CN111662349B - 密蒙花提取物、其制备方法及用途 - Google Patents

密蒙花提取物、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种密蒙花提取物、其制备方法及其在制备用于治疗或预防视网膜退行性病变的药物中的用途。本申请采用水性溶液提取密蒙花，得到了一种密蒙花提取物，在该提取物中，芹菜素‑7,4’‑二‑O‑β‑D‑葡糖苷酸、松果菊苷、毛蕊花甙、异毛蕊花苷和芹菜素‑7‑O‑芸香糖甙五种化合物的总重量占提取物总重量的10％以上。经过实验验证，上述提取物对VEGFR‑1和VEGFR‑2均有很好的抑制活性，并且可以显著抑制视网膜光感受器细胞退行性改变的发生，可被用于治疗或预防视网膜退行性病变。

Description

密蒙花提取物、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地，本发明涉及一种密蒙花提取物、其制备方法、及其在制备治疗或预防视网膜退行性病变的药物中的用途，以及含有所述密蒙花提取物的药物组合物。
背景技术
视网膜退行性疾病是一类以视网膜光感受器细胞死亡为核心病理改变的，可引起严重视力障碍甚至失明的眼底病，是临床上常见的严重致盲性眼部疾病，主要包括年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)、糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)以及视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)等病症。其中，AMD是发达国家老年人低视力和致盲的首要原因，全球约有3000万老年黄斑变性患者，每年约有50万人因此而致盲，在全球致盲原因中居第三位。随着我国社会人口老龄化加剧，该疾病已逐渐成为50岁以上人群的主要致盲原因。目前，AMD治疗主要以抗VEGF药物为主，如贝伐单抗、雷珠单抗、哌加他尼等，但该类药物存在给药途径局限(眼内注射)、易致患者出现诸多不良反应(眼内炎、眼压增高、前房炎症、胃肠道反应、休克、心力衰竭)等副作用。DR是糖尿病患者最主要也是最为常见的微血管并发症，在发达国家已成为20-64岁人群致盲的主要原因，而糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)则是引起糖尿病患者视力受损的常见原因。糖尿病视网膜病变发病率随糖尿病病程的加长而逐渐升高，10年以上者发病率增至69％～90％。病程15年以上的糖尿病患者约2％因视网膜病变而失明，约10％的患者表现为严重的视力损伤。光感受器细胞死亡及其导致感光功能障碍见于糖尿病视网膜病变发病早期。针对糖尿病视网膜病变的光感受器细胞死亡的现代医学治疗干预尚存在大量空白。据统计我国糖尿病患病率已达9.7％，而其中DR人群也将不断增加。目前，DR、DME的确切发病机制尚不清楚，但普遍认为持续高血糖状态下视网膜缺氧导致了视网膜屏障破坏和血管通透性改变，最终导致DR、DME的发生。RP是一种以遗传因素为主导的进行性、营养不良性的视网膜退行性病变，涉及基因多样，甚至同一基因可在不同患者中表现为不同的突变，在全球各国的发病率约为1/4000，是世界范围内最常见、最严重的致盲性眼部疾病之一。其典型的临床表现为夜盲、进行性视野缩窄，晚期可致管状视野和中心视力丧失，目前尚无有效治疗方法。近年来，研究发现早期视杆细胞病变同样会导致视网膜内VEGF形成，因此抗VEGF药物可能对早期的RP患者具有治疗作用。
新生血管的形成被认为是视网膜退行性疾病的病理基础和重要临床表现，而血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor,VEGF)则在视网膜新生血管形成过程中发挥了主要作用，与视网膜退行性疾病的发作密切相关。VEGF与特异性受体VEGFR-1和VEGFR-2结合后可调控血管通透性及内皮细胞的增生、移行，发生自身磷酸化，激活后启动细胞内信号传导系统，从而导致机体产生分解血管基底膜所需要的蛋白酶及整合素，降解血管基底膜、促使内皮细胞有丝分裂，最终形成血管管腔。目前医学上已经证实VEGFR抑制剂是一种有效的治疗视网膜退行性疾病的药物，因此，现有的视网膜退行性疾病一线治疗药物多以抗VEGFR化药为主，采用眼内玻璃体注射给药，能有效缓解相关症状，但治疗的同时也伴有诸如易致眼部感染、眼内压升高以及胃肠道不适等多种不良反应，且长期使用会产生耐药性，从而导致药物失效。
中药密蒙花为马钱科醉鱼草属植物密蒙花(Buddleia officinalis Maxim.)的干燥花蕾和花序，又名小锦花、黄饭花、鸡骨头花、染饭花等，广泛分布于我国西南、中南等地。该药始载于《开宝本草》，为传统中药中重要的眼科用药，具有疏风清热，养肝明目，退翳功效，用于目赤肿痛，多泪羞明，眼生翳膜，肝虚目暗，视物昏花等症。截至目前，国内外学者已从密蒙花中分离得到了黄酮类、苯乙醇苷类、三萜及其皂苷类、单萜、环烯醚萜和挥发油等多种成分，但上述单体化合物的药理活性研究较少。目前报道的该中药对眼部疾病活性的报道集中在提取物层面。
沈志华等通过小鼠实验发现密蒙花水煎液可减少小鼠碱烧伤角膜新生血管生成，但对于水煎液中发挥药效的物质并不明确(沈志华，中国中医眼科杂志，2016,26(3)：161-165)。
接传红等通过研究发现密蒙花水煎液可阻滞经VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增生，但同样未明确密蒙花水煎液中发挥治疗作用的关键小分子化合物及其作用机制(接传红，眼科，2004,13(6)：348-351)。
吴正正等从血管内皮生长因子-血管内皮生长因子受体(VEGF-VEGFR)信号传导机制方面研究了密蒙花方抑制缺氧状态下人血管内皮细胞增殖的作用机制，证实密蒙花方可干预细胞内VEGF-VEGFR信号传导通路抑制缺氧状态下HUVEC的增殖(吴正正，中国中医眼科杂志，2011,21(5)：249-252)。该方由黄芪、女贞子、益母草、黄连、肉桂和密蒙花六味药材组成，化学成分复杂，且并未研究各单味药是否作用于VEGF-VEGFR信号传导通路从而具有抑制缺氧状态下HUVEC的增殖的药理活性，从其公开内容无法获知哪些药理组分可作用于VEGF-VEGFR信号传导通路并具有抑制缺氧状态下HUVEC的增殖的药理活性。
因此，研究中药，特别是密蒙花中具有VEGFR抑制活性并具有视网膜退行性疾病的治疗效果的有效成分仍具有非常大的现实意义。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种可以用于治疗或预防视网膜退行性病变的药物或药物组合物及其制备方法和制药用途。
一方面，本发明提供了一种密蒙花提取物，其包含：
化合物Ⅰ：芹菜素-7,4’-二-O-β-D-葡糖苷酸(Apigenin-7,4’-di-O-β-D-glucuronide)
Figure BDA0001985989730000031
化合物Ⅱ：松果菊苷(Echinacoside)
Figure BDA0001985989730000032
化合物Ⅲ：毛蕊花甙(Verbascoside)
Figure BDA0001985989730000033
化合物Ⅳ：异毛蕊花苷(Isoacteroside)
Figure BDA0001985989730000041
和
化合物Ⅴ：芹菜素-7-O-芸香糖甙(Apigenin-7-O-rutinoside)
Figure BDA0001985989730000042
其中，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的总重量占提取物总重量的10％-60％，优选20％-60％。
在具体实施方式中，在所述密蒙花提取物中，化合物Ⅰ含量大于2％，优选大于5％，更优选大于9％；化合物Ⅱ含量大于1％，优选大于3％，更优选大于7％；化合物Ⅲ含量大于5％，优选大于9％，更优选大于20％；化合物Ⅳ含量大于1％，优选大于3％；化合物Ⅴ含量大于0.5％，优选大于1％，更优选大于4％。
另一方面，本发明提供了上述密蒙花提取物的制备方法，所述方法包括：采用水性溶液提取密蒙花一次或多次，优选两次以上，得到密蒙花水性提取液。
优选地，上述制备方法进一步包括浓缩所述密蒙花水性提取液的步骤。
上述制备方法中，术语“水性溶液”可以是指纯水(不含醇性有机溶剂)，或含醇百分比小于或等于50％的水-醇混合体系溶液，优选纯水。
上述制备方法中，优选地，所述水性溶液中水的含量大于50％，优选所述水性溶液为纯水。
上述制备方法中，通过采用水性溶液提取密蒙花两次或更多次得到粗提物，然后采用大孔树脂对所述粗提物纯化，可得到化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ重量占提取物总重量的50％以上的密蒙花提取物。
另一方面，本发明提供了上述密蒙花提取物在制备治疗或预防视网膜退行性病变的药物中的用途。
上述用途中，所述视网膜退行性病变包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病变DR)以及视网膜色素变性(RP)等病症。
进一步地，本发明提供了上述密蒙花提取物在制备抑制光感受器细胞死亡的药物中的用途。
进一步地，本发明提供了上述密蒙花提取物在制备维持视网膜外核层形态、防治视网膜外核层损伤或防治视网膜外核层厚度降低的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了上述密蒙花提取物在制备VEGFR抑制剂药物中的用途。所述VEGFR包括VEGFR1和VEGFR2。
再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述密蒙花提取物，任选地，还包含药学上可接受的载体。
进一步地，所述药物组合物中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的总重量占药物组合物中活性成分总重量的50％以上，或者，从药物组合物中基本上除去化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ后，该药物组合物的VEGFR抑制活性和/或治疗视网膜退行性病变的生物活性降低50％以上。
再一方面，本发明提供了一种制备上述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的制备方法，包括以下步骤：
a)用水性溶液一次或多次提取原料药密蒙花，得到密蒙花水性提取液，任选地浓缩所得提取液；以及
b)将由步骤a)得到的密蒙花水性提取液采用大孔吸附树脂纯化，用水洗脱掉多糖、蛋白质成分，然后采用5％-60％乙醇溶液洗脱以获得富含化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组分的提取物；或
b’)将由步骤a)得到的密蒙花水性提取液采用乙酸乙酯快速萃取获得含有化合物Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的提取物；进一步，将经乙酸乙酯萃取后的密蒙花水性提取液，采用正丁醇萃取，快速获得含有化合物Ⅱ及余下的化合物Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的提取物；经正丁醇萃取后余下的密蒙花水性提取液则主要含有化合物Ⅰ。
优选地，上述步骤a)中所述水性溶液中水的含量大于30％，优选大于50％，最优选水。
优选地，上述步骤b)中，可以将由步骤a)得到的密蒙花水性提取液采用大孔吸附树脂反复多次纯化，以使化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ五个单体化合物的重量占提取物总重量达50％以上。
优选地，上述步骤b’)中，上述萃取部位还可被任选地用大孔吸附树脂纯化，所述用大孔吸附树脂纯化可以通过包含如下步骤的实现：
i)将步骤b’)中分离获得的不同萃取部位用水性溶剂溶解制成水性溶液，任选地除去残留的有机溶剂；
ii)将任选除去残留有机溶剂的水性溶液加到大孔树脂上；
iii)用水性洗脱液除掉蛋白质、多糖组分；
iv)用醇性洗脱液洗脱、浓缩所得洗脱液得到纯化的密蒙花提取物。
优选地，上述iv)中，密蒙花提取物还可任意选用反相硅胶、Sep-LH20凝胶进行纯化，采用醇性溶剂梯度或等度洗脱，浓缩所得洗脱液即可获得纯度达90％以上的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。
优选地，上述步骤b)中，所述大孔树脂为D101或DIAION HP20。
优选地，上述步骤iii)所述水性洗脱液中水的含量大于80％，优选大于90％，最优选所述水性洗脱液为水。
优选地，上述步骤iv)中所述醇性洗脱液为乙醇-水混合体系，优选10％的乙醇，进一步最优选20％的乙醇，最优选40％的乙醇。
另一方面，本发明提供了上述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ或Ⅴ，或它们药学上可接受盐在制备治疗或预防视网膜退行性病变药物中的用途。
上述用途中，所述视网膜退行性病变包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病变DR)以及视网膜色素变性(RP)等病症。
进一步地，本发明提供了上述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ或Ⅴ，或它们药学上可接受盐在制备抑制光感受器细胞死亡的药物中的用途。
进一步地，本发明提供了上述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ或Ⅴ，或它们药学上可接受盐在制备维持视网膜外核层形态、防治视网膜外核层损伤或防治视网膜外核层厚度降低的药物中的用途。
再一方面，本发明提供了上述上述化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ或Ⅴ，或它们药学上可接受盐在制备VEGFR抑制剂药物中的用途。
再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含化合物Ⅰ(Apigenin-7,4’-di-O-β-D-glucuronide)
Figure BDA0001985989730000061
或其药学可接受的盐；或
化合物Ⅱ(Echinacoside)
Figure BDA0001985989730000071
或其药学可接受的盐；或
化合物Ⅲ(Verbascoside)
Figure BDA0001985989730000072
或其药学可接受的盐；或
化合物Ⅳ(Isoacteroside)
Figure BDA0001985989730000073
或其药学可接受的盐；或
化合物Ⅴ(Apigenin-7-O-rutinoside)
Figure BDA0001985989730000081
或其药学可接受的盐；或化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或它们药学上可接受盐的任意混合物，任选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
具体地，本发明所述药物组合物可以是片剂、硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂、颗粒剂、乳剂、悬浮液、溶液和用于口服或非口服给药的缓释制剂的形式。
本发明所述药学上可接受载体是指本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体，本发明的药学上可接受载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、助流剂、掩味剂、表面活性剂、防腐剂等。填充剂包括但不限于乳糖、微晶纤维素、淀粉、糖粉、糊精、甘露醇、硫酸钙等。润湿剂与黏合剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂包括但不限于羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯垸酮、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素等。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、月桂醇硫酸镁等。粘合剂包括但不限于阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、预明胶化淀粉、藻酸钠、山梨醇、淀粉、糖浆和黄蓍胶。助流剂包括但不限于胶体二氧化硅、粉状纤维素、三硅酸镁、二氧化硅和滑石粉。掩味剂包括但不限于阿斯巴坦、甜菊苷、果糖、葡萄糖、糖浆、蜂蜜、木糖醇、甘露醇、乳糖、山梨醇、麦芽糖醇、甘草甜素。表面活性剂包括但不限于吐温-80、泊洛沙姆。防腐剂包括但不限于尼泊金酯、苯甲酸钠、山梨酸钾等。
本发明所述药学上可接受的盐包括并不限于与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸形成的盐，与甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸的酸性加成盐，或与碱形成的盐，如钠、钾等无机碱的盐，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成的碱性加成盐。
再一方面，本发明提供了上述药物组合物在制备治疗视网膜退行性病变药物中的用途。
进一步地，本发明提供上了述药物组合物在制备抑制光感受器细胞死亡的药物中的用途。
进一步地，本发明提供了上述药物组合物在制备维持视网膜外核层形态、防治视网膜外核层损伤或防治视网膜外核层厚度降低的药物中的用途。
再一方面，本发明提供了上述药物组合物在制备VEGFR抑制剂药物中的用途。
有益效果
本发明通过提取工艺富集得到了密蒙花提取液以及进一步得到密蒙花中的5个化合物(化合物I～V)，并证实它们对VEGFR-1和VEGFR-2的抑制活性。经动物体内实验证实化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ可有效维持视网膜外核层形态、防治视网膜外核层损伤、防治视网膜外核层厚度降低，有效抑制光感受器细胞死亡，从而显著改善视网膜退行性病变。这5个化合物中，化合物Ⅰ为首次从密蒙花药材中分离得到，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ均未见用于防治视网膜退行性疾病的相关报道。因此，本发明的密蒙花提取物为视网膜退行性疾病治疗的潜力药物。
另外，本申请中提供的提取工艺，不仅可以快速、高效的提取得到特征化合物Ⅰ，还可大量获得化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ四个活性成分，从而为密蒙花提取物及其有效成分防治视网膜退行性疾病提供重要参考。
附图说明
图1：MMH-95、MMH-95-50、MMH-70、MMH-50和MMH-H2O五个样品的HPLC特征图谱信息。
图2：化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ标准品HPLC特征图谱。
图3：MMH-H2O样品萃取后各部分(MMH-H2O-EA、MMH-H2O-BU、MMH-C-H2O)中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的HPLC特征图谱。
图4：正常组及模型组小鼠视网膜结构OCT成像特征图。
图5：化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ治疗组小鼠视网膜结构OCT成像特征图。
图6：相对于正常组及模型组，密蒙花提取物MMH-H2O治疗组小鼠视网膜结构OCT成像特征图。
具体实施方式
为了使本发明的内容更好地理解，列出以下实施方式，然而下述具体方式不意图限制本发明的范围。
材料、试剂与仪器
中药密蒙花：购于浙江佐力百草中药饮片有限公司；批号：20180701；生产日期：2018年07月20日。
化学试剂：95％乙醇、蒸馏水、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、色谱乙腈等试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；D101大孔吸附树脂(国药集团化学试剂有限公司)，ODS层析填料(日本，YMC*GEL，s 50μm)，Sephadex LH-20层析填料(瑞典，GEHealthcare)。
生物测试仪器及试剂：SpectraMax i3x Multi-Mode Reader(MolecularDevices)、White 384-well MicroPlate(Cat#264706,Nunc)、HTRF kinEASE TK试剂盒包含的主要试剂(Cat#62TKOPEC,Cisbio)、TK-biotin substrate、Streptavidin-XL665、TKAntibody-Cryptate、5xEnzymatic buffer、SEB、HTRF Detection buffer、VEGFR-1(Cat#PV4790,Invitrogen)、VEGFR-2(Cat#08-191,Carna)、ATP 10mM(Cat#PV3227,Invitrogen)、DTT 1M(Cat#D5545,Sigma)、MgCl2 1M(Cat#M8266,Sigma)。
化学仪器：
旋转蒸发仪：BUCHI-RVO。
冻干机：Christ，ALPHA 1-2LD PLUS，德国。
电子天平：BT 125D，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
超声仪：SK7200H(350W)，上海科导超声仪器有限公司。
ESI-MS：Finnigan LCQ-DECA型质谱仪测定。
NMR：Varian INOVA 400型核磁共振仪测定，TMS为内标。
高效液相色谱仪(HPLC)：Agilent 1260高效液相系统，DAD检测器。
制备实施例1：水提法和醇提法提取密蒙花中的有效成分
称取密蒙花中药饮片100g，加入95％乙醇1000ml，浸润0.5h后80℃加热回流提取1h，过滤收集滤液；滤渣中再次加入95％乙醇1000ml，80℃加热回流提取1h，过滤合并两次滤液，采用旋转蒸发仪减压浓缩得到密蒙花95％提取物浓缩液，冷冻干燥(19.6g)，编号MMH-95。
95％乙醇提取后滤渣加入50％乙醇1000ml，100℃加热回流提取1h，过滤收集滤液；滤渣中再次加入50％乙醇1000ml，100℃加热回流提取1h，过滤合并两次滤液，采用旋转蒸发仪减压浓缩得到密蒙花50％提取物浸膏，采用冻干机冷冻干燥得固体样品，编号MMH-95-50(11.3g)。
称取密蒙花中药饮片100g，加入70％乙醇1000ml，浸润0.5h后90℃加热回流提取1h，过滤收集滤液；滤渣中再次加入70％乙醇1000ml，90℃加热回流提取1h，过滤合并两次滤液，采用旋转蒸发仪减压浓缩得到密蒙花70％提取物浸膏，采用冻干机冷冻干燥得固体样品，编号MMH-70(25.1g)。
称取密蒙花中药饮片100g，加入50％乙醇1000ml，浸润0.5h后90℃加热回流提取1h，过滤收集滤液；滤渣中再次加入50％乙醇1000ml，90℃加热回流提取1h，过滤合并两次滤液，采用旋转蒸发仪减压浓缩得到密蒙花50％提取物浸膏，采用冻干机冷冻干燥得固体样品，编号MMH-50(22.7g)。
称取密蒙花中药饮片100g，加入蒸馏水1000ml，浸润0.5h后100℃加热回流提取1h，过滤收集滤液；滤渣中再次加入蒸馏水1000ml，100℃加热回流提取1h，过滤合并两次滤液，采用旋转蒸发仪减压浓缩得到密蒙花水提浓缩液，采用冻干机冷冻干燥得固体样品，编号MMH-H2O(26.8g)。
制备实施例2：水提-溶剂萃取法分离密蒙花中的有效成分
称取密蒙花中药饮片100g，加入蒸馏水1000ml，浸润0.5h后100℃加热回流提取1h，过滤收集滤液；滤渣中再次加入蒸馏水1000ml，100℃加热回流提取1h，过滤合并两次滤液，采用旋转蒸发仪减压浓缩得到密蒙花水提浓缩液200ml，加入200ml乙酸乙酯溶剂萃取，静置至分层后收集上层乙酸乙酯溶液，同样操作萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压干燥得乙酸乙酯萃取样品，编号MMH-H2O-EA；余下水层加入200ml正丁醇溶剂萃取，静置至分层后收集上层正丁醇溶液，同样操作萃取5次，合并正丁醇萃取液，减压干燥得正丁醇萃取样品，编号MMH-H2O-BU；正丁醇萃取后水层减压干燥得萃取后水层样品，编号MMH-C-H2O。上述萃取样品统一采用冻干机冷冻干燥处理得固体样品。
制备实施例3：化合物I～V的纯化及鉴定
称取制备实施例2中得到的MMH-C-H2O样品5g加入适量蒸馏水加热超声溶解，采用大孔树脂(D101)进行柱层析分离(500×60mm)，首先采用蒸馏水1000ml进行洗涤，随后采用20％乙醇1000ml洗涤并收集洗脱液，该洗脱液经HPLC分析含有主要特征峰，纯度在70％以上，浓缩合并得20％乙醇洗脱样品。该样品采用ODS层析填料再次进行纯化，依次采用蒸馏水、10％甲醇洗脱，浓缩合并10％甲醇洗脱液，经HPLC分析，纯度94.14％。减压浓缩干燥得棕黄色固体粉末86.2mg，编号化合物Ⅰ，易溶于水。
化合物Ⅰ结构鉴定如下：ESI-MS负离子信号M-H-＝621.2；1H NMR(DMSO,500MHz)δ：8.08(d,J＝8.9Hz,2H),7.22(d,J＝8.9Hz,2H),6.98(s,1H),6.89(d,J＝2.1Hz,1H),6.48(d,J＝2.1Hz,1H),5.27(d,J＝7.2Hz,1H),5.24(d,J＝7.3Hz,1H),4.05(d,J＝9.6Hz,1H),4.00(d,J＝9.6Hz,1H),3.1-3.6(m,6H)；13C NMR(100MHz)δ：182.1,170.0(2×C),163.6,162.6,161.2,160.0,157.0,128.4(2×C),124.1,116.5(2×C),105.6,104.3,99.5,99.3,99.2,94.8,75.8,75.7,75.4(2×C),72.9,72.8,71.3(2×C)。与文献(Wagner H.,ErsteSynthese eines naturlich vorkommenden Flavonoid-diglucuronids(Apigenie-4’,7-di-O-β-D-glucuronid)und Synthese von Chrysoeriol-7-mono-O-β-D-glucuronid,Chem.Ber.1973,106:2536-2541)报道一致，鉴定为Apigenin-7,4’-di-O-β-D-glucuronide。该化合物为首次从密蒙花中分离得到。
称取MMH-H2O-BU样品8.2g加入适量蒸馏水加热超声溶解，采用大孔树脂(D101)进行柱层析分离(500×60mm)，首先采用蒸馏水1000ml进行洗涤，随后采用20％、40％、60％、95％乙醇各1000ml梯度洗脱，按不同浓度乙醇收集合并洗脱液，经减压浓缩依次得到20％(Fr.1)、40％(Fr.2)、60％(Fr.3)、95％乙醇洗脱样品(Fr.4)。经HPLC分析，优选20％、40％乙醇洗脱样品进行后续分离纯化。20％乙醇洗脱样品(Fr.1)加入适量蒸馏水溶解，采用ODS层析填料进行纯化，依次采用蒸馏水、10％和20％甲醇洗脱，经TLC检测合并得10％甲醇洗脱液样品，该样品采用SepLH20凝胶填料，10％甲醇等度洗脱，经HPLC分析获得纯度为92.83％纯品，经减压浓缩干燥得黄色固体粉末16.4mg，编号化合物Ⅱ，易溶于甲醇。40％乙醇洗脱样品(Fr.2)同样采用ODS层析填料进行纯化，依次采用10％、20％、30％和40％甲醇梯度洗脱得到Fr.2-1、Fr.2-2、Fr.2-3和Fr.2-4四组分，20％甲醇洗脱组分(Fr.2-2)经HPLC分析为单一主峰，纯度达95.66％，减压浓缩干燥得黄色固体粉末112.7mg，编号化合物Ⅲ，易溶于甲醇。30％甲醇洗脱组分(Fr.2-3)采用SepLH20凝胶填料，20％甲醇等度洗脱，经HPLC分析完成两主峰的分离纯化，经减压浓缩干燥均为淡黄色固体粉末，编号化合物Ⅳ(9.2mg，纯度95.25％)和化合物Ⅴ(14.3mg，纯度91.96％)，易溶于甲醇。
此外，60％(Fr.3)中主峰即为MMH-H2O样品中23.0min和24.3min主峰，通过ODS填料，甲醇-水梯度洗脱，实现分离纯化，其结构鉴定为密蒙花新苷和蒙花苷。
化合物Ⅱ结构鉴定如下：ESI-MS负离子信号M-H-＝785.2；1H NMR(CD3OD,500MHz)δ：7.62(d,J＝15.9Hz,1H),7.07(d,J＝2.0Hz,1H),6.98(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),6.80(d,J＝8.2Hz,1H),6.73(d,J＝2.0Hz,1H),6.70(d,J＝8.0Hz,1H),6.59(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),6.29(d,J＝15.9Hz,1H),5.20(d,J＝1.6Hz,1H),5.02(t,J＝9.6Hz,1H),4.41(d,J＝7.9Hz,1H),4.31(d,J＝7.7Hz,1H),4.06(m,1H),3.93(m,2H),3.84(m,2H),3.20-3.80(m),2.81(m,2H),1.10(d,J＝6.2Hz,3H)；13C NMR(100MHz)δ：167.1,148.4,146.8,145.4,144.7,143.3,130.1,126.3,121.9,119.9,115.8,115.1,115.0,113.9,113.3,103.3,102.8,101.7,80.3,76.5,76.4,74.8,73.7,73.4,72.4,71.0(2×C),70.7,70.1,69.2,69.1,68.0,61.2,35.2,17.1。与文献(李教社，密蒙花中本乙醇甙的分离和鉴定，中国中药杂志，1997,22(10)：613-615)报道一致，鉴定为仙人球甙(Echinacoside)。
化合物Ⅲ结构鉴定如下：ESI-MS正离子信号M+Na+＝647.2，2M+Na+＝1270.8；1HNMR(CD3OD,500MHz)δ：7.62(d,J＝15.9Hz,1H),7.08(d,J＝1.9Hz,1H),6.98(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),6.80(d,J＝8.2Hz,1H),6.72(d,J＝1.9Hz,1H),6.70(d,J＝8.0Hz,1H),6.59(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),6.39(d,J＝15.9Hz,1H),5.21(d,J＝1.5Hz,1H),4.94(t,J＝9.4Hz,1H),4.40(d,J＝7.9Hz,1H),4.07(m,1H),3.94(m,1H),3.84(t,J＝9.2Hz,1H),3.75(m,1H),3.25-3.70(m),2.82(m,2H),1.12(d,J＝6.2Hz,3H)；13C NMR(100MHz)δ：166.9,148.4,146.6,145.4,144.7,143.3,130.1,126.3,121.8,119.9,115.7,115.1,114.9,113.8,113.3,102.8,101.6,80.2,74.8,74.7,72.4,71.0,70.9,70.7,69.2,69.0,61.0,35.2,17.1。与文献(李教社，密蒙花中本乙醇甙的分离和鉴定，中国中药杂志，1997,22(10)：613-615)报道一致，鉴定为毛蕊花苷(Verbascoside)。
化合物Ⅳ结构鉴定如下：ESI-MS负离子信号M-H-＝623.3；1H NMR(CD3OD,500MHz)δ：7.57(d,J＝15.9Hz,1H),7.04(d,J＝2.0Hz,1H),6.90(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),6.77(d,J＝8.2Hz,1H),6.67(d,J＝2.0Hz,1H),6.64(d,J＝8.0Hz,1H),6.54(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),6.29(d,J＝15.9Hz,1H),5.18(d,J＝1.6Hz,1H),4.80-4.90(hidden,),4.50(dd,J＝11.9,2.1Hz,1H),4.36(m,1H),4.33(d,J＝7.9Hz,,1H),3.99(m,3H),3.71(m,2H),3.53(m,2H),3.40(m,2H),3.25-3.35(hidden),2.78(m,2H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H)；13C NMR(100MHz)δ：169.1,149.7,147.3,146.8,146.1,144.7,131.4,127.7,123.2,121.3,117.1,116.5,116.3,115.1,114.8,104.4,102.7,83.9,75.7,75.4,74.0,72.4(2×C),72.3,70.4,70.0,64.6,36.7,17.9。与文献(李教社，密蒙花中本乙醇甙的分离和鉴定，中国中药杂志，1997,22(10)：613-615)报道一致，鉴定为异毛蕊花苷(Isoacteroside)。
化合物Ⅴ结构鉴定如下：ESI-MS负离子信号M-H-＝577.2；1H NMR(CD3OD,500MHz)δ：7.89(d,J＝8.9Hz,2H),6.97(d,J＝8.9Hz,2H),6.78(d,J＝2.1Hz,1H),6.67(s,1H),6.55(d,J＝2.1Hz,1H),5.07(d,J＝7.2Hz,1H),4.74(d,J＝7.3Hz,1H),4.07(d,J＝9.6Hz,1H),3.92(m,1H),3.30-3.80(m),1.20(d,J＝6.2Hz,3H)；13C NMR(100MHz)δ：182.7,165.5,163.3,161.6,161.5,157.5,128.3(2×C),121.7,115.7(2×C),105.7,102.8,100.7,100.2,99.7,94.9,76.4,75.8,73.4,72.7,71.0,70.7,69.9,68.4,66.0,16.5。与文献(郑畅，密蒙花中黄酮类成分的分离与鉴定，中国药物化学杂志，2018,28(1)：52-57)报道一致，鉴定为Apigenin-7-O-rutinoside。
结果分析
(1)化合物标准品配制：
精密称取化合物Ⅰ样品1.35mg，置于1ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称取化合物Ⅱ样品0.72mg，置于1ml容量瓶中，甲醇溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称取化合物Ⅲ样品0.97mg，置于1ml容量瓶中，甲醇溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称取化合物Ⅳ样品0.96mg，置于1ml容量瓶中，甲醇溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称取化合物Ⅴ样品0.98mg，置于1ml容量瓶中，甲醇溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
(2)样品配置
精密称定MMH-95样品11.70mg，置于1ml容量瓶中，甲醇溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称定MMH-95-50样品9.89mg，置于1ml容量瓶中，50％甲醇溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称定MMH-70样品10.71mg，置于1ml容量瓶中，70％甲醇溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称定MMH-50样品10.73mg，置于1ml容量瓶中，50％甲醇溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称定MMH-H2O样品8.24mg，置于1ml容量瓶中，水溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称定MMH-H2O-EA样品7.80mg，置于1ml容量瓶中，甲醇溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称定MMH-H2O-BU样品5.59mg，置于1ml容量瓶中，甲醇溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
精密称定MMH-C-H2O样品9.73mg，置于1ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容至1ml刻度，充分混匀后吸取0.5ml溶液采用0.22μm滤膜过滤后备用。
(3)含量测定
仪器：安捷伦1260型(DAD检测器)HPLC；
色谱柱型号：Agilent ZORBAX SB-C18，5μm，4.6×250mm，柱温：25℃；
流动相：色谱乙腈、水(含0.2％冰醋酸)；
流速：1ml/min
检测波长：320nm
进样量：10μl
检测方法如表1所示。
表1.密蒙花样品HPLC分析检测方法
时间(min) 色谱乙腈％ 水(含0.2％冰醋酸)％
0 10 90
10 20 80
17 20 80
21 30 70
30 95 5
采用上述方法对制备实施例1和2中得到的各提取样品MMH-95、MMH-95-50、MMH-70、MMH-50、MMH-H2O、MMH-H2O-EA、MMH-H2O-BU、MMH-C-H2O中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ含量进行测定，每个样品重复进样三次，每次10μl，取峰面积(A)均值计算化合物百分含量。
制备实施例1中五种不同提取溶剂得到的样品中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ测定结果如表2所示，各样品HPLC特征图谱如图1所示，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ标准品HPLC特征图谱如图2。
表2.五种不同提取溶剂样品中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的含量测定结果(n＝3)
Figure BDA0001985989730000141
Figure BDA0001985989730000151
根据从以上表2中的数据可以看出，五种不同提取溶剂得到的样品中(MMH-95-50、MMH-70、MMH-50和MMH-H2O)，95％乙醇溶液提取样品(MMH-95)未能检测到化合物Ⅰ和Ⅳ，化合物Ⅲ含量较高，占MMH-95干燥固体重量的9.24％；MMH-95-50和MMH-70样品中均未检测到化合物Ⅳ，95％乙醇提取后药材采用50％乙醇二次提取可高效提取获得化合物Ⅰ，含量占到MMH-95-50重量的5.99％；含醇量高于50％的水-醇混合溶液均无法有效提取得到化合物Ⅳ，且纯水提取密蒙花所得样品(MMH-H2O)中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的总重量达到14.36％，50％的水-醇混合溶液提取样品(MMH-50)中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的总重量为13.43％，优于含醇量高于50％的水-醇混合溶液提取得到样品(MMH-95、MMH-70和MMH-95-50)中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的重量之和。因此，MMH-50和MMH-H2O工艺能同时实现化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的高效提取，相比之下MMH-H2O工艺更优。
在制备实施例2中，MMH-H2O样品经EA和BU溶剂萃取后各组分化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的含量测定结果如下表3所示。HPLC特征图谱如图3所示。
表3.MMH-H2O样品有机溶剂萃取后各部分中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ含量测定结果(n＝3)
Figure BDA0001985989730000152
从以上表3中的数据可以看出，乙酸乙酯作为萃取溶剂，可以有针对性的富集化合物Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，MMH-H2O-EA样品中上述三种化合物的含量均显著提升；乙酸乙萃取后水层，采用正丁醇进行后续萃取，能有效提取样品中残留的化合物Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，同时实现化合物Ⅱ的富集(MMH-H2O-BU)；乙酸乙酯、正丁醇萃取后的水层(MMH-C-H2O)，则主要含有化合物Ⅰ。因此，上述萃取工艺可高效实现化合物Ⅰ的快速分离。
制备实施例4：水提-大孔树脂法提取密蒙花的有效成分
称取MMH-H2O样品10.0g，采用DIAION HP20大孔树脂(6cm×60cm)，乙醇-水梯度洗脱，依次用纯水500ml，40％乙醇1000ml，60％乙醇1500ml，95％乙醇1000ml，经HPLC分析40％乙醇组分富含化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，经浓缩合并冷冻干燥得3.9g固体(MMH-H2O-40ETOH)。称取MMH-H2O-40ETOH样品3.0g，采用DIAION HP20大孔树脂(5cm×50cm)进行二次纯化，同样采用乙醇-水梯度洗脱，依次用纯水200ml，5％乙醇200ml，10％乙醇200ml，20％乙醇400ml，30％乙醇400ml，40％乙醇400ml，梯度洗脱，经HPLC分析，二次纯化可进一步除去样品中不具有VEGFR1/2抑制活性的蒙花苷和密蒙花新苷化合物，合并10％、20％、30％乙醇洗脱组分，经浓缩合并冷冻干燥得1.49g固体(MMH-H2O-EN)。
精密称定MMH-H2O-40ETOH和MMH-H2O-EN样品各2.76、2.08mg，纯水充分溶解各定容到1ml容量瓶中，采用上述液相分析方法进行定量分析，平行进样3次，取峰面积均值计算五个单体化合物占提取物重量的百分比，测定结果如表4所示。
表4.MMH-H2O-40ETOH样品中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ含量测定结果(n＝3)
Figure BDA0001985989730000161
从以上表4中的数据可以看出，采用DIAION HP20大孔树脂经过两次纯化可有效富集化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ使其总重量占提取物总重量的50％以上。
实验实施例1：化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ对VEGFR-1和VEGFR-2激酶的抑制活性
(1)工作液配制
1×Enzymatic Buffer:
VEGFR-1:200μL 5×Enzyme buffer,5μL 1M MgCl2,1μL 1M MnCl2,1μL 1M DTT,793μL ddH2O.
VEGFR-2:200μL 5×Enzyme buffer,5μL 1M MgCl2,1μL 1M MnCl2,1μL 1M DTT,10μL SEB,783μL ddH2O.
5×Substrate-TK和ATP工作液
Substrate-TK和ATP的具体浓度见表5。
用1×Kinase Buffer稀释Substrate-TK和ATP至反应浓度的5倍。
5×Enzyme工作液
酶的浓度优化已在之前的工作中完成，筛选时所用试剂的浓度见表5。用1×kinase buffer配制酶的5×酶工作液。
4×Streptavidin-XL665工作液
Sa-XL665在反应中的浓度参见表5。用Detection Buffer配制4×Streptavidin-XL665工作液。
4×TK-Antibody-cryptate工作液
用Detection Buffer将TK-Antibody-Cryptate稀释100倍作为工作液。
(2)实验流程及方法
a.首先使用配置好的1X kinase buffer配制2.5％的DMSO溶液(DMSO浓度过高会对反应产生影响，控制DMSO的终浓度为1％)，然后用2.5％的DMSO溶液稀释待测化合物，化合物的筛选浓度为10uM和1uM。除对照孔外，向所用反应孔中加入4微升的稀释好的待测化合物溶液，向对照孔中加入4微升先前配制的2.5％的DMSO溶液。
b.向所有反应孔中加入2微升先前配制好的TK-biotin substrate溶液(酶筛选时底物的用量见表5)。
c.向除阴性孔外的所有反应孔中加入2微升先前配制好的酶溶液(酶的用量见表1)，阴性孔用2微升酶对应1X kinase buffer补足体积。用封板膜封板，混匀后室温孵育10分钟，使化合物和酶充分作用结合。
d.向所有反应孔中加入2微升的ATP溶液来启动激酶反应(酶筛选时的ATP浓度和反应时间见表5)。
e.在激酶反应结束前5分钟开始配制检测液。使用试剂盒中的detection buffer配制Streptavidin-XL665和TK antibody europium cryptate(1:100)检测液(酶筛选时检测试剂浓度见表5)。
f.待激酶反应结束后，向所有反应孔中加入5微升稀释好的Streptavidin-XL665，混匀后立即加入稀释好的TK antibody europium cryptate检测液。
g.封板混匀，室温反应1h后，用SpectraMax i3x Multi-Mode Reader(MolecularDevices)仪器检测荧光信号(340nm刺激,665nm，615nm发射)。通过全活性孔和背景信号孔计算出每个孔的抑制率，复孔取平均值，同时用专业的画图分析软件Graphpad prism 6.0对待测化合物进行半数抑制活性(IC50)的拟合。
表5激酶的反应体系各组分及浓度表
Figure BDA0001985989730000181
上述测试结果按如下公式进行分析计算：
发射率(ER)＝665nm发射信号/615nm发射信号
抑制率＝(ER阳性―ER样品)/(ER阳性―ER阴性)*100％
(3)测试结果
5个化合物(化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)对VEGFR-1抑制活性测试结果如表6所示，对VEGFR-2抑制活性测试结果如表7所示。
表6.化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ对VEGFR-1抑制活性测试结果
Figure BDA0001985989730000182
表7.化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ对VEGFR-2抑制活性测试结果
Figure BDA0001985989730000191
在表6和表7中，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ在10μM浓度下对VEGFR-1的抑制率分别为70.06％、99.46％、98.78％、82.58％、97.31％；5个化合物在10μM浓度下对VEGFR-2抑制率均大于90％。根据5个单体化合物对VEGFR-1和2的初筛抑制活性，本申请优选了化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ测定了其对VEGFR-2抑制活性的IC50，测定结果显示：化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对VEGFR-2的IC50值分别为1.21μM、0.32μM和0.51μM，为现已发现的强效VEGFR-2天然抑制剂，其中化合物Ⅱ的IC50值与阳性药Staurosporine相当(0.29μM)。
此外，还测试了蒙花苷和密蒙花新苷对VEGFR-1和VEGFR-2的抑制活性，在10μM初筛浓度对VEGFR-1/2的抑制率均在50％以下。
实验实施例2：密蒙花提取物MMH-H2O(下文简称“提取物MMH-H2O”)以及化合物I、II和III对光诱导的视网膜光感受器细胞退行性改变的抑制作用
(1)方法：
a.药物：化合物Ⅰ(纯度94.14％)、Ⅱ(纯度92.83％)和Ⅲ(纯度95.66％)均为实验室自制，分离纯化方法、结构鉴定及纯度分析数据见以上制备实施例3；提取物MMH-H2O制备方法见制备实施例1。
b.动物模型：采用4-6周龄雌性Balb/c小鼠(斯莱克，上海)进行实验。小鼠随机分为正常对照组(5只小鼠)、光损伤模型对照组(5只小鼠)、化合物Ⅰ处理组(4只小鼠)、化合物II处理组(4只小鼠)、化合物Ⅲ处理组(4只小鼠)、提取物MMH-H2O处理组(3只小鼠)。正常对照组不接受白光刺激，仅接受溶剂(H2O)处理，其它各组接受100μl体积的溶剂或提取物MMH-H2O、化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ处理，提取物MMH-H2O剂量为150mg/Kg体重，化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ剂量为100mg/Kg体重，光照前30分钟腹腔注射。光照刺激将采用弥散白色冷荧光灯，光照条件设置为10,000Lux，持续30分钟。7天后，进行视网膜形态分析。
c.视网膜结构分析：药物治疗及光照后第7天，10％水合氯醛麻醉小鼠，托吡卡胺散瞳后，采用小动物OCT(Phoenix Research Labs)分别对各组小鼠视网膜形态进行观察和比较，重点观察ONL厚度变化情况。
(2)结果
a.正常小鼠视网膜结构OCT成像
OCT(Optical Coherence Tomography，光学相干断层扫描)是一种非侵入性的光学成像手段，可对视网膜进行高分辨率的断层成像，其非侵入性的特点为客观、动态地进行眼底病变的诊断、评价药物疗效效应提供了良好的技术支持。如图4所示，采用OCT可对小鼠视网膜各层组织结构进行高分辨率的观察OCT成像，由外而内可见以下主要结构组成：视网膜色素上皮(RPE)、外节(OS)、连接纤毛(CC)、内节(IS)、外界膜(OLM)、外核层(ONL)、外网层(OPL)、内核层(INL)、内网层(IPL)及神经节细胞(GC)。
b.白光照射诱发小鼠视网膜严重损害
白光照射后7天，采用OCT对视网膜结构进行成像。如图4所示，白光照射诱发严重的以光感受器细胞损伤为主要病理表现的视网膜退行性改变，主要表现为ONL、OS、CC、IS严重损伤及OPL界限不清。
c.提取物MMH-H2O、化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对视网膜保护效应
白光照射前30分钟，小鼠接受溶剂或化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ治疗，剂量为100mg/kg体重，提取物MMH-H2O治疗，剂量为150mg/kg体重，体积各为100μl，腹腔注射。光照后7天，采用OCT进行视网膜结构分析。如图5、6及表8所示。
表8.各实验组小鼠视网膜ONL形态OCT分析结果
样品编号 动物数(只) 完全保护(只) 部分保护(只) 无保护(只)
正常组 5 5 0 0
模型组 5 0 0 5
化合物Ⅰ 4 3 1 0
化合物Ⅱ 4 3 1 0
化合物Ⅲ 4 3 1 0
MMH-H<sub>2</sub>O 3 3 0 0
从以上表8中的数据及图4、5和6可以看出，与未接受光照的正常小鼠视网膜相比较，光照导致视网膜ONL严重损伤，影响覆盖全视网膜，而提取物MMH-H2O、化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ治疗组均对视网膜光感受器细胞起到了显著的保护作用，体现为ONL维持完好，ONL结构接近未接受光照的正常小鼠视网膜ONL结构，提示提取物MMH-H2O、化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ治疗可显著抑制光诱导的视网膜光感受器细胞退行性改变的发生。由此可知，提取物MMH-H2O、化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对视网膜光损伤小鼠模型具有干预效应，对视网膜光感受器细胞的死亡及其导致的视网膜退行性病变的发生具有显著的防治作用。

Claims (4)

1.一种从密蒙花中提取化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的方法，包括以下步骤：
a)称取密蒙花中药饮片100g，加入蒸馏水1000ml，浸润0.5h后100℃加热回流提取1h，过滤收集滤液；滤渣中再次加入蒸馏水1000ml，100℃加热回流提取1h，过滤合并两次滤液，采用旋转蒸发仪减压浓缩得到密蒙花水提浓缩液，采用冻干机冷冻干燥得固体样品，编号MMH-H2O；以及
b)称取MMH-H2O样品10.0g，采用DIAION HP20大孔树脂，依次用纯水500ml，40％乙醇1000ml，60％乙醇1500ml，95％乙醇1000ml梯度洗脱，取40％乙醇组分，经浓缩合并冷冻干燥得3.9g固体MMH-H2O-40ETOH；称取MMH-H2O-40ETOH样品3.0g，采用DIAION HP20大孔树脂进行二次纯化，依次用纯水200ml，5％乙醇200ml，10％乙醇200ml，20％乙醇400ml，30％乙醇400ml，40％乙醇400ml，梯度洗脱，合并10％、20％、30％乙醇洗脱组分，经浓缩合并冷冻干燥得含有化合物I-V的提取物，
其中，化合物I-V的名称和结构分别如下：
化合物Ⅰ：芹菜素-7,4’-二-O-β-D-葡糖苷酸
Figure FDA0003211153540000011
化合物Ⅱ：松果菊苷
Figure FDA0003211153540000012
化合物Ⅲ：毛蕊花甙
Figure FDA0003211153540000021
化合物Ⅳ：异毛蕊花苷
Figure FDA0003211153540000022
化合物Ⅴ：芹菜素-7-O-芸香糖甙
Figure FDA0003211153540000023
2.一种从密蒙花中提取化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的方法，包括以下步骤：
a)用纯水一次或多次提取原料药密蒙花，得到密蒙花水性提取液，任选地浓缩所得提取液；以及
b’)将由步骤a)得到的密蒙花水性提取液采用乙酸乙酯萃取获得含有化合物Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的提取物；进一步，将经乙酸乙酯萃取后的密蒙花水性提取液，采用正丁醇萃取，获得含有化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的提取物；经正丁醇萃取后余下的密蒙花水性提取液则为主要含有化合物Ⅰ的密蒙花提取物，
其中，化合物I-V的名称和结构分别如下：
化合物Ⅰ：芹菜素-7,4’-二-O-β-D-葡糖苷酸
Figure FDA0003211153540000031
化合物Ⅱ：松果菊苷
Figure FDA0003211153540000032
化合物Ⅲ：毛蕊花甙
Figure FDA0003211153540000041
化合物Ⅳ：异毛蕊花苷
Figure FDA0003211153540000042
化合物Ⅴ：芹菜素-7-O-芸香糖甙
Figure FDA0003211153540000043
3.如以下结构的化合物Ⅰ或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防视网膜退行性病变药物中的用途，
化合物Ⅰ：芹菜素-7,4’-二-O-β-D-葡糖苷酸
Figure FDA0003211153540000051
4.如以下结构的化合物Ⅰ或其药学上可接受的盐在制备VEGFR抑制剂药物中的用途，其中，所述VEGFR为VEGFR1和/或VEGFR2，
化合物Ⅰ：芹菜素-7,4’-二-O-β-D-葡糖苷酸
Figure FDA0003211153540000052
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