KR100759467B1 - 차가버섯 또는 상황버섯으로부터 분리된 화합물을 함유하는통풍 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 차가버섯 또는 상황버섯으로부터 분리된 화합물을 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 차가버섯(Inonotus Obliquus) 또는 상황버섯(Phellinus baumi)으로부터 분리된 다음 화학식 1의 화합물이 요산의 형성에 중요한 효소인 산틴 옥시다제를 저해하여 혈중요산을 감소시켜 부작용없이 항염증 작용을 나타내며 통풍성관절염 환자에게 많이 발현되는 젤라틴나제 B의 발현을 억제하는 통풍 예방 및 치료 작용을 나타냄으로써 의약품 및 건강식품의 소재로서 유용하게 사용될 수 있는 다음 화합물 1의 새로운 의약용도에 관한 것이다.

차가버섯, 상황버섯, 산틴 옥시다제, 젤라틴나제 B, 통풍

Description

차가버섯 또는 상황버섯으로부터 분리된 화합물을 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물{Composition for prevention and treatment of anti-gout containing a compound isolated from Inonotus obliquus or Phellinus baumi}

도 1은 화학식 1로 표시되는 화합물의 수소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2는 화학식 1로 표시되는 화합물의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 3은 화학식 1로 표시되는 화합물의 이차원 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 4는 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도별 처리 후 젤라틴나제 B발현을 자이모그래피에 의하여 확인한 결과이다

도 5는 화학식 1로 표시되는 화합물 처리 마우스에서 혈중요산 감소를 나타낸 그림이다.

본 발명은 차가버섯 또는 상황버섯으로부터 분리된 화합물을 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 차가버섯(Inonotus Obliquus) 또는 상황버섯(Phellinus baumi)으로부터 분리된 화학식 1의 화합물이 요산의 형성에 중요한 효소인 산틴 옥시다제를 저해하여 혈중요산을 감소시켜 부작용없이 항염증 작용을 나타내며 통풍성관절염 환자에게 많이 발현되는 젤라틴나제 B의 발현을 억제하는 통풍 예방 및 치료 작용을 나타냄으로써 의약품 및 건강식품의 소재로서 유용하게 사용될 수 있는 다음 화합물 1의 새로운 의약용도에 관한 것이다.

상황버섯은 고산지대에 서식하고 있는 산뽕나무, 참나무, 밤나무, 상수리나무, 백양나무와 버드나무와 같은 활엽수 나무 몸통 등의 고목에서 자생하고 있다.

상황버섯의 모양은, 초기에는 진흙 덩어리가 뭉쳐진 것 같은 형태로 유지 되다가 다 자란 후 모습은 나무 그루터기에 혓바닥을 내민 모습이어서 수설(樹舌)이라고도 한다.

상황버섯 자실체는 처음에는 진흙 덩어리 형태로 자라다가 겨울이 되면 성장을 멈추고 노란부분이 진흙색으로 변하며 다시 봄이 되면 노랗게 덧자라는 다년생 버섯이다. 버섯을 달였을 때는 노랗거나 담황색으로 맑게 나타나며, 맛과 향이 없는 것이 특징이고, 맛이 순하고 담백하다.

상황버섯은 위암, 식도암, 십이지장암, 결장암, 직장암을 비롯한 소화기 계통의 암이나 간암의 절제 수술 후 화학요법을 병행할 때 면역기능을 항진시키고, 자궁출혈 및 대하, 월경불순, 장출혈, 오장 및 위장 기능을 활성화시키고 해독작용을 한다.

차가버섯은 시베리아 및 동유럽 지역에서 아주 오랫동안 민간 비약으로 전해 내려오고 있는 버섯으로 대체의학이 발달한 러시아와 동유럽 등지에서 수 십 년에 걸쳐 과학적으로 연구 분석되고 임상 실험까지 마친 상태이다. 특히, 항암, 항종양의 효능과 혈당 강하 효능에 대해 널리 알려져 왔다. 조안 에이치 윈터스 등의 논문 "차가버섯의 폴란드 및 미국 변이들의 비교 식물화학 연구"(플로리다 대학, 약학부, 1960)에는 차가버섯의 항암효과에 대해 기재되어 있으며, 다카시 미즈노 등의 논문 "차가버섯의 균핵 및 균사체 유래의 다당류의 항종양 및 저혈당 활성"(International Jounal of Medicinal Mushrooms, Vol.1, pp.301-306, 1999)에서는 암 및 당뇨병 치료에 대한 차가버섯의 효능에 대해 기술하고 있다. 이외에도 에이즈 및 위장관의 질병들에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 상기의 두 가지 약용버섯에서 분리된 화합물이 통풍을 예방 치료할 수 있는 혈중 뇨산의 감소효능에 대해서는 알려진 바 없다.

통풍(Gout)이란 사람에게서만 발견되는 다양한 질병군을 나타내는 용어로 혈청 요산 농도의 증가(hyperuricemia), 급성 관절염이 재발하는 증상이 있으면서 활액 백혈구(synovial fluid leukocyte)에서 모노소디움 요산염 결정(monosodium urate crystal, MSU)이 존재하고 주로 관절 안과 그 주위에 모노소디움 요산염 결정의 덩어리(tophi)가 침착되어 때때로 관절의 기형과 불구를 유발하고 신장질환을 동반하며 증상들을 나타내는 질환으로 서로 다른 조합으로 나타날 수 있다.

고요산증(Hyperuricemia)이란 혈액에 요산의 농도가 증가되어 있다는 말이다. 이는 혈청에서 모노소디움 요산염의 농도가 제한된 용해도의 한계를 넘을 때 발생된다. 37 ℃에서 혈장의 요산 포화도는 약 7 mg/㎗이다. 그러므로 이 농도를 넘으면 물리화학적으로 과포화 상태가 된다. 혈청 요산 농도는 정상인의 평균 혈청 요산 농도보다 +2 SD를 초과한 경우에 상대적으로 높은 것으로 알려져 있다. 대부분의 역학 조사에서 남자의 상위 한계는 7 mg/㎗, 여자는 6 mg/㎗이다. 이러한 이유 때문에 고요산증의 실질적인 상위 한계수준은 7.0 mg/㎗ 이상인 경우로 정의되고 있다. 통풍은 "질병의 왕" 그리고 "왕들의 질병"이라 불리고 있고 나이가 들수록 많이 발생하는 질환이며 엄지발가락부위 요산 결정에 의하여 발생된 염증성 반응에 의하여 굉장한 통증을 수반하는 질환으로 알로퓨리놀(allopurinol) 같은 만만치 않은 부작용을 갖는 약물이 치료제로서 사용되고 있어 안전하고 부작용이 없으면서 모노소디움 요산 결정에 의하여 야기되어 조직파괴에 관여하는 단백질 분해효소인 젤라틴나제 B의 발현을 억제하는 물질의 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 약용식물 소재로부터 통풍 치료 효과를 갖는 물질을 탐색하던 중 차가버섯 또는 상황버섯에서 항산화 활성을 보이는 물질로 분리된 다음 화학식 1로 표시되는 화합물(상혼)[특허출원 제 2004-0002292호]이 통풍의 주요원인 물질인 혈중요산을 저감시키면서 요산 결정에 의하여 유도되는 단백질 분해효소 인 젤라틴나제 B의 발현을 저해하는 이중효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

[화학식 1]

본 발명의 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 통풍 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 통풍 예방 및 치료용 건강식품을 제공하는 것이다

본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 통풍 예방 및 치료용 약제 조성물을 그 특징으로 한다.

[화학식 1]

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 통풍 예방 및 치료용 건강식품을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 차가버섯(Inonotus Obliquus) 또는 상황버섯(Phellinus baumi)으로부터 분리된 상기 요산의 형성에 중요한 효소인 산틴 옥시다제를 저해하여 혈중요산을 감소시켜 부작용 없이 항염증 작용을 나타내며 통풍성관절염 환자에게 많이 발현되는 젤라틴나제 B의 발현을 억제하는 통풍 예방 및 치료 작용을 나타냄을 밝힘으로써 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 통풍 예방 및 치료 조성물에 관한 것이다.

먼저, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법은

1) 차가버섯 또는 상황버섯을 채취하여 음지에서 건조하고 메탄올로 추출하고 여과한 후 그 여액을 감압농축하여 메탄올 추출물을 얻는 단계;

2) 상기 메탄올 추출물을 증류수에 현탁하고 에틸아세테이트로 진탕추출하여 에틸아세테이트층을 얻는 단계;

3) 상기 에틸아세테이트층을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 얻는 단계;

4) 상기 활성분획을 감압 건조하여 아세토나이트릴 수용액으로 고속액체크로마토그래피를 수행하는 단계로 이루어진다.

이렇게 분리된 활성분획을 정제하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 얻는다. 또한, 상기 방법 이외에 화학적으로 합성하여 화학식 1의 화합물을 얻는 방법도 본 발명에 포함된다.

이렇게 얻어진 화학식 1의 화합물은 산틴 옥시다제를 저해하여 혈중요산을 감소시켜 부작용 없이 항염증 작용을 나타내며 통풍성관절염 환자에게 많이 발현되는 젤라틴나제 B의 발현을 억제하여 이를 유효성분으로 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물을 제조할 수 있다.

또한, 상기 화학식 1의 화합물이 산(acid) 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 푸마르산, 락트산, 말레인산, 숙신산 및 타르타르산 등의 유기 또는 무기산과 함께 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수도 있고, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속 이온이나 암모늄 이온과 반응하여 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수도 있기 때문에 상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염이 모두 본 발명에 포함된다.

한편, 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 통풍 예방 및 치료용 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥 수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다. 또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

상기 화합물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 0.1 ∼ 30 ㎎/㎏(몸무게)/1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 하는 건강식품을 포함한다.

건강식품이란, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 상황버섯 또는 차가버섯으로부터 화학식 1의 화합물의 분리

재배한 상황버섯 혹은 차가버섯 건조물 1.5 kg를 분말화 하고 100% 메탄올로 3일 동안 추출하여 감압여과한 후, 그 여액을 60 ℃의 수조에서 감압농축하여 농축된 메탄올 농축액을 1 L의 증류수에 현탁하였다. 증류수에 현탁시킨 메탄올 추출물은 분액여두에서 2 L의 에틸아세테이트로서 진탕 추출하여 에틸아세테이트층을 얻은 다음 다시 에틸아세테이트층을 60 ℃의 수조에서 감압농축하였다. 에틸아세테이트층의 농축물을 소량의 메탄올에 녹여 메탄올에 평형화된 세파덱스 엘에이치 20 칼럼(Sephadex LH-20 gel column chromatography)에서 전개시켜 활성분획을 얻고 그 분획을 YMC 젤 ODS 칼럼 크로마토그래피(YMC gel ODS column chromatography)에서 10% 아세토나이트릴 수용액을 용매로 사용하여 고속액체크로마토그래피를 수행하였다.

분리 정제된 물질을 중메탄올(CD₃OD)에 녹여 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, 이차원 NMR을 통하여 다음 표 1의 수소 및 탄소의 케미칼시프트(chemical shift)를 확정할 수 있었다. 또한, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, 이차원 NMR 스펙트럼 결과는 첨부도면에 나타내었다[도 1 내지 도 3 참조].

탄소번호	수소 NMR의 케미칼시프트(ppm)	탄소 NMR의 케미칼시프트(ppm)
1	-	127.7
2	7.07	115.3
3	-	150.1
4	-	147.0
5	6.78	116.6
6	6.99	123.5
7	7.52	146.9
8	6.55	124.7
9	-	201.6
10	2.32	27.0

상기 분리 정제된 물질은 벤젠환에 두개의 수산화기가 치환되어있고, 트랜스형의 올레핀기에 케톤기과 메틸기가 붙어 있는 화합물로 4-(3,4-디하이드록시-페닐)-부트-3-엔-2-온(4-(3,4-Dihydroxy-phenyl)-but-3-en-2-one, 상혼(sanghone))으로 명명하였고, 그 구조는 다음 화학식 1과 같다.

[화학식 1]

제조예 2: 화학식 1의 화합물의 합성

3,4-다이하이드록시벤즈알데하이드(3,4-Dihydroxybenzaldehyde, 13.8 g 0.1 mol)를 아세토나이트릴(300 ml)에 녹인 후 아세톤(50 ml, 0.66 mol), 피페리딘(2.5 ml, 25 mmol) 및 초산(1.43 ml, 2.5 mmol)을 분자 체 4(molecular sieves 4, 3 g)존재 하에서 넣고 6시간 동안 환류하였다. 반응을 마친 후 실온으로 냉각시키고 회전 농축기(rotary evaporator)를 이용하여 감압 하에서 용매를 제거하였다. 아세톤용매를 이용하여 실리카 젤에 코팅한 후 컬럼 크로마토그래피법(CHCl₃: CH₃OH = 9: 1)에 의하여 노란색 고체 8.8 g(50%)을 얻었다.

실시예 1: 잔틴 옥시다제(Xanthine oxidase)의 상혼에 의한 저해

잔틴을 기질로 하고 잔틴 산화효소를 효소로 하여 효소 기질 반응 실험을 하였다.

50 mM 인산완충용액(산도 7.5), 시료, 잔틴산화효소(0.5 unit/ml)을 혼합하여 25 ℃에서 15분간 반응하여 효소와 기질이 결합하는 반응을 시킨 뒤, 15μM의 잔틴을 넣어 25 ℃에서 30분 반응시킨 후 1N 염산용액을 넣어 반응을 멈추고 290 nm에서 흡광도를 측정하였다. 잔틴 산화효소 저해활성은 (1-시료를 넣은 효소 활성/시료를 넣지 않은 효소 활성)× 100으로 50% 저해값을 계산할 수 있다. 잔틴 옥시다제를 50% 저해하는 상혼의 농도는 14.3 μM이였다.

실시예 2: 뇨산염에 의해 유도되는 젤라틴나제 B 발현의 상혼에 의한 저해

상혼의 젤라틴나제 B 생성량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 마우스 대식세포주인 RAW264.7을 48 웰 플레이트(well plate)에 계대 배양 후 각 농도별 시료를 처리하고 24시간 후에 젤라틴나제 B 발현량의 변화를 확인하였다.

본 발명의 상혼을 처리하기 전에 10% 혈청배지에서 1% 혈청배지로 바꾸어 준 다음 시료 처리 3시간 후에 2 mg/㎖의 모노소디움 요산염을 처리하고 17시간을 배양하였다. 배양 후 세포의 모양과 세포독성을 확인하고 배양액만을 취하여 글리세롤과 발색시약이 함유된 충진 완충용액과 각각 섞어 전기영동하였고 대조구와 비교하여 MMP9 발현 억제활성을 확인하였다. 대조구는 모노소디움 요산염을 대식세포의 MMP9의 발현을 활성화시켜주는 유도제로 사용하였는데 처리구와 비처리구로 나누어 유도되는 양상을 육안으로 확인하였고 시료를 첨가한 배양액에서 젤라티나제 B의 발현양상을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었으며, 대식세포에서 젤라티나제 B 발현 유발물질인 모노소디움 요산염을 처리하면 24 시간 후에 젤라티나제 B의 발현이 크게 증가하였으나, 모노소디움 요산염과 상혼을 동시에 처리하였을 때 상혼의 처리농도에 비례하여 젤라티나제 B 발현이 1 ㎍/ml 이상에서 50% 저해됨을 확인하였다.

실시예 3 : 실험 동물 및 처리

공시동물로서는 7주령의 db/db를 사용하였다. 그리고 각 그룹당 6마리를 체중 범위에 따른 무작위법에 의하여 군(group) 분리를 실시하여 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 21± 2 ℃, 습도 55 ± 5%, 환기 횟수 15 ~ 17 회/Hour, 조도 150 ~ 300 Lux, 그리고 조명은 12시간 명암(점등: 06:00, 소등: 18:00)으로 조정하여 실험 기간동안 일정하게 SPF(specific pathogen free) 상태로 유지하였다. 고형사료(미국, Harlan)와 물(Autoclaved water)은 자유 급이·급수시켰으며 부검 및 샘플링 전 12시간 절식시켰다. 군(group)당 7마리 수컷(male)을 공시하였으며, 상혼을 10 mg/kg의 dosage로 경구 투여하였다. 대조군은 0.1 ml의 멸균수를 경구 투여하였다.

실시예 4 : 동물실험을 통한 상혼의 혈중요산 강하 효과 측정

상기 실시예 3의 방법에 의한 동물실험을 통하여 약용버섯으로부터 분리된 화합물인 상혼은, 통풍과 관련있는 혈중 뇨산의 농도를 대조군에 비하여 70% 저해하는 것으로 나타났으므로(도 5), 통풍을 예방 치료하는 기능성 식품 및 의약품의 소재로서 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

실시예 5: 독성시험

화학식 1로 표시되는 화합물을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 100 ㎎/㎏을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.

제제예 1: 시럽제의 제조

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시 럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

상기 화학식 1로 표시하는 화합물의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

제제예 2: 정제의 제조

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 3: 캡슐제의 제조

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 500 ㎎을 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4 : 주사제의 제조

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 200 ㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200 ㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.

제제예 5: 음료 제조

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

이상의 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 혈당 강하 효과가 우수하여 통풍 예방 및 치료에 매우 유용하리라 기대된다.

Claims (2)

1. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 통풍 예방 및 치료용 조성물.

   [화학식 1]

   
2. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 통풍 예방 및 개선용 건강식품.

   [화학식 1]

   

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