KR100475647B1

KR100475647B1 - 고삼 추출물을 포함하는 성기능 장애 개선용 조성물

Info

Publication number: KR100475647B1
Application number: KR10-2002-0026650A
Authority: KR
Inventors: 이용섭; 김동현; 김형자; 박호군
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2002-05-15
Filing date: 2002-05-15
Publication date: 2005-03-10
Also published as: KR20030088906A

Abstract

본 발명은 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 플라보노이드 화합물 또는 이를 포함하는 고삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 성기능 장애 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 cGMP 포스포디에스테라제 저해활성을 가짐으로써 발기부전 또는 발기 기능 장애와 같은 성기능 장애를 개선하는데 사용할 수 있다.

화학식 1

(상기식에서, R₁, R₂, R₃, R₄ 및 점선은 하기 명세서에 나타낸 바와 같다.)

화학식 2

Description

고삼 추출물을 포함하는 성기능 장애 개선용 조성물{A COMPOSITION FOR TREATING SEXUAL DYSFUNCTION COMPRISING AN EXTRACT FROM SOPHORA FLAVESCENS AND COMPOUNDS ISOLATED THEREFROM}

본 발명은 고삼 추출물을 포함하는 성기능 장애 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 cGMP(cyclic guanosine monophosphate) 포스포디에스테라제(phosphodiesterase)의 저해활성을 가짐으로써 발기부전과 같은 성기능 장애를 개선하는데 사용할 수 있는 플라보노이드 화합물 또는 이를 포함하는 고삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 성기능 장애 개선용 조성물에 관한 것이다.

발기부전(erectile dysfunction 또는 impotence)은 남성에 있어서 성교하기 위한 힘이 결핍되어 있는 것으로 정의되며, 음경 발기 또는 사정을 할 수 없는 것을 포함한다. 구체적으로, 발기부전 또는 발기 기능장애는 성행위를 할 수 있도록 발기가 충분하지 않거나, 발기가 되더라도 유지되지 못하는 경우로서, 남성 인구 중 2∼7 %가 이러한 증상을 가지고 있는 것으로 알려졌으며, 50세 이하의 연령에서 증가하고, 55∼80세 사이의 연령 중 18∼75 %가 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 미국에서만 천만명 이하의 발기부전 남성이 있는 것으로 추정되고 있는데, 이들 대부분은 심인성(정신적 원인) 보다는 기질성(신체적 원인)의 문제로 인한 것으로 알려져 있다.

발기의 메카니즘으로는 성적 자극이 전달되면 음경의 동맥주위에 cGMP(cyclic guanosine monophosphate)라는 체내성분이 특이적으로 만들어져 이로 인해 동맥이 확장되고 음경 해면체 내로 혈액이 모여 단단해진다. cGMP는 해면체들을 팽창시켜 스펀지 사이의 간격을 좁혀 동맥을 통하여 들어온 혈액이 정맥으로 빠져나가지 못하게 함으로서 결과적으로 유출되는 혈액이 적어져 음경은 커지고 발기가 되는 것이다. 발기를 유발시키고 남은 cGMP는 분해효소인 PDE5(포스포디에스테라제-5, phosphodiesterase-5)에 의해 분해됨으로서 발기가 풀리고 원상태 돌아오게 된다.

최근 발기부전 치료제로 개발되어 전세계적으로 사용되고 있는 실데나필은 음경해면체에 특이적으로 분포하는 PDE5의 저해에 의한 cGMP의 농도를 증가시킴으로서 음경해면체내 혈류를 증대시켜 발기를 유도하여 발기부전의 치료효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 두통, 안면홍조, 소화불량 및 심장마비 등 여러 부작용이 보고되고 있어 이를 대신 또는 보완할 수 있는 새로운 약재의 필요성이 요구되고 있다. 따라서 당업계에서는 실데나필 보다 우수한 약리작용을 가진 cGMP-PDE5 저해제를 합성하는 연구와 천연물 복합제제를 이용한 발기부전 치료제 개발 연구가 소개되고 있다.

한국특허 제0074869호에서는 발기부전치료용으로 L-알라닌, 가시오가피 추출물, 구기자 추출물의 복합제제가 개시되었다. 그러나, 종래의 천연물로부터의 발기부전 치료제의 연구는 실데나필과 같이 발기부전에 효과적임을 입증하기 위하여 작용기전을 제시하거나 이들 복합제제에서 발기부전 치료에 효과적인 성분들이 제시되지 않고 있다.

한편 고삼(Sophora flavescens)은 고미건위제, 말초혈관 수축제, 해열진통제 및 피부기생충구제제 등으로 사용되어오던 것으로, 생약명이 소포라에 라딕스(Sophorae radix)로 뿌리를 주로 생약으로 사용한다. 고삼의 대표적인 주성분은 알카로이드류(alkaloids)로 마트린(matrine), 옥시마트린(oxymatrine) 등이 있으며, 플라보노이드류(flavonoids)로는 쿠쉐놀 H(kushenol H), 쿠쉐놀 K(kushenol K), 쿠라리놀(kurarinol), 쿠라리딘(kuraridine) 등이 알려져 있다. 또한, 최근에는 본 발명자들에 의하여 소포라플라베세놀(sophoraflavescenol)이 고삼으로부터 처음으로 분리되어 그 구조가 밝혀진 바가 있다(김형자 외, Journal of Natural Products, 1998, 61(12), 1552). 그러나, 고삼 추출물 또는 고삼에 포함된 성분들이 발기부전과 같은 성기능 장애 개선 효과가 기대되는 cGMP-PDE5의 저해활성을 억제한다는 사실이 밝혀진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 인체 안전성이 확보된 다양한 생약을 대상으로 cGMP-PDE5의 활성을 강력하게 억제하는 물질을 연구하던 중, 고삼(Sophora flavescens) 추출물이 낮은 농도에서 cGMP-PDE5의 활성을 강력하게 저해하며, 고삼 추출물에 함유되어 있는 성분을 분리 및 정제하여 얻은 쿠쉐놀 H, 쿠쉐놀 K, 쿠라리놀, 소포플라베세놀 및 쿠라리딘이 cGMP-PDE5의 활성을 강력하게 억제한다는 사실을 발견하고 이들이 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선에 탁월한 효과를 나타낼 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 cGMP-PDE5에 강력한 저해활성을 나타내는 성기능 장애 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명의 목적은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 하는 성기능 장애 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 고삼 추출물을 유효성분으로 하는 성기능 장애 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 고삼 추출물로부터 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 cGMP-PDE5 저해활성을 가짐으로써 발기부전 또는 발기 기능 장애와 같은 성기능 장애를 개선하는데 사용할 수 있는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 플라보노이드 화합물 또는 고삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 성기능 장애 개선용 조성물에 관한 것이다.

(상기식에서,

R₁은 치환되지 않거나 하이드록시 그룹으로 치환된 C₅∼C₁₁의 직쇄 또는 분쇄상 알켄일 그룹이고,

R₂는 수소, 하이드록시 또는 C₁∼C₃의 알콕시이며,

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록시이며,

점선은 단일결합 또는 이중결합을 나타낸다.)

상기 화학식 1 및 2의 화합물 중 바람직한 화합물은 하기에 나타내었다.

(1)2-(2,4-디하이드록시-페닐)-3,7-디하이드록시-8-[2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-3-메틸-부트-3-엔일]-5-메톡시-크로만-4-온(쿠쉐놀 H, 화학식 3)

(2)2-(2,4-디하이드록시-페닐)-3,7-디하이드록시-8-[2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-3-메틸-부트-3-엔일]-5-메톡시-크로만-4-온(쿠쉐놀 K, 화학식 4)

(3)2-(2,4-디하이드록시-페닐)-7-하이드록시-8-[2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-3-메틸-부트-3-엔일]-5-메톡시-크로만-4-온(쿠라리놀, 화학식 5)

(4)3,7-디하이드록시-2-(4-하이드록시-페닐)-5-메톡시-8-(3-메틸-부트-2-엔일)-크로멘-4-온(소포플라베세놀, 화학식 6)

(5)1-[2,4-디하이드록시-3-(2-이소프로펜일-5-메틸-4-헥센일)-6-메톡시-페닐]-3-(2,4-디하이드록시-페닐)-프로페논(쿠라리딘, 화학식 7)

상기 화합물들은 그 구조 내에 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있으므로, 개개의 에난티오머(enantiomer) 또는 부분입체이성체(diastereomer)로 존재할 수 있고, 라세미체(racemate)를 포함한 이들의 혼합물로도 존재할 수 있으며, 이러한 이성체 또는 이들의 혼합물도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에 따른 화합물은 또한 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염에는 알칼리금속 수산화물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨), 알칼리금속 중탄산염(예: 중탄산나트륨, 중탄산칼륨), 알칼리금속 탄산염(예: 탄산 나트륨, 탄산 칼륨, 탄산 칼슘)등과 같은 무기염기와 1차, 2차 3차 아민 아미노산과 같은 유기염기가 포함된다.

본 발명의 화합물들은 또한 용매화물, 특히 수화물의 형태일 수 있다. 수화는 상기 화합물을 분리하는 동안 일어날 수 있거나, 또는 화합물의 흡습성으로 인해 시간이 경과함에 따라 일어날 수 있다.

본 발명의 cGMP-PDE5 저해활성을 가짐으로써 발기부전의 개선작용을 갖는 고삼 추출물은 C₁∼C₄의 저급 알콜, 함수(函數) 알콜, 디클로로메탄 또는 아세트산에틸로 추출한 후 여과 및 감압 증발시켜 얻으며, 또한 C₁∼C₄의 저급 알콜로 추출하여 얻은 상기 고삼 알콜 추출물을 여과 및 감압 증발시킨 후, 물에 현탁시킨 용액을 디클로로메탄, 아세트산에틸 또는 부탄올로 추출한 후 여과 및 감압 증발시켜 얻는다. 일예로, 고삼의 뿌리를 잘게 절단하거나 분말화하여 그대로 사용하거나 냉동건조시킨 후, 여기에 1 kg 당 메탄올, 에탄올과 같은 저급알콜, 상기 저급 알콜의 60∼100 % 알콜 수용액을 0.1∼5 ℓ, 바람직하게는 0.5∼1.0 ℓ의 양으로 가하고 상온에서 4∼5 일 동안 방치한다. 상기 과정은 필요에 따라 3회 이상 반복할 수 있다. 얻어진 추출물을 여과 및 감압 증발시켜 알콜 추출물을 얻는다. 또한 알콜 추출물 1 kg 당 1∼5 ℓ, 바람직하게는 1.5∼2.0 ℓ의 물을 가한 후, 아세트산에틸(EtOAc) 0.1∼5 ℓ, 바람직하게는 1.0∼1.5 ℓ로 충분히 추출하여 아세트산에틸 추출물을 얻을 수 있다. 아세트산에틸 추출물은 알콜 추출과정을 생략하고 직접 고삼의 뿌리를 아세트산에틸로 추출하여 제조할 수도 있다.

본 발명의 플라보노이드 화합물의 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선효과를 확인하기 위하여 cGMP-PDE5 활성 억제작용을 조사한 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 쿠쉐놀 H, 쿠쉐놀 K, 쿠라리놀, 소포플라베세놀, 쿠라리딘인 5종의 플라보노이드 화합물들 모두가 농도의존적으로 cGMP-PDE5 활성을 억제하였으며, 특히 소포플라베세놀의 cGMP-PDE5 활성억제 효과가 가장 강력하였다. 유효 성분 중 비교적 억제 효과가 큰 쿠라리놀, 소포플라베세놀, 쿠라리딘의 PDE5 억제 기전을 분석한 결과 경쟁적 또는 혼합형 활성 억제를 보여 주었다(도 2∼4 참조). 이러한 결과를 통하여 본 발명의 플라보노이드 화합물은 cGMP-PDE5 활성억제 효과가 우수하여 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선에 유효하다는 사실을 알 수 있다.

또한, 고삼의 메탄올 추출물이 cGMP-PDE5의 활성을 강력하게 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있다. 고삼의 메탄올 추출물을 디클로로메탄, 아세트산에틸, 부탄올, 물 등으로 분획한 추출물들의 cGMP-PDE5 활성 억제작용을 조사한 결과, 아세트산 에틸 추출물의 cGMP-PDE5 활성 억제작용이 가장 강력하였으며, 그 다음이 디클로로메탄 추출물이었고, 부탄올 추출물과 물 추출물의 cGMP-PDE5 활성 억제작용은 대체적으로 약하였다.

상기에 나타낸 바와 같이 고삼 추출물을 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선을 위하여 사용하기 위해서는 메탄올, 에탄올, 함수 에탄올과 같은 알콜용매 추출물을 사용할 수 있으며, 아세트산에틸이나 디클로로메탄 분획을 사용하면 매우 효과적인 약리작용을 얻을 수 있음을 알 수 있다.

결과적으로, 본 발명의 상기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 플라보노이드 화합물 및 이를 포함하는 고삼 추출물은 cGMP-PDE5의 활성을 억제하므로, 이들을 포함하는 본 발명의 조성물은 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체와 함께 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캅셀, 새세이 또는 기타 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭씨르, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 주사용 용액 또는 현탁액, 연고제, 크림제, 겔제 또는 로숀제 등의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1 일에 1 회 내지 여러차례 나누어 투여할 수 있으며 바람직하기로는 화합물이 10∼1,000 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 20∼500 ㎎/kg, 추출물이 50∼10,000 ㎎/㎏의 농도로 투여되도록 제형화될 수 있다. 상기 제제의 정확한 양, 투여경로 및 횟수는 제제의 특성, 투여대상의 체중 및 상태, 그리고 사용하고자 하는 특정 유도체의 특성에 따라 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명에서 조성물은 실험용 생쥐를 대상으로 한 급성독성검사 결과, 경구투여 또는 복강내 주사 시 반치사량 (LD₅₀)은 10,000 ㎎/㎏ 이상으로 전혀 독성효과를 나타내지 않음으로써 생체 안전성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 성기능 장애 개선용 조성물은 생체에 대해 안전하게 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 고삼 추출물로부터 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 화합물을 분리 및 정제방법을 포함한다.

구체적으로, 본 발명은 상기에서 얻은 고삼의 아세트산 에틸 추출물에 대하여 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행함으로써 본 발명의 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선에 효과적인 화합물을 분리 및 정제할 수 있다. 칼럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수 차례 실시할 수 있는데, 특히, 세파덱스, RP-18 및 실리카겔을 충진제로 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 적절히 조합하여 수행하는 것이 가장 바람직하다.

상기의 칼럼크로마토그래피 과정을 통해 고삼의 아세트산 에틸추출물로부터 쿠쉐놀 H, 쿠쉐놀 K, 쿠라리놀, 소포플라베세놀, 쿠라리딘과 같은 플라보노이드 화합물들을 분리할 수 있었으며, 그 중, 소포플라베세놀의 활성이 가장 강력하였다. 따라서, 본 발명의 고삼 추출물이 cGMP-PDE5의 활성을 억제하여 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선에 중요한 작용을 하는 유효활성성분들이 쿠쉐놀 H, 쿠쉐놀 K, 쿠라리놀, 소포플라베시놀, 쿠라리딘과 같은 플라보노이드 화합물들임이 확인되었으며, 이는 고삼 추출물이 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선에 효과적이라는 본 발명의 결과를 더욱 입증하는 것이다.

이하에서 본 발명을 실험예 및 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 기술적 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 고삼 추출물의 제조

고삼의 뿌리를 잘게 세절하고 음건한 9.0 kg을 20 ℓ의 메탄올에 담가 상온에서 4∼5일 동안 추출한 후 여과하였다. 3번에 걸쳐 추출한 메탄올 용액을 40℃에서 회전 농축기로 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다. 고삼의 메탄올 추출물 257 g을 물 2000 ㎖에 현탁시킨 다음 디클로로메탄(CH₂Cl₂, 2000 ㎖ ×3)으로 추출하고, 물층을 아세트산 에틸(EtOAc, 2000 ㎖ ×3)로 추출한 다음, 이 물층을 다시 부탄올 (BuOH, 2000 ㎖ ×3)로 충분히 추출하였다. 얻어진 추출 용액을 여과 후 농축시켜 각각의 분획물을 얻었다.

<실시예 2> 분리,정제 방법

고삼의 아세트산 에틸 분획 14.08 g을 실리카젤(230∼400 mesh)을 이용하여 칼럼 크로마토그래피(4 ×35 ㎝)를 실시하였다. 전개용매로 사용한 용매는 아세트산 에틸-메탄올-물 (70:5:2)의 혼합용매로부터 시작하여 극성을 점차로 높여서 아세트산 에틸-메탄올-물 (100:10:7)의 혼합용매와 아세트산 에틸-메탄올-물 (100:13.5:10)의 혼합용매를 이용하였다. 얻어진 분획들은 순상 실리카겔 박층크로마토그라피 (전개용매: 아세트산 에틸-메탄올-물=100:13.5:10)로 관찰한 후, 유사한 극성을 갖는 화합물끼리 모아 8개의 소분획(분획 1∼분획 8)으로 나누었다. 소분획 2(5.2 g)를 메탄올을 전개용매로 이용한 세파덱스 칼럼 크로마토그래피 (4.5 ×40 ㎝)와 실리카젤(300 g)을 이용한 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 6개의 소분획(E2A∼E2F)을 얻었다. 이때 사용한 용매는 헥산-디클클로 메탄-메탄올 (10:10:2→5:10:3)의 혼합용매와 디클클로 메탄-메탄올-물 (50:10:1)의 혼합용매를 사용하였다. 소분획 E2C(0.52 g)는 세파덱스를 이용한 컬럼분리 (MeOH, 2.5 ×36 ㎝) 후 메탄올을 이용하여 재결정을 실시한 결과 순수한 신규화합물인 소포플라베세놀(27 ㎎)를 얻었다. 소분획 E2D(1.8 g)는 역상 칼럼크로마토그래피 (Cat. No.:13900, 머크, 70% 메탄올, 3 ×30 ㎝)를 실시하여 쿠라리놀(530 ㎎)을 얻었으며, 소분획 E2E(1.1 g)는 세파덱스, 역상 칼럼크로마토그래피, MCI gel을 순차적으로 이용한 정제를 실시하여 쿠쉐놀 K(180 ㎎)와 쿠쉐놀 H(167 ㎎)을 순수하게 얻을 수 있었다. 또한 소분획 E2B(0.47 g)은 디클클로 메탄-메탄올-물 (100:13:1)의 혼합용매를 전개용매로 이용한 실리카젤 칼럼크로마토그래피와 70% 메탄올을 사용한 역상 칼럼크로마토그래피를 실시하여 쿠라리딘(24 ㎎)을 얻었다.

<실험예 1> cGMP-PDE5 활성억제 실험

고삼 추출물 및 이로부터 분리된 성분들의 cGMP-PDE5 활성 억제 실험은 하기와 같은 방법으로 수행하였다.

cGMP-PDE5는 공지된 방법(Lugnier C 등, Biochem. Pharmacil., 1986, 35, 1743-1751)에 따라 쥐의 횡경막 조직으로부터 분리하여 사용하였다. 상기 조직을 5 배 부피의 헤르페스 완충용액(20 mM HERPES, 0.25 M Sucrose, 1 mM PMSF, pH 7.2)을 이용하여 균질화 하였다. 이를 두겹의 외과용 가제로 여과하여 4℃에서 100,000 rpm으로서 60분간 원심분리하고, 상등액을 0.2 ㎛의 여과지로 여과하고, 모노 큐 음이온 컬럼을 이용한 FPLC 시스템에서 20 mM bis-Tris, 3 mM EDTA, 0.2 mM DTT, 1 mM 벤즈아미드 및 1 μM PMSF가 포함된 50 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 6.5)으로 컬럼을 평형화 시킨 후, 1 M 소듐 아세테이트 완충용액(pH 6.5)으로 농도구배를 주면서 PDE 이소자임(isozyme)을 용출하였다. 이 분획들에 대하여 하기와 같은 PDE의 활성을 측정함으로써 PDE5 분획을 분리하고, 이 분획을 이용하여 시험물질의 cGMP-PDE5의 활성억제 정도를 측정하였다.

튜브에 반응용액(15 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, , pH 7.4) 100 ㎕에 상기 PDE 시료 (20∼40 ㎕)을 넣고 잘 혼합한 후, [3H]-GMP (22000 dpm/㎕)와 시험물질을 첨가함으로써 반응을 시작하고, 30℃ 항온조에서 약 20분 동안 반응시켰다. 그 후 반응 튜브를 끓는 물에 약 2분간 담가 반응을 종결시켰다. 튜브를 얼음조에서 약 10분간 냉각시키고, 5'-뉴클리오타제 활성을 띄고 있는 사독(snake venom protein, 10 mg/㎖로서 5 ㎕)을 가한 후, 30℃ 항온조에서 약 10분 동안 반응시킨 다음, 0.5 ㎖의 냉각수를 첨가하였다. 반응용액을 DEAE-Sephacel 음이온 교환 수지 컬럼(0.5 ×50 mm)에 주입하고 이온수지에 결합하지 않는 효소반응 산물을 2 ㎖의 증류수로 용출시키고, 여기에 방사능측정용 칵테일 (Ultima Gold) 10 ㎖을 첨가하고 β-카운터를 이용한 방사활성을 측정하여 효소 활성도를 계산하였다.

(1) 고삼 추출물의 제조 및 cGMP-PDE5 활성억제 효과 측정

상기 실시예 1에서 얻어진 고삼 추출물을 상기 실험방법을 이용하여 cGMP-PDE5 활성 억제효과를 각각 측정하였다.

그 결과, 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 고삼의 부탄올 분획물과 물 분획물은 약한 cGMP-PDE5 활성 억제효과를 보인 반면에, 메탄올 분획, 디클로로메탄 분획 및 아세트산 에틸 분획물은 cGMP-PDE5 활성 억제력이 각각 4.77 ㎍/㎖, 2.34 ㎍/㎖ 및 1.54 ㎍/㎖의 IC₅₀ 값을 나타내어 이들 추출물이 cGMP-PDE5를 강력하게 억제하는 것으로 밝혀져 실데나필과 같이 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선에 유용한 것으로 밝혀졌다.

상기 실시예 1에서 얻어진 각 추출물 분획의 cGMP-PDE5 활성 억제효과를 표 1에 정리하였다.

용매분획	cGMP-PDE5 활성 억제력(IC₅₀, ㎍/㎖)
고삼의 메탄올 추출물	4.77
고삼의 디클로로메탄 분획	2.34
고삼의 아세트산 에틸 분획	1.54
고삼의 부탄올 분획	24.79
고삼의 물 분획	24.50

(2) 고삼으로부터 분리된 성분들의 cGMP-PDE5 활성억제 효과 측정

상기 실시예 2에서 얻어진 플로보노이드 화합물에 대하여 상기 실험방법을 이용하여 이들의 cGMP-PDE5 활성억제 효과를 각각 측정하였다.

그 결과, 분리된 화합물인 쿠쉐놀 H, 쿠쉐놀 K, 쿠라리놀, 소포플라베세놀, 쿠라리딘인 5종의 플라보노이드 화합물들 모두가 농도의존적으로 cGMP-PDE5 활성을 억제하였으며(도 1 참조), 이 결과를 바탕으로 50 %활성을 억제하는 IC₅₀ 값을 표 2에 나타내었으며, 그 중 소포플라베세놀의 cGMP-PDE5 활성억제 효과가 가장 강력하였다. 유효 성분 중 비교적 억제 효과가 큰 쿠라리놀, 소포플라베세놀, 쿠라리딘의 PDE5 억제 기전을 분석한 결과 (도 2∼4 참조) 경쟁적 또는 혼합형 활성 억제를 보여 주었다.

분리된 성분	cGMP-PDE5 활성 억제력(IC₅₀, ㎍/㎖)
쿠쉐놀 H	4.75
쿠쉐놀 K	10.6
쿠라리놀	6.1
소포플라베세놀	0.013
쿠라리딘	0.64

따라서, 본 발명의 쿠쉐놀 H, 쿠쉐놀 K, 쿠라리놀, 소포플라베세놀, 쿠라리딘, 또는 이들을 포함하는 고삼의 알콜 추출물, 고삼의 디클로로메탄 추출물 및 고삼의 아세트산 에틸 추출물은 cGMP-PDE5 활성억제 효과가 우수하여 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선에 유효하다는 사실을 알 수 있었다.

<실험예 2> 생쥐에 대한 경구 또는 복강 투여 급성 독성실험

본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 물질 중 쿠쉐놀 H, 쿠쉐놀 K, 쿠라리놀, 소포플라베세놀, 쿠라리딘과 같은 플라보노이드 화합물 및 본 발명의 추출물에 대한 생체내 급성 독성실험을 하기와 같이 실시하였다.

실험군 당 생쥐(C57BL/6 mouse) 6 마리씩 사용하여, 본 발명의 화합물 및 추출물을 최대 10,000 ㎎/㎏의 용량으로 각 용량 단계별로 경구투여 또는 복강 내 주사하였다. 경구투여군은 2주간 관찰하였으며, 복강내 투여군은 1주간 관찰하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하고 현미경검사를 실시하였다.

실험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과로부터, 본 발명의 화합물 및 추출물은 생쥐에서 경구투여 또는 복강내 주사시 반치사량(LD₅₀)은 10,000㎎/㎏ 이상으로 전혀 독성효과를 나타내지 않음으로써 생체 안정성이 매우 높다는 것을 알 수 있었다.

<제제예 1> 시럽제의 제조방법

본 발명의 화합물 및 추출물을 유효성분으로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.

본 발명의 화합물, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

본 발명의 화합물(또는 본 발명의 고삼 추출물) ··· 0.5 g

사카린 ·······················0.8 g

당 ························ 25.4 g

글리세린······················ 8.0 g

향미료 ······················ 0.04 g

에탄올 ·······················4.0 g

소르브산 ······················0.4 g

증류수 ·······················정량

<제제예 2> 정제의 제조방법

유효성분 0.5 g이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

본 발명의 화합물 또는 고삼 추출물 0.5 g을 락토오스 17.6 g, 감자전분 18 g 및 콜로이드성 규산 3.2 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 16 g, 활석 5.0 g 및 스테아린산 마그네슘 0.5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

본 발명의 화합물(또는 본 발명의 고삼 추출물) ···· 0.5 g

락토오스 ·······················17.69 g

감자전분 ······················· 18 g

콜로이드성 규산 ··················· 3.2 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ························ 16 g

활석 ·························· 5 g

스테아르산 마그네슘 ·················· 0.5 g

<제제예 3> 주사액제의 제조방법

유효성분 0.03 g을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

본 발명의 화합물 또는 고삼 추출물 0.03 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

본 발명의 화합물(또는 본 발명의 고삼 추출물) ···· 0.03 g

염화나트륨·······················0.6 g

아스코르브산······················0.1 g

증류수·························정량

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물 및 이를 포함하는 고삼 추출물은 cGMP-PDE5 활성억제 효과가 우수하며, 독성이 적어 발기부전과 같은 성기능 장애의 개선에 탁월한 효과를 나타내고 있다.

도 1은 본 발명의 고삼 추출물에서 분리된 쿠쉐놀 H(△), 쿠쉐놀 K(○), 쿠라리놀(□), 소포플라베세놀(■) 및 쿠라리딘(▲)의 cGMP-PDE5 활성억제 효과를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 쿠라리놀이 백서의 횡경막으로부터 추출한 PDE5 활성에 미치는 효과를 분석하여 작성한 린위버-벅크 플롯(Linewaever-Burk plot)이고,

도 3은 본 발명의 소포플라베센스가 백서의 횡경막으로부터 추출한 PDE5 활성에 미치는 효과를 분석하여 작성한 린위버-벅크 플롯(Linewaever-Burk plot)이고,

도 4는 본 발명의 쿠라리딘이 백서의 횡경막으로부터 추출한 PDE5 활성에 미치는 효과를 분석하여 작성한 린위버-벅크 플롯(Linewaever-Burk plot)을 나타낸 것이다.

Claims

하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 약학적으로 허용되는 그의 염, 그의 이성체 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 하는 성기능 장애 개선용 조성물.

화학식 1

(상기식에서,

R₁은 2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-3-메틸-부트-3-엔일기 또는 3-메틸-부트-2-엔일기이고,

R₂는 수소, 하이드록시 또는 C₁∼C₃ 알콕시이며,

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록시이며,

점선은 단일결합 또는 이중결합을 나타낸다.)

화학식 2
제 1항에 있어서, 상기 화합물이

(1)2-(2,4-디하이드록시-페닐)-3,7-디하이드록시-8-[2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-3-메틸-부트-3-엔일]-5-메톡시-크로만-4-온(쿠쉐놀 H, 화학식 3);

화학식 3

(2)2-(2,4-디하이드록시-페닐)-3,7-디하이드록시-8-[2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-3-메틸-부트-3-엔일]-5-메톡시-크로만-4-온(쿠쉐놀 K, 화학식 4);

화학식 4

(3)2-(2,4-디하이드록시-페닐)-7-하이드록시-8-[2-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-3-메틸-부트-3-엔일]-5-메톡시-크로만-4-온(쿠라리놀, 화학식 5);

화학식 5

(4)3,7-디하이드록시-2-(4-하이드록시-페닐)-5-메톡시-8-(3-메틸-부트-2-엔일)-크로멘-4-온(소포플라베세놀, 화학식 6); 또는

화학식 6

(5)1-[2,4-디하이드록시-3-(2-이소프로펜일-5-메틸-4-헥센일)-6-메톡시-페닐]-3-(2,4-디하이드록시-페닐)-프로페논(쿠라리딘, 화학식 7)

화학식 7

인 것을 특징으로 하는 성기능 장애 개선용 조성물.
제 1항의 화합물을 포함하고, C₁∼C₄의 저급 알콜, 함수(函數) 알콜, 디클로로메탄 또는 아세트산에틸로 추출한 후 여과 및 감압 증발시켜 얻어진 고삼(Sophora flavescens) 추출물을 유효성분으로 하는 성기능 장애 개선용 조성물.
제 1항의 화합물을 포함하고, C₁∼C₄의 저급 알콜로 추출하여 얻은 상기 고삼 알콜 추출물을 여과 및 감압 증발시킨 후, 물에 현탁시킨 용액을 디클로로메탄, 아세트산에틸 또는 부탄올로 추출한 후 여과 및 감압 증발시켜 얻어진 고삼 추출물을 유효성분으로 하는 성기능 장애 개선용 조성물.
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