浓缩至无醇，用等体积乙酸乙酯萃取5次，萃取液减压浓缩，得乙酸乙酯部分CS-1(580g)和水相部位CS-2(270g)，如图1。

我们前期活性筛选发现上述赤芍部位中仅CS-4具有抗过敏作用。因此将赤芍部位CS-4进一步提取：赤芍部位CS-4甲醇溶解后，经SephadexLH-20柱分离，50％甲醇、甲醇分别洗脱，得到组分CS-4-1～CS-4-8。CS-4-3(42.8g)经反相中压色谱，条件：20％甲醇-水(60min)、20％-80％甲醇-水(240min)、80％甲醇-水(60min)、100％甲醇(30min)，分离得到CS-4-3-1～CS-4-3-13，CS-4-3-9(7.8g)经硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇50:1-1:1)分离得到K1～K20，K13经制备液相色谱(Rp C18，36％乙腈-水，230nm)得到K13-1～K13-4，K13-2经制备液相色谱(Rp C18，30％乙腈-水，210nm)分离得到化合物Ⅲ(8mg)、化合物Ⅰ(5mg)。K19经正相硅胶柱色谱(二氯甲烷-丙酮-甲醇-冰醋酸10:2:1:1)分离得到K19-1～K19-6，K19-3经制备液相色谱(Rp C18，52％甲醇-水，230nm)分离得到化合物Ⅳ(3mg)，K19-5经Flash快速分离系统(40-100％甲醇-水，120min)分离得到化合物Ⅱ(11mg)。经UV、IR、NMR、MS等谱学手段分析鉴定其结构，为单萜苷类化合物。

上述化合物波谱信息如下：

Ⅰ：淡黄色粉末；ESI-MS m/z 339[M+Na]₊；¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ:5.33(1H,m,H-2),1.18-2.06(7H,m,H-3,H-4,H-5,H-6),1.59(3H,s,H-7),1.16(3H,s,H-9),1.16(3H,s,H-10),4.44(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),3.10(1H,dd,J＝8.9,7.7Hz,H-2′),3.26(1H,d,J＝8.9Hz,H-3′),3.32(1H,t,J＝8.9Hz,H-4′),3.32(1H,ddd,J＝9.5,5.3,2.4Hz,H-5′),3.62(1H,dd,J＝11.8,5.4Hz,H-6′a),3.77(1H,dd,J＝11.8,2.4Hz,H-6′b)；¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ:135.0(C-1),122.0(C-2),28.2(C-3),45.3(C-4),25.2(C-5),32.2(C-6),23.8(C-7),81.2(C-8),23.1(C-9),25.3(C-10),98.7(C-1′),75.4(C-2′),78.4(C-3′),71.9(C-4′),77.6(C-5′),63.0(C-6′)。

Ⅱ：淡黄色粉末；ESI-MS m/z 471[M+Na]⁺；¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ:5.43(1H,m,H-2),1.72～2.20(6H,m,H-3,5,6),3.22(1H,t,J＝8.2Hz,H-4),1.69(3H,s,H-7),1.30(3H,s,H-9),1.26(3H,s,H-10),4.55(1H,d,J＝7.7Hz,H-1′),3.40～3.50(3H,m,H-2′,3′,4′),3.67(1H,dd,J＝8.5,6.4Hz,H-5′),3.93(1H,dd,J＝12.2,3.7Hz,H-6′a),4.08(1H,d,J＝12.2Hz,H-6′b),4.38(1H,d,J＝6.4Hz,H-1″),3.59(1H,dd,J＝7.8,2.7Hz,H-2″),3.43(1H,m,H-3″),3.79(1H,m,H-4),3.61(1H,dd,J＝3.9,2.7Hz,H-5″a),3.88(1H,td,J＝3.5,2.0Hz,H-5″b)；¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ:134.8(C-1),121.9(C-2),28.1(C-3),45.3(C-4),25.1(C-5),32.1(C-6),23.5(C-7),81.1(C-8),23.1(C-9),25.1(C-10),98.6(C-1′),75.3(C-2′),78.2(C-3′),71.7(C-4′),76.3(C-5′),69.2(C-6′),104.8(C-1″),72.3(C-2″),74.0(C-3″),69.5(C-4″),66.2(C-5″)。

Ⅲ：白色粉末；ESI-MS m/z 335[M+Na]⁺；₁H NMR(CD₃OD,600MHz)δ:7.22(2H,d,J＝8.0Hz,H-2,6),7.35(2H,d,J＝8.0Hz,H-3,5),4.65(1H,d,J＝11.6Hz,H-7a),4.90(1H,d,J＝11.6Hz,H-7b),2.90(1H,p,J＝6.9Hz,H-8),1.25(6H,d,J＝6.9Hz,H-9,10),4.35(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),3.25(1H,m,H-2′),3.28(1H,dd,J＝5.7,2.1Hz,H-3′),3.30(1H,d,J＝8.5Hz,H-4′),3.35(1H,m,H-5′),3.70(1H,dd,J＝11.9,5.7Hz,H-6′a),3.91(1H,dd,J＝11.9,2.2Hz,H-6′b)；₁₃C NMR(CD₃OD,150MHz)δ:136.5(C-1),129.6(C-2,6),127.4(C-3,5),149.8(C-4),71.8(C-7),35.3(C-8),24.6(C-9,10),103.3(C-1′),75.3(C-2′),78.3(C-3′),71.9(C-4′),78.2(C-5′),63.0(C-6′)。

Ⅳ：淡黄色粉末；ESI-MS m/z 481[M+Na]⁺；¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ:7.35(1H,d,J＝8.0Hz,H-2),7.22(1H,d,J＝8.0Hz,H-3),7.22(1H,d,J＝8.0Hz,H-5),7.35(1H,d,J＝8.0Hz,H-6),4.82(1H,d,J＝11.5Hz,H-7a),4.62(1H,d,J＝11.5Hz,H-7b),2.91(1H,dt,J＝13.8,6.9Hz,H-8),1.25(3H,d,J＝6.9Hz,H-9),1.25(3H,d,J＝6.9Hz,H-10),4.33(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),3.25(1H,t,J＝8.3Hz,H-2′),3.31(1H,dd,J＝9.0,7.0Hz,H-3′),3.36(1H,t,J＝8.8Hz,H-4′),3.41(1H,ddd,J＝8.8,6.2,1.6Hz,H-5′),4.02(1H,dd,J＝11.2,1.6Hz,H-6′a),3.66(1H,dd,J＝11.2,6.2Hz,H-6′b),4.82(1H,d,J＝1.7Hz,H-1″),3.89(1H,dd,J＝3.3,1.7Hz,H-2″),3.72(1H,m,H-3″),3.37(1H,m,H-4″)3.73(1H,dd,J＝9.5,6.0Hz,H-5″),1.30(3H,d,J＝6.2Hz,H-6″)；¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ:136.1(C-1),129.6(C-2),127.3(C-3),149.7(C-4),127.3(C-5),129.6(C-6),69.8(C-7),35.2(C-8),24.5(C-9),24.5(C-10),102.3(C-1′),75.1(C-2′),78.0(C-3′),71.6(C-4′),76.9(C-5′),68.1(C-6′),102.9(C-1″),72.2(C-2″),72.4(C-3″),74.0(C-4″),71.7(C-5″),18.1(C-6″)。

二、赤芍部位的药理活性实验

实验例1

赤芍部细胞毒性探索

培养箱中取出处于对数生长期的RBL-2H3细胞，将细胞消化制备成细胞悬液。使用手持式细胞计数器(型号：scepter)计算细胞密度。用新鲜完全培养基调整细胞数至1×10⁵个/ml，接种于96孔板中，每孔200μL，每接种三个孔混匀一次细胞悬液，培养24h后，弃去上清，分别加入新鲜培养基配置的不同浓度(0.2μg/ml，T2为2μg/ml，T3为20μg/ml)的待筛药物，每组3个复孔，另设正常组(不加药物的细胞空白孔)和调零孔(不接种细胞空白孔)，培养24h后，弃去上清，加入无血清配置的MTT溶液200μL(无血清培养基：5mg/ml：MTT＝1:10),孵育4h，离心400g/5min，弃上清，加入150μL DMSO,充分震荡使结晶溶解后，于570nm下测定各孔OD值。

细胞活力(％)＝(药物组OD值-调零组OD值)/(正常组OD值-调零组OD值)×100％

结果见表1。如表1，各药物作用于RBL-2H3细胞后，细胞的存活率均高于95％，由此可见，赤芍部位的细胞毒性较小，可以认为赤芍部位在给药剂量为20μg/ml时不存在细胞毒性。由上述结果可知，赤芍部位细胞毒性较小，安全性很高。可选取0.2-20μg/ml为给药的剂量选择范围，进一步探讨该部位对抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒HIS及β-HEX释放率的影响。

表1 赤芍部位对RBL-2H3细胞的细胞毒作用(平均值±标准差，n＝6)

实验例2

研究赤芍部位对过敏反应导致的RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

取对数生长期的细胞消化，调整细胞密度至1×10⁵个/ml。200μL/孔加入到96孔板内，设置调零孔、空白对照孔、总酶孔及各给药孔。给药孔分为模型对照组、T1、T2和T3组，其中T1给药终浓度为0.2μg/ml，T2为2μg/ml，T3为20μg/ml。孵育过夜，调零孔、正常孔以及总酶孔加入完全培养基正常培养，模型组加入终浓度为750ng/ml的完全培养基配置的anti-DNP-IgE 200μL，给药孔分别加入各浓度药物及终浓度为750ng/ml的anti-DNP-IgE共200μL，孵育24h，后离心，加入改良台式液清洗至无残留培养基，调零孔、空白对照孔加入空白改良台式液200μL，总酶孔加入1％的TritonX-100裂解液200μL，给药组及模型对照组加入改良台式液配置的终浓度为1μg/mL的DNP-BSA，培养2h后，3000r/5min离心取上清，测定组胺及β-氨基糖苷酶释放量并显微镜观察细胞形态。组胺释放量测定方法如下：取细胞上清100μL，加入组胺底物20μL，加入NaOH 20μL，37℃孵育15min，加入终止液3％HCL溶液终止反应，稳定15min后在激发波长为355nm，发射波长为460nm处测定各组荧光值。根据各组所测荧光值，按以下公式计算组胺释放率：

组胺释放率(％)＝(样品上清荧光值-调零组上清荧光值)/(总酶孔荧光值-调零组上清荧光值)×100％

β-氨基糖苷酶释放量测定方法如下：取细胞上清50μL，加入β-氨基糖苷酶底物，37℃孵育45min，加入终止液NaHCO3/Na2CO3 200μL终止反应，405nm下测定各孔吸光度。根据各组所测OD值，按以下公式计算β-氨基糖苷酶释放率：

β-氨基糖苷酶释放率(％)＝(样品上清值-调零值)/(总酶孔值-调零值)×100％

如表2，组胺以及β-氨基糖苷酶释放率测定结果表明，750ng/ml的anti-DNP-IgE刺激、1μg/ml的DNP-BAS激发可显著提升细胞培养上清中组胺以及β-氨基糖苷酶的含量(P<0.001,P<0.001),而上述赤芍化合物在20μg/mL时可抑制组胺和β-氨基糖苷酶释放的释放(P<0.001,P<0.001)。

表2 赤芍部位对过敏反应导致的细胞脱颗粒的影响(0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL,平均值±标准差，n＝6)

^###P<0.001vs空白对照组，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型对照组

实验例3

赤芍部位对类过敏反应导致的细胞脱颗粒的影响(0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL,平均值±标准差，n＝6)

96孔板内，设置调零孔、空白对照孔、总酶孔及各给药孔。给药孔分为模型对照组、T₁、T₂和T₃组，其中T₁给药终浓度为0.2μg/mL，T₂为2μg/mL，T₃为20μg/mL。模型对照组加入终浓度为15μg/ml的改良台式液配置的C48/80溶液。给药孔分别加入改良台式液配置的各浓度药物及终浓度为15μg/ml C48/80共200μL，调零孔、空白对照孔加入空白改良台式液200μL，总酶孔加入1％的TritonX-100裂解液200μL，孵育1h后3000r/5min离心取上清，测定组胺及β-氨基糖苷酶释放量。测定方法同上。

如表3，组胺以及β-氨基糖苷酶释放率测定结果表明，15μg/ml的C48/80可显著提升细胞培养上清中组胺以及β-氨基糖苷酶的含量(P<0.001,P<0.001),而上述赤芍化合物在2-20μg/mL剂量范围内可选择性抑制组胺或β-氨基糖苷酶释放的释放。其中组胺：在20μg/mL的给药剂量下，可能显著性降低其释放量(P<0.001)。对于β-氨基糖苷酶：在2μg/mL给药剂量下，能显著性降低其释放量(P<0.001)。

表3 赤芍部位对类过敏反应导致的细胞脱颗粒的影响(0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL,平均值±标准差，n＝6)

^###P<0.001vs空白对照组，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型对照组

由实验例2和实验例3中结果可知，在各给药剂量下，CS-1,CS-2,CS-3均无抗过敏以及抗类过敏作用。在20μg/mL的给药剂量下仅赤芍部位CS-4能显著性抑制过敏反应以及类过敏反应导致的细胞脱颗粒中组胺以及β-氨基糖苷酶的释放(P<0.001)。因此对CS-4部位进行了进一步的提取和分离。

三、赤芍单体化合物的药理活性实验

国内外研究发现，自然界常见的过敏原有花粉、粉尘、柳絮、动物的皮毛、油烟、食物、药物等，出现在生活的各个环节，这些过敏原均能引起机体出现过敏或类过敏反。本发明通过药理学实验，发现化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ具有明显的抑制组胺及β-氨基糖苷酶释放的作用，可用于制备成预防或治疗过敏类疾病的药物。

实验例4赤芍化合物细胞毒性探索

培养箱中取出处于对数生长期的RBL-2H3细胞，将细胞消化制备成细胞悬液。使用手持式细胞计数器(型号：scepter)计算细胞密度。用新鲜完全培养基调整细胞数至1×10⁵个/ml，接种于96孔板中，每孔200μL，每接种三个孔混匀一次细胞悬液，培养24h后，弃去上清，分别加入新鲜培养基配置的不同浓度(0.08、0.2、4、10、50μM)的待筛药物，每组3个复孔，另设正常组(不加药物的细胞空白孔)和调零孔(不接种细胞空白孔)，培养24h后，弃去上清，加入无血清配置的MTT溶液200μL(无血清培养基：5mg/ml：MTT＝1:10),孵育4h，离心400g/5min，弃上清，加入150μL DMSO,充分震荡使结晶溶解后，于570nm下测定各孔OD值。

细胞活力(％)＝(药物组OD值-调零组OD值)/(正常组OD值-调零组OD值)×100％

结果见表1。如表1，各药物作用于RBL-2H3细胞后，细胞的存活率均高于70％，由此可见，赤芍化合物的细胞毒性较小，化合物Ⅰ和Ⅱ作用下，细胞的存活率高于95％，可以认为上述两种化合物在给药剂量为50μM时不存在细胞毒性。由上述结果可知，赤芍化合物细胞毒性较小，安全性很高。可选取50-0.08μM为给药的剂量选择范围，进一步探讨各药物对抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒HIS及β-HEX释放率的影响。

表4 赤芍化合物对RBL-2H3细胞的细胞毒作用(平均值±标准差，n＝6)

实验例5

研究赤芍化合物对过敏反应导致的RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

取对数生长期的细胞消化，调整细胞密度至1×10⁵个/ml。200μL/孔加入到96孔板内，设置调零孔、空白对照孔、总酶孔及各给药孔。给药孔分为模型对照组、T₁、T₂和T₃组，其中T₁给药终浓度为50μM，T₂为25μM，T₃为5μM。孵育过夜，调零孔、正常孔以及总酶孔加入完全培养基正常培养，模型组加入终浓度为750ng/ml的完全培养基配置的anti-DNP-IgE 200μL，给药孔分别加入各浓度药物及终浓度为750ng/ml的anti-DNP-IgE共200μL，孵育24h，后离心，加入改良台式液清洗至无残留培养基，调零孔、空白对照孔加入空白改良台式液200μL，总酶孔加入1％的TritonX-100裂解液200μL，给药组及模型对照组加入改良台式液配置的终浓度为1μg/mL的DNP-BSA，培养2h后，3000r/5min离心取上清，测定组胺及β-氨基糖苷酶释放量并显微镜观察细胞形态。组胺释放量测定方法如下：取细胞上清100μL，加入组胺底物20μL，加入NaOH 20μL，37℃孵育15min，加入终止液3％HCL溶液终止反应，稳定15min后在激发波长为355nm，发射波长为460nm处测定各组荧光值。根据各组所测荧光值，按以下公式计算组胺释放率：

组胺释放率(％)＝(样品上清荧光值-调零组上清荧光值)/(总酶孔荧光值-调零组上清荧光值)×100％

β-氨基糖苷酶释放量测定方法如下：取细胞上清50μL，加入β-氨基糖苷酶底物，37℃孵育45min，加入终止液NaHCO₃/Na₂CO₃ 200μL终止反应，405nm下测定各孔吸光度。根据各组所测OD值，按以下公式计算β-氨基糖苷酶释放率

β-氨基糖苷酶释放率(％)＝(样品上清值-调零值)/(总酶孔值-调零值)×100％

显微镜观察结果表明，正常组RBL-2H3细胞呈长梭形，边缘完整，结构致密。而模型组的细胞体积增大，边缘不整，出现大量的空泡或颗粒样结构，可见大部分细胞膜破裂，有颗粒样物质渗出。给予赤芍化合物细胞状态明显好转，空泡样结构明显减少，提示赤芍化合物可有效保护细胞形态完好，抑制颗粒样物质渗出。

如表5，组胺以及β-氨基糖苷酶释放率测定结果表明，750ng/ml的anti-DNP-IgE刺激、1μg/ml的DNP-BAS激发可显著提升细胞培养上清中组胺以及β-氨基糖苷酶的含量(P<0.001,P<0.001),而上述赤芍化合物在5-50μM剂量范围内可选择性抑制组胺或β-氨基糖苷酶释放的释放。其中组胺：在50μM给药剂量下均能显著性降低其释放量。其中化合物Ⅲ、Ⅳ在5μM的剂量下仍能显著性降低细胞上清中组胺含量(P<0.001)。对于β-氨基糖苷酶：在25μM给药剂量下，除了化合物Ⅳ外均能显著性降低其释放量。其中7化合物Ⅰ和Ⅲ在5μM的剂量下仍能显著性降低细胞上清中β-氨基糖苷酶的含量(P<0.001)。

表5 赤芍化合物对过敏反应导致的细胞脱颗粒的影响(5μM、25μM、50μM,平均值±标准差，n＝6)

^###P<0.001vs空白对照组，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型对照组

实验例6

赤芍化合物对类过敏反应导致的细胞脱颗粒的影响(50μM、25μM、5μM,平均自±标准差，n＝6)

96孔板内，设置调零孔、空白对照孔、总酶孔及各给药孔。给药孔分为模型对照组、T₁、T₂和T₃组，其中T₁给药终浓度为50μM，T₂为25μM，T₃为5μM。模型对照组加入终浓度为15μg/ml的改良台式液配置的C48/80溶液。给药孔分别加入改良台式液配置的各浓度药物及终浓度为15μg/ml C48/80共200μL，调零孔、空白对照孔加入空白改良台式液200μL，总酶孔加入1％的TritonX-100裂解液200μL，孵育1h后3000r/5min离心取上清，测定组胺及β-氨基糖苷酶释放量。测定方法同上。

如表6，组胺以及β-氨基糖苷酶释放率测定结果表明，15μg/ml的C48/80可显著提升细胞培养上清中组胺以及β-氨基糖苷酶的含量(P<0.001,P<0.001),而上述赤芍化合物在5-50μM剂量范围内可选择性抑制组胺或β-氨基糖苷酶释放的释放。其中组胺：在50μM给药剂量下，除了化合物Ⅲ外均能显著性降低其释放量(P<0.001)。其中化合物Ⅳ在5μM的剂量下仍能显著性降低细胞上清中组胺含量(P<0.001)。对于β-氨基糖苷酶：在25μM给药剂量下，均能显著性降低其释放量(P<0.001)。

表6 赤芍化合物对类过敏反应导致的细胞脱颗粒的影响(5μM、25μM、50μM,平均值±标准差，n＝6)

^###P<0.001vs空白对照组，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型对照组

由实验例2和实验例3中结果可知，在50μM给药剂量下Ⅰ和Ⅱ均能显著性抑制过敏反应以及类过敏反应导致的细胞脱颗粒中组胺以及β-氨基糖苷酶的释放(P<0.001)。在5μM给药剂量下，Ⅰ和Ⅲ仍表现出了很强的抗过敏作用(P<0.001)。Ⅳ表现出了较强的抗类过敏作用，其在抗过敏作用方面存在选择性，Ⅳ对β-氨基糖苷酶的释放无明显影响，但在5μM给药剂量下，仍能显著性抑制组胺的释放量(P<0.001)。

实验例7

赤芍化合物对过敏反应引起的细胞上清中TNF-α及IL-4的影响

取对数生长期的细胞消化，调整细胞密度至1×10⁵个/ml。500μL/孔加入到24孔板内，设置调零孔、空白对照孔、及各给药孔。给药孔分为模型对照组、T₁、T₂和T₃组，其中T₁给药终浓度为50μM，T₂为25μM，T₃为5μM。孵育过夜，调零孔、正常孔以及总酶孔加入完全培养基正常培养，模型组加入终浓度为750ng/ml的完全培养基配置的anti-DNP-IgE 200μL，给药孔分别加入各浓度药物及终浓度为750ng/ml的anti-DNP-IgE共200μL，孵育24h，后离心，加入改良台式液清洗至无残留培养基，调零孔、空白对照孔加入空白改良台式液200μL，给药组及模型对照组加入改良台式液配置的终浓度为1μg/mL的DNP-BSA，培养2h后，3000r/5min离心取上清，按照江苏晶美生物科技有限公司大鼠TNF-α、IL-4试剂盒说明书方法，检测上清中炎性因子TNF-α、IL-4的含量。

如表7，炎性介质TNF-α、IL-4释放的检测结果表明，750ng/ml的anti-DNP-IgE刺激、1μg/ml的DNP-BAS激发可显著提升细胞培养上清中TNF-α及IL-4的含量(P<0.001,P<0.001),而赤芍化合物在50μM剂量作用下能显著性抑制TNF-α和IL-4的释放。其中TNF-α：除化合物Ⅳ外，其他赤芍化合物在25μM剂量作用下均能显著抑制其在上清中的含量(P<0.01)，化合物Ⅰ在5μM剂量作用下仍能显著抑制其含量(P<0.05)。IL-4：除了化合物Ⅳ，在25μM剂量作用下，其他赤芍化合物均能显著抑制IL-4在上清中的含量(P<0.01)。

表7 赤芍化合物对过敏反应引起的细胞上清中TNF-α及IL-4的影响(5μM、25μM、50μM,平均值±标准差，n＝6)

^###P<0.001vs空白对照组，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型对照组

实验例8

赤芍化合物对类过敏反应导致的细胞上清中TNF-α及IL-4的影响

取对数生长期的细胞消化，调整细胞密度至1×10⁵个/ml。500μL/孔加入到24孔板内，设置调零孔、空白对照孔、及各给药孔。给药孔分为模型对照组、T₁、T₂和T₃组，其中T₁给药终浓度为50μM，T₂为25μM，T₃为5μM。模型对照组加入终浓度为15μg/ml的改良台式液配置的C48/80溶液。其余给药孔分别加入改良台式液配置的各浓度药物及终浓度为15μg/mlC48/80共200μL，调零孔、空白对照孔加入空白改良台式液200μL。孵育1h后3000r/5min离心取上清，按照江苏晶美生物科技有限公司大鼠TNF-α、IL-4试剂盒说明书方法，检测上清中炎性因子TNF-α、IL-4的含量。

如表8，炎性介质TNF-α、IL-4释放的检测结果表明，15μg/ml的C48/80可显著提升细胞培养上清中TNF-α及IL-4的含量(P<0.001,P<0.001),而赤芍化合物在50μM剂量作用下均能显著性抑制TNF-α和IL-4的释放。其中TNF-α：除了Ⅲ外，在25μM剂量作用下其他赤芍化合物均能显著抑制其在上清中的含量(P<0.001)。IL-4：在25μM剂量作用下，Ⅰ和Ⅳ均能显著抑制IL-4在细胞上清中的含量(P<0.001，P<0.01)。

表8赤芍化合物对类过敏反应导致的细胞上清中TNF-α及IL-4的影响(50μM、25μM、5μM,平均值±标准差，n＝6)

^###P<0.001vs空白对照组，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型对照组

由实验例7和实验例8可知，赤芍化合物可选择性抑制RBL-2H3细胞上清中TNF-α及IL-4的含量，具有良好的抗炎作用。由实验例5和实验例6可知赤芍化合物可显著抑制过敏以及类过敏反应导致的RBL-2H3细胞脱颗粒，降低细胞组胺以及β-氨基糖苷酶的释放，具有良好的抗过敏以及抗类过敏作用。由实例4和实验例1可知，上述赤芍部位及化合物的安全性较高，由实验例2和实验例3中结果可知，在20μg/mL的给药剂量下赤芍部位能显著性抑制过敏反应以及类过敏反应导致的细胞脱颗粒中组胺以及β-氨基糖苷酶的释放(P<0.001)。赤芍单体化合物普遍产生显著性差异的浓度为25μM/L,对上述四种赤芍化合物的相对分子质量分别为316、448、312、458，则转化单位后，化合物作用的最高浓度分别为7.9μg/mL，11.2μg/mL，7.8μg/mL，11.4μg/mL，上述浓度小于20μg/mL给药部位的剂量，因此，赤芍单体化合物的抗过敏以及类过敏的作用强于赤芍部位(CS-4)。

因此由上述实验结果可见，赤芍化合物安全性较高，具有良好的抗过敏、抗类过敏及抗炎活性，且赤芍单体相比与部位活性更强。

注：过敏反应分为两个阶段，及刺激阶段和激发阶段，在上述实验中，过敏反应阳性药分为激发剂和刺激激，其中刺激剂为anti-DNP-IgE，中文名称为抗二硝基苯酚IgE单克隆抗体。激发剂为DNP-BSA，中文名称为二硝基苯酚-牛血清白蛋白；类过敏反应阳性药为C48/80，属于肥大细胞活化剂。

Claims (4)

1.一类单萜苷类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防、缓解和/或治疗过敏类疾病药物中的应用，其特征在于，所述的化合物选自如下群组，

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化合物药学上可接受的盐选自化合物与无机酸或有机酸形成的盐。

3.一种药物组合物在制备预防、缓解和/或治疗过敏类疾病药物中的应用，其特征在于，该药物组合物含有治疗有效量的如下化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液、滴眼剂或吸入剂。