KR20100129481A - 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난을 유효성분으로 포함하는 에이엠피케이의 활성화에 의해 매개되는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 육두구 유래의 AMP-활성 단백질키나제 효소(AMP-activated protein kinase; AMPK)를 활성화시키는 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 비만과 같은 대사증후군(metabolic syndrome)의 예방과 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 육두구를 30%이하 에탄올 수용액으로 추출한 후 크로마토그래피를 이용하여 순수 분리 정제하여 얻은 하기 화학식 1로 표시되는 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물 중 어느 하나를 포함하는 AMPK 활성화 화합물과 이를 유효성분으로 함유하는 비만, 당뇨, 고지혈증, 심혈관계 질환 등과 같은 AMPK 효소의 활성화에 따른 대사증후군 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

육두구, AMPK, 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난, 비만, 대사증후군

Description

2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난을 유효성분으로 포함하는 에이엠피케이의 활성화에 의해 매개되는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물{2,5-Bis-aryl-3,4-dimethyltetrahydrofuran lignans as AMPK activators, and compositions for prevention and treatment of metabolic syndromes through activation of AMPK enzyme containing the same as an active ingredients}

본 발명은 육두구로부터 얻은 AMP-활성 단백질키나제 효소(AMP-activated protein kinase; AMPK)를 활성화 시키는 리그난계 화합물 및 이를 포함한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 육두구(Myristica fragrans)의 10~30% 에탄올 수용액 추출물로부터 AMP-활성 단백질키나제 효소를 활성화하여 비만, 당뇨, 고지혈증, 심혈관계 질환 등과 같은 AMPK 효소의 활성화에 따른 대사증후군 관련 질환의 예방 및 치료 작용이 있는 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 AMPK 활성화 작용 매개질환의 예방과 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 경제발전에 따른 생활수준의 향상으로 인하여 위생환경이 개선되고 식생활의 향상으로 섭취 열량 또한 급속한 증가가 이루어지고 있다. 그러나 과도한 음식으로 섭취 열량이 증가하는 반면 운동 부족 등으로 소비되는 열량이 적어 비만이 증가하는 경향을 보이고 있다. 비만은 마른 체형을 좋아하는 젊은이들에게 있어서 미용상의 모습을 해칠 뿐만 아니라 비만이 지속됨으로써 여러 가지 질환, 즉, 고혈압, 당뇨, 고지혈증, 관상동맥질환 등과 같은 성인병을 비롯하여 유방암, 자궁암 및 대장암 등을 야기하는 것으로 보고되면서 이제는 치명적인 질병으로 취급되고 있다[J. Biol. Chem., 273, 32487-32490 (1998); Nature, 404, 652-660 (2000)].

현재 비만을 치료하는 치료제로는 크게 중추 신경계에 작용하여 식욕에 영향을 주는 약제와 위장관에 작용하여 흡수를 저해하는 약물로 나누어 볼 수 있다. 중추 신경계에 작용하는 약물로는 각각의 기전에 따라 세로토닌 (5-HT) 신경계를 저해하는 펜플루라민, 덱스펜플루라민 등의 약물, 노르아드레날린 신경계를 통한 에페드린 및 카페인 등의 약물 및 최근에는 세로토닌 및 노르아드레날린 신경계에 동시 작용하여 비만을 저해하는 시부트라민 등의 약물들이 시판되고 있다. 이외에도, 위/장관에 작용하여 비만을 저해하는 약물로 장관 리파제를 저해하여 지방의 흡수를 줄여 주는 비만 치료제로 허가된 오를리스타트 등이 대표적인 약물로 사용되고 있다. 그러나 기존에 사용되어온 약물 중 펜플루라민 등의 약물은 부작용으로 원발성 폐고혈압이나 심장 판막병변을 일으켜 최근에 사용이 금지되었으며, 다른 약물들도 혈압감소나 유산산혈증 등의 문제점이 발생하여 심부전, 신질환 등의 환자에는 사용하지 못하는 문제점이 있다.

따라서 발명자는 개선된 비만 치료 방법을 찾기 위해 최근 에너지대사를 조 절하는 기전에 관심을 갖게 되었다. 통상 대사증후군 예방 및 치료제는 발병 후 장기간 복용해야 하며 에너지 조절관련 기관이 미토콘드리아이므로 이의 조절을 통한 에너지 조절제는 다른 계열의 약물 목표점보다 보다 높은 안전성(낮은 독성)을 가져야 한다는 전제 아래 천연물로부터 AMPK 효소를 활성화시키는 약물을 탐색하게 되었다.

AMPK는 세포의 영양상태나 운동, 스트레스 등에 의해 변화하는 세포 에너지 상태(ATP/AMP ratio)에 반응하여 그 활성이 조절되는 인산화 효소로 세포의 에너지대사에 관여하는 여러가지 효소들의 인산화를 조절함으로써 글루코스 이동(glucose transport), 지방산 합성(fatty acid synthesis), 콜레스테롤 생합성(cholesterol synthesis) 등의 다양한 생리작용에 영향을 미치는 것으로 알려진 효소이다(Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 47, 185-210, 2007).

최근 보고에 의하면 운동에 의하여 촉진되는 근세포에서의 글루코스 흡수(glucose uptake)에 AMPK가 관여함이 밝혀졌으며 AMPK는 일반적으로 세포 내에서 에너지 준위를 모니터하는 센서 역할을 담당하고 있는 것으로 밝혀지고 있다. 운동을 하거나 허기진 상태에서 근육세포, 간세포 그리고 지방세포는 필요한 에너지를 공급하기 위하여 지방, 글리코겐 등의 합성을 억제하며, 저장물질(지방)로부터 지방분해를 통하여 몸에서 필요한 에너지를 생성케 하는 역할을 수행한다. 또한, 이 효소는 지방세포로부터 분비되는 렙틴(leptin)과 아디포넥틴(adiponectin)의 세포내 신호전달 물질로도 알려져 있다. 특히, 아디포넥틴은 비만인 사람의 혈중에서 정상체중의 사람에 비교하여 낮은 농도로 측정되는 것으로 보아, 비만으로 기인한 인술린저항성과 높은 관계가 있을 것으로 추정되며, 따라서 AMPK 활성화 물질은 비만의 훌륭한 약물목표점으로 부상하고 있다(Nat. Rev Mol Cell Biol., 8(10), 774-785, 2007).

지금까지 경구용 당뇨병 치료용으로 사용하여 왔으나 그 기전을 모르고 있었던 메트포민(metformin)의 약물목표점이 AMPK 활성과 관련성이 알려지면서 많은 기업들이 이들을 목표점으로 약물을 개발하여 왔으며, 2008년에 호주의 가르반 의학연구소팀은 '화학 & 생물학저널'에 발표한 연구결과 비터멜론(bitter melon)에서 추출한 4가지 성분이 체내 대사를 조절하는데 관여하는 것으로 잘 알려진 단백질 효소인 AMPK를 활성화하는 것으로 보고하였다(Chem Biol., 15(5), 263-273, 2007)

일반적으로 새로운 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법 중, 기존 약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 전통의학에서 사용되고 있는 천연물 약제들로부터 새로운 활성성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높으며 이러한 활성 성분들은 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 약물들에 의한 독성 염려가 적다는 장점이 있다.

본 발명의 대상 천연물인 육두구(Myristica fragrans)는 육두구과에 속하는 상록교목으로 수마트라, 자바에서 재배되는 높이 10-20m 정도로 자라는 자웅이주 식물이다. 과실은 난구형 육질로서 가운데에 홍색의 가종피에 둘러싸인 종자를 포함하며 종자를 육두구라 하여 사용한다. 육두구는 예로부터 소스 등 식품의 향미료로서 광범위하게 이용되어 왔고, 한방에서는 설사, 복부팽만, 구토, 식용감퇴 등의 방향성 건위제로 사용되었다.

본 발명자는 육두구로부터, 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리 그난계 화합물을 다수 분리하여 이들 화합물이 AMPK 효소를 활성화하였으며, 이들 화합물을 동물에게 투여하여 활성을 확인함으로써 본 발명의 화합물이 비만을 비롯한 대사증후군 예방 및 치료용도로서 사용 가능함을 밝혔다.

그러나, 많은 논문에서 육두구를 다량 복용시 급성독성이 일어났다고 보고하고 있으며, 육두구 추출물에는 인체에 독성을 나타내는 대표적인 물질로서 아래 그림과 같이 알킬벤젠 유도체인 미리스티신(myristicin), 엘레미신(elemicin), 샤프롤(safrole)이 함께 추출되어 사람이 섭취하면 체내에서 암페타민 유도체로 변화되어 항정신성 약물과 비슷한 독성작용을 나타내는 것으로 잘 알려져 있으며, 독성을 제거하기 위해 전통적으로 육두구를 석회수에 하루 정도 담가두었다가 불로 건조하여 약재에 사용하기도 했다.

육두구의 독성물질로서 가장 많이 존재하는 것이 미리시트신(YAGAKU ZASSHI, 128(1), 129-133, 2008)이며, 문헌상에서 육두구의 메탄올 추출물은 평균 2.1%의 미리스티신을 함유하고 있는 것으로 보고되었다(Natural Toxins, 5, 186-192, 1997; 생약학회지, 38(1), 19-21, 2007).

상기와 같이 육두구 추출물을 비만을 비롯한 대사증후군 예방 및 치료용 조성물을 개발하는데 있어서 본 발명자들은 육두구로부터 미리스티신을 최소로 함유하면서도 활성성분을 최대로 함유하는 추출조건을 확립하였다.

한편 육두구 관련 추출물을 함유한 분획물을 이용한 선행 특허로 “생약 추출물을 포함하는 콜레스테롤 에스터레이즈 저해용 조성물(특허등록 제399529호)”, “한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물(특허등록 제795976호)” 및 “한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 관상동맥성 심장 질환 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물(특허등록 제793204호)” 등이 있으나 이들은 단지 활성성분이 규명되지 않은 육두구 추출물 자체를 사용한 것으로 육두구 추출물 중에 함유된 활성을 확인한 화합물을 기반으로 하는 본 발명과는 관련성이 적다.

육두구 함유 활성 화합물을 이용한 선행 특허로는 “항암제로 유발되는 독성의 억제제 및 이를 함유하는 항암제조성물(특허등록 제646574호)”, “리그난계 화합물을 유효성분으로 함유하는 여드름 치료 또는 예방용 조성물(특허등록 제567431호)”, “간보호 및 간장질환 치료용 의약 조성물(특허등록 제619498호)”, “리그난계 화합물을 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물(특허등록 제579752호)”, “제2형 당뇨병 치료 또는 예방용 약제학적 조성물(특허등록 제627643호)”, “메이스리그난 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 ＰＰＡＲα에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물(특허등록, 제830192호)”, “리그난계 화합물을 함유하는 뇌신경질환의 치료 또는 예방 용 약학적 조성물(특허등록 제679306호)” 등으로 이들 특허들은 메이스리그난(macelignan)을 이용한 다양한 활성에 대해 공지된 것으로 본 발명의 활성화합물인 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물과는 그 구조와 특성이 다르다.

최근의 공개특허 제2008-112090호에는 당뇨병 또는 피피에이알-감마 매개질환 치료 활성물질로 아우스토바이리그난 7(austobailignan 7)을 제시하고 있으나, 본 발명의 추출조건의 추출물에서는 상기 성분을 확인하지 못하였으며, 상기 공개특허 제2008-112090호에서 개시된 약물 기전은 피피에이알-감마를 활성화시켜 경구용 당뇨병 치료제로 사용되고 있는 글리티아존 계열의 약물과 동일한 것인데, 이들 약물은 당뇨병을 치료하는 과정 중에 지방세포 수를 늘려 비만이 유도되는 부작용이 있다고 알려져 있다.

이에 대해 본 발명의 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난 화합물은 AMPK 효소 활성화하여 에너지 대사를 증가시켜서 비만 및 대사증후군 예방 및 치료제로 사용함으로써 피피에이알-감마를 활성화와는 다른 기전으로서 피피에이알-감마를 활성화에 따른 부작용이 전혀 없다는 장점을 갖는다.

육두구 이용 선행문헌 중에서 본 발명과 가장 관련이 있는 등록특허 제830192호에서 육두구의 활성 화합물로 제시한 메이스리그난과 본 특허에서 활성화합물로 제시한 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물 중 하나인 넥탄드린 B의 활성을 비교하기 위하여, 동일한 농도에서 메이스리그난과 넥탄드린 B를 각각 동일한 기간 동안 경구투여한 후 동물 활성을 비교하여 넥탄드린 B가 월등한 활성을 갖는 것을 확인한 내용을 추가하여 본 발명을 완성하였다.

선행문헌과 달리 본 발명은 육두구의 독성물질인 미리스티신, 엘레미신의 추출을 최소화하고, 활성물질인 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란를 최대로 추출하기 위하여 10~30% 에탄올 수용액을 육두구의 추출용매 조건으로 하여 새로운 비만을 비롯한 대사증후군 예방 및 치료용의 육두구 추출물 조성물을 완성하였으며, 또한 본 발명자들은 10~30% 에탄올 수용액을 육두구의 추출물에 함유된 미량의 미리스티신 독성물질을 제거하기 위하여 추가로 이온 교환수지를 사용하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 육두구의 10~30% 에탄올 수용액 추출물로부터 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물을 분리하고 이들 화합물 각각을 C2C12 세포주를 이용하여 AMPK의 활성화 상태인 p-AMPK와 p-ACCs(ACC1 과 ACC2)를 측정하는 방법을 사용하여 활성을 확인하였고, 대표 화합물인 넥탄드린 B를 얻어 이들 화합물을 비만 및 대사증후군 약물 개발의 모델로 사용하는 동물실험을 통하여 화합물의 활성을 최종적으로 확인하였다.

따라서 본 발명의 목적은 육두구로부터 독성물질인 미리스티신이 최소화하고 AMPK 활성화 작용을 갖는 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난 화합물을 1종 이상 함유하는 육두구 추출물로서 비만 또는 대사증후군 관련 질환에 예방과 치료 효과를 나타내는 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 육두구로부터 순수하게 분리 정제하여 얻은 AMPK 활성화 작용을 갖는 비만 또는 대사증후군의 예방과 치료 효능을 갖는 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난 화합물들을 각각 혹은 1개 이상 혼합하여 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공함에 있다.

본 발명자는 상기와 같은 점을 감안하여 각종 자생식물 및 한약재를 채집하여 AMPK 활성화 작용의 조사과정을 통하여 육두구를 후보식물로 선정하였다.

상기 선정된 육두구로부터 에탄올 수용액으로 추출된 추출물 및 이로부터 독성물질인 미리스티신 함량이 낮고 활성성분인 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물의 농도가 높은 추출 조건을 확립하고 상기 추출 조건에서 추출된 육두구 추출물과 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물이 AMPK 활성정도가 높으며 비만 유도를 억제한다는 것을 확인함으로 본 발명을 완성하였다.

또한 적어도 한 가지 이상의 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난 화합물(하기 화학식 1 참조)이 포함된 육두구 에탄올 수용액 추출물의 조성물이 AMPK를 활성화 작용을 통해 비만 또는 대사증후군 관련 예방 또는 치료 혹은 용도로 사용되는 것을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

상기 화합물은 비만 또는 당뇨의 치료 물질, 비만 또는 당뇨의 예방 물질 및 AMPK 활성화용 약제 물질 중에서 선택되는 적어도 하나의 용도로 사용되는 것을 특징으로 한다.

(화학식 1)

본 발명에 따른 AMPK 활성화용 약학조성물은, 상기한 화합물들 중 적어도 하나의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 육두구의 AMPK 활성물질인 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난 화 합물은 육두구를 마쇄한 후 에탄올 수용액으로 추출하는 단계; 크로마토그래피를 이용하여 AMPK 활성화용 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난 화합물을 순수하게 분리 정제하는 단계; 상기 단계에서 얻은 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난 화합물의 화학구조 및 물리화학적 특성을 조사하는 단계; 상기 단계의 화합물을 고속액체크로마토그래피법(HPLC)을 이용하여 분석하는 단계; 상기 단계의 화합물의 AMPK 활성화를 조사하는 단계; 및 상기 단계에서 얻은 화합물을 포함하는 분획물의 경구투여에 의한 동물 실험단계를 포함하는 제조과정을 통해 얻어질 수 있다.

상기 육두구의 에탄올 수용액 추출물은 추가로 이온 교환수지를 이용하여 남아있는 미량의 미리스티신을 제거함과 동시에 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난 화합물을 농축시킬 수 있는 방법을 이용할 수도 있으며, 본 발명에서 미리스티신을 제거하기 위한 이온 교환수지는 더욱 상세하게는 합성흡착제로 방향족계 무치환 수지 중의 하나인 디아이온 HP-20류, SP825류, AXT204류, XAD1600T류, MN200류(미쓰비시케미칼 제조)일 수 있다.

본 발명자는 물리화학적 특성 및 핵자기공명 스펙트럼의 해석으로부터 본 발명에 따른 화합물이 넥탄드린 B(Nectandrin B), 넥탄드린 A(Nectandrin A),프라그란신 C1(Fragransin C1), 베루코신(Verrucosin), 사우서네틴(Saucernetin), 테트라하이드로푸로구아이다신(Tetrahydrofuroguaiacin)임을 알았고 이들 화합물을 포함하는 화합물 또는 분획물의 경구투여를 통하여 AMPK 활성화 작용 및 동물효능 효과를 규명하였다.

본 발명에 따른 AMPK 활성 화합물은 육두구로부터 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수가 있다. 조추출물은 필요에 따라서 상법에 따라서 더욱 정제할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 크로마토그래피에는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 칼럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온 교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 박층크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등이 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난 화합물은 AMPK 활성화에 작용하므로 비만 또는 당뇨의 예방과 치료에 효능이 있으므로 생체내 이용성이 높아서 유리하게 활용할 수 있고 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물은 육두구로부터 쉽게 분리할 수 있을 뿐만 아니라 안정도도 높으므로 식품, 의약품의 첨가제로 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 육두구 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱 스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 활성성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판 단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 추출물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 상기 육두구 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 비만 예방을 위한 건강 기능 식품을 제공한다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 상세하게는, 본 발명은 육두구 추출물을 유효성분으로 함유하는 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 비만 또는 대사증후군 관련 예방과 치료용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명에 따른 육두구로부터 에탄올 수용액으로 추출된 추출물 및 이로부터 독성물질인 미리스티신 함량이 낮으면서 AMPK 활성성분인 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물의 농도가 높은 추출 조건을 확립하고 상기 추출 조건에 서 추출된 육두구 추출물과 2,5-비스아릴 테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물이 AMPK 효소를 활성화하여 에너지 대사과정에 대한 작용을 통하여 비만 또는 대사증후군 관련 예방과 치료의 효과를 기대할 수 있다.

또한 육두구 추출물에 존재하였던 독성물질을 제거하는 방법을 이용하여 의약품, 화장품 및 식품 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예, 실험예 및 제제예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예, 실험예 및 제제예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 또한 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 제공되는 것이다.

<실시예 1 :육두구로부터 미리스티신 함량은 적고 넥탄드린 B 함량이 많은 에탄올 수용액 추출물의 제조>

분쇄된 육두구 100g을 각 용매(표 1 참조) 500㎖에 넣어 2시간 동안 3회에 걸쳐 초음파 추출기를 사용하여 활성물질을 추출하였다. 분리된 추출물의 활성물질은 동일 농도로 하여 사용하였고 미리스티신은 시그마사(제품번호: M9237)에서 구입하였다. 각각의 육두구 용매추출물과 미리스티신은 MeOH-H₂O(0-32 min: 63% MeOH, 32-37min: 63 → 100% MeOH)을 사용하여 HPLC [Optima Pak C₁₈ column 4.6 × 250mm, 5μm 입자 크기, 유속 1㎖/min, UV detection: 260nm]로 분석하였다. 표 1 은 각각 다른 용매로 추출된 육두구 추출물의 미리스티신 및 넥탄드린 B의 함량을 나타낸 도표이다.

알코올 추출용매	추출 물질중의 함량
	미리스티신	넥탄드린 B
물 추출액	0.19%	0.62%
10% 에탄올 수용액 추출물	0.31%	1.24%
20% 에탄올 수용액 추출물	0.33%	2.98%
30% 에탄올 수용액 추출물	0.45%	7.48%
40% 에탄올 수용액 추출물	1.34%	2.79%
50% 에탄올 수용액 추출물	1.48%	2.77%
75% 에탄올 수용액 추출물	1.27%	2.95%
75% 메탄올 수용액 추출물	1.85%	7.47%

표 1에 도시된 바와 같이 30% 에탄올 수용액을 이용한 추출물에서의 미리스티신의 함량은 평균 0.45% 였으며, 75% 에탄올을 사용하여 추출하였을 경우의 1.27% 및 75% 메탄올을 사용하여 동일조건으로 추출하였을 경우의 1.85%로 평균 3배 적게 추출됨을 알았다. 또한 30% 에탄올로 추출된 육두구 추출물을 이용하여 실시한 MeOH-H₂O(0-35min: 60% MeOH, 35-60min: 60 100% MeOH)을 사용하여 HPLC[OptimaPak_C₁₈ column 4.6 x 250mm 5μm 입자 크기, 유속 1㎖/min, UV detection : 205, 280nm]로 분석한 결과 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물 중에서 넥탄드린 B가 가장 많은 양을 차지하고 있었다(도 1 참조). 이를 참고로 육두구 추출물에서 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물의 양을 측정할 때는 넥탄드린 B를 지표로 하여 양적인 정도를 비교한 결과, 도 2 내지 도 4에 도시된 바와 같이 30% 이하 에탄올 수용액 추출물에서 넥탄드린 B의 양이 많다는 것을 확인하였다.

이로써 활성물질의 양을 최대로 하고 독성물질의 함량을 최소로 하는 조건을 고려하여 본다면 30%이하 에탄올 수용액으로 육두구의 활성물질을 추출하는 것이 가장 효율적인 추출방법임을 알 수 있다.

<실시예 2: 육두구 에탄올 수용액 추출물로부터 독성물질 미리스티신의 추가 제거>

육두구 500g을 30% 에탄올 수용액 1,000㎖로 추출한 후 이온 교환수지 중의 하나인 디아이온 HP-20 500g에 통과시켜 흡착시켰다. 이후 50% 에탄올, 60% 에탄올, 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 100% 에탄올 및 100% 아세톤을 1ℓ씩 사용하여 용출하였다. 표 2는 디아이온 HP-20에 흡착된 넥탄드린 B와 미리스타신이 에탄올 수용액 및 아세톤에서 용출되는 정도를 표시한 도표이다.

용출용매조건	용출물질 중의 함량
	미리스티신	넥탄드린 B
30% 에탄올 수용액	0.04%	0.01%
50% 에탄올 수용액	0.04%	0.1%
70% 에탄올 수용액	0.04%	24.2%
80% 에탄올 수용액	0.04%	61.0%
90% 에탄올 수용액	0.66%	13.9%
100% 에탄올	20.77%	1.0%
100% 아세톤	13.71%	3.0%

미리스티신은 표 2에 도시된 바와 같이 디아이온 HP-20 흡착물을 80% 이하 에탄올 수용액을 사용하여 용출하였을 경우에 거의 검출되지 않았다.

또한 각각의 용매 조건에서 역시 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물 중의 하나인 넥탄드린 B를 확인하였는데 표 2, 도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이 넥탄드린 B도 80% 에탄올 수용액을 용매로 이용했을 때가 많이 용출되었다.

<실시예 3: 육두구로부터 추출된 화합물의 확인>

상기 실시예 1의 30% 에탄올 수용액 육두구 추출물을 HPLC로 분리된 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물은 ¹H, ¹³C-NMR을 이용하여 그 특성을 분석하였다. 본 발명에 따라 육두구로부터 추출한 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물(1-6)의 물리화학적 특성은 다음과 같다.

3-1. 테트라하이드로푸로구아이아신 (Tetrahydrofuroguaiacin, 화합물 1)

무색의 분말, 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500 MHz, CDCl₃) : δ 0.61(6H, d, J=6.0 Hz, 3- and 4-Me), 2.67(2H, m, 3- and 4-H), 3.91(6H, 3'- and 3"-OMe), 5.12(2H, d, J=6.6 Hz, 2- and 5-H), 5.59(2H, s, 4'- and 4"-OH), 6.90-6.99(6H, m, 2'-, 5'-, 6'-, 2"-, 5"- and 6"-H), 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (125 MHz, CDCl₃) : δ 11.7(3- and 4-Me), 41.5(C-3 and C-4), 55.8(2×OMe), 82.7(C-2 and C-5), 109.0(C-2' and C-2"), 113.9(C-5' and C-5"), 119.3(C-6' and C-6"), 132.5(C-1' and C-1"), 144.3(C-4'and C-4"), 146.2(C-3' and C-3").

3-2. 사우서네틴 (Saucernetin, 화합물 2)

무색의 오일, 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500 MHz, CDCl₃) : δ 0.63(3H, d, J=6.5 Hz, 4-Me), 1.01(3H, d, J=6.5 Hz, 3-Me), 2.33(2H, m, 3- and 4-H), 3.90-3.92(6H, 3'- and 3"-OMe), 4.65(1H, d, J=9.5 Hz, 2-H), 5.46(1H, d, J=4.5 Hz, 5-H), 5.58(2H, s, 4'- and 4"-OH), 6.77-6.99(6H, m, 2'-, 5'-, 6'-, 2"-, 5"- and 6"-H), 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (125 MHz, CDCl₃) : δ 9.42(3-Me), 11.83(4-Me), 43.4(C-3), 47.6(C-4), 55.8(2×OMe), 84.8(C-2), 85.7(C-5), 108.3(C-2'), 108.7(C-2"), 113.9(C-5'), 114.0(C-5"), 118.8(C-6'), 119.3(C-6"), 132.6(C-1'), 135.0(C-1"), 144.3(C-4'), 145.0(C-4"), 146.3(C-3"), 146.6(C-3').

3-3. 베루코신 (Verrucosin, 화합물 3)

무색의 오일, 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500 MHz, CDCl₃) : δ 0.67(3H, d, J=6.5 Hz, 4-Me), 1.06(3H, d, J=6.5 Hz, 3-Me), 1.79(1H, m, 3-H), 2.25(1H, m, 4-H), 3.87-3.89(6H, 3'- and 3"-OMe), 4.36(1H, d, J=9.5 Hz, 2-H), 5.10(1H, d, J=9.0 Hz, 5-H), 6.80-6.96(6H, m, 2'-, 5'-, 6'-, 2"-, 5"- and 6"-H), 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (125 MHz, CDCl₃) : δ 14.8(3-Me), 15.2(4-Me), 45.9(C-4), 46.8(C-3), 56.4(2×OMe), 84.6(C-2), 89.0(C-5), 111.6(C-2'), 111.9(C-2"), 115.7(C-5'), 116.1(C-5"), 120.7(C-6'), 120.9(C-6"), 133.0(C-1'), 133.8(C-1"), 147.5(C-4'), 146.8(C-4"), 148.6(C-3"), 149.0(C-3').

3-4. 넥탄드린 B (Nectandrin B, 화합물 4)

무색의 오일, 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (600 MHz, CDCl₃) : δ 1.05(6H, d, J=6.0 Hz, 3- and 4-Me), 2.35(2H, m, 3- and 4-H), 3.85(6H, 3'- and 3"-OMe), 4.53(2H, d, J=5.4 Hz, 2- and 5-H), 5.74(2H, brs, 4'- and 4"-OH), 6.91(2H, d, J=7.8 Hz, 5'- and 5"-H), 6.93(2H, dd, J=1.8, 7.8 Hz, 6'- and 6"-H), 6.99(2H, d, J=1.8 Hz, 2'- and 2"-H), 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (200 MHz, CDCl₃) : δ 133.9(C-1' and C-1"), 114,1(C-2' and C-2"), 146.4(C-3' and C-3"), 144.9(C-4' and C-4"), 109.2(C-5' and C-5"), 119.1(C-6' and C-6"), 87.2(C-2 and C-5), 44.1(C-3 and C-4), 12.7(3-Me and 4-Me), 55.7(-OMe × 2).

3-5. 넥탄드린 A (Nectandrin A, 화합물 5)

흰색결정, 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500 MHz, CDCL₃) δ: 1.00(3H, d, J=3.5 Hz, 4-Me), 1.02(3H, d, J=3.5 Hz, 3-Me), 2.27(2H, m, 3- and 4-H), 3.80 - 3.86(9H, s, 3×OMe), 4.43(1H, d, J=7.5 Hz, 2-H), 4.44(1H, d, J=7.5 Hz, 5-H), 6.81-7.09(6H, m, Ar-H) ; 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (125 MHz, CDCL₃) δ: 13.1(3-Me), 13.2(4-Me), 45.6(C-4), 45.5(C-3), 56.1-56.3(3×OMe), 88.0(C-5), 88.2(C-2), 110.9(C-2'), 111.3(C-2"), 112.7(C-5'), 115.5(C-5"), 119.5(C-6'), 120.0(C-6"), 135.1(C-1'), 136.4(C-1"), 146.9(C-4'), 148.3(C-4"), 149.9(C-3"), 150.4(C-3').

3-6. 프라그란신 C-1 (Fragransin C-1, 화합물 6)

무색의 오일, 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500 MHz, CDCl₃) : δ 1.04(3H, d, J=6.6 Hz, 3-Me), 1.06(3H, d, J=7.2 Hz, 4-H), 2.32(1H, m, 3-H), 2.34(1H, m, 4-H), 3.88(9H, 3'-, 5'- and 3"-OMe), 4.50(1H, d, J=7.2 Hz, 2-H), 4.52(1H, d, J=7.2 Hz, 5-H), 5.47-5.58(2H, br, s, 4'- and 4"-OH), 6.67(2H, br, s, 2'- and 6'-H), 6.91-6.97(3H, m, 2"-, 5"- and 6"-H), 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (125 MHz, CDCl₃) : δ 12.9(3-Me), 13.1(4-Me), 44.0(C-3), 44.5(C-4), 56.3-55.8(3×OMe), 87.2(C-2), 87.5(C-5), 103.1(C-2' and C-6'), 102.9(C-2"), 114.1(C-5"), 119.3(C-6"), 134.0(C-1'), 133.5(C-1"), 145.1(C-4'), 146.4(C-4"), 146.9(C-3', C-5' and C-3").

<실험예 1 : 리그난계 화합물 1-6의 AMPK 활성화 작용의 측정>

실시예 3의 육두구 추출물 분획으로부터 분리 정제한 화합물 1-6의 AMPK 활성화 효능을 C2C12 myoblast cell line을 사용하여 측정하였다. C2C12 세포를 6-웰 플레이트에 접종한 후 10% 우혈청이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 배양시킨 후 분화를 유도하기 위하여 1% 우혈청을 포함한 DMEM 배지로 치환하였다. 분화된 세포는 효소의 인산화 작용을 확인하기 위해 16시간 동안 무혈청 상태의 DMEM 배지로 유지한 뒤 정해진 농도의 시료를 처리하여 2시간 동안 배양하였다. 시료 처리후 세포에 SDS 샘플 버퍼를 처리하여 수거하고 초음파를 이용하여 세포를 파쇄하여 세포 용출액을 얻었다. 세포 용출액을 이용하여 10% SDS-PAGE 전기영동을 실시하고 세미 드라이 트랜스퍼 기기를 이용하여 PVDF 트랜스퍼 멤브레인에 단백질을 고착시켰다. 멤브레인은 5% 탈지방유로 1시간 동안 상온에서 반응시키고 AMPK와 인산화된 AMPK(phospho-AMPK, Thr172) 항체를 이용하여 웨스턴블롯을 수행하였다. 또한 에너지 대사과정에서 AMPK 활성의 증가는 ACCs(acetyl-CoA carboxylase1 과 2)의 인산화를 증가시키는 것으로 알려져 있으므로 AMPK 활성화를 확인하기 위하여 동일한 방법으로 수득한 세포 용출액을 이용하여 인산화된 ACCs(phospho-ACCs)를 확인하였다.

육두구 추출물으로부터 분리된 리그난계 화합물 1－6의 AMPK 활성화 작용을 측정한 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7에 도시된 바와 같이 육두구 추출물으로부터 분리된 리그난계 화합물 1-6은 대조군에 비해 AMPK와 ACC가 높게 활성화되어 있는 것을 확인할 수 있다. 도 7의 결과를 참조하여 넥탄드린 B가 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물 중에 많은 양을 차지하면서도 AMPK 활성 정도도 높기 때문에 다음 실험부터는 대표적인 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물로 넥탄드린 B를 사용하여 실험을 수행하였다.

<실험예 2 : DIO(Diet-Induced Obesity) 모델에서 항비만 효과 검정>

[1 단계] 시료준비

동물실험에 사용된 넥탄드린 B, 메이스리그난은 100mg/kg의 농도로, 육두구의 30% 에탄올 추출물은 100mg/kg의 농도로 매일 경구투여 하였으며 경구투여 전 투여 약물은 메틸셀룰로오스(Sigmaco.USA) 5% 수용액에 녹여서 준비하였다.

[2 단계] 실험군 설정 및 체중감량 효과 검증

본 실험을 진행하기 위하여 7주령의 C57BL/6J 수컷 생쥐를 대상으로 군당 10마리씩 준비하였으며, 1주간의 적응기간을 가진 후, 개별 우리에 분리하여 12시간 간격의 낮(오전 7시~오후5시)과 밤의 주기에 따라 관리하였다. 실험군은 1)고지방식이군, 2)고지방식이와 더불어 넥탄드린 B를 100 mg/kg/day 섭취군, 3)고지방식이와 더불어 메이스리그난 100 mg/kg/day 섭취군, 4)고지방식이와 더불어 30% 육두구 추출물 100 mg/kg/day 섭취군의 총 4개 군으로 나뉘어 1일 1회씩 8주 동안 일정한 시간(오전 10시)에 경구로 투여하였다. 체중은 매주 1회(오전 11시) 측정을 실시하였으며, 투여시작 8주 후에 실험군과 대조군의 최종 체중을 측정하여 분석하였다. 표 3은 각 물질을 경구투여한 후 체중 변화량을 측정한 결과이다.

그 룹	경구투여 후 체중변화량 (g)
	14일	21일	28일	35일	42일	49일	56일
고지방식이	4.40 ±0.63	6.68 ±0.70	8.04 ±0.88	10.13 ±0.87	11.49 ±0.88	12.50 ±0.87	13.40 ±0.92
넥탄드린B + 고지방식이	2.73 ±0.49	3.68 ±0.63	4.39 ±0.60	6.61 ±0.62	7.44 ±0.67	8.51 ±0.80	8.89 ±0.82
메이스리그난 + 고지방식이	4.00 ±0.38	5.31 ±0.54	6.52 ±0.59	8.91 ±0.72	9.70 ±0.85	10.63 ±0.84	11.48 ±0.89
육두구 30% 에탄올 추출물 + 고지방식이	3.22 ±0.28	4.33 ±0.39	5.20 ±0.49	7.13 ±0.48	8.39 ±0.39	9.12 ±0.51	9.55 ±0.50

실험 실시 후 56일 경과 시점에서 각 투여군의 체중을 비교하여 보면, 표 3 및 도 8에 도시된 바와 같이 고지방식이만 섭취하였던 군과 메이스리그난과 고지방식이를 섭취하였던 군에 비해서 육두구 추출물이나 넥탄드린 B를 고지방식이와 함께 섭취한 군의 체중증가가 낮음을 확인할 수 있다. 고지방식이 투여군의 체중은 13.40g 증가하였다. 넥탄드린 B 투여 군의 체중은 8.89g증가 하였다. 이러한 체중증가량은 고지방식이 투여군과 비교했을 때 95% 신뢰수준에서 통계적으로 유의하게 체중 증가가 억제되었다고 할 수 있다. 이에 반해 메이스리그난 투여군의 체중은 11.48g 증가하였는데 고지방식이 투여군과 비교했을 때 통계적으로 유의한 수준의 체중증가 억제는 아니다. 30% 육두구 추출물 투여군의 경우 체중이 9.55g 증가하였는데 고지방식이 투여군과 비교했을 때 95% 유의 수준에서 통계적으로 유의하게 체중 증가가 억제 되었다(표3 참조).

<실험예 4 : 독성실험> ;

4-1. 급성독성

육두구로부터 추출된 활성분획을 단기간에 과량을 섭취하였을 시 급성적(24시간 이내)으로 동물 체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 20 마리를 대조군은 10마리, 실험군은 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 PEG-400/tween-80/EtOH(8/1/1, v/v/v)만을 투여하고, 실험군은 육두구로부터 추출된 활성 분획을 상기한 실험예 3에서 이용된 투여농도인 100㎎/㎏의 50배(5g/㎏)의 농도로 각각 경구 투여하였다. 표 4는 육두구 추출물 및 넥탄드린 B를 5g/kg으로 경구투여 후 치사율을 확인한 결과를 나타내는 도표이다.

경구투여 물질	투여 이후 시간 (Hour)
	3	6	9	12	15	18	24
대조군(30% 에탄올 수용액 용매)	생존	생존	생존	생존	생존	생존	생존
육두구 30% 에탄올 추출물	생존	생존	생존	생존	생존	생존	생존
넥탄드린 B	생존	생존	생존	생존	생존	생존	생존

투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 표 4에 도시된 바와 같이 대조군과 5g/㎏ 농도의 육두구 추출물 및 넥탄드린 B를 투여한 실험군에서 모두 생존하였다.

4-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

장기 독성 실험은 을 각 농도로 8주 동안 투여하여 비만예방 및 치료 등의 시험에 이용된 C57BL/6J 생쥐를 대상으로 실험하였다. 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 넥탄드린 B 및 30% 에탄올 추출물을 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 표 5는 8주간 육두구 30% 에탄올 추출물과 넥탄드린 B의 경구투여 후의 GTP와 BUM 차이를 나타내는 도표이다.

8주간 경구투여된 물질	8주간의 수치 차이
	GTP	BUM
대조군(30% 에탄올)	1.9 ㎎/dl	2.1 ㎎/dl
육두구 30% 에탄올 추출물	2.3 ㎎/dl	2.2 ㎎/dl
넥탄드린B	2.1 ㎎/dl	1.8 ㎎/dl

그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다(표 5 참조). 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 정취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

<제제예 1 : 약학적 제제>

1-1. 정제의 제조

본 발명에 따른 육두구 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

2-2. 주사액제의 제조

본 발명에 따른 분리된 화합물을 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<제제예 2 : 식품 제조>

2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명에 따른 육두구 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 각각 0.2~10 중량부로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명에 따른 육두구 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 각각 0.1~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명에 따른 육두구 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 각각 0.1~1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

2-4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명에 따른 육두구 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 각각 0.1~1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

2-5. 야채 주스 제조

본 발명에 따른 육두구 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 0.5g을 토마토 또는 당근 주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채 주스를 제조하였다.

2-6. 과일쥬스 제조

본 발명에 따른 육두구 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 0.1g을 사과 또는 포도 주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일 주스를 제조하였다.

도 1은 육두구를 30% 에탄올로 추출한 후 디아이온 HP-20에 흡착시킨 후 용출한 활성분획 각각의 구성 화합물을 분리하여 구조를 확인한 후, HPLC 상에서 나타나는 피크와 화합물을 도시한 HPLC 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2는 육두구로부터 30% 에탄올로 추출한 육두구 추출물을 HPLC로 분석한 스펙트럼이다.

도 3는 육두구로부터 75% 에탄올로 추출한 육두구 추출물을 HPLC로 분석한 스펙트럼이다.

도 4는 육두구로부터 75% 메탄올로 추출한 육두구 추출물을 HPLC로 분석한 스펙트럼이다.

도 5는 육두구 30% 에탄올 추출물을 디아이온 HP-20에 흡착시킨 후 80% 에탄올 용출한 후 HPLC로 분석한 스펙트럼이다.

도 6은 육두구 30% 에탄올 추출물을 디아이온 HP-20에 흡착시킨 후 90% 에탄올로 용출한 후 HPLC로 분석한 스펙트럼이다.

도 7은 육두구로부터 분리하여 얻은 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물 각각을 10μg/㎖의 최종농도로 분화된 C2C12 세포주에 화합물을 처리하여 AMPK 효소의 활성을 측정하기 위하여 p-AMPK와 p-ACC를 측정한 그림이다.

도 8은 넥탄드린 B와 비교 화합물 메이스리그난 및 육두구 30% 에탄올 추출물을 고지방식이로 유도된 비만모델에 8주간 경구투여 후의 체증증가 변화를 보여 주는 실험결과이다.

Claims (8)

1. 육두구를 10~30% 에탄올 수용액으로 추출되어 독성물질인 미리스티신 함량이 0.5중량% 이하 함유하고, 넥탄드린 B(Nectandrin B), 넥탄드린 A(Nectandrin A), 프라그란신 C1(Fragransin C1), 베루코신(Verrucosin), 사우서네틴(Saucernetin) 또는 테트라하이드로푸로구아이아신(Tetrahydrofuroguaiacin)의 리그난계 화합물 중 적어도 한 가지 이상 포함된 것을 특징으로 하는 육두구 추출물.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 육두구 추출물은 추가로 이온교환수지를 사용하여 미리스티신을 흡착제거하여 독성물질인 미리스티신 함량이 0.1중량% 이하 함유하고, 넥탄드린 B, 넥탄드린 A, 프라그란신 C1, 베루코신, 사우서넥틴 또는 테트라하이드로푸로구아이아신의 리그난계 화합물 중 적어도 한 가지 이상 포함된 것을 특징으로 하는 육두구 추출물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항의 육두구 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 대사증후군 개선용 건강기능식품.
4. 제 3 항에 있어서,

   상기 건강기능식품은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림을 포함한 낙농제품, 스프, 이온음료 등을 포함한 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제를 포함한 영양 공급용 제품으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품
5. 제 1 항 또는 제 2 항의 육두구 추출물을 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 비만 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물
6. 제 5 항에 있어서,

   상기 조성물은 AMP-활성 단백질키나제(AMPK) 효소의 활성을 증가시키기는 것임을 특징으로 하는 비만 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물.
7. 넥탄드린 B, 넥탄드린 A, 프라그란신 C1, 베루코신, 사우서네틴 또는 테트라하이드로푸로구아이아신 화합물 중 하나를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 히는 비만 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 조성물은 AMP-활성 단백질키나제(AMPK) 효소의 활성을 증가시키기는 것임을 특징으로 하는 비만 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학조성물.

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