KR101244402B1 - 암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 샴푸진저(Zingiber zerumbet)의 조추출물 또는 그 조추출물의 비극성 용매 가용 추출물, 또는 그 추출물로부터 분리된 화합물을 활성성분으로서 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물을 제공한다.

Description

암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물{A composition for enhancing the radiotherapy of cancer}

본 발명은 샴푸진저(Zingiber zerumbet)의 추출물을 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 샴푸진저의 추출물, 또는 샴푸진저의 추출물부터 분리된 화합물을 활성성분으로서 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물에 관한 것이다.

현재 암 환자 중 국내 35 %, 미국의 경우 50 % 정도가 방사선 치료를 받고 있으며, 국내에서도 방사선 치료를 받는 암 환자의 비중이 꾸준히 증가하고 있고, 암치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다. 이와 같이 방사선 치료는 현재 다양한 종류의 암에 필수적인 치료방법으로 알려져 있으나 암세포의 방사선 저항성, 저산소증 세포의 존재는 종래 암 방사선치료에서 국부적 실패를 일으키는 중요한 인자이다(Int. J. Radiation oncology Biol. Phys., 1988, 14, 831-833). 또한, 이러한 방사선 항암 치료의 실패에 따라 방사선량을 증가시킨 고선량 방사선 조사 치료 시 인체정상조직의 파괴 등 방사선 치료의 부작용이 나타나는 문제점이 대두되었다. 따라서, 방사선 치료시 그 효율성을 증대시킬 수 있는 방사선 치료 증진제 및 방사선 증감성 화합물에 관한 연구들이 계속 진행되고 있다(Oncogene, 2004, 23, 1599-1607; Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 2006, 64(5), 1466-1474; Clin, Cancer Res, 2007, 13(16), 4891-4899). 현재까지 보고된 방사선 치료 증진제는 주로 항암제로 알려진 탁솔(Taxol), 시스플라틴(cisplatin), 플루오로우라실(Fluorouracil: 5-Fu), 류프롤리드(Leuprolide) 등이 유방암, 자궁암, 위암, 난소암, 폐암, 전립선암, 대장암 등 여러 고형암등에서 방사선 치료 증진제로서 연구되었으며, 이러한 화합물 투여와 방사선 치료를 병행하였을 때 방사선의 치료 효율이 증진된다는 것이 입증되었다(Oncology Rep. 2006 16: 1085-1091; Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2006, 1, 64(5), 1466-1474; Clin Cancer Res. 2005, 1, 11(19), 7047-7052; Int J Radiat Biol. 2007, 83(1), 41-47). 그러나, 위에서 언급한 항암제들은 다양한 암세포 조직에서 방사선 치료 증진 효과를 나타내지 못할 뿐 아니라 항암제 부작용 또한 큰 것으로 나타나고 있어, 새로운 방사선 치료 증진제의 개발이 요구되고 있다.

방사선 치료 증진제의 개발은 주로 세포사멸 단계에 관여하는 생체 물질들(p53 암 억제 인자, Bcl-2 족, IAP 족, 스핑고지질 족, 세포신호전달체계 등)을 대상으로 하여 이루어지고 있다. 특히, 열충격 단백질(heat shock proteins, HSP)은 고온, 중금속, 에탄올, 산소결핍 등 세포에 대한 각종 외부 스트레스에 대하여 직접적인 저항성을 나타낼 뿐만 아니라, 세포사멸에 관여하는 중요한 기작들을 직접 또는 간접적으로 저해하여 세포사멸에 대한 저항성을 높여 주는 것으로 최근 보고되었다. 그 중, 저분자량 열충격단백질인 HSPB1(쥐에서는 Hspb1)은 시토크롬 C(cytochrome C), 닥스(DAXX) 및 섬유성 액틴(F-actin) 등과 결합하여 세포사멸을 억제하는 것으로 밝혀진 바 있다.

따라서, 암세포 특이적으로 열충격 단백질들을 무력화시켜 암세포의 치료에 대한 민감도를 증진시키려는 노력들이 많이 수행되었다. 특히, 분자량이 90,000인 열충격단백질(HSP90)에 대한 저해제는 이미 임상 단계에 들어가 있고, 분자량이 70,000인 열충격단백질 HSPA(HSP70)에 대한 저해제 개발도 활발히 진행되고 있다. 그러나, 저분자량 열충격단백질(예를 들면, HSPB1(분자량 27kD) 등)에 대한 저해제는 가능성만 생각되어 왔을 뿐, 저분자 열충격 단백질 저해에 의한 방사선 증진제는 현재 개발되어 있지 않다.

이와 관련하여, 암의 방사선 치료시 나타나는 암세포의 내성에 대한 정확한 분자적 기작은 불분명한 것으로 알려져 있었으나, 본 발명의 연구진들은 방사선 내성 세포를 연구하여, 방사선 내성의 주된 원인이 저분자량의 열충격단백질, Heat Shock Protein B1(이하 사람에서는 HSP27, 쥐에서는 HSP25)의 과발현이며, 과발현된 HSP B1이 프로틴 키나제 C(Protein kinase C)와의 결합을 통해 방사선에 의한 세포사멸을 저해함으로써 방사선 내성을 가지게 된다는 것을 규명하였다( 2007, 1;67(13):6333-41)

한편, 샴푸진저(Zingiber zerumbet)는 생강과(Zingiberaceae) 식물에 속하는 진지버(Zingiber)속 식물로서, 동남아시아 등지에서 광범위하게 분포되어 있으며 민간요법으로 이용되어 왔다. 진지버속 식물는 말레이시아에서 여러 진지버속 식물의 뿌리가 위통, 멀미, 구토, 간질, 인후통, 기침, 타박상, 상처, 해산, 안질환, 간장병, 류머티즘, 근육통, 백선(버짐), 천식, 발열, 악성종양 및 종기 등의 치료제로 사용된다.

샴푸진저의 뿌리는 인도네시아에서는 복통, 설사, 구충, 통증, 류마티즘, 자궁질환을 치료하는 전통 약재로 사용되어 왔다(Ozaki et al., Chem. Pharm. Bull., 39. pp2353-2356, 1991). 또한, 활성에 관한 연구로서는 항산화작용(Masuda et al., Chem. Lett., 1, pp189-192, 1993; Jitoe et al., Tetrahedron Lett., 35, pp981-984, 1994), 항염증 작용(Ozaki et al., Chem. Pharm. Bull., 39, pp2353-2356, 1991), 살충작용(Nugroho et al., Phytochemistry, 41, pp129-132, 1996) 및 자궁 이완 작용(Kanjanapothi et al., Planta Med., 53, pp329-332, 1987)이 보고되었으며, 생강의 뿌리의 성분에 관한 연구에서는 페닐부테노이드(phenylbutenoid) 및 커큐미노이드(curcuminoid)가 보고되었다(Masuda and Jitoe, Phytochemistry, 39, pp459-461, 1995). 특히, 샴푸진저로부터 휴물렌 유도체로서 제룸본, 5-히드록시-2E,6E,9E-휴물라트리엔(humulatrien)-8-온을 분리하고, 그러한 화합물이 염증 질환 치료에 효과가 있음이 보고되었다( 2005 Jul;53(7):829-31).

그러나, 샴푸진저에서 분리된 물질에 대한 계속적인 연구에도 불구하고, 샴푸진저에서 분리된 성분들이 암에 대한 방사선 치료 증진제로서 효과를 갖는지 여부에 대해서 발표된 바는 없다.

이에 본 발명자들은 HSP27에 대한 저해활성을 가져 암에 대한 방사선 치료를 증진시키는 효과를 가지면서도 심각한 부작용 없이 방사선 치료와 함께 사용될 수 있는 방사선 치료 증진제를 개발하기 위해 식물 생약에 대해 연구한 결과, 종래 생약으로 사용되어 왔던 샴푸진저의 추출물 및 그 샴푸진저 유래의 여러 화합물이 암에 대한 방사선 치료 증진 효과를 갖는다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암에 대한 방사선 치료를 증진시키는 효과가 있는 식물 생약의 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식물 생약 유래의 화합물을 포함하는 암에 대한 방사선 치료를 증진시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

샴푸진저(Zingiber zerumbet)의 조추출물 또는 그 조추출물의 비극성 용매 가용 추출물을 활성성분으로서 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 휴물렌 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 활성성분으로서 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물을 제공한다:

상기 화학식 1 및 2에서, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 또는 C₁-C₃ 알콕시이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 독성이나 부작용이 적은 방사선 치료 증진제를 개발하기 위한 연구과정에서, 민간에서 약용으로 널리 사용되어지고 있는 식물 생약인 샴푸진저의 추출물 또는 그로부터 분리된 화학식 1 또는 화학식 2의 휴물렌 유도체가 암세포에서 HSP27의 발현을 억제함으로써 암에 대한 방사선 치료 시 암세포의 방사선에 대 한 내성을 감소시켜 암세포에 대한 세포사멸효과를 증진시킴으로써, 암에 대한 방사선 치료를 증진시키는 효과가 있다는 것을 실험으로 확인하게 되었다.

따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서, 샴푸진저의 조추출물 또는 그 조추출물의 비극성 용매 가용 추출물을 활성성분으로서 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물을 제공한다.

상기 샴푸진저의 조추출물은 물, C₁-C₄ 알콜, 또는 이들이 혼합용매의 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올의 추출물일 수 있다. 용매로 추출 시, 추출은 가열 추출, 냉침 추출, 환류냉각 추출, 또는 초음파 추출 등이 이용될 수 있다. 이러한 추출은 실온에서 수행할 수도 있으며, 가온 조건 하에서 수행할 수도 있다. 바람직하게는, 샴푸진저의 뿌리의 음건 세절물에 메탄올 또는 에탄올을 넣고 2일 이상 실온에서 추출하여 얻을 수 있다. 상기 추출은 활성성분을 보다 다량 수득하기 위해 1 회 이상 여러 번 추출할 수 있으며, 바람직하게는 3 회 이상 연속추출하여 합한 추출액을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물은 샴푸전저를 상기와 같이 조추출물로서 포함할 수도 있으나, 상기 조추출물을 비극성 유기 용매로 더욱 추출하여 얻어진 비극성 용매의 가용성 추출물로서 포함할 수도 있다. 상기 비극성 용매의 가용성 추출물은 조추출물을 물로 현탁시킨 다음, 이를 현탁액의 약 1 내지 100 배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 클로로포름과 같은 비극성 용매를 가하여 1 내지 10 회, 바람직하게는 2 내지 5 회 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 비극성 용매 가용 분획물을 수득할 수 있다. 또한, 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniqeus of plant analysis., 3rd Ed., pp 6-7, 1998).

상기한 바와 같은 방법에 의해 추출한 추출물은 그대로 사용할 수도 있으나, 농축한 엑스 형태로 사용될 수도 있고, 농축한 다음 동결 건조하여 동결건조물의 형태로서 사용될 수도 있다. 바람직하게는, 충분한 농도로 사용될 수 있도록 농축된 형태로서 사용한다.

상기 비극성 용매 가용 추출물에 대해 크로마토그래피에 의한 정제를 더욱 수행하여 구체적인 활성성분을 분리해 낼 수 있다.

보다 구체적으로는, 상기 공정으로 수득된 샴푸진저 비극성 용매 가용 추출물 중 활성이 높은 분획들을 취하여 TLC 상에서 비슷한 Rf 수치를 갖는 분획들을 모아 단일 분획을 만들고 건조하여 정제된 형태의 정제 분획물을 얻은 다음, 용출용매로 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올, 증류수 또는 이들의 혼합용매를 사용하여, 바람직하게는 헥산:에틸아세테이트 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행한 후, 이를 통하여 얻은 수 개의 분획물을 다시 당업계에서 통상적인 재결정법 또는 세파덱스 컬럼 크로마토그래프법을 수행함으로써 본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2의 휴물렌 유도체들을 수득할 수 있다. 또한, 이러한 공정에 의해 얻어지지 않은 본 발명에 따른 화학식 1 또는 2의 휴물렌 화합물들은 기본 모핵의 치환기들을 당해 기술분야에 공지된 알킬화, 아 세틸화 제조 공정 등을 통하여 통상의 치환기들을 부분 합성함으로써 또는 전합성에 의해 제조할 수 있다(Herbert O. House: Modern Synthetic Reactions. 2nd Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., 1972).

본 발명자들은 상기 분리된 화학식 1 또는 화학식 2의 휴물렌 유도체들이 HSP 27의 기능을 저해하여 암에 대한 방사선 치료시 방사선 치료를 증진시킨다는 것을 최조로 발견하였다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서 있어서, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 활성성분으로서 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에서, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 또는 C₁-C₃ 알콕시이다.

상기 화학식 1 또는 2의 화합물은 바람직하게는 제룸본, 제룸본 옥사이드 또는 5-히드록시-2E,6E,9E-휴물라트리엔(humulatrien)-8-온일 수 있으며, 가장 바람직하게는 하기 화학식 3의 제룸본일 수 있다.

약학적으로 허용가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 그 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기용매를 사용하여 침전시킴으로써 제조할 수 있다. 동몰량의 화합물 및 수중의 산 또는 알코올(예: 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 석출된 염을 흡인여과시킬 수 있다.

상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 예를 들어 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 예를 들어 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 멜레산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바니닐산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약제학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 상기 금속염으로는 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염이 있다.

암에 대한 방사선 치료 시 상기 방사선 치료 증진용 조성물을 이용할 수 있는 암은 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 폐암, 유방암, 난소암, 대장암, 췌장암, 전립성암 등의 방사선 치료에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물이 암에 대한 방사선 치료 증진 효과가 있다는 것은 하기 실시예에서 입증하였다. 구체적으로는, 본 발명의 일 구현예에 따라 샴푸진저의 추출물에서 분리된 상기 화학식 1의 제룸본(2E,6E,9E-휴물라트리엔(humulatrien)-8-온)을 인체 폐암세포(NCI-H460, NCI-H1299, 한국세포주은행)를 대상으로 3 시간 처리하고 방사선을 처리한 결과 방사선만을 처리하였을 경우에 비해 세포 사멸 정도가 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 면역 결핍마우스(SCID mouse)의 대퇴부에 폐암 세포주(NCI-H460, NCI-H1299)를 주입시킨 후 종양을 유도시킨 후, 방사선 단독 처리하였을 경우와 제룸본과 방사선을 병용처리하였을 경우 종양의 사이즈를 측정한 결과, 방사선 단독처리군에 비해 제룸본과 방사선을 병용처리하였을 경우가 종양 사이즈가 현저히 감소하였으며, HSP27 발현량이 높은 NCI-H1299 세포를 이용한 발암 모델에서 NCI-H460 세포를 이용한 경우에 비해 제룸본에 의한 방사선 치료효율 증가가 더 크게 나타나는 것이 관찰되었다. 또한, 제룸본을 인체 폐암세포 NCI-H1299에 처리한 결과 HSP 70의 발현량은 거의 영향이 없었으나, HSP 27의 발현량은 제룸본의 농도가 높아질수록 처리시간이 길어질수록 감소하는 것으로 확인되었다. 또한, 이러한 HSP 27의 발현량의 감소는 HSP27의 불활성 이량체의 형성에 의한 것으로 확인되었으며, 이러한 불활성 이량체의 형성은 HSP 27의 141번 시스테인 잔기를 통해서 일어나는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 암에 대한 방사선 치료를 증진시키며, HSP27의 불활성 이량체의 형성으로 인한 HSP 27의 발현 억제 기전에 의해 암에 대한 방사선 치료를 증가시킨다는 것을 알 수 있다.

본 발명에 따른 방사선 치료 증진용 조성물은 방사선 치료와 동시에 투여할 수도 있으며, 방사선 치료 및 본 발명에 따른 방사선 치료 증진용 조성물의 효과가 서로 상호작용을 갖는 범위 내이기만 하면, 방사선 치료 증진용 조성물의 투여 및 방사선 치료에 시간적 격차를 두고 수행할 수도 있다.

본 발명에 따른 방사선 치료 증진용 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 제형으로는 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 대표적으로 경구 투여용 제형으로 제제화 시 상기 담체로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

상기 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사 이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다.

또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

이러한 제제화에 필요한 기술 및 약제학적으로 적절한 담체, 첨가제 등에 관해서는 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있으며, 이와 관련하여 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)를 참조할 수 있다.

상기 방사선 치료 증진용 조성물은 암에 대한 방사선 치료 증진 효과를 얻기 위하여, 유효성분으로서 성인을 기준으로 1 일 총 투여량이 추출물 또는 화합물로서 30-100 mg/kg, 생약으로서 70-150 g/kg 이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다. 상기 투여량은 암의 종류, 암의 진행 정도, 투여 경로, 성별, 나이, 체중 등에 따라 적절히 증감될 수 있다.

현재 샴푸진저는 생약으로서 민간에서 사용되고 있는 것으로서, 이로부터 유래된 샴푸진저의 추출물 또는 화학식 1 또는 2의 화합물 역시 독성 또는 부작용의 문제가 없다고 볼 수 있으므로, 본 발명에 따른 방사선 치료 증진용 조성물은 장시간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 장점이 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 샴푸진저의 추출물 또는 상기 화학식 1 또는 2의 화합물이나 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 활성성분으로서 포함하는 조성물은 방사선의 치료와 병용하여 방사선 치료효과를 증진시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 방사선에 대한 내성이 있는 암에 대해서도 방사선 치료 효율을 증진시킬 수 있다. 또한, 이러한 방사선 치료 증진 작용에 의해 방사선 치료의 선량을 낮추면서도 치료 효율적인 측면에 있어서는 고 선량의 방사선을 처리할 때 얻을 수 있는 우수한 항암 효과를 얻을 수가 있으므로, 방사선 치료 시 고선량의 방사선을 조사하는 것으로 인해 발생되는 부작용을 줄일 수 있는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 안전성이 입증된 식물 생약을 원료로 함으로써 종래 방사선 증진제로서 사용되었던 탁솔, 시스플라틴, 플루오로우라실, 또는 류프롤리드(Leuprolide) 등에서 발생되던 각종 부작용의 문제를 해결할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

샴푸진저로부터 화합물의 추출, 분리 및 정제

건조된 샴푸 진저 (인도네시아) 10 kg을 95% 에탄올 20 ℓ에 넣어 실온에서 7일 동안 보관 후 여과지로 여과한 다음, 감암농축하고 동결건조 시켜 노란색의 분 말(1 kg)을 얻었다. 여기에 증류수 2 ℓ를 넣어 현탁시키고, 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부탄올 순으로 분획하여 그 중 클로로포름 분획물 (170 g)을 얻었다. 얻은 클로로포름 추출물은 실리카겔 컬럼크로마토그래피(3.0 kg, 70 ~ 240 메쉬, Merck)를 사용하였으며, 이동상 용매로서는 n-헥산, n-헥산:에틸아세테이트 (100:1 ~ 1:4 혼합비) 혼합용매 및 메탄올을 순차적으로 사용하여 30 개의 분획(분획물1-1 ~ 30)을 얻었다. 분획물 1-12 (10.9 g)를 실리카겔(60 g, 70 ~ 230 메쉬)에 흡착시키고, 실리카겔 컬럼크로마토그래피(1 kg, 230 ~ 400 메쉬)를 하였으며, 이때 이동상 용매로서는 n-헥산 : 에틸아세테이트의 혼합용매를 사용하여 분획물 1-12-1 ~ 24을 얻었다. 이중에서 소분획인 Fr.1-15-1 ~ 7은 n-헥산:에틸에테르(30:1 부피비)의 혼합용매를 이동상 전개용매로 사용하여 두 번째 컬럼크로마토그래피(5 g, 230 ~ 400 메쉬)를 하여 화합물인 제룸본 (1.7 g)을 얻었다.

실시예 2

천연물로부터 분리한 화합물의 구조 분석

상기 실시예 1에서 얻어진 화합물에 대해 VG 고분해능 GC/MS 분광기(VG high resolution GC/MS spectrometer, Election Ionization MS, JEOLJMS-700)를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였다. 또한, 편광기(Perkin-Elmer polarimeter 343 )를 사용하여 선광도를 측정하였으며, 핵자기공명 분석(Bruker Bruker IFS 66)을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR, 호모-코지(HOMO-COSY), HMQC(¹H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization) 스펙트럼을 얻고, 분자구조를 결정하였다.

그 결과 얻어진, 각각의 화합물의 물성, 분자량, 분자식, NMR 분석, 및 질량분광분석 결과를 아래에 나타내었다.

[화학식 1]

제룸본 (Zerumbone)

1) 물성 : 흰색 침상 결정체(녹는점 : 73 ~ 74 ℃)

2) 분자량 : 218

3) 분자식 : C₁₅H₂₂O

4) ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.08 (3H, s, C-14), 1.21 (3H, s, C-15), 1.55 (3H, s, C-12), 1.89 (3H, s, C-13), 1.92 (1H, m, 1a), 2.23-2.49 (5H, m, 1b, 4a, 4b, 5a, 5b), 5.26 (1H, d, J = 15.6 Hz, C-2), 5.87 (1H, d, J = 16.2 Hz, C-10), 5.98 (1H, d, J = 16.2 Hz, C-9), 6.01 (1H, d, J = 11.5 Hz, C-6)

5) ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 11.8 (C-13), 15.2 (C-12), 24.2 (C-14), 24.4 (C-5), 29.4 (C-15), 37.9 (C-11), 39.4 (C-4), 42.4 (C-1), 125.0 (C-2), 127.1 (C-9), 136.3 (C-3), 137.9 (C-7), 148.8 (C-6), 160. 8 (C-10), 204.4 (C-8)

6) EIMS m/z 218 [M]+(100), 190 (80), 162 (90)

실험예

[실험방법]

1) 사용 세포주의 배양: 인체 암세포인 NCI-H460, NCI-H1299는 RPMI에 열처리한 10% 우태아혈청(FBS, GIBCO)과 항생제를 첨가하여 섭씨 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다.

2) 방사선 조사: 세포를 배양접시에 깔아서 37℃, CO₂ 배양기에서 70-80% 정도 자랄 때까지 배양한 뒤 감마선(137Cs) (Atomic Energy of Canada, Ltd., Canada)을 3.81 Gy/분의 선량률로 조사하였다. 총 5, 10 Gy를 조사하였다.

3) 세포분석: 세포를 배양한 뒤, 주어진 시간에 채취하여 프로피듐 요오다이드(propidium iodide, PI)로 염색한 뒤, 판매자의 지시대로 FACScan flow cytometer를 이용하여 분석하였다.

4) 전기영동과 면역반응을 이용한 단백질 분석: 시료 속의 단백질을 분석하기 위하여 우선 PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 후, 웨스턴블 랏을 수행하였다. 실험하고자 하는 세포들을 우선 용해용액 [120 mM NaCl, 40 mM Tris (pH 8.0), 0.1% NP40]에 현탁하여 세포들을 터뜨린 다음, 환원제(reducing agent)가 포함되있는 SDS-PAGE 샘플용액 (62.5 mM 0.5 M Tris-Cl pH 6,8 : 10 % Glycerol : 2% SDS : 0.01% bromphenol blue)과 섞어 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 분자량별로 분리한 다음, 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮긴 다음 면역블롯팅(immunoblotting)을 이용하여 분석하였다.

5) 면역침강반응: 세포를 용해용액 [50 mM Hepes, pH 7.6, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40]에 현탁한 후 원심분리(10 min at 15000 xg)를 이용하여 단백질을 분리한 후, 면역침강 시키고자 하는 특정 단백질(500ug)에 해당되는 항체를 1:100의 비율로 4℃에서 12시간이상 반응시킨 후 50μl 단백질 G-세파로오스 비드를 이용하여 4℃에서 1시간 동안 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질을 용해용액으로 3 회 이상 세척 후 SDS 샘플 완충액을 넣고 5 분 간 끊인 후, 전기영동과 면역 반응을 이용해 면역 침강된 특정 단백질과 결합하는 단백질을 확인하였다.

6) 유전자재조합: HSP25 유전자(gene bank NM_013560.2)를 pcDNA3 (Invitrogen)에 클로닝하였다. 두 번의 연속된 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 이용하여 HSP25의 아미노산 141번의 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환 시킨 돌연변이를 제조하여 세포에 넣어주었다.

7) 세포내 유전자 주입: 대조군 벡터(pcDNA3), HSP25(wt)벡터와 HSP25의 아미노산 141번 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환한 벡터(141m)를 60-mm 디쉬 기준으 로 2 ㎍ 벡터를 이용하여 plus Lipofectamin^TM 시약과 15분 먼저 반응시킨 후, Lipofectamin^TM 시약을 15분 반응시킨 세포에 반응시켜 주입시켰다.

8) MASS Spectrometry

HSP27(1.25 μg/μl)과 제룸본(0.32 μg/μl)을 20 mM Tris (pH 7.5, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 용액에 37℃에서 3 시간 동안 반응시킨 후 트립신으로 잘라준 후 Mass Spectrometry를 실시하였다.

9) 다량체 형성 확인 실험(BN-PAGE)

DMSO와 제룸본(10 μg/ml)을 24 시간 동안 처리한 세포를 용해용액 [50 mM BisTris, pH 7.2, 10 % glycerol, 50 mM NaCl, 0.001 % Ponceau-S, 5 mM MgCl₂, 0.5 % Triton X-100]에 현탁한 후 원심분리(10 min at 15000 xg)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 단백질의 다량체 형성 정도를 분석하기 위하여 BN-PAGE(Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 다량체의 크기에 따라 분리한 후, 단백질들을 PVDF 멤브레인에 옮겨 면역블랏팅을 수행하였다.

실험예 1

A. 제룸본의 HSP27단량체(monomer) 발현 저해 기능

상기 실시예 1에서 천연물(Zingiber Zerumbet)로부터 분리한 제룸본을 인체 폐암세포주 NCI-H1299 세포에 5, 10, 20 ug/ml의 서로 다른 농도로 24 시간 처리하고(도 1, 좌측), 5 ug/ml 농도에서 12시간, 24시간으로 처리한 다음(도 1 우측) 세포를 분획하여, HSP27항체와 HSP70항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 단백질의 동량정량 확인을 위해 β-actin항체로 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 NCI-H1299 폐암 세포주에서 제룸본을 서로 다른 시간 및 농도로 처리 시 HSP27 및 HSP70의 발현양을 웨스턴 블랏팅에 의해 확인한 결과이다.

도 1의 결과에 따르면, 제룸본을 H1299세포에 처리하였을 경우 HSP70의 발현량 변화와는 달리, 농도가 높아질수록 처리시간이 길어질수록 HSP25의 발현량이 감소하는 것으로 확인되었다.

B. 제룸본에 의한 HSP27의 불활성이량체 형성 확인

상기 실시예 1에서 분리한 제룸본을 NCI-H1299 세포에 10, 20, 40 ug/ml의 농도로 3시간 또는 6시간 처리한 후 HSP 27 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 또한, HSP70 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 단백질의 동량정량 확인을 위해 β-액틴 항체로 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 그 결과를 도 2a에 나타내었다.

도 2a는 NCI-H1299 폐암 세포주에서 제룸본에 의한 HSP27의 이량체의 형성을 웨스턴 블랏팅에 의해 확인한 결과이다.

도 2a에 따르면 농도와 시간 의존적으로 HSP27이 이량체 위치(50KDa근처)에서 발현이 증가되는 것으로 확인되고 HSP27 단량체는 발현이 감소하는데 반해, HSP 70은 그 발현량이 제룸본에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.

이량체를 형성하는 단백질의 경우, 일반적으로 환원제(reducing reagent)를 이용하여 웨스턴블랏팅을 하는 경우 이량체 형성에 필요한 디설파이드 결합(공유결합)이 끊어져 단량체의 위치에서 단백질이 검출되게 된다. 그러나, 제룸본에 의한 이량체는 환원제를 사용하여도 결합이 깨지지 않음을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로부터, 제룸본에 의해 형성된 HSP27 이량체는 일반적인 HSP27의 이량체와는 다르다는 것을 알 수 있다.

C. 제룸본에 의한 HSP27의 불활성이량체 형성의 기전 확인

HSP25의 이량체 형성에 중요한 아미노산 141번 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환시킨 벡터(141m), 정상 단백질의 HSP25 벡터(WT, wild type), 및 대조군으로서 pcDNA3벡터(pcDNA3)를 plus Lipofectamin^TM 시약과 15분 먼저 반응시킨 후, Lipofectamin^TM 시약을 15분 반응시켜 NCI-H1299 세포내에 과발현 시킨 후, 제룸본(10ug/ml)을 24시간 처리하여 세포를 분획한 후 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. HSP 70에 대해서도 웨스턴 블랏팅을 실시하였으며, 단백질의 동량정량 확인을 위해 β-액틴 항체로 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 그 결과를 도 2b에 나타내었다.

도 2b는 NCI-H1299 폐암 세포주에서 HSP25의 와일드 타입(wild type, wt)의 벡터, 또는 HSP27의 141번 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환한 돌연변이벡터(141m)를 과발현시키고, 제룸본에 의한 HSP27의 이량체의 형성을 웨스턴 블랏팅에 의해 확인한 결과이다.

도 2b에 따르면, 아미노산 141번 시스테인 잔기를 알라닌으로 변이시킨 단백질(141m)은 제룸본에 의한 이량체 형성이 이루어지지 않는 것으로 관찰되었다. 따라서, 제룸본에 의한 HSP25의 이량체 형성도 일반적인 HSP27의 이량체 형성결합에 관여하는 141번 시스테인 잔기를 통해서 일어난다는 것을 확인할 수 있었다.

D. 제룸본에 의한 HSP27의 불활성이량체 형성의 기전 확인

Stressgene 회사로부터 구입한 HSP27 단백질(1.25 μg/μl)에 디메틸술폭사이드(DMSO) 또는 제룸본을 0.32 μg/μl으로 3 시간 동안 처리하여 Mass-Spectrometry를 이용하여 분석해 보았다. 그 결과를 도 3a에 나타내었다.

도 3a는 HSP27 단백질을 제룸본과 반응시킨 후, 제룸본에 의한 HSP27의 이량체 형성을 Mass-spectrometry로 확인한 결과이다.

도 3a에 따르면, HSP 27 단백질의 2 분자와 제룸본의 한 분자가 반응물을 형성하고 있는 것으로 확인되었다.

이러한 제룸본에 의해 형성되는 HSP27의 이량체가 HSP27의 다량체 형성에 어떻게 관여하는지를 알아보기 위해 Native-Gel을 이용하여 다량체 형성여부를 확인하였다. 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

도 3b는 NCI-H1299 세포에서 제룸본에 의한 다량체 형성의 저해효과를 Native-Gel을 이용하여 확인한 결과이다.

도 3b에 따르면, HSP27의 다량체 형성이 제룸본에 의해 감소되는 것을 확인하였다. 따라서 제룸본에 의해 형성되는 HSP27의 이량체는 다량체 형성을 유도하 지 않는 불활성 이량체인 것으로 확인되었다.

실험예 2

제룸본에 의한 암세포의 방사선 민감도 증진효과 측정

NCI-H1299세포를 대상으로 상기 실시예 1에서 얻어진 제룸본을 10 ug/ml로 3 시간 처리하고 방사선을 5, 10 Gy로 처리한후 48, 72 시간 후에 세포사멸의 정도를 프로피디움 요오다이드(propium iodide)를 이용하여 분석하였다. 대조군으로서 DMSO를 처리하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 NCI-H1299 세포를 대상으로 제룸본을 처리한 다음, 방사선 조사 시 세포사멸의 정도를 프로피디윰 요오다이드를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4 의 결과에 따르면, 대조군으로 DMSO를 처리한 경우에 비하여, 제룸본을 처리하였을 때 방사선 조사 시 세포사멸정도가 현저히 높은 것으로 관찰되었다. 따라서, 제룸본은 방사선에 의한 암세포 사멸 효과를 농도 및 시간 의존적으로 현저히 증진시키는 것으로 확인되었다.

실험예 3

1) 동물모델에서 제룸본에 의한 방사선 치료효율 측정

면역결핍마우스(SCID mouse)의 대퇴부에 폐암세포주(NCI-H460, NCI-H1299)를 주입시켜 종양을 유도시킨 후, DMSO 투여(대조군), 방사선 단독 처리할 경우, 제룸 본 단독 투여할 경우, 방사선 조사 및 제룸본 투여를 병용처리하였을 경우 종양의 사이즈를 측정하였다. 종양크기가 250mm³ 가 되었을 때 제룸본(1.25mg/마리)을 한번 투여하고, 10 Gy로 방사선을 한번 조사한 후, 제룸본은 이틀 간격으로 두 번 더 투여하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 면역결핍마우스(SCID mouse)의 대퇴부에 폐암세포주(NCI-H460, NCI-H1299)를 주입시켜 종양을 유도시킨 후, 방사선, 제룸본을 각각 단독 투여한 경우와 병용투여한 경우에 종양의 사이즈를 측정한 결과이다.

도 5의 결과에 따르면, 두 세포주의 발암모델에서 대조군(control)보다 방사선 단독처리와 제룸본 단독처리에서 종양의 크기가 줄어들었으며, 제룸본과 방사선을 병용처리하였을 경우 종양의 사이즈가 현저히 감소되는 것을 관찰하였으며, NCI-H460 세포보다, HSP27의 발현량이 더 높은 NCI-H1299 세포를 이용한 발암모델에서 제룸본에 의한 방사선 치료효율 증가가 더 크게 나타나는 것으로 관찰되었다.

2) 제룸본에 의한 HSP27 불활성화 기전 확인 실험

HSP27은 세포내에서 세포사멸에 관련된 시토크롬 C(cytochrome C)와 PKCδ 단백질과 결합하여 세포사멸을 저해하는 것으로 알려져 있으므로, DMSO 또는 제룸본을 처리한 상기 1)의 NCI-H1299 발암 조직에서 단백질을 분획하여, HSP27과 시토크롬 C 혹은 PKCδ와의 결합정도를 면역침강 및 웨스턴 블랏팅에 의해 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6은 마우스에서 종양을 유도한 후, 제룸본을 처리한 다음 방사선 조사 후 종양조직으로부터 단백질을 분획한 후, 면역침강반응 및 웨스턴블랏팅에 의해 HSP27과 시토크롬 C와 PKCδ와의 결합정도를 확인한 결과이다.

도 6에 따르면, 제룸본을 처리한 조직에서 시토크롬 C와 PKCδ에 대한 HSP27의 결합량이 DMSO(대조군)를 처리하였을 때보다 감소하는 것으로 확인되었다.

상기 실험결과에 따르면, 제룸본은 HSP27의 불활성이량체 형성을 가져오며, 따라서 HSP27에 의해 나타나는 방사선 내성을 극복할 수 있는 방사선 민감제로서의 역할을 수행한다는 것을 알 수 있다.

도 1은 NCI-H1299 폐암 세포주에서 제룸본을 서로 다른 시간 및 농도로 처리 시 HSP27 및 HSP70의 발현양을 웨스턴 블랏팅에 의해 확인한 결과이다.

도 2a는 NCI-H1299 폐암 세포주에서 제룸본에 의한 HSP27의 이량체의 형성을 웨스턴 블랏팅에 의해 확인한 결과이다.

도 2b는 NCI-H1299 폐암 세포주에서 HSP25의 와일드 타입(wild type, wt)의 벡터과 HSP27의 141번 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환한 돌연변이벡터(141m)를 과발현시키고, 제룸본에 의한 HSP27의 이량체의 형성을 웨스턴 블랏팅에 의해 확인한 결과이다.

도 3a는 HSP27 단백질을 제룸본과 반응시킨 후, 제룸본에 의한 HSP27의 이량체 형성을 Mass-spectrometry로 확인한 결과이다.

도 3b는 NCI-H1299 세포에서 제룸본에 의한 다량체 형성의 저해효과를 Native-Gel을 이용하여 확인한 결과이다.

도 4는 NCI-H1299 세포를 대상으로 제룸본을 처리한 다음, 방사선 조사 시 세포사멸의 정도를 프로피디윰 요오다이드를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 면역결핍마우스(SCID mouse)의 대퇴부에 폐암세포주(NCI-H460, NCI-H1299)를 주입시켜 종양을 유도시킨 후, 방사선, 제룸본을 각각 단독 투여한 경우 병용투여한 경우에 종양의 사이즈를 측정한 결과이다.

도6은 마우스에서 종양을 유도한 후, 제룸본을 처리한 후 종양조직에서 단백 질을 분획한 후, 면역침강반응 및 웨스턴블랏팅에 의해 HSP27과 시토크롬 C와 PKCδ와의 결합정도를 확인한 결과이다.

<도면의 주요 기호에 대한 설명>

ZER: 제룸본

IR: 방사선 조사,

hr: 시간

Claims (8)

1. 샴푸진저(Zingiber zerumbet)의 조추출물 또는 그 조추출물의 비극성 용매 가용 추출물을 활성성분으로서 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 약학 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조추출물은 물, C₁-C₄ 알콜, 또는 이들의 혼합용매의 추출물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 비극성 용매 가용 추출물은 n-헥산, 디클로로메탄, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 휴물렌 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 활성성분으로서 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 약학 조성물:

   [화학식 1]

   

   [화학식 2]

   

   상기 화학식 1 및 2에서, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 또는 C₁-C₃ 알콕시이다.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 샴푸진저로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
6. 제 4 항에 있어서, 화학식 1의 화합물은 제룸본, 제룸본 옥사이드, 또는 5-히드록시-2E,6E,9E-휴물라트리엔(humulatrien)-8-온인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 열충격 단백질(HSP) 27의 기능 저해에 의해 암에 대한 방사선 치료를 증진시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 열충격 단백질(HSP) 27의 기능 저해는 HSP 27의 불활성 이량체 형성을 유도하거나 HSP 27의 다량체 형성을 저해하는 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.

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