KR20110139593A

KR20110139593A - 고미신-ａ를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료를 위한 약학 조성물

Info

Publication number: KR20110139593A
Application number: KR1020100059761A
Authority: KR
Inventors: 이영한; 이영규; 임융호; 신순영; 김지호
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2010-06-23
Publication date: 2011-12-29
Also published as: KR101201866B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 고미신-A(gomisin-A), 상기 고미신-A를 유효성분으로 함유하여 카스파제-7(caspase-7)의 활성을 증가시켜 암 세포 성장을 억제하는 항암제용 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]

본 발명에 따른 고미신-A(gomisin-A)는 카스파제-7(caspase-7) 활성 효과를 통해 대장암 세포의 세포사멸을 유도함으로써 암세포 성장 억제를 위한 예방 및 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 생약재로부터 분리된 고미신-A는 화학적으로 합성되어 판매되는 약물에 비해 상대적으로 중독성 및 부작용이 적으며, 각종 식품 조성물에 첨가되어 암 질환 예방 및 치료용 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

고미신-Ａ를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료를 위한 약학 조성물{A Pharmaceutical Composition Comprising the Compound Gomisin-A for Treating or Preventing Cancer}

본 발명은 고미신-A를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 오미자(Schisandra chinensis)로부터 분리된 화학식 1로 표시되는 고미신-A(gomisin-A), 상기 고미신-A를 유효성분으로 함유하여 카스파제-7(caspase-7)의 활성을 증가시켜 암 세포 성장을 억제하는 항암제용 조성물에 관한 것이다.

아포토시스(apoptosis) 또는 계획된 세포사멸(programmed cell death; PCD) 현상은 세포 스스로 죽음을 유도 시키는 세포 생리 현상(세포 자살; cell suicide)을 의미한다(Steller, Science 1995,267,1445-1449). 계획된 세포사멸 현상은 생체의 태아 발달 과정에서 각종 기관(organ)의 형태를 적절하게 만들어주는 것과 같은 생리적 역할뿐만 아니라(Jacobson 등, Cell,1997,88,347-354), 종양괴사인자 알파(TNF-α, tumor necrosis factor-α) 수용체나 Fas 수용체와 같은 수용체에 리간드(ligand)가 결합되거나, 세포가 자외선 노출, 방사능 노출, 독성물질, DNA 손상 자극 등의 각종 스트레스성 자극에 노출되어 세포의 게놈에서 심각한 손상이 발생되면 세포 스스로 죽음을 유도시키는 생체 방어 시스템으로 작용한다(Li와 Yuan, Current Opinion in Cell Biology 1999,11,261-266).

카스파제(caspase)는 세포 사멸을 유도시키는 시스테인 단백분해 효소 (cystein protease)중의 하나로서, 통상 비활성형의 전구효소(proenzyme)인 프로카스파제(procaspase) 형태로 존재하고 있다. 프로카스파제 단백질은 프로-도메인(pro-domain)과 작은-서브유닛(small-subunit), 큰-서브유닛(large-subunit) 등의 구조로 구성되어 있는데, 세포사멸 자극 신호에 의해 프로-도메인과 큰-서브유닛 사이, 작은-서브유닛과 큰-서브유닛 사이가 잘려진 후 작은-서브유닛과 큰-서브유닛 끼리만 다시 결합하여 활성형 효소로 전환된다.

DNA 손상 자극에 의한 세포사멸 현상 과정의 가장 대표적인 작용 기전은 세포내로 전달된 각종 DNA 손상 자극에 의해 p53 유전자가 활성화 되면서 시작된다. 활성화 된 p53 유전자는 Bax나 PUMA, NOXA 같은 단백질 발현을 증가시켜 미토콘드리아 막에 존재하는 시토크롬-C(cytochrome c) 단백질을 유리시키고, 유리된 시토크롬-C 단백질은 Apaf-1 단백질과 카스파제-9 전구효소(procaspase-9)와 결합하여 아포토좀(apoptosome)이라는 단백 복합체를 이루어 카스파제-9 효소를 활성화 시킨다(Li 등, Cell 1997,91,479-489; Srinvasula 등 Mol Cell 1998,1,949-957; Yoshida 등, Cell 1998,94,739-750). 활성 카스파제-9은 곧 이어서 비활성 카스파제-3 또는 카스파제-7 전구효소(proenzyme)를 절단시켜 이들 효소를 활성화 시킨다(Hakem 등, Cell 1998,94,339-352). 활성 카스파제-3 또는 카스파제-7은 세포의 생리적 활성에 중요한 각종 기질 단백질을 분해시켜 결과적으로 세포의 죽음이 유도된다.

카스파제-7은 다른 종류의 카스파제와 유사하게 비활성형의 전구체(proenzyme)로 존재하다가 세포사멸 신호 자극에 의해 활성화 되는 카스파제-8 또는 카스파제-9에 의해 잘려서 활성형으로 변한다. 카스파제-7은 세포사멸 과정의 마지막 단계에서 활성화 되면서 기질 단백질을 직접으로 분해시키는 효소이므로, 카스파제-7의 활성을 파악하면 세포사멸 진행 여부를 용이하게 판단할 수 있으며, 카스파제-7 활성 여부는 전구체형이 활성형의 단편으로 잘려지는 정도를 분석함으로써 판단할 수 있다.

오미자(Schisandra chinensis)는 다섯 가지 맛을 모두 가지고 있다고 해서 붙여진 이름으로 대뇌신경을 흥분시키는 효과를 위해서 전통 한방에서 사용되어 왔다. 그러나 일반적으로 알려진 오미자의 효능은 추출물에서 비롯된 것이다.

오미자 과실에 함유된 성분은 주로 리그난(lignans) 화합물이며, 기름, 정유, 색소 등 다양한 성분이 함유되어 있는 것으로 보고되어 있다. 오미자에 함유된 여러 리그난 화합물들 중 고미신-A(gomisin-A)와 고미신-N(gomisin-N)에 대한 분석은 많이 이루어져 있으며, 그 정량분석법들에 대하여도 많은 연구가 있다.

그러나 그동안 고미신-A에 의한 카스파제 활성과 암 세포 사멸 유도 현상에 대한 것은 보고된 바가 없었다.

이에 본 발명자들은 생약재를 이용하여 카스파제-7 절단 효과를 통한 암 세포 억제 현상을 검색하던 중, 오미자(Schisandra chinensis)로부터 효과가 있는 물질을 추출, 분리하고 이의 구조를 규명하였으며, 이 물질이 카스파제-7 절단 효과를 통해 대장암 세포 억제 효과가 있는 것으로 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

결국, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 오미자(Schisandra chinensis)로부터 분리된 항암제용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오미자(Schisandra chinensis)로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 고미신-A(gomisin A) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 고미신-A를 유효성분으로 함유하며, 카스파제-7(caspase-7)의 활성을 증가시켜 암 세포 성장을 억제하는 항암제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항암제용 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 고미신-A 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품으로 제공한다.

본 발명의 오미자(Schisandra chinensis)에서 분리된 폴리페놀 화합물의 일종인 고미신-A(gomisin-A)는 카스파제-7(caspase-7) 활성 효과를 통해 대장암 세포의 세포사멸을 유도함으로써 암세포 성장 억제를 위한 예방 및 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 오미자는 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 약재로서 본 발명에 따른 오미자로부터 분리된 고미신-A는 화학적으로 합성되어 판매되는 약물에 비해 상대적으로 중독성 및 부작용이 적으며, 각종 식품 조성물에 첨가되어 암 질환 예방 및 치료용 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 오미자로부터 분리한 고미신-A의 고성능액체크로마토그램이다.
도 2는 본 발명에 따른 고미신-A의 ¹H-NMR(400 ㎒) 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명에 따른 고미신-A의 ¹³C-NMR(100 ㎒) 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명에 따른 고미신-A의 핵자기공명분광 실험 결과로 얻은 화학적 이동도(chemical shift)이다.
도 5는 암세포 콜로니 형성능 분석 실헙법을 이용하여, 본 발명의 고미신-A를 HCT116 사람 대장암세포에 첨가하면 농도 의존적으로 암세포 성장이 억제되는 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 웨스턴 블롯(Western Blot)법을 이용하여, 본 발명의 고미신-A를 HCT116 사람 대장암세포에 첨가하면 세포사멸을 촉진시키는 활성형의 카스파제-7 (cleaved caspase-7) 단백질 양이 증가되는 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 공촛점 형광현미경을 이용하여, 본 발명의 고미신-A를 HCT116 사람 대장암세포에 첨가하면 세포내에서 활성형의 카스파제-7 (cleaved caspase-7)이 증가되면서 세포사멸 특징인 핵단편(nuclear fragmentation) 현상이 유도되는 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 오미자(Schisandra chinensis)로부터 분리된 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물, 고미신-A(gomisin-A) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 오미자로부터 분리된 고미신-A는 통상적으로 사용되는 공지의 방법에 의해 분리할 수 있으며, 바람직하게는 건조된 오미자로부터 용매를 사용하여 추출하는 단계, 상기 추출액을 여과 후 농축하는 단계 및 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함한다.

상기 추출용매로는 상기 오미자로부터 분리된 고미신-A를 효과적으로 추출할 수 있는 용매라면 특별히 제한되지는 아니하나, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 에틸렌글리콜 등을 포함하는 알코올류, 염화메틸렌, 클로로포름, 사염화탄소 등을 포함하는 할로겐 원자로 치환된 탄화수소류, THF, DMF, DMSO, 에틸렌아세테이트 등에서 선택되는 1종 이상인 것이 좋다.

본 발명에서는 에탄올을 사용하여 추출하였으나 이것은 예시에 불과할 뿐, 상기 오미자로부터 분리된 고미신-A가 다른 용매, 예를 들면, 메탄올, 에탄올과 물과의 일정비율을 가진 혼합물, 또는 카본설파이드, 알코올류, 에테르, 클로로포름, 벤젠, 아세트산 등에서도 잘 용해되므로 이들의 사용을 제한하는 것은 아니다.

또한, 상기 용매로 추출하여 얻어진 추출액은 여과 및 용매의 증류에 의해 농축될 수 있는데, 용매의 증류는 통상 감압증류에 의해 성취되나 대기압 하에서 증류하는 것을 배재하는 것은 아니다. 감압증류 된 농축액은 크로마토그래피에 의해 순수한 화합물로 정제된다.

본 발명에서는 농축액을 분취용 고속 액체 크로마토그래피(컬럼: Phenomenex C18, 10 ㎜ × 250 ㎜, 유속: 2.5 ㎖/분, 이동상 50% 아세토니트릴 수용액, 검출파장: UV 254 ㎚, 머무름 시간(RT): 16.9분)에 적용하였으나, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 크로마토그래피에 사용되는 물질 및 전개 용매를 다양하게 변형할 수 있음은 자명할 것이다. 또한, 필요에 따라 재결정에 의해 보다 순수한 화합물을 얻을 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 고미신-A를 유효성분으로 함유하며, 카스파제-7(caspase-7)의 발현을 촉진시켜 암 세포의 성장을 억제하는 항암제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 고미신-A는 오미자로부터 분리되는 것을 특징으로 하며, 특정 암 세포주, 바람직하게는 대장암 세포의 성장을 억제하여 예방 및 치료하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 해당 용도에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 독립적으로 또는 약품 첨가제로 사용되거나, 사람에게 투여하기 적합한 기타 모든 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 함유될 수 있는 담체로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제 및 지질 등이 포함될 수 있으며, 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질환의 진행 정도, 나이, 성별, 신체 상태, 투여 기간, 투여 방법, 환자의 체중, 식사, 배출 속도 등에 따라 용량을 달리하여 투여될 수 있다.

그러나 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 약학적 조성물을 통상 성인의 경우 1일, 100 ~ 1,000 ㎎의 범위로 비경구 또는 경구 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하지 아니한다.

또한, 본 발명의 조성물을 경구용 제제로서 조제하는 경우에는 부형제, 또한 필요에 따라서 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제, 교미교취제 등을 가한 후 통상적인 방법에 의해 정제, 피복정제, 과립제, 캡슐제 등으로 조제가 가능하다. 부형제로는 예를 들면 젖당, 옥수수 전분, 백당, 포도당, 솔비트, 결정 셀룰로오스 등이, 결합제로는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트라가칸트, 젤라틴, 셸락, 하이드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피리돈 등이, 붕괴제로는 예를 들면 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 구연산칼슘, 덱스트란, 펙틴 등이, 활택제로는 예를 들면 스테아린산 마그네슘, 활석, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화 식물유 등이, 착색제로는 의약품이 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이, 교미교취제로는 예를 들면 코코아 분말, 박하뇌, 방향산, 박하유, 용뇌, 계핀 분말 등이 사용되며, 이들의 정제는, 과립제에는 당의, 젤라틴의, 기타 필요에 따라 적절히 코팅하는 것을 배제하는 것은 아니다.

또한, 주사제로는 조제하는 경우에는 필요에 따라 pH 조정제, 완충제, 안정화제, 보존제 등을 첨가하고, 통상적인 방법에 의해 피하, 근육 내, 정맥 주사제로 한다.

또한, 본 발명의 고미신-A는 필요에 따라 염산, 황산, 인산 등의 무기염 및 수산, 푸마르산, 말레인산, 능금산, 구연산, 주석산, 글루탐산 등의 유기염 등 약학적으로 허용 가능한 산부가염으로서도 약효를 충분히 발휘시킬 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오미자로부터 화합물의 분리 및 정제

건조된 오미자 1.2 ㎏을 마쇄하여 에탄올 3,000 ㎖를 가해 72시간 동안 빛을 차단하고 침지시킨 후 실온에서 추출하고, 상기 추출물을 감압여과 하여 잔류물은 동일한 방법으로 2회 더 반복 추출하였다. 이때 얻어진 여과액은 모두 합쳐 40℃에서 감압농축한 후 영하 50℃에서 동결건조 하여 에탄올 추출물(200 g)을 얻었다.

상기 에탄올 추출물은 극성에 따른 분리 추출을 위하여 헥산과 물의 혼합액(1:1)으로 3회 분배 추출하여 헥산 추출물 50 g을 얻었다.

헥산 추출물 10 g에 대해 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분취하였다. 이때, 전개용매로는 헥산 및 에틸아세테이트 혼합용매(4:1)를 사용하였으며, 5개의 분획을 확보하였다. 이들 분획 중 5번째 분획을 분취용 액체크로마토그래피(컬럼: Phenomenex C18, 10 ㎜ × 250 ㎜, 유속: 2.5 ㎖/분, 이동상 50% 아세토니트릴 수용액, 검출파장: UV 254 ㎚, 머무름 시간: 16.9분)를 사용하여 본 발명에 따른 화합물을 18 mg 수득하였다. (도 1)

실험예 1. 오미자로부터 분리한 화합물의 구조 분석

상기 실시예에서 분리, 정제하여 얻은 물질을 완전히 건조하여 0.5 ㎖ 중수소-디메틸설폭사이드(DMSO-d6)에 10 ㎎을 녹인 후, 5 ㎜의 튜브에 넣어 핵자기 공명 분광기(Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer; Bruker, Advance 400(9.4T), 독일)를 이용하여 ¹H-NMR(400 ㎒), ¹³C-NMR(100 MHz) 및 DEPT-135(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) 스펙트럼 분석을 실시하였다.

또한, 상기 화합물의 2D-NMR 스펙트럼, 즉 COSY(correlated spectroscopy), TOCSY(total correlated spectroscopy), HMQC(heteronuclear multiple quantum correlation) 및 HMBC(heteronuclear multiple bonding correlation) 스펙트럼을 상기 핵자기 공명 분광기를 이용하여 조사하였다.

구체적으로, ¹H-NMR의 경우, 1초 간격으로 16번 스캔하고, 32K의 데이터포인트를 사용하였다. 90도 펄스는 9.5초로 하고, 스펙트럼 넓이는 4595.58 Hz로 하여 기록하였다.(도 2)

¹³C-NMR과 DEPT는 64K의 데이터포인트를 사용하였으며, 90도 펄스는 10.5초로 하고 스펙트럼 넓이는 20833.33Hz로 하였다.(도 3)

또한, 모든 2D-스펙트럼은 f2 dimension의 경우에는 2048개의 데이터포인트를 사용하였고, f1 dimension에서는 256을 사용하였으며, HMBC는 장거리 결합(long range) 결합상수를 62.5 밀리초로 하였다.

그 결과, ¹³C-NMR 스펙트럼과 DEPT에 의해 상기 화합물은 모두 23개의 탄소로 이루어진 것을 확인하였는데, 구체적으로는 6개의 일차탄소, 4개의 이차탄소, 2개의 삼차탄소와 11개의 사차탄소가 존재하는 것을 알 수 있었다. 화학적 이동도(chemical shift)에 근거하여 두 개의 방향족 고리가 존재하며, 두 개의 메틸기가 있고, 네 개의 메톡시기가 존재함이 확인되었다. COSY, TOCSY, HMQC 및 HMBC 분석에 근거하여 도 4와 같이 수소 및 탄소 화학적 이동도를 얻을 수 있었다. 이와 같은 화학적 이동도 분석으로부터 하기 화학식 1와 같은 구조를 확인하였다.

상기와 같은 결과들로, 본 발명에 따른 오미자로부터 분리한 화합물은 하기 화학식 1로 표시되며, 분자량이 416이고, C₂₃H₂₈O₇의 분자식을 갖는 폴리페놀의 일종인 고미신-A(gomisin A)로 결정되었다(Takeya et al., Chemical & Pharmaceutical Bulletin (1994), 42(3), 430-7).

[화학식 1]

실험예 2. 고미신-A의 대장암세포 성장 억제 확인

HCT116 사람 대장암세포를 ATTC(American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하여, 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies)과 Antibiotic-Antimycotic solution (Invitrogen Life Technologies)이 함유되어 있는 DMEM (Invitrogen Life Technologies) 배양액에 2일에 한 번씩 100-mm 세포배양접시에 1 × 10⁶의 접종 밀도(seed density)로 계대하면서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

고미신-A에 의한 세포증식 억제 효과는 암세포의 콜로니 형성능 (Colonogenic assay)이 얼마나 억제되는지의 여부로 측정하였다. HCT116 세포를 24-well 배양접시에 well 당 6000개 세포로 분주한 후 0, 5, 10, 15 μM 농도의 고미신-A를 처리하고, 7일 후 6% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)와 0.5% 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 용액을 1 : 1로 섞어준 혼합액을 세포에 첨가한 후 15분 동안 반응시켜 남아있는 세포를 염색하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 고미신-A를 5 μM 농도 이상으로 처리했을 때 암세포의 콜로니 형성능이 점차 감소되는 것이 관찰되었다. 이러한 사실로부터 고미신-A는 HCT116 대장암세포의 증식을 억제시키는 효과가 있다는 사실을 확인하였다.

실험예 3. 대장암세포에서 고미신-A 처리에 의한 활성형 카스파제-7 단백질 증가 확인

HCT116 대장암세포에서 고미신-A에 의해 세포사멸을 촉진시키는 카스파제-7의 활성형(cleaved caspase-7)이 증가되는지 확인하기 위하여 상기 방법으로 배양한 HCT116 세포에 10 μM 농도의 고미신-A을 각각 24시간과 48시간 동안 처리하였다. 고미신-A를 처리한 후 웨스턴 블롯(Western Blot)법으로 활성형의 절단된 카스파제-7 단백질이 발현되는 정도를 확인하였다. 고미신-A를 처리한 HCT116 세포를 수확하여 20 mM HEPES(pH 7.2), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤(glycerol), 150 mM NaCl, 10 ㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin), 1 mM PMSF가 함유된 용해액을 30분 동안 반응시켜 세포를 용해시킨 후 단백질 분리액을 12% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였다. 분리된 겔 단백질을 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)으로 옮긴 후 절단형의 카스파제-7 단백질과 결합하는 1차 항체(rabbit anti-cleaved caspase-7 antibody)와 시료의 상대적 양이 정확한지를 비교하기 위하여 단백질 발현이 변화되지 않는 GAPDH를 인지하는 대조 항체(anti-GAPDH antibody)를 각각 5시간 동안 반응한 후 1차 항체를 인지하는 2차 항체(goat anti-rabbit antibody)를 30분 동안 반응 시켰다.

형광법 (chemiluminescence detection system; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)을 이용하여 X-ray 필름에서 GAPDH와 절단형 카스파제-7 단백질 양을 측정한 결과를 도 6에 나타내었다. HCT116 대장암세포에 고미신-A를 처리한 경우 대조 단백질인 GAPDH의 양은 변하지 않았으나 절단형 카스파제-7 단백질 발현양은 처리 48 시간 후에 증가된다는 사실을 확인하였다.

실험예 4. 대장암세포에서 고미신-A 처리에 의한 활성형 카스파제-7 단백질 활성 증가와 세포사멸 유도 확인

공촛점 형광 현미경을 이용하여 세포내에 절단형 카스파제-7 단백질 존재와 세포사멸 유도 여부를 조사하였다. 상기와 같은 방법으로 HCT116 대장암세포를 커버 글라스(cover glass)에서 배양한 후 고미신-A를 24시간 동안 처리하고, 절단형 카스파제-7 단백질과 결합하는 1차 항체(rabbit anti-cleaved caspase-7 antibody; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)를 90분 동안 반응시킨 후 적색 형광체 Alexa-Fluor 555 가 결합된 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 30분 동안 반응시켰다. 커버글라스를 PBS(phosphate buffered saline) 완충 용액으로 10분간 세척하고 파랑색으로 DNA를 선택적으로 염색하는 시약인 Hoechst 33258 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가한 후 FV-1000 공촛점 형광 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 고미신-A 처리에 의해 활성형 카스파제-7 (적색으로 염색)을 발현시키는 세포가 증가되었으며, 활성형 카스파제-7이 나타나는 세포에서만 세포사멸의 특징적 현상으로 나타나는 핵단편(nuclear fragmentation; 화살표로 표시)이 관찰되었다. 이러한 결과는, 고미신-A를 HCT116 대장암 세포에 처리하면 카스파제-7이 활성화 되어 암 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도시킨다는 사실을 의미한다.

Claims

오미자(Schisandra chinensis)로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 고미신-A(gomisin A) 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
[화학식 1]
상기 화학식 1로 표시되는 고미신-A 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하며, 카스파제-7(caspase-7)의 활성을 증가시켜 암 세포 성장을 억제하는 항암제용 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 고미신-A는 오미자로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 항암제용 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 암 세포는 대장암 세포(HCT116)인 것을 특징으로 하는 항암제용 조성물.
제 2항의 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 5항에 따른 약학 조성물을 유효성분으로 함유하는 항암제.
상기 화학식 1로 표시되는 고미신-A 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품.