KR20160150232A

KR20160150232A - 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20160150232A
Application number: KR1020150087545A
Authority: KR
Inventors: 박소영; 주환빈
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2015-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2016-12-29
Also published as: KR101716571B1

Abstract

본 발명은 크로몬류(chromones) 및/또는 플라보노이드류(flavonoids) 화합물, 및 그의 염의 알츠하이머성 치매 예방 및 치료 용도에 관한 것이다. 본 발명의 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 베타-아밀로이드의 형성을 억제하므로 알츠하이머성 치매의 근원적 치료가 가능한 현저한 효과를 발휘한다. 본 발명은 관중에서 분리, 동정된 단일 물질의 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료에 관한 최초의 용도를 제시한다.

Description

알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Prevention or Treatment of Alzheimer's disease}

본 발명은 크로몬류(chromones) 및/또는 플라보노이드류(flavonoids) 화합물, 및 그의 염의 알츠하이머성 치매 예방 및 치료 용도에 관한 것이다.

치매(dementia)는 정상적인 노화와는 구분해야 할 병적인 현상이며 그 원인에 따라 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매(vascular dementia), 기타 알콜 중독, 외상, 파킨슨병의 후유증으로 오는 치매로 구별된다.

이중, 알츠하이머성 치매의 발병 기전은 신경독성단백질인 베타-아밀로이드(β-amyloid protein)의 독성이 가장 중요한 원인으로 제시되고 있다.

베타-아밀로이드에 의해 신경세포사멸이 유도되는 단계를 살펴보면 먼저 APP로부터 아밀로이도게닉 패스웨이(amyloidogenic pathway)에 의해 단계적으로 베타-아밀로이드가 생성되고 이렇게 생성된 모노머 형태의 베타-아밀로이드는 서로 응집하여 올리고머를 형성하게 되는데 이렇게 응집된 형태의 베타-아밀로이드가 결국 신경세포사멸을 유도하게 된다는 것이 일반적으로 받아 들여지고 있는 가설이다.

따라서 베타-아밀로이드에 의한 신경세포 사멸을 억제하기 위해서는 베타-아밀로이드의 생성을 억제하거나, 모노머 베타-아밀로이드가 올리고머로 응집되는 것을 억제하거나, 응집된 베타-아밀로이드의 독성으로부터 세포를 보호해야 한다.

현재까지 치매 치료를 위한 약물 치료는 아세틸콜린 전구체를 투여하거나 아세틸콜린의 분해를 저해하는 약물을 투여하여 뇌의 아세틸콜린 농도를 높여 주는 치료 방법이 사용되어 왔다. 대표적인 약물로는 타크린 (tacrine), 도네페질 (donepezil), 리바스티그민 (rivastigmine), 갈란타민 (galantamine) 등이 있다.

기존의 치매 치료제는 주로 아세틸콜린에스터라제 억제 효과만을 가지고 있을 뿐, 베타-아밀로이드의 형성이나 응집 억제 기능은 없기 때문에 치매의 근원적 치료가 불가능하다.

또한, 기존 치매 치료제는 콜린 작용성 약물이기 때문에 다른 콜린 작용성 약물과 병용투여가 불가하고, 항콜린성 약물의 효과를 저해하는 문제가 있으며, 심결관계에 작용하여 심박률에 미주신경항진 효과를 나타낼 수 있고, 중증의 천식이나 폐쇄성 폐질환의 병력이 있는 환자에게는 주의하여 사용해야 하는 단점이 있다.

따라서, 기존 치료제와는 다른 방법으로서 알츠하이머성 치매의 근원적인 치료가 가능한 방법, 즉 베타-아밀로이드 생성을 억제하면서도 독성이 낮은 약물을 찾는 것이 그 질환의 극복을 위해 무엇보다 중요한 실정이다.

본 발명의 발명자들은 관중(Dryopteris crassirhizoma)의 알츠하이머성 질환 치료 및 예방에 대해 연구하던 중 해당 생약에 존재하는 성분 중 종래 알츠하이머성 질환과 전혀 언급된바 없으며 연구되지도 않았던 성분 중 베타-아밀로이드의 생성을 억제할 수 있는 유효 성분의 용도를 발견한 후 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2010-0082090호 대한민국 공개특허 제10-2010-0012927호

본 발명은 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 관중에서 유효성분을 추출, 분리하고 제형화하는 것을 포함한 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 크로몬류(chromones) 및/또는 플라보노이드류(flavonoids) 화합물, 그 이성체 또는 그 염을 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 관중에서 유효성분을 추출, 분리하고 제형화하는 것을 포함한 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 베타-아밀로이드의 형성을 억제하므로 알츠하이머성 치매의 근원적 치료가 가능한 현저한 효과를 발휘한다.

본 발명은 관중에서 분리, 동정된 단일 물질의 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료에 관한 최초의 용도를 제시한다.

도 1은 본 발명에 따른 화합물을 얻기 위한 추출 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 화합물을 얻기 위하여 부탄올 분획물을 분리하는 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 단일물질로 동정된 화합물 1의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 4는 단일물질로 동정된 화합물 1의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 5는 화합물 1의 구조를 나타낸 도이다.
도 6은 단일물질로 동정된 화합물 2의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 7은 단일물질로 동정된 화합물 2의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 8는 화합물 2의 구조를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 화합물 3의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 화합물 3의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 화합물 3의 구조를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 화합물 4의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 화합물 4의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명에 따른 화합물 4의 구조를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명에 따른 화합물 5의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명에 따른 화합물 5의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명에 따른 화합물 5의 구조를 나타낸 도이다.
도 18는 본 발명에 따른 화합물 6의 ¹H-NMR을 나타낸 도이다.
도 19은 본 발명에 따른 화합물 6의 ¹³C-NMR을 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명에 따른 화합물 6의 구조를 나타낸 도이다.
도 21은 화합물 1 내지 6이 세포 독성을 나타내지 않음을 확인한 도이다.
도 22는 화합물 1 및 2의 베타-아밀로이드 형성 억제 여부를 웨스턴 블럿으로 나타낸 도이다.
도 23는 화합물 1 및 2의 베타-아밀로이드 형성 억제 여부를 그래프로 비교하여 나타낸 것이다.
도 24는 화합물 3 및 4의 베타-아밀로이드 형성 억제 여부를 웨스턴 블럿으로 나타낸 도이다.
도 25는 화합물 3 및 4의 베타-아밀로이드 형성 억제 여부를 그래프로 비교하여 나타낸 것이다.
도 26은 화합물 5 및 6의 베타-아밀로이드 형성 억제 여부를 웨스턴 블럿으로 나타낸 도이다.
도 27은 화합물 5 및 6의 베타-아밀로이드 형성 억제 여부를 그래프로 비교하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 크로몬류(chromones) 및/또는 플라보노이드류(flavonoids) 화합물, 이의 이성체 또는 그 염을 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 정의되는 크로몬류 화합물은 다음 화학식 1의 기본 구조를 가진다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서 2번, 5번, 6, 7번, 8번 위치는 알킬, 히드록시, 알킬옥시, 치환되거나 치환되지 않은 헤테로환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 치환기로 치환될 수 있다.

본 발명의 크로몬류 화합물은 바이플로린(biflorin), 7-메톡시-이소바이플로린(7-methoxy-isobiflorin), 노르유게닌(noreugenin)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서 바이플로린(biflorin), 7-메톡시-이소바이플로린(7-methoxy-isobiflorin), 노르유게닌(noreugenin)은 세포 독성을 보이지 않으면서도 베타-아밀로이드의 형성을 억제하는 현저한 효과를 발휘하였다(도 21 및 24 내지 27 참조).

본 명세서에서 정의되는 플라보노이드 화합물은 다음 화학식 2의 기본 구조를 가진다.

<화학식 2>

상기 화학식 2에서 5번, 7번 위치 및 2번 위치에 치환된 벤젠기의 2` 내지 6` 위치는 알킬, 히드록시, 알킬옥시, 치환되거나 치환되지 않은 헤테로환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 치환기로 치환될 수 있다.

본 발명의 플라보노이드류 화합물은 에리오딕티올(eriodictyol)인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서 본 발명의 단일물질 분리법에 따라 관중으로부터 유효성분을 동정하여 얻은 화합물 1 및 화합물 2는 카테킨류로서 플라보노이드 계열의 이소플라보노이드로 분류될 수 있는데, 이는 세포독성은 없지만 베타-아밀로이드 단백질 형성 억제 효과에 영향을 미치지 못하였다(도21, 22, 23 참조).

반면에 플라보노이드류 화합물인 에리오딕티올은 본 발명의 일 실시예에서 세포 독성을 보이지 않으면서도 베타 아밀로이드 단백질 생성을 억제하는 현저한 효과를 발휘하였다(도 21, 26 및 27 참조).

본 발명의 약제학적 조성물은 바이플로린(biflorin), 7-메톡시-이소바이플로린(7-methoxy-isobiflorin), 노르유게닌(noreugenin), 및 에리오딕티올, 이의 이성체 또는 그 염으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 약효물질을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 바이플로린(biflorin), 7-메톡시-이소바이플로린(7-methoxy-isobiflorin), 노르유게닌(noreugenin), 및 에리오딕티올, 이의 이성체 또는 그 염 중 한 가지의 약효 물질을 단독으로 포함하더라도 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 바이플로린, 이의 이성체 또는 그 염만을 포함하더라도 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 7-메톡시-이소바이플로린, 이의 이성체 또는 그 염 만을 포함하더라도 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 노르유게닌, 이의 이성체 또는 그 염 만을 포함하더라도 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물 중의 약효 물질은 에리오딕티올, 이의 이성체 또는 그 염만을 포함하더라도 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 크로몬류(chromones) 또는 플라보노이드류(flavonoids) 화합물의 염은 무기산, 유기산, 무기 염기 또는 유기 염기와의 생리학적으로 허용되는 염일 수 있다.

상기 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산 및 인산이 예시될 수 있고, 유기산은 구연산 (citric acid), 초산, 젖산, 주석산 (tartariac acid), 말레인산, 푸마르산 (fumaric acid), 포름산, 프로피온산 (propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등이 예시될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용하는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease)란 알츠하이머 질환으로 야기되는 치매, 즉, 베타-아밀로이드가 뇌조직에 형성, 침착되어 발병하는 치매를 의미하며, 베타-아밀로이드의 형성 및 침착으로 야기된 치매라면 본원 발명의 권리범위에 포함된다.

본 발명에 따른 크로몬류 및 플라보노이드류 화합물을 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 인간을 포함한 동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 크로몬류(chromones) 또는 플라보노이드류(flavonoids) 화합물은 화학적 합성법에 의해 제조되거나 관중(Dryopteris crassirhizoma)에서 추출하여 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 크로몬류 및/또는 플라보노이드류 화합물을 관중으로부터 분리하였다.

관중(Dryopteris crassirhizoma)은 연마과(Aspidiaceae)에 속하는 여러해살이 풀이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 크로몬류(chromones) 또는 플라보노이드류(flavonoids) 화합물을 추출법에 의해서 수득하는 경우 그 추출법은 냉침추출법, 온침추출법, 열 추출법, 초음파 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 크로몬류(chromones) 또는 플라보노이드류(flavonoids) 화합물의 분리는 메탄올 및 부탄올을 순차적인 용매로 적용하여 달성할 수 있다.

상기 분리에 이용되는 메탄올은 바람직하게는 50 %(v/v) 내지 99 %(v/v)의 희석수가 바람직하다.

구체적으로, 관중의 메탄올 추출물은 추출 후, 관중 찌꺼기를 제거하고, 필터 페이퍼로 여과한 후 여액을 진공회전농축기 또는 진공건조기를 사용하여 농축한 후, 실온에서 보관할 수 있다.

상기 관중의 메탄올 추출물은 부탄올을 이용하여 동시 또는 순차적으로 분획과정을 더 실시한다.

상기 부탄올은 바람직하게는 30 %(v/v) 내지 99 %(v/v) 수용액인 것이 좋다.

상기 분획과정을 수행하여 수득한 분획 추출물은 진공회전농축기 또는 진공건조기를 사용하여 농축한 후, 실온에서 보관할 수 있다.

상기 부탄올로 분획하여 얻어진 부탄올층은 이온교환수지 크로마토그래피법, 실리카젤 컬럼크로마토그래피법 또는 중압액체크로마트그래피법(MPLC)을 통해 분리할 수 있다.

상기 크로마토그래피법에 사용되는 용매는 제한되지 않으나, 바람직하게는 메탄올, 아세토나이트릴, 아세토니트릴, 메칠클로라이드를 예로 들 수 있다.

본 발명에 따른 크로몬류 또는 플라보노이드류 화합물은 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료에 탁월한 용도를 제공한다.

본 발명의 한 실시예에서 크로몬류 및 플라보노이드류 화합물의 베타-아밀로이드 형성 억제 효과를 측정한 결과, 농도 의존적으로 베타-아밀로이드의 형성을 억제하는 것을 알 수 있었다(도 24 내지 27 참조).

즉, 본 발명의 크로몬류 및/또는 플라보노이드류 화합물, 이의 이성체 또는 그 염을 포함하는 약제학적 조성물은 알츠하이머성 치매의 근본적인 문제인 베타-아밀로이드의 생성 자체를 억제할 수 있다.

따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 알츠하이머성 치매의 예방 및 치료에 직접적으로 적용할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여량은 투여 방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 1일 유효 성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 바람직하게는 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 더 바람직하게는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있고, 상기 투여는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 불활성 담체, 희석제, 또는 이들 둘 다를 포함하여 제형화 될 수 있다.

상기 불활성 담체 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 옥수수전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 시트르산, 타르타르산, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 위에 예시된 담체, 희석제를 포함한 첨가제를 포함하여 경구 또는 비경구 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여를 위한 제제에는 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 현탁화제 및 시럽제 등이 포함된다. 비경구투여를 위한 형태는 크림제, 로션제, 연고제, 액제, 겔제, 카타플라스마제, 패취제, 에어로솔제, 유동엑스제, 엘릭서, 침제, 향낭, 주사제등의 형태일 수 있다.

이 경우, 상기 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 내 크로몬류 및/또는 플라보노이드류 화합물의 함량은 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 0.1 중량% 내지 99 중량%, 또는 1 중량% 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 화합물의 함량은 바람직한 함량으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 공지의 치매 치료 효과가 있는 것으로 당업계에 알려진 물질, 일 예로 타크린(tacrine), 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine), 갈란타민(galantamine)등의 물질을 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 관중 추출물 및 분획 추출물의 제조

1. 관중의 메탄올 추출물의 제조

불순물이 제거된 관중 6kg에 90% 메탄올을 가하여 24시간 상온에 침지시킨 후 여과지로 여과한 다음, 여액을 진공회전농축기 (EYELA)를 사용하여 농축하였다. 이 과정을 3번 반복하여 325 g의 갈색의 결정성 가루형태 추출물을 얻었다.

2. 관중의 분획 추출물의 제조

상기 농축된 관중 메탄올 추출물을 극성의 차이를 이용하여 섞이지 않는 두 가지 용매로 각각 분획한다. 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 부탄올, 물 층으로 분획하여 농축하며, 이 과정을 3번 반복한다. 농축액은 사용할 때까지 4℃에서 보관한다. 추출물은 각각 헥산 층 16 g, 클로로포름 층 30 g, 에틸 아세테이트 층 54 g, 부탄올 층은 80 g, 물 층은 140 g 수득하였다.

실시예 2. 화합물 1 내지 6의 분리 정제

상기 분획한 부탄올 층 추출물 (80g)을 1차적으로 MCI 컬럼 크로마토그래피에 적용하였다. 이동상은 메탄올 30% ~ 100%로 사용하였으며, 총 6개의 fraction을 얻었다 (S1~S6). 이 중 TLC, HPLC 결과를 바탕으로 두 번째 fraction (S2)을 다시 한번 실리카겔 컬럼크로마토그래피 방법으로 분리를 진행하였다. 이동상은 Methylene Chloride (MC) : MeOH : Water(7 : 2 : 1)으로 시작하였으며 MC : MeOH : Water = 7:2:1, 7:3:1, 7:4:1. 7:5:1 로 진행하였다. 그 결과 총 11개의 fraction이 나왔고 그 중 1번 fraction (198mg)은 HPLC (용매조건 : 12~20%ACN) 방법을 통해 순수한 단일 물질인 화합물 1 (epicatechin, 1mg)과 화합물 2(4β-carboxymethyl-(-)-epicatechin, 1mg)을 얻었다. 3번 fraction (206mg)도 1번 fraction과 같은 조건으로 HPLC를 진행하였고, 그 결과 화합물 3 (7-methoxy-isobiflorin, 6.7mg)과 화합물 4(biflorin, 4.5mg)을 얻었다. 다음으로 S5(3.5g)은 MPLC (조건 : MC : MeOH : Water = 10 : 1 : 1 ~ 10 : 5 : 1)을 수행하여 10개의 fraction을 얻었고 그 중 1번 fraction(255mg)은 HPLC (용매조건 : 40~50% ACN)방법을 통해 화합물 5 (eriodictyol, 1.2mg)을 얻었다. 2번 fraction (26mg)은 1번 fraction과 같은 조건의 HPLC 방법을 통해 화합물 6 (noreugenin, 1mg)을 얻었다.

실시예 3. 화합물 1의 구조 동정

화합물 1은 흰색의 가루로 분리되었다. ¹H NMR은 3개의 프로톤 δH 6.89(d, J = 2.1 Hz, H-2'), 6.67 (d, J = 7.7 Hz, H-5'), 6.66 (dd, J = 2.1, 7.7 Hz, H-6')의 coupling과 ¹³C NMR에 의해 1‘,3‘,4’치환의 아로마틱 프로톤임을 확인하였다. 2개의 프로톤 5.89 (d, J = 2.1 Hz, H-8), 5.72 (d, J = 2.1 Hz, H-6)은 한쌍의 메타 coupling과 ¹³C NMR에 의해 5,7 치환의 아로마틱 프로톤임을 확인하였고 2개의 프로톤 4.73 (s, H-2), 4.00 (m, H-3)과 메틸렌 프로톤 2.68 (dd, J = 4.2, 16.1 Hz, H-4), 2.56 (dd, J = 16.1, 3.5 Hz, H-4)를 확인하였다. ¹³C NMR은 δC 156.99 (C-5), 156.69 (C-7), 156.24 (C-9), 144.97 (C-4'), 144.92 (C-3'), 131.06 (C-1'), 118.40 (C-6'), 115.36 (C-2'), 115.22 (C-5'), 98.23 (C-10), 95.50 (C-6), 94.52 (C-8), 78.51 (C-2), 65.36 (C-3), 28.68 (C-4)를 확인하였다. NMR 결과를 바탕으로 카테킨의 모핵을 확인하였고 참고문헌과 비교한 결과 화합물 1은 epicatechin(도 5 참조)으로 확인, 동정하였다.

실시예 4. 화합물 2의 구조 동정

화합물 2은 흰색의 가루로 분리되었다. ¹H NMR은 3개의 프로톤인 δH 6.91(d, J = 2.1 Hz, H-2'), 6.69 (d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.68 (dd, J = 2.1, 8.4 Hz, H-6')의 coupling과 ¹³C NMR에 의해 1‘,3’,4‘치환의 아로마틱 프로톤임을 확인하였다. 2개의 프로톤 5.92 (d, J = 2.1 Hz, H-8), 5.72 (d, J = 2.1 Hz, H-6)은 한 쌍의 메타 coupling과 ¹³C NMR에 의해 5,7 치환의 아로마틱 프로톤임을 확인하였다. 다음으로 3개의 프로톤 4.76 (d, J = 4.2 Hz, H-3), 4.75 (s, H-2), 3.16 (m, H-4)와 메틸프로톤 3.64 (s, Me-4"), 메틸렌 프로톤 2.81 (dd, J = 4.2, 15.4 Hz, H-2"), 2.41 (dd, J = 15.4, 11.2 Hz, H-2")를 확인하였다. ¹³C NMR은 δC 172.8 (C-2"), 157.40 (C-5), 157.15 (C-7), 156.15 (C-9), 145.05 (C-3'), 144.98 (C-4'), 130.90 (C-1'), 118.38 (C-6'), 115.38 (C-5'), 115.28 (C-2'), 101.63 (C-10), 95.73 (C-6), 94.56 (C-8), 78.38 (C-2), 63.54 (C-3), 51.77 (C-4"), 38.53 (C-4), 35.77 (C-1")를 확인하였다. NMR 결과를 바탕으로 카테킨의 모핵을 확인하였고 참고문헌과 비교한 결과 화합물 2는 4β-carboxymethyl-(-)-epicatechin(도 8 참조)으로 확인, 동정하였다.

실시예 5. 화합물 3의 구조 동정

화합물 3은 흰색의 가루로 분리되었다. ¹H NMR은 1개의 프로톤 δH 13.02(s, OH-5)은 downfield chemical shift로 인하여 히드록시 아로마틱 프로톤임을 확인하였고 2개의 프로톤 6.23 (s, H-6) , 6.18 (s, H-3)을 확인하였다. 다음으로 2개의 프로톤 4.64 (d, J = 9.8 Hz, H-1'), 3.88 (t, J = 9.8 Hz, H-2'), 메틸렌 프로톤 3.69 (d, J = 10.5 Hz, H-6'), 3.42 (dd, J = 5.6, 10.5 Hz, H-6'), 3개의 프로톤 3.22 (t, J = 8.4 Hz, H-3'), 3.16 (br s, H-4', H-5')의 coupling과 ¹³C NMR에 의해 glucosyl group의 프로톤임을 확인하였고 메톡실 프로톤 3.17(s, MeO-7), 메틸 프로톤 2.35 (s, Me-2)을 확인하였다.

¹³C NMR은 δC 182.48 (C-4), 167.67 (C-2), 163.84 (C-7), 160.89 (C-5), 156.90 (C-9), 107.98 (C-3), 104.96 (C-8), 103.78 (C-10), 99.06 (C-6), 81.83 (C-5'), 79.05 (C-3'), 73.66 (C-1'), 71.38 (C-2'), 70.95 (C-4'), 61.87 (C-6'), 49.05 (MeO-7), 20.29 (Me-2)를 확인하였다. NMR 결과를 바탕으로 크로몬의 모핵을 확인하였고 참고문헌과 비교한 결과 화합물 3은 7-methoxy-isobiflorin(도 11 참조)으로 확인, 동정하였다.

실시예 6. 화합물 4의 구조 동정

화합물 4는 흰색의 가루로 분리되었다. ¹H NMR은 1개의 프로톤 δH 13.41(s, OH-5)은 downfield chemical shift로 인하여 히드록시 아로마틱 프로톤임을 확인하였고 2개의 프로톤 6.35 (s, H-8), 6.16 (s, H-3)을 확인하였다. 다음으로 2개의 프로톤 4.56 (d, J = 9.8 Hz, H-1'), 4.03 (t, J = 9.8 Hz, H-2'), 메틸렌 프로톤 3.68 (dd, J = 5.6, 10.5 Hz, H-6'), 3.39 (br d, J = 10.5 Hz, H-6'), 3개의 프로톤 3.15 (t, J = 8.4 Hz, H-3'), 3.12 (br s, H-4', H-5')의 coupling과 ¹³C NMR로 인해 glucosyl group의 프로톤임을 확인하였고 메틸 프로톤 2.34 (s, Me-2)를 확인하였다. ¹³C NMR은 δC 182.33 (C-4), 167.77 (C-2), 164.22 (C-7), 161.17 (C-5), 157.19 (C-9), 109.29 (C-6), 108..0 (C-3), 103.34 (C-10), 93.92 (C-8), 82.04 (C-5'), 79.44 (C-3'), 73.50 (C-1'), 71.07 (C-2'), 70.57 (C-4'), 61.93 (C-6'), 20.32 (Me-2)를 확인하였다. NMR 결과를 바탕으로 크로몬의 모핵을 확인하였고 참고문헌과 비교한 결과 화합물 4는 biflorin(도 14 참조)으로 확인, 동정하였다.

실시예 7. 화합물 5의 구조 동정

화합물 5는 노란색 가루로 분리되었다. ¹H NMR은 3개의 프로톤 δH 6.94(d, J = 2.1 Hz, H-2'), 6.80~6.82 (m, H-5', H-6')과 ¹³C NMR에 의해 1‘,3’,4‘ 치환의 아로마틱 프로톤임을 추측하였고 2개의 프로톤 5.91 (d, J = 2.1 Hz, H-8)과 5.89 (d, J = 2.1 Hz, H-6)은 한 쌍의 메타 coupling에 의해 5,7 치환의 아로마틱 프로톤임를 확인하였다. 다음으로 1개의 프로톤 5.30 (dd, J = 2.8, 12.6 Hz, H-2)와 메틸렌 프로톤 3.09 (dd, J = 12.6, 14 Hz, H-3), 2.72 (dd, J = 2.8, 14 Hz, H-3)을 확인하였다. ¹³C NMR은 δC 196.25 (C-4), 168.82 (C-7), 164.08 (C-5), 163.45 (C-9), 145.49 (C-4'), 145.11 (C-3'), 131.76 (C-1'), 117.82 (C-6'), 114.82 (C-5'), 113.28 (C-2')101.84 (C-10), 95.72 (C-6), 94.87 (C-8), 79.09 (C-2), 42.72 (C-3)를 확인하였다. NMR 결과를 바탕으로 플라보노이드의 모핵을 확인하였고 참고문헌과 비교한 결과 화합물 5는 eriodictyol(도 17 참조)으로 확인, 동정하였다.

실시예 8. 화합물 6의 구조 동정

화합물 6은 선홍색 가루로 분리되었다. ¹H NMR은 2개의 프로톤 δH 6.20 (d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.07 (d, J = 2.1 Hz, H-6)은 한 쌍의 메타 coupling과 ¹³C NMR에 의해 5,7 치환의 아로마틱 프로톤임을 확인하였다. 1개의 프로톤 5.95 (d, J = 0.7 Hz, H-3)과 메틸 프로톤 2.26 (d, J = 0.7 Hz, Me-2)은 한 쌍의 메타 coupling을 확인하였다. ¹³C NMR은 δC 182.56 (C-4), 167.86 (C-7), 164.93 (C-2), 161.86 (C-5), 158.53 (C-9), 107.47 (C-3), 103.51 (C-10), 98.71 (C-6), 93.57 (C-8), 18.87 (Me-2)를 확인하였다. NMR 결과를 바탕으로 크로몬의 모핵을 확인하였고 참고문헌과 비교한 결과 화합물 6은 noreugenin(도 20 참조)으로 확인, 동정하였다.

실험예 1. 분리, 동정된 화합물의 독성 확인

실시예 2 내지 8을 통해 분리, 동정된 화합물1~6의 세포독성을 검사하기 위하여 MTT-based cytotoxicity assay를 시행 하였다. 화합물 1~6이 처리된 APP

-CHO 세포를 24시간 배양한 후, 5 mg/ml 농도의 MTT 용액을 넣고 3시간 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO를 넣어 30분간 용해시킨 후 Emax precision microplate reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과 모든 화합물이 100ug/ml의 농도에도 독성이 없는 것으로 나타났다(도 21 참조).

실험예 2. 크로몬류 및 플라보노이드류 화합물의 베타-아밀로이드 형성 억제 효과

화합물1-6의 베타아밀로이드 생성 억제능을 측정하기 위하여 CHO 세포에 APP 를 과발현시킨 APP-CHO 세포주를 이용하여 베타-시크리테이즈에 의해 잘리워져 세포 밖으로 분비되는 sAPPβ 단백질의 양을 웨스턴 블럿 실험법을 이용하여 측정하였다. 잘려진 sAPPβ는 감마-시크리테이즈에 의해 다시 한번 잘리워져 베타-아밀로이드가 되므로 생성되는 베타아밀로이드의 양과 비례하기 때문에 sAPPβ 양을 측정하였다. 그 결과 6개의 화합물 중 화합물 1 및 화합물 2는 sAPPβ 생성억제 효과가 없었지만 화합물 3 및 화합물 4는 100μg/ml 에서 sAPPβ의 양을 컨트롤에 비해 약 30% 감소시켰다. 화합물 5, 화합물 6은 20μg/ml 에서 sAPPβ의 양을 컨트롤에 비해 약 30% 감소하였고 100 μg/mL의 농도에서 sAPPβ 의 생성을 컨트롤에 비해 50% 이하로 감소시켰다(도 22 내지 27).

Claims

크로몬류 및/또는 플라보노이드류 화합물, 그 이성체 또는 그 염을 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 크로몬류 화합물은 바이플로린, 7-메톡시-이소바이플로린, 노르유게닌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 플라보노이드류 화합물은 에리오딕티올 인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효물질은 바이플로린 인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효물질은 바이플로린 만을 함유하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효물질은 7-메톡시-이소바이플로린 인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효물질은 7-메톡시-이소바이플로린 만을 함유하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효물질은 노르유게닌 인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효물질은 노르유게닌 만을 함유하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효물질은 에리오딕티올 인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물 중의 약효물질은 에리오딕티올 만을 함유하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 염은 무기산, 유기산, 무기 염기 또는 유기 염기와의 생리학적으로 허용되는 염인 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 크로몬류 및/또는 플라보노이드류 화합물이 관중(Dryopteris crassirhizoma)에서 분리된 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 13에 있어서,
상기 크로몬류 또는 플라보노이드류 화합물의 분리는 관중을 메탄올 추출하여 달성되는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 14에 있어서,
상기 메탄올 추출물을 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 부탄올, 물로 이루어지는 그룹에서 선택된 1종 이상의 용매간 극성 차이를 이용하여 분획하여 달성되는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 15에 있어서,
부탄올 분획물을 이온교환수지 크로마토그래피법에 적용한 다음, 실리카젤크로마트그래피법 또는 중압액체크로마트그래피법(MPLC)에 적용하여 단일 물질 분리가 달성되는 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 불활성 담체, 희석제, 또는 이들 둘 다를 포함하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구형 제제로 제형화된 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 18에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 현탁화제 및 시럽제, 형태는 크림제, 로션제, 연고제, 액제, 겔제, 카타플라스마제, 패취제, 에어로솔제, 유동엑스제, 엘릭서, 침제, 향낭, 주사제로 이루어지는 군중에서 선택된 제제로 제형화된 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 타크린, 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민 으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 약효 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
i) 관중을 50 %(v/v) 내지 99 %(v/v) 메탄올로 추출하는 단계,
ii) 위 단계에서 얻어진 추출물을 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 부탄올, 물로 이루어지는 그룹에서 선택된 1종 이상의 용매로 분획하는 단계;
iii) 위 단계에서 얻어진 부탄올층을 이온교환수지 크로마토그래피법에 적용한 다음, 실리카젤크로마트그래피법 또는 중압액체크로마트그래피법(MPLC)에 적용하는 단계; 및
iv) 위 단계에서 분리된 크로몬류 및/또는 플라보노이드류 화합물을 환자에게 투여 가능하도록 제형화하는 단계
를 포함하는 제1항에 따른 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조방법.