KR100524373B1

KR100524373B1 - 삼백초 추출물을 함유하는 항암제용 약학조성물 및 그의제조방법

Info

Publication number: KR100524373B1
Application number: KR10-2002-7015402A
Authority: KR
Inventors: 함종천; 이대상; 고재필; 이인경; 이현우; 박정숙
Original assignee: 그린텍이십일 주식회사; 함종천
Priority date: 2000-05-18
Filing date: 2001-05-17
Publication date: 2005-11-02
Also published as: JP2004506608A; US20040024055A1; KR20010105064A; WO2001087869A1; KR20030019384A; AU5889501A; EP1282613A1; EP1282613A4

Abstract

본 발명은 삼백초로부터 추출한 신규 화합물 HNP-98701A(에피-마나싼틴 A, epi-manassantin A), HNP-98701B 및 HNP-98701C(마나싼틴 A, manassantin A)의 항암제로서의 용도와 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 삼백초를 메탄올로 추출하고 이를 다시 여러 유기용매로 분획하여 가장 우수한 항암 활성을 나타낸 에틸아세테이트 분획을 박막 크로마토그라피 또는 칼럼 크로마토그라피로 분리하고 고속액체 크로마토그라피로 정제하여 얻은 신규한 화합물 HNP-98701A 및 HNP-98701B, 기지의 화합물 HNP-98701C와 이의 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C은 암세포주 유래의 세포에만 선택적으로 작용하여 아폽토시스(apoptosis)에 의한 세포사멸을 유발하므로 기존의 항암제보다 정상세포에 대한 부작용은 적으면서 항암 활성이 매우 우수한 선택적인 항암제의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

삼백초 추출물을 함유하는 항암제용 약학조성물 및 그의 제조방법{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE EXTRACT OF SAURURUS CHINENSIS BAILL USEFUL AS AN ANTICANCER AGENT AND A PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF}

본 발명은 삼백초로부터 추출한 신규 화합물 HNP-98701A(에피-마나싼틴 A, epi-manassantin A), HNP-98701B 및 HNP-98701C(마나싼틴 A, manassantin A), 또는 이들의 혼합물(HNP-98701)의 항암제로서의 용도와 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 삼백초를 메탄올로 추출하고 이를 다시 여러 유기용매로 분획하여 가장 우수한 항암 활성을 나타낸 에틸아세테이트 분획을 박막 크로마토그라피(thin-layer chromatography) 또는 칼럼 크로마토그라피(column chromatography)로 분리하고 고속액체 크로마토그라피(high performance liquid chromatography)로 정제하여 얻은 신규한 화합물 HNP-98701A 및 HNP-98701B, 기지의 화합물 HNP-98701C, 또는 이들의 혼합물 및 이의 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

동남아시아인의 10% 정도가 간염보균자로서, 간염은 간경화 및 간암의 직접적인 발병원인으로 해석되고 있다. 통계적으로 간암 환자의 95% 이상이 간염이 발병원인으로 보고되었으며, 특히 한국인의 간암발생율과 간암사망률은 세계 1위이다. 1991년 통계 자료에 의하면, 한국인의 간암 발생율은 인구 10만명 당 24.1명 이었고, 1996년 보건복지부 자료에 의하면, 간암의 발생빈도는 22.4%로서 위암의 40.7%에 이어 암 발생빈도에 있어 2위를 차지하고 있다. 또한, 1995년 통계 자료에 의하면, 한국인의 암사망율에 있어서도 10만명당 26.5명 꼴인 위암사망률에 이어 간암사망률이 10만명 당 22.0명으로 2위를 기록하고 있으며, 간암사망률로는 세계 1위이다.

이와 같이, 높은 간암발생율과 간암사망률이 사회적인 문제로 대두되면서 간염백신, 간염치료제 및 간암치료제 등의 연구개발과 상품화가 활발히 진행되고 있으나, 현재까지 개발된 다양한 치료법은 여러 가지 문제점이 발생되고 있다. 예를 들면, 현재 시중에서 사용되고 있는 간염백신은 항원성(antigenicity)이 낮아 백신으로서 효과적이지 못하며, 간염치료제는 대부분이 간 기능 개선에 초점을 두고 개발되어 간염 바이러스에 대한 직접적인 효능이 의문시되고 있는 실정이다. 최근에는 간염바이러스의 증식을 저해하는 작용기작을 가진 간염치료제가 개발되었으나, 모든 간염환자에게 적용할 수 없는 등의 문제점을 안고 있다. 따라서, 대다수의 간염 환자들은 간암으로 진전될 수 있는 위험에 노출되어 있는 것이다.

현재 사용되고 있는 간암치료제는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 시타라빈(sytarabine) 및 알킬옥산(alkyloxane) 등이 있으나, 이들은 암세포를 사멸하는 기능보다는 암세포의 성장을 저해하는 기능에 초점을 둔 것으로서 간암의 근원적인 치료방법이 되지 못하고 있다. 또한, 간암의 획기적인 치료방법으로 알려진 "홀륨-키토산 복합체 치료제"(DW-166HC)은 아직 임상적으로 그 안정성 및 효과가 입증되지 않아 앞으로도 많은 환자를 대상으로 한 장기간의 임상시험이 진행되어야 하며, 암 덩어리가 2개 이상 여러 장기에 퍼져 있거나 다른 장기로 전이되었을 경우, 복수 또는 황달의 증상이 있을 경우, 암 덩어리에 연결된 혈관이 여러 개인 경우에는 상기의 치료방법이 적용될 수 없다는 문제점이 있다. 더욱이, 상기 치료법은 병원에서 의사의 시술에 의해서만 치료를 받을 수 있다는 제한성을 가지고 있다.

이와 같이 간암치료제를 개발하는 것은 간이 인체 내 모든 물질의 대사에 관여하는 특성을 고려할 때 매우 어려운 일이나, 정상세포에는 최소한의 독성을 나타내면서 간암세포에는 최대한의 독성을 나타낼 수 있는 선택적인 활성물질을 개발할 수 있다면 획기적인 간암치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

한편, 전립선 암은 서구에서는 여성의 유방암만큼이나 발병률이 높은 남성 질환으로서, 현재 미국에서 가장 빈번하게 진단되는 남성질환 중의 하나이다. 매년 30여만 명의 환자들이 전립선 암을 선고 받으며, 전립선 암에 걸려 사망하는 환자수도 매년 41,400명에 이르고 있어 미국에서는 암으로 인한 사망원인 중 폐암에 이어 2위를 차지하고 있다.

최근 한국에서도 60세 이상의 노인 인구 10만 명당 40명 꼴로 전립선 암이 발병하고 있는데, 특히 전립선 암 환자들의 대다수가 초기에는 전립선 비대증의 증세를 보였던 병력을 가지고 있는 것으로 보고되어 60세 이상 노인 남자의 60% 이상을 차지하는 전립선 비대증 환자들에게 전립선 암의 발병에 대한 경각심을 불러일으키고 있다. 하지만, 전립선 암 치료에 있어 가장 큰 문제점은 전립선 암을 치료하는 과정 중에 성기능이 마비되는 부작용이 야기되기 때문에 대부분의 남성들이 전립선 암에 대해 거론하기를 꺼려한다는 점이며, 이로 인해 그 동안 전립선 암에 대한 연구는 상대적으로 무시되어 왔다. 10년 전만 해도 전립선 암을 치료하는 방법은 성기능과 배뇨억제능력 상실 등의 부작용을 유발하는 수술법말고는 대안적인 치료법이 없었지만, 이러한 문제점을 극복하기 위한 부단한 노력과 연구 결과 기존의 치료법들을 새로운 방식으로 응용하는 획기적인 전립선 암 치료법이 개발되고 있다. 예를 들면, 셀제네시스사(Cell Genesys)의 면역시스템을 자극하는 방법, 아이시스 제약회사(Isis Pharmaceuticals Inc.) 및 노바티스(Novartis AG)의 안티센스(antisense) 기술, 인트로젠 테라퓨틱사(Introgen Therapeutics Inc.)의 아데노바이랄-p53(adenoviral-p53) 유전자 요법, 테라제닉사(Theragenics)의 방사능 치료법, 유로메드사(UroMed Corp.)의 카버맵 서지컬 에이드(CaverMap Surgical Aid) 및 머크사(Merck Co.)의 전립선비대증 치료제인 프로스카(Proscar) 등에 관한 연구가 전세계적으로 활발하게 진행되고 있지만, 그 연구성과는 아직까지 초기단계에 불과한 상태이다.

이와 같이 전립선 암은 남성의 생식기에 발생하는 암으로서 가장 흔하게 발병하는 남성질환이면서도 치료 시 유발되는 성기능 장애라는 부작용 때문에 많은 환자들이 감추게 되고 그 치료 역시 완쾌가 쉽지 않은 질병이다. 따라서, 전립선 암 치료제에 대한 엄청난 시장 수요를 고려할 때, 정상세포에는 최소한의 독성을 나타내면서 전립선암세포에는 최대한의 독성을 나타낼 수 있는 선택적인 천연물 유래의 활성물질을 개발한다면, 이는 전립선 암 치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 것이며 전 인류의 건강증진에 이바지할 수 있을 것이다.

한편, 삼백초는 후추목(Piperales) 삼백초과(Saururaceae)에 속하는 식물로서, 삼백초과 식물은 5속 7종으로 구성되어 있으며 주로 북미와 아시아에 분포하고 있다. 전 세계적으로 분포하고 있는 삼백초 속은 삼백초(Saururus chinensis Baill)와 서양삼백초(Saururus cernuus)가 있으며, 한국에서 자생하는 삼백초과 식물은 삼백초와 약모밀(Houttuynia cordata Thunb ; 어성초)의 2종이 보고되어 있다. 이들은 모두 습지에서 자라는 다년초 식물로서, 일반 약재 시장에서는 약모밀이 삼백초로 유통되고 있는 등 구분 없이 판매되고 있으나 엄연히 다른 식물이다. 삼백초는 주로 제주도에 자생하고 있는 식물로서 현재 멸종 위기식물로 지정되어 복원사업이 진행 중이며, 경남 거창에서 대단위로 재배되고 충청남도 농촌진흥원에서 재배시험이 실시되는 등 삼백초의 재배에 많은 연구가 진행되고 있다.

삼백초는 다년생 초본으로 뿌리줄기는 희고 옆으로 뻗으며 수염뿌리를 가지고 있다. 30 내지 90 ㎝ 정도의 키에 줄기는 곧게 서고 털이 없으며 하부는 옆으로 비스듬히 누워 있다. 잎은 어긋나고 난형(卵形) 또는 난상피침형(卵狀披針形)으로 끝이 뾰족하며 엽병이 존재한다. 잎은 길이가 5 내지 14 ㎝, 폭이 4 내지 6 ㎝ 정도로서 다섯 갈래의 맥이 있고 초여름에 줄기 윗부분의 2 내지 3 매의 잎이 하얗게 변하는 특징이 있다. 꽃은 양성이고 백색이며 길이는 10 내지 15 ㎝이며 개화기는 6 내지 8월이고 수술은 6 내지 7개, 암술은 1개, 자방은 3 내지 5개의 심피를 가지고 있다. 삼백초는 개화기 때 줄기 윗부분에 존재하는 3개의 잎이 흰색으로 변하여 삼백초라 하기도 하고, 뿌리, 잎 및 꽃 등 3곳이 희다고 하여 삼백초라 하기도 한다.

상기와 같은 특징을 갖는 삼백초는 중국에서 오래 전부터 민간약으로 사용되어 온 약초이다. 중약대사전(中葯大辭典)에는 삼백초가 청리습열(淸利濕熱), 소종(消腫) 및 해독(解毒)작용이 있어 수종(水腫), 각기(脚氣), 황달(黃疸), 임탁(淋濁), 대하(帶下), 옹종(癰腫) 및 정독(賽毒)에 효과가 있다고 되어 있다. 청리습열(淸利濕熱) 및 황달(黃疸)에 효과가 있는 것은 간장질환에 효과가 있음을 의미한다.

당본초(唐本草)에는 삼백초가 수종(水腫), 각기(脚氣), 대소변의 원활한 배설, 소담파벽(消痰破癖) 및 제적취(除積聚)의 기능이 있다고 하였는데, 파벽(破癖)과 제적취(除積聚)에 효과가 있다 함은 간경화와 암에 효과가 있음을 나타낸다고 볼 수 있다. 또한, 소변의 원활한 배설에 효과가 있음은 전립선 비대증과 암에 효과가 있음을 알 수 있다.

중국약학대사전(中國藥學大辭典)에서도 삼백초는 수종(水腫), 각기(脚氣), 대소변의 원활한 배설, 소담파벽(消痰破癖) 및 제적취(除積聚)의 기능이 있다고 하였으며, 중국의학대사전(中國醫學大辭典)에서는 삼백초가 소담(消痰), 파벽(破癖), 제적취(除積聚), 이대소변(利大小便), 치학질(治虐疾), 치흉격담열(治胸膈痰熱), 치수종(治水腫), 치각기(治脚氣) 및 요정종(療賽腫)의 기능이 있다고 기재 되어 있다. 그 외 본초습유(本草拾遺), 식물명실도고(植物名實圖考), 영남채약록(嶺南采葯錄), 광서중약지(廣西中葯志), 본초추진(本草推陳) 및 호남약물지(湖南葯物志) 등에서도 삼백초의 효용을 기록하고 있으며, 항암중약일천방(抗癌中葯一千方)에는 삼백초가 간암에 효과가 있다고 기재되어 있다.삼백초는 국내에서도 오래 전부터 민간약으로 사용되어 왔는데, 원색천연약물대사전(原色天然藥物大辭典)에는 삼백초가 소변불리(小便不利), 수종(水腫), 임탁(淋濁), 각기(脚氣), 간염(肝炎), 황달(黃疸) 및 옹종(癰腫) 등에 효과가 있다고 하여 간장질환, 배뇨기능 및 암에 유효하다고 기재되어 있다.

미국에서의 서양삼백초(Saururus cernuus)에 대한 연구는 쇼발 등이 상기 식물에 세스퀴테르펜(sesquiterpene)계 화합물이 다수 들어 있는 것으로 보고하였으며(Chaubal et al., Phytochemistry, 14 : 595-596, 1975), 라오 등은 SC-8과 SC-9라는 새로운 네오리그난(neolignan)계 활성물질을 분리하여 이들이 신경이완작용(neuroleptic activity)이 있는 것을 발견하였다(Rao et al., Dissertation Abstract International, 45(6) : 2384B, 1981). 이후 라오 등은 지속적인 연구를 통하여 삼백초로부터 마나산틴 A, 마나산틴 B(manassantin A, B) 및 소서네올(saucerneol)이라는 물질을 분리하여 각각의 구조를 규명하였으며, 이 중 마나산틴 A가 강력한 신경이완효과를 가지고 있음을 밝혀내었다(Rao et al., Tetrahedron Lett. 24(45) : 4947-4950, 1983). 상기 결과를 바탕으로 라오 등은 마나산틴 A 의 신경계 내 중추 억제효과에 대해 연구하기 위하여 마나산틴 A의 마우스 독성 실험을 수행한 결과, 마나산틴 A를 마우스의 복강 내에 투여할 때 IC₅₀은 0.21 ± 0.02 ㎎/㎏으로서 자발운동이 감소되며 암페타민 유발상동성(stereotypy)이 저지됨을 관찰하였다. 반면, 마나산틴 A를 LD₅₀에 도달하는 양으로 투여할 경우에도 할로페리돌(haloperidol)에서의 강직증이나 안검하수증이 관찰되지 않아 마나산틴 A가 선택으로 신경이완효과를 나타내고 있음을 보고하였다(Rao et al., Pharmacol. Res. Comm. 19(9) : 629-639, 1987). 또한, 라오 등은 서양 삼백초로부터 락탐(lactam)계 화합물인 아리스토락탐 BII(aristololactam BII ; cepharanone)와 소리스토락탐(sauristolactam)을 새로이 분리하였다(Rao et al., J. Nat. Prod., 53(2) : 309-312, 1990).

중국에서의 삼백초(Saururus chinensis)에 대한 연구는 쑤 등이 전체 플라보노이드(flavonoid)와 하이페린(hyperin)의 전량적정(coulometric titration)에 의한 삼백초의 분석방법을 보고하였고(Xu et al., Acta Pharmaceutica Sinica, 21(4) : 306-309, 1986 ; 葯物分析雜志, 8(4) : 223-225, 1988), 왕 등은 삼백초로부터 추출한 클로로포름 분획층이 강력한 항고혈압활성이 있음을 밝혔으며, 삼백초로부터 리그난(lignan)계의 소치논(sauchinone), 안트라퀴논(anthraquinone)계의 피시온(physcion), 에모딘(emodin), 피시온배당체(physion-8-D-glucopyranose) 및 알칼로이드(alkaloid)계의 세파라논 B(cepharanone B) 등을 분리하였다(Wang et al., Heterocycles, 43(5) : 969-975, 1996).

일본에서는 삼백초에 대한 연구는 거의 전무한 반면, 약모밀에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 미국, 중국, 일본 등을 위시한 외국의 삼백초 연구에서는 삼백초가 항암 활성을 나타낸다는 어떠한 연구 결과도 보고된 바 없으며, 삼백초로부터 유용한 항암성분을 분리했다는 결과도 없었다.

국내에서는 곽이 삼백초의 수성엑기스, 메탄올엑기스, 부탄올분획 추출물 및 쿠에르세틴(quercetin)에 대한 약리작용 및 항균작용에 대하여 실험한 결과, 진통, 해열 및 소염효과가 있음을 보고하였다(경희대학교 박사학위논문, 1988). 특히, 곽은 아세틸콜린, 바륨 및 히스타민에 의해 수축된 마우스 및 기니픽 적출반전장관에 대해서 상기의 삼백초 추출물이 이완효과를 나타냄을 보고하였는데, 이러한 결과는 라오 등의 연구결과와 부합되는 것으로 보인다. 그 외에도 곽은 상기 분획 가운데 일부 분획에서 항히스타민작용, 혈압강하작용 및 항균작용이 나타나는 것으로 보고하였다. 최는 삼백초로부터 휘발성 성분, 지방산, 아미노산 및 플라보노이드를 추출분리하고 삼백초의 물추출물이 항균 활성을 나타냄을 보고하였다(경희대학교 박사학위논문, 1989). 이는 삼백초 지상부의 성분에 관한 연구에서 테르펜계(terpenoids)로 추정되는 성분을 분리하였으나, 상기 성분은 생리활성기능을 나타내지 않는 것으로 보고하였다(서울대학교 석사학위논문, 1988). 권은 삼백초로부터 간세포 보호활성을 갖는 물질을 분리하여 구조를 규명하였고 이 물질이 플라보노이드계의 쿠에르세틴 배당체임을 보고하였다(서울대학교 석사학위논문, 1994).

그 외 최 및 정에 의해 삼백초의 플라보노이드 성분에 관한 연구(Analytical Science & Technology, 4(3) : 285-288, 1991 ; Analytical Science & Technology, 7(1) : 11-15, 1994 ; J. of Basic Sciences, Cheju Nat. Univ. 8(1) : 137-142, 1995), 정유성분에 관한 연구(Analytical Science & Technology, 2(2) : 259-262, 1988 ; 경희대학교 논문집 18 : 341-347, 1989 ; Cheju Nat. Univ. Journal 33 : 105-111, 1991) 및 지방산과 아미노산 성분에 관한 연구(Analytical Science & Technology, 2(2) : 285-292, 1989 ; Cheju Univ. Jour. (Natural Sci.), 35 : 111-118, 1992) 등이 보고되었다.

상기와 같이 국내의 삼백초에 대한 연구는 삼백초의 성분을 분석하는 기초연구분야에서 활발하게 진행되고 있는데, 국내 뿐 아니라 전술한 바와 같이 전세계적으로 삼백초로부터 분리된 50여 종의 성분중에서 항암 성분으로 보고되거나 항암활성을 가지고 있다고 보고된 성분은 아직까지 없었다.

삼백초와 관련된 특허 또한 많지 않다. 국외적으로는 1건의 특허(US Patent 4,619,943)가 미국에서 출원되었는데, 이는 서양삼백초 유래의 네오리그난(Neolignan)계 물질인 마나싼틴 A(manassantin A)의 신경이완 및 살충ㆍ살선충효과에 관한 것으로 항암효과에 대한 작용은 기재되어 있지 않다. 국내적으로도 1건의 특허(한국특허공개 96-31440)가 출원된 상태이며, 이는 삼백초 성분의 하나인 소리스토락탐계의 화학적인 유도체를 조성물로 하는 항암제에 관한 것이나, 본 발명자가 삼백초로부터 소리스토락탐을 분리하고 결정화 한 후 항암 활성을 조사한 결과 항암 활성이 검출되지 않았다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 삼백초는 동·서양 모두에서 간장 및 비뇨기계의 제적취 및 암종 치료 등의 신생물(neoplasm) 치료에 전통적으로 사용되어 왔으나, 삼백초의 항암성분에 대한 구체적인 연구는 보고된 바 없다. 지금까지 전세계적으로 삼백초로부터 분리된 50여종의 성분 중 항암활성물질로 밝혀진 성분은 없었고 단지 플라보노이드계의 쿠에르세틴 배당체가 항암활성과 연관되어 있음을 추측하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 뚜렷한 간암 및 전립선암 치료제가 없는 국내외의 실정을 감안할 때 간암 및 전립선암치료제로서 유용하게 사용할 수 있는 약학적 조성물을 제공하기 위하여, 임상적으로 항간암 및 항전립선암 효과가 있는 삼백초를 이용하여 정상세포에는 영향을 주지 않고 간암세포 및 전립선암세포에만 선택적으로 작용하는 새로운 항암활성물질을 분리하였다. 또한, 본 발명자들은 삼백초로부터 분리한 항암활성을 갖는 신규한 선도물질이 간암세포 및 전립선암세포에 대해 선택적으로 작용함을 밝히고 이를 유효성분으로 함유하여 간암 및 전립선암 등의 암치료에 매우 유용하게 사용될 수 약학적 조성물을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

도 1은 전립선암세포주(DU-145)가 피하이식된 누드마우스에서 HNP-98701의 항암활성을 종양의 크기 변화로 나타낸 것이다.

본 발명의 목적은 삼백초 유래의 항암활성을 갖는 신규한 화합물 HNP-98701A(에피-마나싼틴 A), HNP-98701B와 기지의 화합물 HNP-98701C(마나싼틴 A), 또는 이들의 혼합물(HNP-98701) 및 이의 유도체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 항암활성을 갖는 신규한 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 기지의 화합물 HNP-98701C를 삼백초로부터 추출하는 제조방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 상기 항암활성을 갖는 신규 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 기지의 화합물 HNP-98701C, 또는 이들의 혼합물(HNP-98701)을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 항암활성을 갖는 삼백초 유래의 신규한 화합물질, 그의 유도체 및 그들의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

화학식 1

상기 화학식 1에서 R1은 메틸기, 아세틸기, 알킬기, 알켄기, 알킨기, 아민기, 아미드기, 시아노기, 티오시아노기, 알데히드기 또는 할로겐 원자로부터 선택되며, 각각 동일하거나 다를 수 있다.

화학식 1에서, R1이 H인 항암활성을 갖는 신규한 화합물 HNP-98701A는 하기 화학식 4로 표시되며 마나싼틴 A의 에피머(epimer)로서 존재한다.

화학식 4

또한, 상기 화학식 1에서 R1에 -COCH₃ 또는 -CH₃가 치환된 아세틸 유도체 또는 메틸 유도체 역시 항암활성을 나타낸다.

화학식 2

상기 화학식 2에서 R1은 메틸기, 아세틸기, 알킬기, 알켄기, 알킨기, 아민기, 아미드기, 시아노기, 티오시아노기, 알데히드기 또는 할로겐 원자로부터 선택되며, 각각 동일하거나 다를 수 있다.

화학식 2에서, R1이 H인 항암활성을 갖는 신규한 화합물 HNP-98701B는 하기 화학식 5로 표시되며, 마나싼틴 A와 에피-마나싼틴 A의 혼합형의 구조를 갖는다.

화학식 5

또한, 상기 화학식 2에서 R1에 -COCH₃ 또는 -CH₃가 치환된 아세틸 유도체 또는 메틸 유도체 역시 항암활성을 나타낸다.

화학식 3

상기 화학식 3에서 R1은 메틸기, 아세틸기, 알킬기, 알켄기, 알킨기, 아민기, 아미드기, 시아노기, 티오시아노기, 알데히드기 또는 할로겐 원자로부터 선택되며, 각각 동일하거나 다를 수 있다.

화학식 3에서, R1이 H인 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701C는 하기 화학식 6으로 표시되는 마나싼틴 A로 그의 에피머 역시 항암활성을 나타낸다.

화학식 6

또한, 상기 화학식 3에서 R1에 -COCH₃ 또는 -CH₃가 치환된 아세틸 유도체 또는 메틸 유도체 역시 항암활성을 나타낸다.

또한, 상기 화학식 1, 2, 3의 혼합물 역시 항암활성을 나타낸다.

본 발명의 화학식 1, 2 및 3의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 화학식 1, 2 및 3의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 항암활성을 갖는 신규한 화합물 HNP-98701A(에피-마나싼틴 A), HNP-98701B 및 HNP-98701C(마나싼틴 A), 또는 이들의 혼합물(HNP-98701)은 삼백초를 메탄올로 추출한 후 여러 종류의 유기용매로 분획하여 얻은 유기용매 추출분획 중 가장 우수한 항암 활성을 나타내는 에틸아세테이트 추출분획을 박막 크로마토그라피 또는 칼럼 크로마토그라피로 분리하여 고속액체 크로마토그라피법으로 정제하여 제조되었다. 상기 화학식 4 및 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 삼백초 유래 화합물 HNP-98701A는 HNP-98701C에서 수산기(-OH)의 위치가 변한 마나싼틴 A의이성질체(isomer)인 에피머(epimer)로서 삼백초에서는 처음으로 분리되었으며, HNP-98701A 및 HNP-98701C는 각각 에리스로(erythro) 형의 에피-마나싼틴 A(epi-manassantin A) 구조 및 쓰레오(threo) 형의 마나싼틴 A(manassantin A) 구조를 가지고 있다.

또한, 본 발명의 HNP-98701B는 HNP-98701A 및 HNP-98701C의 NMR 데이타를 공유하고 있으므로, 상기 화학식 5에 나타난 바와 같이 마나싼틴 A의 한쪽 수산기는 쓰레오(threo) 형이고 다른 한쪽 수산기는 에리스로(erythro) 형인 대칭구조를 가지고 있다.

본 발명의 항암활성을 갖는 삼백초 유래 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 물리ㆍ화학적 특성을 성상, 용해도, 자외선 분광분석법, 적외선 분광분석법, 질량 분석법 및 핵자기 공명 분광분석 등으로 분석한 결과는 다음과 같다.

(1) 성상

본 발명의 항암활성을 갖는 삼백초 유래 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C는 모두 백색을 띠며 무취인 특성을 나타낸다.

(2) 용해도

본 발명의 항암활성을 갖는 삼백초 유래 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C는 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 클로로포 및, 디메틸설폭사이드(DMSO) 등에는 매우 잘 용해되는 반면, 물, 아세톤, 에테르 및 헥산 등에는 용해되지 않는다.

(3) 자외선 분광분석법

본 발명의 항암활성을 갖는 삼백초 유래 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 자외선 흡수 스펙트럼을 조사한 결과, 상기 물질들 모두 230 nm 및 280 nm에서 흡수대를 나타낸다.

(4) 적외선 분광분석법

본 발명의 항암활성을 갖는 삼백초 유래 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 적외선 흡수 스펙트럼은 모두 동일하다. 구체적으로, 상기 물질들의 흡수대는 파수 3,442 cm-1, 2,962 cm-1, 2,927 cm-1, 1,652 cm-1, 1,607 cm-1, 1,511 cm-1, 1,418 cm-1, 1,264 cm-1, 1,138 cm-1, 1,029 cm-1, 855 cm-1, 810 cm-1 및 750 cm-1 에서 나타난다. 3,442 cm-1의 흡수대는 수소결합이 있는 수산화기(OH)에 의한 것이고, 2,962 cm-1 및 2,927 cm-1의 흡수대는 -CH기에 의한 것이다.

1,652 cm-1, 1,607 cm-1 및 1,418 cm-1의 흡수대는 방향족환의 탄소 이중결합(C=C)에 의한 것이고, 1,511 cm-1의 흡수대는 방향족환의 1, 2 및 4번 탄소 위치에 수소(H) 이외의 것이 치환되어 나타난 것이며, 1,138 cm-1 및 1,029 cm-1의 흡수대는 C-O기에 의한 것이다. 또한, 855 cm-1, 810 cm-1, 및 750 cm-1의 흡수대는 방향족환의 =CH기의 면외(out-of-plane) 굽힘진동에 의한 것이다.

(5) 질량 분석법

본 발명의 항암활성을 갖는 삼백초 유래 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 분자량은 FAB+ 질량 분석법에 의해서는 분자량이 754로 나타나 핵자기 공명 분광분석 결과와 일치하지 않았으나, EI+ 질량 분석법에 의해서는 분자량이 732로 나타나 일치함을 보인다.

(6) 핵자기 공명 분광분석

본 발명의 항암활성을 갖는 삼백초 유래 화합물 HNP-98701A 및 HNP-98701C를 핵자기 공명 분광분석법으로 조사하여 H-NMR 및 C-NMR 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, HNP-98701B는 HNP-98701A 및 HNP-98701C의 결과를 공유한다.

<표 1> 수소 및 탄소의 위치

본 발명은 항암활성을 갖는 삼백초 유래의 신규한 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 기지의 화합물 HNP-98701C의 분리에 따른 각각의 추출물 및 분리물질을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼백초를 저급 알코올로 추출하여 얻은 삼백초 추출물, 삼백초를 메탄올로 추출한 후 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 등의 유기용매로 다시 추출하여 얻은 삼백초 유기용매 추출분획 및 삼백초로부터 분리한 유기용매 추출분획을 실리카젤이 충진된 칼럼 크로마토그라피(Column Chromatography)로 분리하여 얻은 분리물질이 항암활성을 나타냄을 확인하였다.

또한, 본 발명은 항암활성을 갖는 삼백초 유래의 신규한 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 기지의 화합물 HNP-98701C의 산 및 알칼리에 의한 분해물을 제공하며, 상기 화합물의 각종 분해물 역시 항암활성을 나타낸다.

아울러, 본 발명은 삼백초 유래의 신규한 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 기지의 화합물 HNP-98701C를 추출하는 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은

ⅰ) 삼백초를 저급 알코올에 침지시켜 반복 추출하는 단계 ;

ⅱ) 상기 저급 알코올 추출물에 각종 유기용매를 가하여 추출하는 단계 ;

ⅲ) 상기 각종 유기용매 추출 분획을 크로마토그라피(Chromatography)로 분리하여 항암활성물질을 얻는 단계 ; 및

ⅳ) 상기 분리된 각각의 항암활성물질을 정제하는 단계로 구성된다.

마지막으로, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 삼백초로부터 분리된 항암활성을 갖는 신규한 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 기지의 화합물 HNP-98701C, 또는 이들의 혼합물(HNP-98701)을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 삼백초로부터 항암활성을 갖는 삼백초 추출물을 분리한다.

이를 위하여, 본 발명자들은 삼백초를 저급 알코올에 침지시켜 반복 추출함으로써 항암활성을 나타내는 삼백초의 알코올 분획을 얻었다. 이 때, 삼백초로는 천연 또는 인공 재배한 삼백초를 포함하여 생초, 건초, 지상부, 뿌리 및 차로 이용되고 남은 잔사 등을 사용하고, 알코올로는 메탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이 삼백초를 메탄올을 이용하여 추출한 후 다시 유기용매를 사용하여 추출한 항암활성을 갖는 삼백초 추출물을 분리한다.

구체적으로, 본 발명자들은 삼백초의 전초를 메탄올로 추출하여 농축한 후 다양한 유기용매를 사용하여 분획함으로써 항암 효과가 우수한 삼백초의 다양한 용매추출 분획을 제조하였다.

이 때, 유기용매를 이용한 추출은 비극성용매로부터 극성용매의 차례로 실시하며 유기용매는 저급 알코올을 포함하여 에틸아세테이트, 헥산, 클로로포름 또는 부탄올 등이 시용될 수 있다. 바람직한 실시예로서, 본 발명은 노르말-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 등을 차례로 사용하여 각각의 용매 추출분획 및 물 분획을 제조하였으며 특히, 에틸아세테이트를 사용하여 얻은 삼백초 추출물이 가장 우수한 항암 효과를 나타냄을 확인하였다. 상기와 같은 용매를 사용한 용매 추출시, 삼백초를 추출하는 온도는 4 내지 100℃ 범위인 것이 바람직하고, 실온 또는 4 내지 30℃ 범위인 것이 더욱 바람직하다.

상기의 삼백초로부터 분리한 유기용매 추출분획을 실리카젤이 충진된 칼럼 크로마토그라피를 이용하여 항암 활성을 가지는 물질을 분리하기 위하여, 본 발명자들은 상기에서 가장 우수한 항암활성을 나타낸 에틸아세테이트 추출분획을 농축한 후 이를 메탄올이나 에틸아세테이트에 용해시켜 실리카젤이 충진된 칼럼 크로마토그라피에 점적하고 노르말-헥산, 에틸아세테이트 및 메탄올을 여러 가지 조성 비율로 혼합한 유기용매를 사용하여 용출·농축시킨 후 박막 크로마토그라피로 분리하여 항암 활성을 나타내는 분리물질을 제조하였다.

박막 크로마토그래피 분석 결과, 항암활성을 갖는 분리물질의 이동율(run of flow : Rf)은 0.01 내지 0.5 사이에 위치하고 있으며, 이 이동율 부근의 분획을 모아 반복적으로 농축하여 항암활성을 갖는 물질을 분리하고 상기 화합물을 HNP-98701로 명명하였다.

이후 프렙-박막 크로마토그라피(Prep-Thin Layer Chromatography : prepTLC)를 이용하여 상기 화합물 HNP-98701로부터 3가지 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C를 분리한다.

이를 위하여, 본 발명자들은 삼백초 유래 화합물 HNP-98701 분획을 농축한 후 이를 메탄올이나 에틸아세테이트에 용해시켜 실리카젤을 입힌 프렙-박막 크로마토그라피에 점적한 후 노르말-헥산, 에틸아세테이트 및 메탄올을 여러 가지 조성 비율로 혼합한 유기용매를 사용하여 용출하였다. 프렙-박막 크로마토그라피 분석 결과, 상기 HNP-98701 분획의 이동율은 0.2 내지 0.9 사이에 각각 세곳으로 나뉘어 위치하고 있으며, 세곳의 밴드를 각각 따로 모아 반복적으로 농축하여 항암활성을 갖는 3가지 물질을 분리하고 상기 화합물 각각을 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C로 명명하였다.

이와 같이 분리한 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C를 더욱 정제하기 위하여, 본 발명자들은 노르말-헥산과 에틸아세테이트에 대한 용해도의 차이를 이용한 용매침전법으로 황색색소를 제거하여 백색의 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C를 제조하고, 상기 화합물들의 순수도를 고속 액체 크로마토그라피법(High Pressure Liquid Chromatography : HPLC)을 사용하여 측정한 결과 순도가 매우 높은 물질임을 확인하였다.

마지막으로, 본 발명은 삼백초 유래의 항암활성을 갖는 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물, 또는 이들의 혼합물 및 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 삼백초 유래 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 및 그의 유도체는 임상투여시에 근육 또는 정맥 주사제와 같은 형태의 비경구 투여 뿐 아니라 경구로도 투여할 수 있으며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 기존의 항종양 의약품과 병용하여 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 및 그의 유도체는 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1 내지 3의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 유효성분으로서 함유되는 항암활성을 갖는 삼백초 유래 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물, 또는 이들의 혼합물 및 그의 유도체의 유효량은 0.1 내지 3.0 mg/kg이 바람직하고, 0.3 내지 1.0 mg/kg이 보다 바람직하며, 하루 1 회 투여될 수 있다.

본 발명의 삼백초 유래 항암활성을 갖는 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물은 정상세포 유래의 세포주에는 독성을 나타내지 않는 반면, 간암 및 전립선암 세포 유래의 암세포주에는 선택적으로 작용하여 세포사멸을 유도하는 특성을 가지고 있어, 이를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물은 간암, 유방암, 인후암, 흑색종, 폐암, 전립선암, 직장암, 위암, 자궁경부암, 식도암, 설암, 구강암, 췌장암, 갑상선암, 백혈병 및 골수암 등의 치료에 사용될 수 있고, 바람직하게는 간암, 전립선암, 유방암, 인후암, 흑색종 및 위암 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 간암 및 전립선암 등에 효과적인 치료제로 사용될 수 있다.

이 외에도, 본 발명의 항암활성을 갖는 삼백초 유래의 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 및 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 기능성 식품 또는 식품 첨가제 및 기능성 음료 또는 음료 첨가제, 항암 화장품첨가제, 항암 비누첨가제 및 항암 샴푸첨가제 등에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 삼백초로부터 메탄올 추출물의 제조

건조된 삼백초 전초 100 g을 분말로 하여 메탄올 1 L에 침지시킨 후 실온에서 3일 동안 추출하였다. 상기 추출물을 여과한 후 잔사는 다시 메탄올로 반복 추출하였으며, 이 과정을 모두 3회 반복하여 실시하였다. 상기에서 얻은 여과 후의 여액은 20 내지 60℃에서 농축하여 메탄올 추출물 8 g을 제조하였다.

상기 과정에서 제조한 메탄올 추출물의 항암활성은 이를 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide, 이하 "DMSO"라 약칭함)에 용해시킨 후 하기 실험예 1의 MTT 분석을 수행하여 확인하였다(표 2).

<실시예 2> 메탄올 추출물로부터 다양한 유기용매 추출분획의 제조

<2-1> 헥산 추출분획의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 메탄올 추출물 5 g을 증류수 100 ㎖에 현탁시켜 500 ㎖의 분획여두에 넣고, 노르말-헥산 100 ㎖을 넣어 진탕시킨 후 5시간 동안 정치시켜 노르말-헥산으로 이행되는 물질을 모았으며, 이를 4회 반복하여 실시하였다. 상기에서 얻은 노르말-헥산층을 모아 여과한 후 이를 농축하여 헥산 추출분획 0.8 g을 제조하였다.

상기 과정에서 제조한 헥산 추출분획의 항암활성은 이를 DMSO에 용해시킨 후 하기 실험예 1의 MTT 분석을 수행하여 확인하였다(표 2).

<표 2>각 용매 추출물의 간암세포주에 대한 항암활성 측정 : IC₅₀ (㎍/㎖)

<2-2> 에틸아세테이트 추출분획의 제조

상기 실시예 2에서 헥산 추출분획을 제조하고 남은 물층 100 ㎖에 에틸아세테이트 100 ㎖을 넣어 진탕시킨 후 5시간 동안 정치시켜 에틸아세테이트로 이행되는 물질을 모았으며, 이를 4회 반복하여 실시하였다. 상기에서 얻은 에틸아세테이트층을 모아 여과한 후 농축하여 에틸아세테이트 추출분획 1.7 g을 제조하였다. 상기 과정에서 제조한 에틸아세테이트 추출분획의 항암활성은 이를 DMSO에 용해시킨 후 하기 실험예 1의 MTT 분석을 수행하여 확인하였다(표 2).

<2-3> 부탄올 추출분획의 제조

상기 실시예 3에서 에틸아세테이트 추출분획을 제조하고 남은 물층 100 ㎖에 부탄올 100 ㎖을 넣어 진탕시킨 후 5시간 동안 정치시켜 부탄올로 이행되는 물질을 모았으며, 이를 4회 반복하여 실시하였다. 상기에서 얻은 부탄올층을 모아 여과한 후 농축하여 부탄올 추출분획 3.6 g을 제조하였다.

상기 과정에서 제조한 부탄올 추출분획의 항암활성은 이를 DMSO에 용해시킨 후 하기 실험예 1의 MTT 분석을 수행하여 확인하였다(표 2).

<2-4> 물 추출분획의 제조

상기 실시예 4에서 부탄올 추출분획을 제조하고 남은 물층 100 ㎖을 모아 여과한 후 농축하여 물 추출분획 1.9 g을 제조하였다.

상기 과정에서 제조한 물 추출분획의 항암활성은 이를 DMSO에 용해시킨 후 하기 실험예 1의 MTT 분석을 수행하여 확인하였다(표 2).

<실시예 3> 에틸아세테이트 추출분획으로부터 컬럼 크로마토그라피에 의한 항암 활성물질 HNP-98701의 분리

상기 실시예 2에서 제조한 여러 유기용매 추출분획 중 가장 우수한 항암활성을 나타낸 에틸아세테이트 추출분획 1 g을 에틸아세테이트 2 ㎖에 용해시킨 후 실리카 젤(Merck Co.)이 충진된 칼럼의 상단부에 주입하고 바다모래로 덮어 유기용매를 사용하여 용출하였다. 용출용매는 노르말-헥산, 2 : 1, 1 : 1, 2 : 3, 1 : 2 및 1 : 4 조성의 노르말-헥산 : 에틸아세테이트를 사용하여 차례로 용출한 후 다시 에틸아세테이트, 20 : 1 및 10 : 1 조성의 에틸아세테이트 : 메탄올을 사용하여 차례로 용출하였다. 용출된 각 분획들의 항암활성은 하기 실험예 1의 MTT 분석에 의해 확인하였으며, 항암활성을 갖는 활성분획을 2차, 3차 및 4차 칼럼 크로마토그라피를 반복하여 용출하였다. 용출용매로 노르말-헥산 : 에틸아세테이트 = 1 : 2 내지 1 : 4를 사용하여 항암활성을 보이는 황색의 물질을 분리하였고, 본 발명자들은 상기 화합물을 HNP-98701이라 명명하였다.

상기 실시예에서 각 단계별로 제조된 분리분획의 항암활성은 이를 DMSO에 용해시킨 후 하기 실험예 1의 MTT 분석을 수행하여 확인하였다(표 3).

<표 3> 각 칼럼 크로마토그라피의 각 분리단계에서 용출된 활성물질의 간암세포주에 대한 항암활성 측정 : IC₅₀ (㎍/㎖)

<실시예 4> 박막 크로마토그라피를 이용한 화합물 HNP-98701로부터의 3가지 항암활성물질 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 분리

상기 실시예 3에서 컬럼 크로마토그라피에 의해 분리된 항암활성을 갖는 HNP-98701 70 ㎎을 에틸아세테이트 0.5 ㎖에 용해하여 프렙-TLC(Merck Co.) 1장에 점적한 후 전개용매를 사용하여 전개하였다. 1 : 2 조성의 노르말-헥산 : 에틸아세테이트를 전개용매로 사용하여 수회 반복하여 전개시킨 결과, 화합물 HNP98701의 이동율은 0.2 내지 0.9 사이에 각각 세곳으로 나뉘어 위치하고 있는데, 이동율이 가장 큰 밴드의 화합물을 HNP-98701A, 이동율이 중간인 밴드의 화합물을 HNP-98701B, 이동율이 가장 낮은 밴드의 화합물을 HNP-98701C라 명명하였으며, 세곳의 밴드를 각각 따로 모아 건조시켜 항암활성을 갖는 미황색의 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C를 분리하였다.

<실시예 5> 용매침전법을 이용한 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 정제

상기 실시예 4에서 분리한 항암활성을 갖는 미황색의 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C 10 ㎎씩을 1 ㎖의 에틸아세테이트에 용해시킨 후 노르말-헥산을 조금씩 첨가하여 침전물이 생성되는 것을 확인하였다. 상기 혼합액을 냉장실에 하룻밤 동안 방치한 후 여과하여 백색의 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 침전물을 얻었다.

<실시예 6> 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 순수도 측정

상기 실시예 5에서 용매침전법으로 정제된 백색의 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701 A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 순수도를 조사하기 위하여, 고속액체 크로마토그라피(High Pressure Liquid Chromatography, 이하 "HPLC"라 약칭함)를 수행하였다.

구체적으로, 각각의 화합물 10 ㎎을 메탄올 1 ㎖에 용해시켜 시료를 준비한 후 상기 시료들을 하이퍼실-BDS C18 칼럼(hypersil-BDS C18 column, Hewlett Packard)에 주입하고 메탄올과 증류수를 이동상으로 사용하여 분리하였다. 50분 동안 분당 0.5 ㎖의 속도로 증류수 : 메탄올의 비율이 증류수 100%에서 메탄올 100%에 이를때까지 분당 2%씩 순차적으로 변화시키며 흡수대의 양상을 확인한 결과, 30분대에서 뚜렷하게 구분되는 큰 흡수대가 단일 밴드로 존재하는 것이 확인됨으로써 상기 화합물들의 순도가 매우 높음을 확인하였다.

상기와 같이 분리된 순도가 매우 높은 3가지 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 항암활성은 이를 DMSO에 용해시킨 후 하기 실험예 1의 MTT 분석을 수행하여 확인하였으며, 상기 3가지 화합물이 혼합된 HNP-98701을 DMSO에 용해하여 하기 실험예 2의 동물 독성실험에 사용하였다(표 4, 5, 6 및 7).

<표 4> 고속액체 크로마토그라피법에 의해 분리된 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 간암세포주에 대한 항암활성 측정 : IC₅₀ (㎍/㎖)

<표 5> 고속액체 크로마토그라피법에 의해 분리된 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 전립선암세포주에 대한 항암활성 측정 : IC₅₀ (㎍/㎖)

<표 6> 고속액체 크로마토그라피법에 의해 분리된 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 각종 인체 암세포주에 대한 항암활성 측정 : IC₅₀ (㎍/㎖)

* : 시료 10 ㎍/ml에서 생존율 60% 이상일 때

N.E. : 효과 없음, 시료 10 ㎍/ml에서 생존율 90% 이상일 때

<표 7> 고속액체 크로마토그라피법에 의해 분리된 화합물 HNP-98701A, HNP-987014B 및 HNP-98701C의 각종 정상세포주에 대한 항암활성 측정 : IC₅₀ (/㎖)

* : 시료 10 /㎖에서 생존율 60% 이상일 때

N.E. : 효과 없음, 시료 10 /㎖에서 생존율 90% 이상일 때

<실시예 7> 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701C의 유도체 합성

<7-1> 아세틸 유도체 합성

상기 실시예 5에서 정제된 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701C의 아세틸 유도체를 합성하기 위하여, 화합물 HNP-98701C 15.9 ㎎에 무수 아세트산(acetic anhydride, Ac2O)과 피리딘(pyridine)을 넣고 실온에서 8시간 동안 반응시켜 생성된 반응물을 에틸아세테이트에 용해한 후 2 : 1 조성의 에틸아세테이트 : 헥산을 전개용매로 하여 프렙-TLC로 분리한 결과, 비반응물질(OAc-s), 1개의 -OH기에만 반응된 아세틸 유도체(OAc-1) 및 2개의 -OH기 모두에 반응된 아세틸 유도체(OAc-2)를 각각 4.2 ㎎, 6.9 ㎎ 및 3.0 ㎎씩 획득하였다. 상기와 같이 제조된 각각의 아세틸 유도체의 항암활성은 하기 실험예 1의 MTT 분석을 수행하여 확인하였다(표 8).

<표 8> 화합물 HNP-98701C의 아세틸 유도체 및 메틸 유도체의 암세포주에 대한 항암활성 측정 : IC₅₀ (㎍/㎖)

<7-2> 메틸 유도체 합성

상기 실시예 5에서 정제된 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701C의 메틸 유도체를 합성하기 위하여, 화합물 HNP-98701C 17.7㎎에 NaH와 CH3I를 넣고 실온에서 8시간 동안 반응시켜 생성된 반응물을 에틸아세테이트에 용해한 후 2 : 1 조성의 에틸아세테이트 : 헥산을 전개용매로 하여 분리한 결과, 비반응물질(OMe-s), 1개의 -OH기에만 반응된 메틸 유도체(OMe-1) 및 2개의 -OH기 모두에 반응된 메틸 유도체(OMe-2)를 각각 8.5 ㎎, 7.0 ㎎ 및 1.9 ㎎씩 획득하였다. 상기와 같이 제조된 각각의 메틸 유도체의 항암활성은 하기 실시예 1의 MTT 분석을 수행하여 확인하였다(표 8).

<실험예 1> MTT 분석을 이용한 항암활성 측정

상기 실시예 1 내지 7에서 제조한 각 단계별 추출물 및 분리물질의 항암활성을 조사하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다.

구체적으로, 간암세포주인 SK-HEP-1 세포를 3 × 105 cells/㎖의 농도로 96-웰 마이크로플레이트 (Falcon, USA)에 웰(well)당 100 ㎕씩 첨가하였다. 상기 실시예에서 분리되어 DMSO에 용해시킨 추출물 및 분리물질들을 100 ㎕씩 웰에 첨가하여 최종농도 50 ㎍/㎖에서부터 0.0244 ㎍/㎖까지 1/2 씩 희석한 후 최종부피가 200 ㎕가 되도록 맞추고 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-y1]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, Sigma Co.) 시약을 5 ㎎/㎖ 농도로 포함하고 있는 인산염 완충용액을 각 웰에 20 ㎕씩 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. 상기 배양액의 상층액을 100 ㎕ 취하여 0.04 N 염산-이소프로판올 100 ㎕를 첨가한 후 하룻밤 동안 방치하고, 이를 자동 엘리자 판독기(Molecular Divices Corp., USA)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 단계별 추출물 및 분리물질의 항암활성은 상기와 같이 측정된 흡광도 값으로부터 하기 수학식 1에 의해 환산된 세포 생존율로 하기 표에 나타내었다.

<수학식 1>

또한, 각 단계별 추출물 및 분리물질 중에서 평균 생존율이 50%가 되는 시료의 LD50을 구하여 간암 세포주에 대한 항암활성을 조사한 결과, 본 발명에서 분리한 추출물 및 분리물질들이 기존에 간암 치료제로 사용되고 있는 시스플라틴(cisplatin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil : 5-FU) 및 아드리아마이신(adriamycin ; doxorubicin) 보다 우수한 항암활성 효과를 보임을 알 수 있었다 (표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7 및 표 8 참조).

<실험예 2> 동물실험을 통한 화합물 HNP-98701의 항암활성 측정

상기 실험예 1의 표 4 및 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 삼백초 유래 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C는 간암세포주 및 전립선암세포주에 대해 매우 우수한 세포사멸 효과를 나타내었다. 따라서, 이들 HNP-98701A, HNP-98701B 및 HNP-98701C의 혼합물(HNP-98701)의 항암활성을 확인하기 위하여 동물실험을 수행하였다.

구체적으로, 간암세포주(SK-Hep-1) 및 전립선암세포주(DU-145)를 누드 마우스(balb/c athymic nude mouse)의 등에 피하이식하여 종양크기가 150 내지 200 mm3에 달하였을 때 본 발명의 항암활성을 갖는 HNP-98701을 복강주사(ip)하였다. 주사후 2주에서 5주까지 종양의 부피를 하기 수학식 2에 의해 측정하고, 종양조직을 절편하여 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.

<수학식 2>종양의 부피 = 1/2 ab²

이때, a는 종양의 긴쪽 직경을, b는 종양의 짧은쪽 직경을 의미한다.

삭제

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701 비처치군의 종양크기에 대한 HNP-98701 약제처치군의 종양크기를 상대적인 비율로 나타내면 전립선암의 경우 HNP-98701이 1 ㎎/㎏ 투여된 처치군은 비처치군에 비해 89%, HNP-98701이 3 ㎎/㎏ 투여된 처치군은 비처리군에 비해 85%의 종양증식 억제효과를 나타내었다(도 1). 또한, 종양조직의 HE 염색 슬라이드를 현미경으로 관찰한 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701 처치군은 비처치군에 비하여 종양내부조직의 괴사가 많이 이루어져 있었다.

한편, 간암의 경우에는 본 발명의 화합물 HNP-98701 비처치군의 종양이 200 내지 250 mm³ 크기에서 더 이상 증식하지 않아 HNP-98701 처치군의 항암활성 효능을 비교할 수 없었으나, 종양조직의 HE 염색 슬라이드를 현미경으로 관찰한 결과, 비처치군과는 달리 HNP-98701 처치군의 종양조직에서 비처치군에 비하여 종양외부에 백혈구 막이 형성되어 있음을 발견하였다. 이와 같이 종양외부에 백혈구 막이 형성된다는 것은 화합물 HNP-98701이 암세포에 영향을 미쳐 백혈구 등의 공격이 용이해지면서 세포사멸이 유도되는 것으로 해석됨으로 본 발명의 화합물 HNP-98701이 전립선암과 간암에 탁월한 효능이 있음을 알 수 있다.

<실험예 3> DNA 절편화 추출법에 의한 화합물 HNP-98701의 세포사멸 유형 조사

세포사멸(cell death)의 유형은 크게 아폽토시스(Apoptosis)와 괴사(Necrosis)로 구분되는데, 아폽토시스는 세포가 외부로부터 자극을 받으면 세포내에 세포사멸을 유도하는 여러 신호(signal)가 전달되어 세포가 죽는 유형이고, 괴사는 외부의 급격한 환경 변화나 충격에 의해 세포가 파괴되어 죽는 유형이다. 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701에 의해 세포가 아폽토시스 유형으로 사멸된다면, 이는 세포내의 작용기작에 의한 반응 결과이므로 본 발명의 화합물 HNP-98701의 항암제로서의 이용 가능성을 더욱 기대할 수 있을 것이다.

세포사멸의 유형을 확인하는 일반적인 방법은 시료를 처리한 세포로부터 추출한 DNA를 전기영동하여 DNA 양상(pattern)을 확인하는 것으로써, DNA가 일정한 크기의 사다리 형태로 나타나면 아폽토시스에 의한 세포사멸이고, DNA가 무작위적으로 끌리면 괴사에 의한 세포사멸이라고 할 수 있다.

이를 바탕으로, 본 발명의 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701의 세포사멸 유형을 확인하기 위하여, DNA 절편화 추출법(DNA fragmentation extraction)을 수행하였다. 구체적으로, DNA 절편화 추출법이 용이한 U937 세포를 3 x 10⁶ cells/㎖의 세포수로 10 ㎖씩 준비하여 본 발명의 HNP-98701을 10 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖씩 처리하고, 대조구로 HNP-98701을 처리하지 않은 것과 시스플라틴 10 ㎍/㎖, 아드리아마이신 10㎍/㎖을 처리한 것을 사용하였으며, 이들 모두를 37oC 에서 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 원심분리하여 시험관에 모아 인산염 완충용액으로 세정한 후 상기 세포에 용혈 완충용액(lysis buffer, 0.25% NP-40 in TBE buffer) 500 ㎕를 첨가하였다. 상기 세포 용액에 RNA 분해효소(RNase, 100 ㎍/㎖)와 단백질 분해효소(Proteinase K, 0.1 내지 1 ㎍/㎖)를 처리하여 37 ℃ 에서 30분 동안 반응시킨 후 페놀 : 클로로포름(phenol : chloroform) 추출 및 에탄올 침전을 통하여 DNA를 분리하였다. 상기 DNA를 1.3 내지 1.5% 아가로스 겔에 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 수행하여 DNA 양상(pattern)을 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 삼백초 유래 화합물 HNP-98701을 처리한 세포의 DNA는 아폽토시스의 전형적인 특징인 사다리꼴 양상(ladder pattern)을 보여주었는데, 이는 화합물 HNP-98701이 아폽토시스 작용기작에 의해 세포사멸을 유발함을 나타낸다.

<실험예 4> 세포주기에 대한 화합물 HNP-98701의 작용

상기 실험예 3에서 확인한 바와 같이 아폽토시스를 통해 세포사멸을 유도하는 본 발명의 화합물 HNP-98701이 세포내 어떤 신호 전달기작을 통하여 작용하는지를 밝히기 위하여, 세포 주기에 관련된 성분에 대한 HNP-98701의 카이네이즈 반응 활성(kinase reaction activity)을 조사하였다. 세포 주기에 관련된 성분으로는 G1 - S기(phase)에 관여하는 CDK2, G1기에 관여하는 CDK4, G2 - M기에 관여하는 Cdc2(CDK1)가 있는데, 이들의 카이네이즈 활성(kinase activity)이 억제되면 정상적인 세포분열을 진행할 수 없으므로 세포는 아폽토시스를 유발한다. 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701을 처리한 세포의 CDKs에 대한 카이네이즈 활성을 조사하면, HNP-98701이 세포주기(cell cycle)의 어느 시기에 관여하는지를 알 수 있다.

카이네이즈 활성을 확인하는 일반적인 방법은 세포에서 CDKs만 분리하여 CDKs 자체의 카이네이즈 활성을 확인하는 방법과 세포에 시료를 처리한 후 CDKs만 분리하여 세포내 CDKs의 양을 확인하는 방법이 있다.

<4-1> CDK2 카이네이즈 활성 반응 측정(분리한 CDK2에 약제처리)

먼저, 본 발명자들은 삼백초 유래 화합물 HNP-98701가 세포주기 중 G1 - S기에 관여하여 세포사멸을 유발하는지를 조사하기 위하여 G1 - S기의 CDK2 카이네이즈 활성을 확인하였다.

구체적으로, 쥐피하 결합조직 세포주인 L929 세포와 태아변형 신장세포주인 293 세포를 100-mm 조직배양 접시(tissue culture dish)에서 충분히 배양한 후 인산염 완충용액으로 2회 세정하였다. 상기 세포에 RIPA 완충용액(RIPA buffer, 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholic acid, 0.1% SDS, 1mM PMSF) 1 ㎖을 첨가하여 세포를 용해(lysis) 시킨 후 원심분리를 통해 세포 잔유물(cell debris)을 제거하고 세포 단백질(cellular protein)이 포함된 용액을 얻어 단백질을 정량하였다. 상기 용액에 항-Cdk2 항체(rabit polyclonal IgG, Upstate Biotechnology Inc.) 를 단백질 3 ㎎ 당 1 내지 10 ㎍씩 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 상기 용액 내 Cdk2에 결합한 항체와 반응시키기 위하여 단백질-G 아가로즈(protein-G agarose, Santa Cruz Biotechnology Inc.) 15 ㎕를 첨가하여 동일한 조건에서 혼합한 후 원심분리하여 Cdk2에 결합한 단백질-G 아가로즈를 시험관에 모으고 이를 RIPA 완충용액으로 2회, 20 mM HEPES 완충용액으로 3회 세정하여 카이네이즈 활성 반응에 사용할 면역침강물(Immunoprecipitate)을 준비하였다. 상기 면역침강물에 적당량의 HEPES 완충용액을 첨가하여 시험관에 분주하고, 여기에 반응 완충용액(reaction buffer)과 기질(substrate)로 히스톤 H-1(Histon-H1, 4㎍, Sigma Co.)을 혼합하고, HNP-98701의 최종농도가 100 μM이 되도록 첨가하였다. 상기 혼합액에 γ³² -ATP(Amersham) 1 mCi를 첨가하여 30℃에서 30분 동안 카이네이즈 반응을 실시한 후, 반응종결 완충용액(stop buffer)을 넣고 가열하여 반응을 종결시켰다. 상기 반응 혼합물을 12% SDS PAGE 전기영동을 수행하여 전개한 후 겔을 건조시키고 엑스레이 필름(x-ray film)에 노출시켜 밴드의 양상(band pattern)을 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 L929 세포의 CDK2 카이네이즈 활성에 대해서는 아무런 영향을 미치지 않은 반면, 293 세포의 CDK2 카이네이즈 활성은 감소시켰다(표 9).

<표 9> L929 및 293 세포주의 CDK2 카이네이즈에 대한 화합물 HNP-98701의 반응 억제 활성 측정

<4-2> 다양한 CDK2 세포주에 대한 화합물 HNP-98701의 반응 억제 활성(세포주에 약제처리후 CDK2 활성 측정)

상기 <4-1>과 동일한 방법으로 카이네이즈 반응 활성을 측정하였다.

구체적으로, L929, 293, 간암세포주인 SK-HEP-1 및 전립선암 세포주인 PC3 세포 등의 다양한 세포주를 100 mm 조직배양접시에 70 내지 80% 정도 자라도록 배양하고 0.2 ㎍/㎖, 0.3 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖의 농도로 준비된 HNP98701을 5 ㎖씩 첨가하여 24시간 동안 배양한 후, 인산염 완충용액으로 2회 세정하였다. 이하 세포를 용해시켜 면역침강물을 제조하고 카이네이즈 반응 활성을 유도하는 과정은 상기 <4-1>과 동일하게 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 상기 <4-1>과 동일하게 L929 세포의 CDK2 양에는 아무런 영향을 미치지 않은 반면, 293, SK-HEP-1 및 PC3 세포의 경우에는 CDK2의 양을 감소시켰다. 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701이 293, SK-HEP-1 및 PC3 세포에서 아폽토시스에 의한 세포사멸을 일으키는 작용기작은 세포주기의 G1 - S기에 관여하는 CDK2 카이네이즈의 활성을 억제하여 정상적인 세포분열을 방해함으로써 유발하는 것임을 확인하였다(표 10).

<표 10> 다양한 세포주의 CDK2 카이네이즈에 대한 화합물 HNP-98701의 반응 억제 활성 측정

<4-3> CDK4 카이네이즈 반응 활성 측정

본 발명자들은 삼백초 유래 화합물 HNP-98701이 세포주기 중 G1기에 관여하여 세포사멸을 유발하는지를 조사하기 위하여 G1기의 CDK4 카이네이즈 활성을 확인하였다.

상기 <4-1> CDK2의 경우와 동일하게 수행하였으나, 항-CDK2 항체 대신에 항-CDK4 항체(rabit polyclonal IgG, Upstate Biotechnology Inc.)를 사용하면서 기질로는 히스톤-H1을 그대로 사용하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 L929 및 293 세포의 CDK4에 대해서 아무런 영향을 미치지 않았다(표 11). 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701이 L929 및 293 세포에서 아폽토시스에 의한 세포사 세포사멸을 일으키는 작용기작은 G1기에 관여하는 CDK4 카이네이즈 활성의 억제에 의한 것이 아님을 확인하였다.

<표 11> L929 세포주의 CDK4 카이네이즈에 대한 화합물 HNP-98701의 반응 억제 활성 측정

<4-4> Cdc2 카이네이즈 반응 활성 측정

또한, 본 발명자들은 삼백초 유래 화합물 HNP-98701이 세포주기 중 G2 - M기에 관여하여 세포사멸을 유발하는지를 조사하기 위하여 G2 - M기의 Cdc2 카이네이즈 활성을 확인하였다.

상기 <4-1> CDK2의 경우와 동일하게 수행하였으나, 항-CDK2 항체 대신에 항-Cdc2 항체(mouse monoclonal IgG, Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 사용하면서 기질로는 히스톤-H1을 그대로 사용하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 293 세포의 Cdc2 카이네이즈 활성에 대해서 아무런 영향을 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701이 293 세포에서 아폽토시스에 의한 세포사멸을 일으키는 작용기작은 세포주기의 G2 - M기에 관여하는 Cdc2 카이네이즈 활성 억제에 의한 것이 아님을 확인하였다.

<4-5> E2F-1 단백질 함량변화 측정

상기 실험예 <4-1> 내지 <4-4>의 결과, 본 발명의 삼백초 유래 화합물 HNP-98701이 세포주기 중 G1 - S기에 관여하여 세포사멸을 유발하는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로, 본 발명자들은 화합물 HNP-98701이 세포주기 중 G1/S기로의 전환에도 관여하는지를 알아보기 위하여 E2F-1 단백질의 함량변화를 조사하였다.

구체적으로, 6 x 105 cells/4 ml(in 60-mm dish) 농도로 준비된 간암 및 전립선암세포주에 HNP-98701을 농도별 및 시간별로 처리하고 밤샘 배배양한 후 세포들을 수거하여 PBS로 2회 세척하였다. 상기 세포에 RIPA 완충용액 50 ㎕(/dish)를 첨가허여 세포를 용해시킨 후 원심분리(13000rpm, 10min)로 세포 잔여물(cell debris)을 제거하고 단백질을 정량하였다. 상기 단백질을 SDS-PAGE에 전기영동(80 V stacking-120 V running)을 수행한 후 겔 상의 단백질을 전기 블럿터(50V, 1.5 h 내지 2 h)를 이용하여 PVDF 막(PVDF membrane, Millipore)에 옮겨 웨스턴 블럿 분석(Western blot analysis)를 수행하였다.

웨스턴 블럿 분석시 항체의 비특이적인 반응을 억제하기 위하여, 상기 막을 5% 탈지분유(skim-milk)를 포함하는 TBST 용액에 담가 상온에서 1시간 동안 흔들어주면서 단백질이 전이되지 않은 여백을 탈지분유로 채워주었다. 상기 막에 1 ㎍/ml(in 2.5% skim-milk in TBST) 농도로 희석된 E2F-1 항체를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 흔들어 주면서 1차 항체결합 반응을 일으킨 후 TBST 완충용액으로 3회 세척하여 상기 막에 결합하지 않고 잔존하는 1차 항체를 제거하였다. 상기 막에 1 : 10,000 농도로 희석된 2차 항체를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 흔들어 주면서 2차 항체결합 반응을 일으킨 후 TBST 완충용액으로 3회 세척하여 비특이적으로 결합된 2차 항체를 제거하고 X-선 필름(X-ray film)에 노출시켜 밴드의 함량을 조사하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701을 1 ㎍/ml 농도로 48시간 동안 처리한 간암세포주(SK-Hep-1) 및 전립선암세포주(PC-3)에서는 E2F-1 단백질 함량이 감소되었는데, 이는 상기 세포들에서 화합물 HNP-98701에 의해 야기되는 아폽토시스에 의한 세포사멸이 G1/S기의 진행이 억제되기 때문에 유발됨을 나타낸다.

<실험예 5> 스트레스성 활성 단백질 관련 카이네이즈에 대한 HNP-98701의 작용

아폽토시스에 의해 세포독성을 유발하는 본 발명의 삼백초 유래 화합물 HNP-98701이 세포내의 여러 신호 전달전달 경로 중 어떠한 경로에 작용하는지를 조사하기 위하여, 스트레스에 의해 활성화되는 단백질(Stress Activated Protein)에 관련된 성분들에 대한 카이네이즈 반응 활성(kinase reaction activity)을 조사하였다. 스트레스성 활성 단백질과 관련된 성분으로는 SAPK, p38 및 MEKK 등의 카이네이즈가 있는데, 이들은 외부에서 스트레스가 전달되면 카이네이즈 활성화 반응이 야기되어 세포의 아폽토시스를 유발한다. 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701을 처리한 세포의 SAPK, p38 및 MEKK의 카이네이즈 활성을 조사하면, 본 발명의 화합물 HNP-98701이 스트레스성 활성 단백질과 관련된 신호전달 경로에 작용하여 아폽토시스에 의한 세포사멸을 유발하는지를 알 수 있다.

<5-1> SAPK 카이네이즈 반응 활성 측정

본 발명의 삼백초 유래 화합물 HNP-98701에 의해 야기되는 아폽토시스가 SAPK 경로에 영향을 주어 발생하는지를 조사하기 위하여 SAPK 카이네이즈 활성에 대한 화합물 HNP-98701의 영향을 조사하였다.

구체적으로, 다양한 세포주(L929, SK-HEP-1 및 PC3 세포)를 100-mm 조직배양 접시에 70 내지 80% 정도 되도록 배양하고 HNP-98701을 1 ㎍/㎖ 농도로 준비하여 5㎖ 씩 30분 동안 처리한 후 PBS 완충용액으로 2회 세정하였다. 이후의 방법은 상기 실험예 2 와 동일하나, 항-CDK2 항체 대신에 항-JNK 항체를 사용하고 히스톤-H1 대신에 GST-Jun을 기질로 사용하였다. 이 때, 상기 세포주에 UV를 1분 동안 조사한 후 1시간 동안 배양한 세포주를 양성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701이 처리된 상기 세포주들 중에서 L929 세포의 SAPK 카이네이즈 활성은 증가되는 반면 (표 12), 그 외 PC3와 SK-HEP-1 세포의 SAPK 카이네이즈 활성에는 아무런 변화도 나타나지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 화합물 HNP-98701이 L929 세포의 SAPK 경로에 관여하여 아폽토시스를 유발한다고 기대할 수 있으나, 그 외 세포주인 PC3와 SK-HEP-1 세포에서의 아폽토시스 유발은 SAPK 경로와 무관하게 이루어졌음을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 PC3와 SK-HEP-1 세포에 세포독성을 일으키는 작용기작은 SAPK 카이네이즈의 활성을 촉진시킴으로써 유도되는 것은 아님을 알 수 있다.

<표 12> L929 세포주의 SAPK 카이네이즈 활성에 미치는 화합물 HNP-98701의 작용

<5-2> MEKK 카이네이즈 반응 활성 측정

본 발명의 삼백초 유래 화합물 HNP-98701에 의해 야기되는 아폽토시스가 MEKK 경로에 영향을 주어 발생하는지를 조사하기 위하여 SAPK 카이네이즈 보다 신호전달 경로에서 전단계에 관여하는 MEKK 카이네이즈 활성에 대한 HNP-98701의 영향을 조사하였다.

구체적으로, 실험방법은 상기 실험예 2와 동일하나, 항-CDK2 항체 대신에 항-MEKK 항체를 사용하고 히스톤-H1 대신에 GST-SEK1을 기질로 사용하였으며 UV를 1분 동안 조사한 후 1시간 동안 배양한 세포주를 양성 대조군으로 사용하였다. 또한, HNP-98701을 처리하기 전에 배지에 0.5%의 FBS를 첨가하고 18시간 동안 배양하여 혈청 결핍(serum starvation) 상태가 유도된 세포를 사용하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 L929 세포의 MEKK 카이네이즈 활성을 20% 정도 증가시켰으나, PC-3와 293 세포의 경우에는 아무런 영향을 주지 않았다(표 13). 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 L929 세포에서는 MEKK 경로에 관여하여 아폽토시스에 의한 세포독성을 유발한다고 볼 수 있으나, 293 및 PC3 세포주에서 야기되는 세포독성은 MEKK 경로와는 무관함을 알 수 있다.

<표13> L929, 293 및 PC-3 세포주의 MEKK 카이네이즈 활성에 미치는 화합물 HNP-98701의 작용

<실험예 6> 화합물 HNP-98701의 상피세포 성장인자 수용체와의 결합여부 조사

본 발명의 삼백초 유래 화합물 HNP-98701이 아폽토시스에 의한 세포사멸을 유발하기 위해서는 세포에 작용하여 신호(signal)를 전달하기 위해 세포내로 유입되거나 세포 수용체(cell receptor)와 결합되어야 하는데, 이때 단백질 카이네이즈 C(Protein Kinase C, PKC)의 일종인 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor Receptor, 이하 "EGFR"이라 약칭함)를 매개로 하여 작용하는지를 규명하기 위하여 HNP-98701과 EGFR과의 결합여부를 조사하였다. 본 발명의 화합물 HNP-98701이 EGFR을 매개로 하여 신호를 전달한다면 HNP-98701과 EGFR의 작용에 의해 자가인산화반응(autophosphorylation)이 일어나지 않게 되므로 이를 조사하면 HNP-98701의 EGFR 매개 여부를 확인할 수 있다.

구체적으로, EGFR 생산세포주인 A431 세포를 100-mm 조직배양 접시(Tissue culture dish)에서 배양한 후 냉각시킨 PBS 완충용액으로 2회 세정하였다. 상기 세포에 적당량의 균질화 완충용액(homogenizer buffer : 50mM Tris-HCl, pH7.4, 1mM EDTA, 250mM Sucrose, 0.5mM PMSF, 0.5ug/ml Leupeptin)을 첨가하여 유리 균질기(glass homogenizer)로 균질균질화(homogenization)한 후 원심분리하여 세포 잔유물을 제거하였다. 상기로부터 얻은 상층액을 초고속 원심분리(ultracentrifuge)하여 침전물 형태의 세포막 분획(membrane fraction)을 분리한 후 이를 완충용액(solubilization buffer ; homogenizer buffer + 1% Triton X-100)에 용해시키고 다시 초고속 원심분리하여 용해된 세포막 분획을 분리하였다. 상기 세포막 분획에 적정 분량의 20 mM HEPES, 10 mM Na₃VO₄ 및 최종농도 10 μM 또는 100 μM 의 HNP-98701을 혼합하고 EGFR을 최종농도 500 nM이 되도록 첨가한 후 30℃에서 15분 동안 방치하여 EGFR을 활성화시켰다. 상기에 300 mM MgCl₂, 300 μM ATP 및 r ³²-ATP를 첨가하여 얼음에서 5분 동안 반응시킨 후 반응종결 완충용액(stop buffer)를 넣고 가열하여 반응을 종결시켰다. 상기 반응액을 12% SDS-PAGE 겔에 전기영동을 수행한 후 X-선 필름에 노출시켰다.

그 결과, HNP-98701 처리시에도 EGFR의 자가인산화반응에는 변화가 없었으므로, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 신호를 전달하기 위하여 세포내로 유입될 때 EGFR을 매개로 하지 않으며 단백질 카이네이즈 C의 활성에도 아무런 영향을 주지 않음을 알 수 있다(표 14).

<표 14> A431 세포주의 EFGR 자가인산화반응에 대한 화합물 HNP-98701의 작용

<실험예 7> 산화질소 생성 여부 측정

본 발명의 삼백초 유래 화합물 HNP-98701이 암세포에 작용하여 아폽토시스에 의한 세포사멸을 유발할 때 정상세포에도 세포독성을 나타낼 수 있는 산화질소(nitric oxide)가 부산물로 발생하는지를 조사하였다.

구체적으로, 세포독성 실험은 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하였으며, 이 때 HNP-98701을 처리한 세포주는 48시간 동안만 배양하였다. 산화질소의 생성여부는 상기 배양액 50 ㎕를 설파닐아마이드 용액(sulfanilamide solution) 50 ㎕와 혼합하여 상온의 암실에서 5 내지 10분 동안 반응시키고, 다시 NED 용액 50 ㎕를 첨가하여 동일한 조건에서 반응시켜 520 내지 550 nm에서 흡광도를 측정하여 나타내었다. 하기 표 15에 나타낸 바와 같이 상기 반응에 의한 NO 농도에 따른 표준 흡광도를 작성한 후 배양액으로부터 측정된 NO의 흡광도 값을 상기 표준 흡광도 표를 이용하여 농도로 환산하여 배양액 내 NO 양을 결정하였다. NO 측정 후 남은 세포는 MTT 분석과 LDH 분석으로 생존율과 괴사율을 측정하여 세포 사멸을 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 아폽토시스에 의한 세포사멸을 유발하지만 부산물로서 NO는 생성하지 않는 것으로 확인하였다(표 16). 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701의 세포독성을 유발하는 작용기작은 산화질소 합성효소(NO Synthase)의 활성과는 무관함을 알 수 있다.

<표 15> NO 농도에 따른 흡광도 표준 반응

<표 16> 산화질소 합성효소의 활성에 대한 화합물 HNP-98701의 작용

<실험예 8> 화합물 HNP-98701의 암세포 전이에 대한 부착 억제 활성 측정

본 발명자들은 삼백초 유래 화합물 HNP-98701이 암세포 전이(metastasis)에 어떠한 영향을 주는지를 확인하기 위하여, 암세포의 혈관벽 부착(adhesion)에 대한 HNP-98701의 억제 활성을 측정하였다.

일반적으로 암세포 전이는 1차로 발생한 암세포가 조직으로부터 혈관벽을 뚫고 혈관속으로 들어가 혈류와 함께 떠다니다가 다른 장기나 조직으로 이동함으로써 발생하는데, 이러한 암세포 전이에 있어 가장 중요한 과정은 이동된 암세포가 다른 장기나 조직의 혈관벽에 부착하는 것이다. 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701이 암세포의 혈관벽 부착에 영향을 미친다면 암세포 전이에도 영향을 미친다고 볼 수 있다. 이를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 매트리-젤(matri-gel), 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen) 및 젤라틴(gellatin) 등과 같이 암세포의 부착에 관여하는 혈관벽을 이루는 기질(matrix) 성분들에 대한 HNP-98701의 부착 억제 활성을 조사하였다.

HNP-98701의 부착 억제 활성은 상기의 기질들 각각이 코팅(coating)된 조직배양기(tissue culture plate)에 HNP-98701을 처리한 후 여기에 암세포를 부착시키고 이때 부착 정도에 미치는 영향으로 조사하였다. 구체적으로, 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate, Corning Co.)에 웰 당 매트리-젤 50 ㎍/㎖, 라미닌 2 ㎍/㎖, 콜라겐 2 ㎍/㎖ 및 젤라틴 2 ㎍/㎖을 각각 첨가하여 웰 표면에 골고루 코팅시켜 2시간 동안 굳힌 후 각 웰에 HNP-98701을 첨가하여 1시간 동안 처리하였다. 이 때, 각 웰에 첨가된 HNP-98701은 DMSO에 용해시켜 최종농도가 10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 0.1 ㎍/㎖가 되도록 농도별로 조절하였고, 최종농도가 50 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 및 0.5 ㎍/㎖로 조절된 시스플라틴과 최종농도가 10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 0.1 ㎍/㎖로 조절된 아드리아마이신을 대조 약물로 사용하였다. 상기 약물들을 1시간 동안 처리한 후 각 웰에 암세포를 첨가하여 3시간 동안 배양하였다. 이 때, 암세포로는 간암세포주(SK-HEP-1), 악성흑색종세포주(SK-MEL-28), 인후암세포주(Hep-2) 및 정상세포주(NIH-3T3)를 최종 세포수가 1 x 10⁶ cells/㎖이 되도록 조정하여 사용하였다. 상기 세포주들을 3시간 동안 배양한 후 원심분리하여 균체만 모아서 증류수나 PBS 완충용액으로 3회 세정하였다. 상기 세포를 디프-퀵 용액(Diff-Quick solution, Fisher Scientific)으로 염색하고 1% SDS/0.5 N NaOH를 처리하여 부착된 세포들을 녹여낸 후 자동 엘리자 판독기(Molecular Divices Corp., USA)로 560 내지 405 nm의 파장에서 흡광도를 측정하고 상기 실험예 1의 수학식 1에 의하여 세포 부착율(%)을 결정하였다. 각 실험은 3회 반복하여 실시하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 대조 약물로 사용한 시스플라틴과 아드리아마이신의 결과와 동일하게 다양한 기질에 대한 암세포의 부착 활성에 아무런 억제 효과를 나타내지 않았다(표 17, 표 18, 표 19 및 표 20). 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 항암활성 작용 중 암세포 전이에 있어 혈류 중의 암세포가 혈관에 부착하는 것을 억제하는 활성은 없는 것으로 나타났다.

<표 17> 화합물 HNP-98701의 메트리-겔에 대한 암세포의 부착 활성 억제 측정

<표 18> 화합물 HNP-98701의 라미닌에 대한 암세포의 부착 활성 억제 측정

<표 19> 화합물 HNP-98701의 콜라겐에 대한 암세포의 부착 활성 억제 측정

<표 20> 화합물 HNP-98701의 젤라틴에 대한 암세포의 부착 활성 억제 측정

<실험예 9> 화합물 HNP-98701의 혈관신생 및 전이억제효과 측정

본 발명자들은 삼백초 유래 화합물 HNP-98701이 암세포 전이를 억제하기 위하여 암세포의 혈관벽 부착 억제 이외에 다른 억제 효과를 나타내는지를 확인하기 위하여, 혈관신생 및 암세포의 전이에 중요한 역할을 하는 효소인 MMP-2(Matrix metalloproteinase-2)에 대한 활성 억제 효과를 측정하였다.

혈관신생이란 기존의 모세혈관에서 새로운 혈관이 형성되는 것을 말하는데, 이를 위해서는 먼저 기존 혈관의 기저막이 붕괴되어야 하고 이때 기저막을 붕괴하는 효소가 MMP-2 이다. 또한, 암세포 전이는 상피조직내의 암세포가 진피로 이동한 혈관을 끌여 들임으로써 암세포의 생장과 함께 일어나는데, 이때 상피조직의 암세포가 진피로 이동하기 위해서는 상피조직과 암세포 사이에 존재하는 기저막이 붕괴되어야 하고 이에 관여하는 효소 역시 MMP-2이다.

MMP-2 억제 활성 측정은 주로 트립토판(tryptophan)으로 구성된 7개의 펩타이드를 사용하는데, 상기 펩타이드에 DNP를 처리하면 형광 발생이 억제된다. 형광이 억제된 상기 펩타이드에 MMP-2를 처리하면 DNP가 제거되어 다시 형광이 나타나게 되고 이러한 형광의 발색유무로 MMP-2의 활성을 측정하게 된다. 구체적으로, 바큘로바이러스(baculovirus) 발현체계를 이용하여 proMMP-2를 얻은 후 37℃에서 1 mM p-(아미노페닐) 아세트산 수은(p-(aminophenyl)mercuric acetate)을 처리하여 활성화된 MMP-2를 얻었다. 반응 기질로 사용된 펩타이드는 Pro-Leu-Met-Trp-Ser-Arg으로 구성되어 있으며, 형광억제물질이 처리되면 DNP-Pro-Leu-Met-Trp-Ser-Arg이 형성된다. 50 mM 트리신(Tricine), 0.2 M NaCl 및 10 mM CaCl₂로 구성된 완충용액(buffer solution)을 pH 7.5로 조정하여 검색에 사용하였으며 검색반응은 23℃에서 실시하였다. 상기 펩타이드와 HNP-98701을 함유한 완충용액에 MMP-2를 첨가한 후 상온 저장하여 안정화시키고 형광분석기(Perkin-Elmer Model LS 50B fluorometer)를 이용하여 형광 변화를 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701 처리에도 불구하고 효소 MMP-2에 의해 상기 펩타이드로부터 형광 억제 물질인 DNP가 제거되어 형광 발생이 유도되었다. 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 혈관신생 및 암세포 전이에 중요한 역할을 수행하는 효소인 MMP-2의 활성을 억제하지 않았다.

<실험예 10> 동물 독성 실험

본 발명의 삼백초 유래 화합물 HNP-98701의 독성을 알아보기 위하여, 실험동물에 농도별로 준비한 HNP-98701을 정맥주사하여 2주일 동안 관찰하면서 실험동물의 50% 치사율 농도(LD50) 및 행동특성과 체중변화를 조사하였다. 실험동물은 몸무게가 30.0 내지 30.8 g 정도의 6주령된 ICR 흰쥐(면진실험동물)를 한 그룹당 5마리씩 사용하였으며, 정맥주사 전 24시간 동안 절식시킨 후 독성실험을 실시하였다. HNP-98701은 세포독성이 적은 DMSO에 용해시켜 사용하였으며, 투여량은 흰쥐의 혈액량을 고려하여 시험관내(in vitro) 실험에서 50% 치사율을 보인 농도를 기준으로 10,000배 농도(0.5 ㎎/마리), 5,000배 농도(0.25 ㎎/마리) 및 2,500배 농도(0.125 ㎎/마리)로 조절하여 주사하였다. 이 때, 대조군으로 HNP-98701을 용해시키지 않은 DMSO가 투여된 흰쥐를 사용하였다. 상기 농도별로 준비된 HNP-98701을 흰쥐의 꼬리 정맥에 각각의 농도별로 주사하고 흰쥐의 치사율, 행동변화, 탈모나 발적 등의 이상증상 및 체중변화를 2 내지 3일 간격으로 15일 동안 조사하였다.

그 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701 투여 농도가 0.5 ㎎/마리 및 0.25 ㎎/마리인 경우에서 모든 실험 동물이 치사한 반면, 0.125 ㎎/마리 농도에서는 모두 생존하였다. 또한, 상기 농도에서 생존한 흰쥐들은 DMSO만이 투여된 대조군의 흰쥐와 동일한 행동 양상을 보였고 특이한 행동특성이나 탈모, 발적 등의 이상증상을 보이지 않았다. 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701의 50% 치사율 농도(LD50)는 0.125 ㎎/마리 내지 0.25 ㎎/마리(4.12 ㎎/kg 내지 8.25 ㎎/kg)의 농도 범위에 있는 것으로 나타났다(표 21). 이는 라오 등이 보고한 마나싼틴 A의 50% 치사율 농도 LD₅₀ = 5.2 ㎎/kg과 거의 일치하는 결과이다. 또한, 시험관내 실험을 통하여 전립선암세포주에 대한 50% 유효농도와 실험동물에 대한 독성농도를 하기 수학식 3에 따라 환산하여 비교한 결과, 본 발명의 화합물 HNP-98701의 치료지수(Therapeutic Index : T.I.)는 2,500 이상인 것으로 나타났다.

<수학식 3>

마나산틴 A를 마우스의 복강내에 투여하여 자발운동이 50% 감소되는 농도(IC₅₀)가 0.21 ± 0.02 ㎎/kg이라는 라오 등의 실험 결과와 비교할 때, 본 발명의 HNP-98701은 이보다 훨씬 낮은 1백분의 1 정도의 농도에서 항암활성(IC₅₀)을 보임을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물 HNP-98701은 암세포에 대한 세포독성이 매우 강함과 동시에 정상세포에 대하여는 독성이 매우 낮게 나타내는 선택성을 보임으로써 부작용이 적으면서 항암활성이 강한 우수한 항암제로의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

<표 21> 화합물 HNP-98701의 동물독성 실험 결과

본 발명은 삼백초로부터 추출한 신규한 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B 및 기지의 화합물 HNP-98701C, 또는 이들의 혼합물(HNP-98701)의 항암제로서의 용도와 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 삼백초 유래 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B, HNP-98701C, 또는 이들의 혼합물(HNP-98701) 및 그의 유도체는 간암 및 전립선암세포주를 비롯하여 유방암, 인후암, 신경교아종 및 악성흑색종 등의 다양한 암세포주에 대해 기존의 항암제인 시스플라틴이나 아드리아마이신 보다 훨씬 강력한 항암활성을 보일 뿐 아니라 정상세포에 대한 부작용 역시 거의 없거나 매우 낮아 항암활성이 매우 우수하면서 선택적으로 작용하는 항암제의 개발이 기대된다.

또한, 본 발명의 삼백초 유래 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A, HNP-98701B, HNP-98701C, 또는 이들의 혼합물(HNP-98701) 및 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암제는 경구용으로의 개발이 가능하여 간편한 치료법을 제공함은 물론 기존의 항암제나 치료법과 병용하여 다양하게 이용될 수 있으며, 이외에도 항암 기능성식품 및 식품첨가제, 항암 기능성음료 및 음료첨가제, 항암 화장품첨가제, 항암 비누첨가제, 항암 삼푸첨가제 등의 유효성분으로 사용 될 수 있다.

아울러, 삼백초는 재배가 용이하고 삼백초의 재배를 통하여 농민의 소득증대에도 기여할 수 있어 농촌의 대외경쟁력을 향상시킬 수 있으며, 삼백초의 전초나 뿌리를 생체나 건조체로도 사용할 수 있을 뿐 아니라 차로 이용한 후 버려지는 잔사를 이용할 수 있어 자원의 재활용에도 기여한다.

마지막으로, 본 발명의 삼백초 유래 항암활성을 갖는 화합물 HNP-98701A 및 HNP-98701C의 수산기(-OH)는 반응성이 높은 작용기로서 새로운 유도체 합성을 위한 선도물질로 제공되어 유도체 합성, 활성검색 및 신약개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

항암활성을 갖는 하기 화학식 1의 신규 화합물 에피-마나싼틴 A(epi-manassantin A), 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염.

화학식 1

상기 화학식 1에서 R1은 아세틸기, 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 아민기, 아미드기, 시아노기, 티오시아노기, 알데히드기 또는 할로겐 원자로부터 선택되며, 각각 동일하거나 다를 수 있다.
제 1항에 있어서,

R1이 H, CH₃ 및 COCH₃로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염.
항암활성을 갖는 하기 화학식 2의 신규 화합물, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염.

화학식 2

상기 화학식 2에서 R1은 아세틸기, 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 아민기, 아미드기, 시아노기, 티오시아노기, 알데히드기 또는 할로겐 원자로부터 선택되며, 각각 동일하거나 다를 수 있다.
제 3항에 있어서,

R1이 H, CH₃ 및 COCH₃로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물, 그의 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염.
삭제
삭제
삼백초로부터 분리된 항암활성을 갖는 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 및 이들의 분해물.
ⅰ) 삼백초를 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올에 침지시켜 추출하는 단계;

ⅱ) 상기 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 추출물에 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 유기용매를 가하여 추출하는 단계;

ⅲ) 상기 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 유기용매 추출 분획을 크로마토그라피(Chromatography)로 분리하여 항암활성물질을 얻는 단계; 및

ⅳ) 상기 분리된 각각의 항암활성물질을 용매침전법으로 정제하는 단계; 로 구성되는 것을 특징으로 하는 삼백초 유래의 항암활성을 갖는 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물 및 그의 유도체의 제조방법.
제 8항에 있어서,

단계 ⅰ)의 삼백초는 생초, 건초, 지상부, 뿌리 및 차로 이용되고 남은 잔사를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 8항에 있어서,

단계 ⅰ)의 알코올이 메탄올인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 8항의 제조방법에서 각 단계별로 제조되는 항암활성을 갖는 삼백초 유래의 추출물.
삼백초로부터 분리된 항암활성을 갖는 HNP-98701A, HNP-98701B, HNP-98701C, 또는 이들의 혼합물(HNP-98701), 또는 이들의 아세틸 유도체 또는 메틸 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물.
제 12항에 있어서,

HNP-98701A, HNP-98701B, HNP-98701C를 0.1 내지 3.0 ㎎/㎏ 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 12항에 있어서,

암은 간암, 전립선암, 유방암, 유선암, 자궁경상피암, 신경교종, 신경아세포종, 신경교아세포종, 위암, 인후상피암, 섬유암종 또는 악성흑색종 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 항암제용 약학적 조성물.
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