KR100679306B1

KR100679306B1 - 리그난계 화합물을 함유하는 뇌신경질환의 치료 또는예방용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR100679306B1
Application number: KR1020050026963A
Authority: KR
Inventors: 황재관; 한정수; 임철승; 김대경; 이선희; 한규리
Original assignee: 아미코젠주식회사; 연세대학교 산학협력단; 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2007-02-06
Also published as: BRPI0609608A2; CA2601808C; EP1863473A4; CA2601808A1; AU2006229533B2; CN101151029A; KR20060104640A; JP2008534582A; AU2006229533A1; JP4909984B2; US20080275111A1; EP1863473A1; RU2354370C1; WO2006104369A1

Abstract

본 발명은 리그난계 화합물을 함유하는 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans) 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 뇌신경질환의 치료 또는 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

[일반식 Ⅰ]

상기에서, R₁및R₂는C_1-5의 알콕시 또는 히드록시 그룹이고, R₃는

또는

이다.

리그난계 화합물, 뇌신경질환, 항산화

Description

리그난계 화합물을 함유하는 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating or preventing a neurological brain disease comprising lignan compounds}

도 1은 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)로부터 리그난계 화합물을 분리하는 공정도이다.

도 2는 본 발명의 리그난계 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 리그난계 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 4는 본 발명의 리그난계 화합물의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.

도 5는 본 발명의 리그난계 화합물의 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼이다.

도 6은 본 발명의 리그난계 화합물의 EI-Mass 스펙트럼이다.

도 7은 HT-22 세포에서 본 발명의 리그난계 화합물이 글루타메이트에 의한 활성 산소종의 생성을 억제하는 효과를 측정한 그래프이다.

도 8은 배양한 해마세포에서 본 발명의 리그난계 화합물이 BSO에 의한 활성 산소종의 생성을 억제하는 효과를 측정한 그래프이다.

도 9는 과산화수소에 의해 유발된 뇌조직의 지질 과산화에 대한 본 발명의 리그난계 화합물의 억제 효과를 각 농도별로 측정한 그래프이다.

도 10은 본 발명의 리그난계 화합물의 세포 독성 효과를 측정한 그래프이다.

도 11은 글루타메이트에 의해 유도된 아폽토시스에 대한 본 발명의 리그난계 화합물의 억제 효과를 각 농도별로 측정한 그래프이다.

도 12는 배양한 뇌의 미세아교세포에서 본 발명의 리그난계 화합물의 IL-6 억제 효과를 조사한 결과이다.

도 13은 배양한 뇌의 미세아교세포에서 본 발명의 리그난계 화합물의 TNF-α 억제 효과를 조사한 결과이다.

도 14는 배양한 뇌의 미세아교세포에서 본 발명의 리그난계 화합물의 NO 억제 효과를 조사한 결과이다.

도 15는 배양한 뇌의 미세아교세포에서 LPS에 의해 유도된 iNOS 및 COX-2의 발현에 대한 본 발명의 리그난계 화합물의 억제 효과를 조사한 결과이다.

A: 웨스턴 블럿 분석 결과

B: iNOS 및 COX-2의 발현에 리그난계 화합물의 억제 효과를 수량화한 그래프

도 16은 본 발명의 메이스리그난을 이용하여 LC/MS 분석을 수행한 결과이다.

본 발명은 리그난계 화합물을 함유하는 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans) 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

사람이 수명이 늘어가고, 고령화 사회로 진행하면서, 뇌졸중, 치매, 파킨슨병 등의 뇌신경질환이 늘어가고 있다. 상기 뇌신경질환들은 특정 뇌세포의 사멸 또는 퇴화가 일시적 또는 오랜 기간에 걸쳐 진행하는 것이 특징인데, 한번 죽은 뇌세포는 재생이 되지 않기 때문에 결국 치명적인 뇌기능의 손실로 이어진다. 특히, 인지기능, 감각기능, 운동기능, 전신기능의 진행성 저하를 수반하는 뇌기능 부전은 결국 성격과 행동의 변화를 가져오고, 환자들이 스스로 자신을 돌볼 수 없는 지경에 이르게 한다. 이러한 뇌세포 사멸의 주요 경로로는 산화적 스트레스에 의한 산화적 독성, 흥분적 독성, 아폽토시스(apoptosis) 등이 제시되고 있으며, 각각은 특이한 신호전달과정을 통하여 세포사멸을 유발하게 된다.

구체적으로, 뇌졸중, 뇌손상, 알츠하이머성 치매, 파킨슨 병 환자에서 뇌세포 사멸의 주원인으로 활성 산소종(Reactive Oxygen Species)의 축적 후 단백질, 핵산, 지질의 산화적 손상이 제시되었다. 특히 자유 라디칼(free radicals)에 의한 산화 스트레스는 체 내의 각 조직에서 일어나는 세포 사멸의 주원인으로 보고되고 있으며, 뇌신경질환에서 나타나는 세포사멸의 주기전의 하나로도 제시되어 왔다(Schapira, A. H., Curr. Opin. Neurol., 9(4):260-264, 1996). 뇌신경질환에서 신경세포의 사멸에 자유 라디칼이 관여한다는 증거로는, 허혈 후 활성 산소종의 생성 증가 및 항산화제에 의한 허혈성 신경세포의 사멸억제효과(Flamm, E. S. et al., Stroke 9(5): 445-447, 1978; Chan, P. H., J. Neurotrauma 9 Suppl. 2:S417-423, 1992); 헌팅턴병의 선조체에서 Fe²⁺의 증가(Dexter, E. T. et al., Ann. Neutol., 32 Suppl:S94-100, 1992), 알츠하이머 질환에서 나타나는 베타 아밀로이드에 의한 자유 라디칼의 생성(Richardson J. S. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 777:362-367, 1996), 가족성 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)에서 Cu/Zn SOD-1 유전자에서의 점 돌연변이(Rosen, D. R. et al., Nature, 362(6415):59-62, 1993) 등이 있다.

또한 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트는 정상상태에서는 신경전달물질로 작용하나 여러 가지 원인에 의하여 과다 분비되면 신경세포의 사멸을 초래한다. 또한 글루타메이트의 수용체인 NMDA, AMPA, 카이네이트 수용체(kainate receptors)의 과도활성은 뇌졸중 및 뇌손상에 의한 신경세포 사멸의 주원인으로 알려져있다(Choi D. W. Neuron, 1:623-634, 1988). 글루타메이트에 의한 신경독성은 ALS에서 일어나는 신경세포의 사멸에 관여하는 것으로 밝혀졌는데, ALS 환자에서 글루타메이트 합성 효소의 이상, 글루타메이트 운반 단백질의 이상, 글루타메이트 수용체 단백질의 증가 등이 그 증거이다(Rothstein, J. D. Clin. Neurosci., 3(6):348-359, 1995; Shaw, P. J. et al., J. Neurol., 244:Suppl 2 S3-14, 1997).

또한 뇌세포 사멸의 다른 원인으로서 아폽토시스가 보고되고 있는데, 아폽토 시스는 허혈(ischemia), 뇌손상, 척추손상, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병에서 나타나는 세포사멸의 주형태이다(Smale et al., Exp. Neurol., 133:225-230, 1995; Crow et al., Nat. Med., 3:73-76, 1997).

이러한 다양한 보고들이 산화적 독성, 흥분적 독성 및 아폽토시스에 의한 뇌세포의 사멸이 다양한 뇌신경질환의 주요 원인으로 작용한다는 것을 보여주고 있으며, 이로부터 뇌신경질환 치료제를 개발함에 있어서 산화적 독성 및 흥분적 독성의 억제 및/또는 뇌세포의 아폽토시스를 억제하는 것이 주요한 목표점이 되고 있다.

한편, 리그난(lignan)은 n-페닐 프로판이 n-프로필 곁사슬의 β 자리에서 결합한 천연 화합물을 총징한 것으로서, 자연계에 널리 분포한다. 혈당강하 작용, 항암작용, 항천식작용, 미백작용 등 리그난의 다양한 생리학적 활성에 대하여 연구되었다. 예컨대, 깨로부터 분리된 리그난인 세사민(sesamin), 에피세사민(episesamin), 세사미놀(sesaminol), 세사몰린(sesamolin) 및 에피세사미놀(episesaminol)이 항염증효과가 있음이 보고된 바 있으며(대한민국 공개특허공보 제1997-7001043호), 신이(Magnoliae flos)로부터 분리된 리그난계 화합물은 항천식 효능제로 사용될 수 있음이 개시되었다(대한민국 등록특허 제0263439호). 또한, 메이스리그난(macelignan)은 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)에서 발견되는 대표적인 리그난계 화합물로서(Tuchinda P. et al., Phytochemistry, 59: 169-173, 2002), 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 카스파제(caspase)-3 증진작용(Park B.Y. et al., Biol. Pharm. Bull., 27(8): 1305-1307,2004), 항균활성 등이 보고되었다. 그러나, 상기 메이스리그난을 비롯하여 리그난 화합물의 뇌신경질환 치료제로서의 용도에 대해서는 지금까지 전혀 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 뇌신경질환의 치료제로서 사용될 수 있는 천연물 유래 화합물을 찾고자 장기간 탐색한 결과, 미리스티카 프라그란스 추출물로부터 분리·정제된 리그난계 화합물이 뇌신경질환의 치료/예방에 탁월한 효과를 가짐을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 미리스티카 프라그란스 추출물로부터 분리·정제된 리그난계 화합물의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

[일반식 Ⅰ]

또는

이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 미리스티카 프라그란스 추출물로부터 분리·정제된 리그난계 화합물의 신규한 용도를 제공하는 데 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 리그난계 화합물은 하기의 일반식 Ⅰ으로 표시된다.

[일반식 Ⅰ]

또는

이다.

본 발명의 바람직한 리그난계 화합물은 상기 일반식 Ⅰ에서, R₁이 메톡시 그룹, R₂ 가 히드록시 그룹, R₃가

인 하기의 화학식 Ⅰ의 메이스리그난[(8R, 8'S)-7-(3,4-methylenedioxyphenyl)-7'-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)- 8, 8'-dimethylbutane)]일 수 있다.

[화학식 Ⅰ]

본 발명에 따른 리그난계 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명의 리그난계 화합물은 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 식물 또는 식물의 일부로부터 수득될 수 있다. 줄기, 뿌리 또는 잎은 목적하는 추출물을 획득하기 위하여 적절히 탈수하여 침연(macerated)하거나 단지 탈수하고, 목적하는 추출물은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 정제된다. 또한 상기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 유도체는 일반적으로 구매 가능한 물질이거나, 공지의 합성 방법을 이용하여 화학적으로 제조될 수 있다.

상기 일반식 Ⅰ로 표시되는 본 발명의 리그난계 화합물은 미리스티카 프라그란스(Myristica fragnance Houtt.)로부터 분리·정제될 수 있다(Jung Yun Lee et al., Kor. J. Pharmacogn. 21(4):270-273, 1990). 바람직하게는 육두구(nutmeg)나 가종피(aril)로부터 분리·정제될 수 있다. 상기 육두구는 미리스티카 프라그란스의 성숙한 과실 또는 과실 속에 있는 종자를 말한다. 또한 본 발명의 리그난계 화합물은 육두구를 압착하여 얻은 오일로부터 분리·정제될 수 있다. 또한 다른 육두구과 식물인 미리스티카 아르겐티아 워르브(Myristica argentea Warb) 등에서도 분리 정제될 수 있다(Filleur, F. et al., Natural Product Letters, 16: 1-7, 2002). 또한 후박나무(Machilus thunbergii)(Park B.Y. et al., Biol. Pharm. Bull., 27(8): 1305-1307,2004), 레우카스 아스페라(Leucas aspera)에서도 분리·정제될 수 있다(Sadhu, S.K. et al., Chem. Pharm. Bull., 51(9): 595-598, 2003).

본 발명의 리그난계 화합물의 분리를 위한 추출 용매로는 물 또는 C1-C6의 유기용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 메탄올 또는 헥산을 사용할 수 있다. 미리스티카 프라그란스 추출물로부터 본 발명의 리그난계 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 본 발명의 리그난계 화합물은 순수하게 분리·정제된 화합물의 형태로 사용될 수 있으며, 또한 이를 함유하는 추출물의 형태로도 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 기재한 바와 같은 미리스티카 프라그란스의 종자, 과실 또는 가종피 추출물이나 미리스티카 프라그란스의 종자를 압착하여 얻은 오일의 형태로 사용될 수도 있다. 상기 추출물은 상기한 바와 같이 미리스티카 프라그란스를 물 또는 C1-C6의 유기용매로 추출하여 얻을 수 있다. 바람직하게는 미리스티카 프라그란스의 종자, 즉 육두구 추출물일 수 있다.

활성 산소종은 체내에서 산화적 독성을 유발하는 물질로서, 세포막의 구성성분인 지질의 과산화 현상을 일으켜서 세포막의 생체보호 및 신호전달 체계를 파괴하고, DNA의 산화 손상, 적혈구의 파괴와 함께 단백질 과산화현상으로 체내의 각종 효소들의 기능을 떨어뜨린다. 이를 통하여 활성 산소종이 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸증, 파킨슨병 등의 뇌질환과 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등의 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 활성 산소종은 특히 알츠하이머 질환의 주요 원인으로 제기되고 있다(Maccioni et al., Arch. Med. Res., 32:367-281, 2001). 따라서 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 리그난계 화합물이 활성 산소종의 생성을 억제하는지 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 리그난계 화합물이 글루타메이트에 의해 유발된 활성 산소종의 생성을 해마 유래 세포주인 HT22 세포 뿐 아니라 배양된 해마 뉴런에서도 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조).

지질 과산화는 산화적 스트레스에 따른 뇌의 손상을 나타내는 지표이다(Sewerynek et al., Neuroscience Letter, 195:203-205, 1995). 과산화수소는 물과 산소로 분해되는데, 이 과정에서 히드록실(hydroxyl) 자유 라디칼을 생성한다. 상기 자유 라디칼은 DNA 손상, 단백질 산화(protein carbonylation), 지질 과산화를 유발한다. 따라서 본 발명의 다른 실시예에서는 과산화수소에 의한 지질 과산화를 본 발명의 리그난계 화합물이 억제하는지 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 리그난계 화합물이 지질 과산화를 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다(도 9 참 조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 리그난계 화합물 자체가 세포 독성을 나타내는지 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 리그난계 화합물은 10 μM에서도 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다(도 10 참조).

뇌세포의 사멸의 다른 원인으로는 흥분성 신경 전달물질인 글루타메이트 및 이의 수용체를 통한 세포사멸이 있다(Olney, J. W., Int Rev. Neurobiol., 27:337-362, 1985). 따라서 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명의 리그난계 화합물이 글루타메이트에 의해 유도되는 뇌세포의 사멸을 억제하는지 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 리그난계 화합물이 글루타메이트에 의해 유도되는 뇌세포의 사멸을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다(도 11 참조).

또한 이부프로펜(Ibuprofen) 등의 항염증제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs)가 알츠하이머 질환의 진행을 지연시킨다는 역학적 증거가 보고된 바 있다(McGeer and McGeer, Exp. Gerontol., 33:371-378, 1998). 특히 알츠하이머 질환을 모사한 생쥐에서 이부프로펜을 투여한 결과 병의 진행이 늦춰짐이 확인되었다(Lim et al, J. Neurosci., 20:5709-5714, 2000). 그러므로 항산화활성뿐 아니라 항염증의 활성을 갖는 화합물이 뇌신경질환 치료/예방제로서의 높은 효능을 가진다. 따라서 본 발명의 다른 실시예에서는 LPS(lipopolysaccharide)를 뇌면역 세포 인 미세아교세포에 처리하여 본 발명의 리그난계 화합물의 항염증 활성을 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 리그난계 화합물이 LPS에 의해 유도된 다양한 면역매개 물질(IL-6, TNF-α, NO, iNOS 및 COX-2)의 발현 및 생성을 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다(도 12 내지 도 15 참조).

이와 같이 본 발명의 리그난계 화합물은 지질 과산화 및 활성 산소종의 생성을 억제하는 항산화 효과, 글루타메이트에 의한 뇌세포의 아톱토시스를 억제하는 뇌세포 보호 효과 및 항염증 효과가 매우 우수하다. 따라서 본 발명은 상기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 미리스티카 프라그란스 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 미리스티카 프라그란스 추출물의 제조는 위에서 기재한 바와 같다.

본 발명의 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 일반적인 의약품의 형태로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 연고제, 크림제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 일반식 Ⅰ의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명의 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물의 유효용량은 1회 복용량이 0.1-50 mg/kg이고, 바람직하기로는 1-10 mg/kg이며, 하루 1 - 3 회 투여될 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중 증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 리그난계 화합물을 래트에 경구 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50 % 치사량 (LD₅₀)은 2,000 mg/kg 이상인 것으로 나타났다(결과 미도시).

본 발명의 약학적 조성물이 적용될 수 있는 뇌신경질환은 지질 과산화, 활성 산소종 및/또는 자유 라디칼에 의한 산화적 스트레스; 글루타메이트에 의한 흥분성 독성; 및/또는 아폽토시스에 의해 유발되는 뇌세포의 사멸 또는 퇴화가 원인이 되는 질환을 말한다. 상기 뇌신경질환은 치매, 경도 인지장애, 파킨슨병, 헌팅턴병 등의 퇴행성 뇌신경질환, 뇌졸중 등의 허혈성 뇌신경질환 및 간질 등의 경련성 뇌신경질환을 포함한다. 구체적으로 상기 뇌신경질환은, 이에 제한되지는 않으나, 치매, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병, 크루츠펠트-제이야콥병, 픽병, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 파킨스-ALS-치매 복합증, 윌슨병, 진행성 핵상 신경마비(progressive supranuclear palsy), 경도 인지장애 및 간질일 수 있다. 상기에서 치매는 노인성 치매, 알츠하이머형 치매, 혈관성 치매, 알콜성 치매, 시상 치매(thalamic dementia)를 모두 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

미리스티카 프라그란스로부터 리그난계 화합물의 분리 및 정제

<1-1> 리그난계 화합물의 분리 및 정제

건조 분쇄한 육두구 100 g(건조중량)에 75 부피% 메탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 상기 용액을 와트만(Whatman) 여과지 제 2번을 이용하여 여과하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다. 메탄올 여과액을 진공농축하고 동결건조하여 육두구의 메탄올 조추출물(7 g)을 제조하였다. 메탄올 조추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 차례로 분획하여 에틸아세테이트 분획물(4.2 g)을 얻었다. 에틸아세테이트 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck Kieselgel 66; 70-230 mesh)를 이용하여 헥산과 에틸아세테이트를 10:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜, 분획물 Ⅲ(1.0 g)를 얻었다. 진공회전농축기로 용매를 완전히 제거하여 육두구의 조추출물을 제조하였다. 이후, 분획물 Ⅲ를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck Kieselgel 66; 70-230 mesh)를 이용하여 헥산과 에틸아세테이트를 20:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜, 분획물 Ⅲ-B(0.52 g)를 얻었다. 분획물 Ⅲ-B를 Rp-18 컬럼 크로마토그래피(Merck LiChroprep; 25-40 ㎛)를 이용하여 80% 메탄올로 용출시켜 단일물질 분획 Ⅲ-B-2(0.5 g)를 얻었다. 이와 같은 분리 공정도를 도 1에 나타내었다.

<1-2> 구조 분석

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 각각 600MHz 와 150MHz(용매: DMSO)에서 측정하였다. 그 결과를 도 2와 도 3에 각각 나타내었다. ¹³C-NMR 스펙트럼과 ¹H-NMR 스펙트럼의 결과를 토대로 ¹H-¹H의 상관관계와 ¹H-¹³C의 상관관계를 측정하기 위하여 ¹H-¹H COSY 스펙트럼과 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 4와 도 5에 각각 나타내었다. ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMBC의 결과를 종합적으로 분석하여 표 1에 나타내었다.

Position	¹³C-NMR	¹H-NMR	¹H-¹H COSY	¹H-¹³C HMBC
1	135.4
2	109.2	6.72 brs		C-7, C-6, C-4, C-3
3	147.3
4	145.1
5	107.9	6.79 d(7.8)	6.61	C-6, C-4, C-3, C-1
6	121.7	6.61 dd(7.8)	6.79	C-7, C-5, C-4, C-2, C-1
7	38.2	2.23 dd(13.2, 9.3) 2.66 dd(13.2, 4.8)	1.64, 2.66 1.64, 2.23	C-8, C-6, C-2, C-1 C-9, C-8, C-6, C-2, C-1
8	38.7	1.64 brs	0.75, 2.23, 2.66	C-7
9	16.0	0.75 d(6.3)	1.64	C-8, C-7
1'	132.4
2'	112.9	6.66 brs		C-7', C-6', C-4', C-3'
3'	147.1
4'	144.4
5'	115.2	6.66 d(7.9)	6.53	C-6', C-4', C-3', C-1'
6'	121.0	6.53 d(7.9, 1.1)	6.66	C-7', C-5', C-4', C-2', C-1'
7'	38.0	2.17 dd(13.2, 9.3) 2.66 dd(13.2, 4.8)	1.64, 2.66 1.64, 2.17	C-8', C-6', C-2', C-1' C-9', C-8', C-6', C-2', C-1'
8'	38.7	1.64 brs	0.75, 2.17, 2.66	C-7'
9'	16.1	0.75 d(6.3)	1.64	C-8', C-7'
OMe	55.5	3.72(s)
O-CH₂-O	100.6	5.95 d(4.8)		C-3, C-4

<1-3> 질량 분석

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2의 질량 분석을 위해 측정한 EI/MS의 결과를 도 6에 나타내었다. 본 화합물은 EI/MS에서 [M]⁺가 m/z 328에서 관측되어 분자량이 328로 판명되었고, 분자식은 C₂₀H₂₄O₄이었다.

<1-4> 비선광도 측정

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2 20 mg을 클로로포름(CHCl₃) 2 ㎖에 용해시킨 후, 자동 편광계(Automatic Polarimeter, APⅢ-589, Rodulph, NJ, USA)로 비선광도([α]_D) 값을 측정한 결과 [α]_D = +4.0 (CHCl₃, c=1.0)으로 나타났다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMBC, EI/MS 및 [α]_D에 대한 측정결과와 기존에 발표된 연구보고(Woo, W.S. et al., Phytochemistry, 26: 1542-1543, 1987)를 비교 분석하여 동정한 결과, 분리된 단일 물질은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 메이스리그난(macelignan)인 것으로 확인되었다.

[화학식 Ⅰ]

<실시예 2>

활성 산소종 생성 억제 효과

뇌의 기억을 담당하는 해마 유래 세포주인 HT-22(데이비드 슈베르트 박사(Dr. David Schubert)로부터 얻음)에 5 mM 글루타메이트(glutamate)와 본 발명의 리그난계 화합물(5 μM)을 8시간 동안 동시에 처리하였다. 대조군에는 본 발명의 리그난계 화합물을 처리하지 않았다. 이후, CM-H₂DCFDA(chloromethyl derivative of dichlorodihydrofluorescein diacetate, Molecular Probes)로 염색하여 활성 산소종의 생성 정도를 조사하였다. 그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 리그난계 화합물이 글루타메이트에 의해 유도된 활성 산소종의 생성을 억제하였다. 또한 본 발명의 리그난계 화합물은 글루타메이트를 처리하지 않는 대조군에서 세포 내 자연적인 활성 산소종의 생성도 유의적으로 억제하였다.

이후, 본 발명의 리그난계 화합물이 조직 배양한 해마 뉴론(neuron)에서도 동일한 항산화 효과를 나타내는지 확인하였다. 이를 위하여 임신 18일된 쥐에서 꺼낸 태아의 해마를 B-27 supplement와 2 mM L-글루타민이 첨가된 신경기초 배지(neurobasal media, Gibco BRL)에서 10일 동안 배양하였다. 조직 배양된 해마 뉴론에 1 mM BSO(buthionine sulfoxide)를 8시간 동안 처리하여 산화적 스트레스를 유발시켰다. 이 때 본 발명의 리그난계 화합물을 농도별(0.1, 0.5 및 1 μM)로 함께 처리하여 상기 화합물에 의한 활성산소 감소 효과를 조사하였다. 대조군에는 BSO를 처리하지 않았다. 이후, 10 μM DCFDA(Molecular probes)를 이용하여 당업계에 공지된 방법(Jung, Y. S., Biochem Biophys Res Commun., 320(3):789-94, 2004)에 따라 활성산소 양을 측정하였다. 그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 리그난계 화합물은 조직 배양한 해마 뉴런에서도 활성 산소종의 생성을 대조군과 유사한 수준으로 억제하였다.

<실시예 3>

지질 과산화 억제 효과

쥐를 마취한 후, EDTA 가 함유된 0.9% 식염수로 쥐 조직을 환류하였다. 이후, 뇌를 적출하여 아이스-콜드(ice-cold) 20 mM Tris-HCl(pH 7.4)로 세척하였다. 물기를 제거한 후, 뇌 무게를 측정하였다. 뇌에 아이스-콜드 20 mM Tris-HCl(pH 7.4)을 0.1 g/㎖의 용량으로 섞은 후 균질화하였다. 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 상층액 40 ㎕에 과산화수소 40 mM를 첨가하여 지질 과산화를 유발하였다. 동시에 상기 실시예 1에서 분리된 리그난계 화합물을 농도별(0.5, 1, 5 및 10 μM)로 각각 첨가하였다. 37℃의 물에서 30-60분 동안 배양한 후, 162.5 ㎕의 R1 용액(lipid peroxidation Assay Kit, Cat. No. 437634, Calbiochem)과 37.5 ㎕의 R2 용액(lipid peroxidation Assay Kit, Cat. No. 437634, Calbiochem)을 첨가하여 45℃에서 40분간 더욱 배양하였다. 이후, 배양액의 흡광도를 586 nm에서 측정하여 지질 과산화 정도를 수량화하였다.

그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이, 과산화수소에 의해 유발된 지질 과산화가 본 발명의 리그난계 화합물에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. 특히, 본 발명의 리그난계 화합물을 10 μM 투여한 경우에는 대조군(과산화수소에 의해 지질 과산화를 유발하지 않은 경우)과 거의 유사한 수준으로 지질 과산화를 억제하였다.

<실시예 4>

세포 독성 효과

본 발명의 메이스리그난 자체의 세포 독성 효과를 측정하기 위하여, 상기 메이스리그난을 해마 유래 세포주인 HT-22에 각 농도별(1, 5 및 10 μM)로 24시간 동안 처리하였다. 그 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, 본 발명의 메이스리그난은 10 μM에서도 세포 독성을 유발하지 않는 것으로 나타났다.

<실시예 5>

뇌세포의 아폽토시스 억제 효과

해마 유래 세포주인 HT-22에 5 mM 글루타메이트(glutamate)를 24시간 동안 처리하여 아폽토시스를 유발하였다. 대조군에는 글루타메이트를 처리하지 않았다. 이후, 본 발명의 리그난계 화합물을 농도별(1, 2, 5 및 10 μM)로 24시간 동안 처리하였다. WST-1(Roche)을 이용하여 세포사멸정도를 관찰하였다. 그 결과, 도 11에서 보는 바와 같이, 본 발명의 리그난계 화합물이 글루타메이트에 의해 유도된 뇌세포의 아폽토시스를 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다.

<실시예 6>

항염증 효과

<6-1> 전염증성 사이토카인의 억제 효과

미세아교세포는 중추신경계에서는 유일하게 중배엽에서 기원되는 세포로서, 뇌조직에 염증반응이 있을 경우에는 크게 늘어난다(Streit, W. J. Prog. Neurobiol., 57:563-581, 1999). 미세아교세포가 LPS 등에 의해 활성화되면 IL-1, IL-6 및 TNF-α와 같은 여러 가지 전염증성 사이토카인들을 합성 및 분비한다(Chen, S. Neurobiol. Aging, 17:781-787, 1996). 따라서 본 발명의 리그난계 화합물의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 리그난계 화합물이 활성화된 미세아교세포에서 IL-6 및 TNF-α의 생성에 미치는 효과를 조사하였다.

먼저, 생후 1일된 쥐의 뇌로부터 신피질만을 분리하였다. 이후, 미세아교세포-별아교세포 혼합체를 당업계에 공지된 방법(Kim, H. Y. et al., J. Immunol., 171:6072-6079, 2003)에 따라 제조하였다. 상기 미세아교세포-별아교세포 혼합체를 10% FBS가 포함된 MEM 배지에서 1 head 당 4 플라스크(flask) 비율로 나누어 75 cm² 플라스크에서 2주 동안 배양하였다. 배양된 세포 중에서 미세아교세포만 떼어내어 5% FBS가 포함된 MEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 미세아교세포를 무혈청 배지로 2회 세척한 후, LPS(1 ㎍/㎖)과 본 발명의 리그난계 화합물 (2.5 및 10 μM)을 24시간 동안 함께 처리하였다. 이후, 세포배양액으로 분비된 IL-6 및 TNF-α의 양을 고체상 ELISA 시스템(solid-phase ELISA system, RPN2742 for IL-6, RPN2744 for TNF-α, Amersham Bioscience)을 이용하여 측정하였다. 이를 위해, 먼저 쥐 IL-6 및 TNF-α 특이적 항체로 코팅되어 있는 96-웰 플레이트에 미세아교세포의 배양 상등액 및 각 물질의 standard(순수 분리 및 정량된 IL-6 또는 TNF-a)를 50 ㎕씩 첨가하였다. 상온에서 2시간 반응시킨 후 각 웰을 세척 버퍼(Amersham Bioscience)로 3회 세척하였다. 바이오틴이 처리된 IL-6 또는 TNF-α 특이적 항체를 100 μM씩 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 웰을 다시 세척 버퍼로 3회 세척한 후, HRP가 결합된 스트렙타피딘 용액(Amersham Bioscience) 100 ㎕씩 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 각 웰을 세척 버퍼로 3회 세척한 후, TMB-기질 용액(Amersham Bioscience) 100 ㎕씩 첨가하여 암 조건의 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, 정지 용액(Amersham Bioscience)을 100 ㎕ 첨가하여 반응을 종료시킨 후, 마이크로리더 (microreader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 12 및 도 13에서 보는 바와 같이, LPS에 의해 유도된 전염증성 사이토카인 (IL-6 및 TNF-α)의 생성이 본 발명의 리그난계 화합물에 의해 농도 의존적으로 억제되었다. 특히, TNF-α 생성에 대한 억제 효과가 보다 큰 것으로 나타났다.

<6-2> LPS에 의해 활성화된 미세아교세포에서 NO 생성 억제 효과

미세아교세포가 활성화되면 신경전달 및 면역반응을 초래하는 매개자인 NO의 발현이 유도된다(Liu, B. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 962:318-331, 2002). 따라서, 미세아세포에서 NO의 생성에 대한 본 발명의 리그난계 화합물의 효과를 알아보았다.

먼저, 생후 1일된 쥐의 뇌로부터 신피질만을 분리하였다. 이후, 미세아교세포-별아교세포 혼합체를 당업계에 공지된 방법(Kim, H. Y. et al., J. Immunol., 171:6072-6079, 2003)에 따라 제조하였다. 상기 미세아교세포-별아교세포 혼합체를 10% FBS가 포함된 MEM 배지에서 1 head 당 4 플라스크(flask) 비율로 나누어 75 cm² 플라스크에서 2주 동안 배양하였다. 배양된 세포 중에서 미세아교세포만 떼어내어 5% FBS가 포함된 MEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 이와 같이 조직 배양된 미세아교세포를 5% FBS 함유 MEM 배지에 1.5 ×10⁴ cells/well의 농도로 접종하여 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 1일 후 LPS(1 ㎍/㎖, Sigma)를 처리하여 미세아교세포의 활성화를 유도하였다. 이 때 본 발명의 리그난계 화합물(2.5 및 10 μM)을 LPS와 함께 처리한 후, 16시간 또는 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 세포 배양액을 취하여 NO 생성량을 측정하였다. NO 생성량은 그리에스 시약 키트(Griess reagent kit, Molecular Probe)를 사용하여 세포 배양액 내에서 NO의 안정한 대사산물인 아질산염(nitrite) 양을 측정함으로써 확인하였다. 측정 방법은 다음과 같다: 세포 배양액을 150 ㎕씩 취하여 그리에스 시약 20 ㎕ 및 물 130 ㎕과 혼합한 후, 마이크로플레이트에서 30분 동안 상온 반응시켰다. 이후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 548 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이, 조직 배양된 미세아교세포에서 LPS에 의해 유도된 NO의 생성이 본 발명의 리그난계 화합물에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명의 리그난계 화합물을 10 μM으로 처리한 경우에는 약 90% 정도의 저해율을 보였다.

<6-3> iNOS 및 COX-2의 발현 억제 효과

상기 실시예 <6-2>를 통하여 조직 배양된 쥐의 미세아교세포에서 LPS에 의해 유도된 NO의 생성이 본 발명의 리그난계 화합물에 의하여 억제됨을 확인하였다. NO는 미세아교세포가 활성화되면 발현이 유도되는 iNOS 효소에 의해 생성되므로 NO 생성의 감소가 iNOS 발현 억제와 연관성이 있는지를 조사하였다. 또한 다른 염증 매개물질의 생성에 관여하는 COX-2 단백질의 변화량도 함께 관찰하였다.

웨스턴 블럿 분석을 위해, 조직 배양된 미세아교세포를 60 mm 세포배양 디쉬에서 7.5 ×10⁵ cell의 농도로 배양하였다. 1일 후 LPS(1 ㎍/㎖, Sigma)를 처리하여 미세아교세포의 활성화를 유도하였다. 이 때 본 발명의 리그난계 화합물(2.5 및 10 μM)을 LPS와 함께 처리한 후, 16시간 또는 24시간 동안 반응시켰다. 배양된 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후, 차가운 용해 버퍼(1% SDS, 1 mM Na₃VO₄, 10 mM NaF, 10 mM Tris-Cl, pH 7.4 containing 1 X protease inhibitors cocktail)를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물(lysate)를 4℃, 12,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 취하였다. 이후, BCA 방법으로 단백질 양을 정량하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 분리한 후, PVDF 막에 옮겼다. 각 막을 3% BSA 용액으로 블록킹한 후, TBS-T 용액(10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl containing 0.1% Tween 20)으로 3회 세척하였다. 이후, 상기 막에 iNOS(rabbit polyclonal Ab, Upstate, 06-573) 및 COX-2(rabbit polyclonal Ab, Santa Cruz Biotechnology, sc-7951)에 특이적인 1차 항체를 각각 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 막을 TBS-T 용액으로 3회 세척한 후, HRP가 결합된 특이적 2차 항체를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 상기 막을 TBS-T 용액으로 3회 세척한 후, ECL 시스템(Sigma)을 이용하여 각 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 15에서 보는 바와 같이, 조직 배양된 미세아교세포에서 LPS에 의해 유도된 iNOS 및 COX-2의 발현이 본 발명의 리그난계 화합물에 의해 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.

<실시예 7>

뇌로의 이행 실험

본 발명의 리그난계 화합물이 뇌로 용이하게 이행되는지 조사하였다.

<7-1> 본 발명의 메이스리그난의 처리 및 샘플 수득

250 g의 수컷 SD 래트의 대퇴정맥(femoral vein)과 대퇴동맥(femoral artery)에 각각 PE50 튜브를 삽입하고, 각각에 생리식염수와 헤파린(25 I.U.)을 함유하는 실린지를 연결하였다. 상기 실시예 1에서 분리·정제된 메이스리그난을 DMSO에 용해시킨 후, 상기 래트에 1 mg/kg의 양으로 정맥투여 하였다. 투여 후 시간별(30초, 1분, 1분 30초 및 2분)로 각각 동맥에서 혈액 400 ㎕를 각각 취하였다. 마지막 샘플링을 마친 후, 래트를 즉시 단두하고, 뇌조직을 꺼내어 생리식염수로 가볍게 세척하였다.

<7-2> 샘플 처리

a. 혈액 샘플 처리

상기 실시예 <7-1>에서 준비된 혈액 샘플을 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 혈장 100 ㎕를 취했다. 상기 혈장에 500 ㎕의 에틸 아세테이트를 첨가하고 10분간 볼텍싱하였다. 이후, 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액 400 ㎕를 취했다. 상기 상등액을 질소 스팀(nitrogen stream)에서 증발건조 시킨 후, 이동상 100 ㎕로 재조성하였다.

b. 뇌조직 샘플 처리

상기 실시예 <7-1>에서 준비된 뇌조직 샘플의 무게를 측정한 후, 뇌조직 무게의 2배에 해당하는 양의 살린(saline)을 첨가하고 균질화 하였다. 이것을 5분간 볼텍싱한 후, 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리로 얻은 상등액 1 ㎖에 에틸 아세테이트 5 ㎖를 첨가하고 10분간 볼텍싱하였다. 이후, 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 취하였다. 상기 상등액 4 ㎖를 질소 스팀(nitrogen stream)에서 증발건조 시킨 후, 이동상 100 ㎕로 재조성하였다.

<7-3> 표준 검정

상기 실시예 1에서 분리한 메이스리그난을 메탄올에 용해시킨 1 ㎎/㎖의 스톡 용액(stock solution)을 단계적으로 희석(serial dilution) 하였다. 래트의 블랭크(blank) 혈장 90 ㎕ 또는 블랭크 뇌 균질액(homogenate) 90 ㎕에 상기 메이스리그난 용액 10 ㎕를 첨가하여 목적하는 농도의 혈장 샘플과 뇌조직 샘플을 제조하였다. 이후, 상기 실시예 <7-2>와 동일한 방법으로 각 샘플을 처리하였다. 이동상 100 ㎕로 재조성한 샘플 중 10 ㎕를 LC/MS 시스템(Agilent 1100 Series, Agilent Technologies, Santa Clara, USA)에 주입하였다. LC/MS 분석은 3.0 mm× 150 mm C18 루나 컬럼(Luna column; Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 이용하여 아세토니트릴(acetonitrile) : 메탄올(methanol) : 3차 증류수(DDW) = 40 : 40 : 20 의 이동상 조건으로 수행하였다.

그 결과, 도 16에서 보는 바와 같이, 메이스리그난은 ESI negative의 SIM [327.0-328.0]에서 검출되었으며, 유지시간(retention time)은 8.36분이었다. 상기 크로마토그램에서 메이스리그난 피크의 면적을 구하여 메이스리그난 농도와 면적 사이에 성립하는 1차식의 표준곡선(standard curve)을 작성하였다.

<7-4> 샘플의 분석

상기 실시예 <7-2>에서 샘플 처리를 마친 혈액 샘플과 뇌조직 샘플을 LC/MS 시스템에 주입한 후, 상기 실시예 <7-3>과 동일한 방법으로 LC/MS 분석을 수행하여 크로마토그래프 상에서 메이스리그난 피크의 면적을 구했다. 상기 면적을 상기 실시예 <7-3>에서 작성된 표준곡선을 이용하여 농도를 구하였다.

<7-5> 메이스리그난의 뇌로의 이행 계산

상기 실시예 <7-4>를 통해 혈액 샘플에서 구한 메이스리그난의 시간-농도의 그래프에서 마지막 샘플링 시간인 tlast까지의 AUC0t(Area Under Curve; AUC)를 사다리꼴 방법(trapezoidal method)(Schaum's Outline of Mathematica, MaGraw-Hill, 2000)으로 구하였다. 또한 뇌조직 샘플의 농도를 이용하여 메이스리그난의 양(Xb)을 계산하였다. 메이스리그난의 AUC는 하기 수학식 1로 구할 수 있다.

상기 수학식 1에서 C는 메이스리그난의 농도, Δt는 시간의 변화를 나타낸다.

이 때 뇌로 이행하는 메이스리그난의 클리어런스(brain uptake clearance; CL _uptake ) 값은 하기 수학식 2로 구할 수 있다.

상기 수학식 2는 다음과 같은 과정으로 유도된다.

뇌중 메이스리그난의 양의 변화는 하기 수학식 3과 같이 나타낼 수 있다.

상기에서 CL _uptake 는 뇌로 이행하는 메이스리그난의 클리어런스(brain uptake clearance) 값, CL _efflux 는 혈액으로 이행하는 메이스리그난의 클리어런스 값, C _p 는 혈액에서의 메이스리그난의 농도, C _b 는 뇌조직에서의 메이스리그난의 농도이다.

상기 수학식 3에서, 투여 직후에는 C _b 가 0에 가깝다고 가정하면, 하기 수학식 4로 나타낼 수 있다.

양변을 t=0에서 t=t까지 적분하면, 하기 수학식 5로 나타낼 수 있다.

이를 계산하면, 하기 수학식 6과 같다.

따라서, 뇌로 이행하는 메이스리그난의 클리어런스는 상기 수학식 2와 같이 나타낼 수 있다.

상기 수학식 2를 이용하여 본 발명의 메이스리그난의 뇌로 이행하는 메이스리그난의 클리어런스를 계산한 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이, 0.203±0.039 mL/min으로서 본 발명의 메이스리그난의 뇌로의 이행이 비교적 양호하게 나타났다.

본 발명의 메이스리그난의 뇌로 이행하는 클리어런스

	본 발명의 메이스리그난
Xb (㎍)	7.90± 1.52
AUC (㎍/mL/min)	38.89± 3.62
CLuptake (mL/min)	0.203± 0.039

<제조예 1>

본 발명에 따른 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 함유하는 약제의 제조

<1-1> 정제의 제조

본 발명의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물 25 ㎎을 부형제 직타용 락토오스 26 ㎎과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 3.5 ㎎, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 1.5 ㎎, 그리고 결합제인 직타용 L-HPC(low-hydrosyprophylcellulose) 8 ㎎과 함께 U형 혼합기에 넣고 20분간 혼합하였다. 혼합이 완료된 후 활탁제로서 마그네슘 스테아레이트 1 ㎎을 추가로 첨가하고 3분간 혼합하였다. 정량 시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여 정제를 제조하였다.

<1-2> 시럽제의 제조

본 발명의 메이스리그난 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분 2%(W/V)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 메이스리그난의 산부가염 2g, 사카린 0.8g 및 당 25.4g을 온수 80g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린 8.0g, 향미료 0.04g, 에탄올 4.0g, 소르브산 0.4g 및 적량의 증류수를 혼합하였다. 상기 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되도록 하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물 50㎎, 유당 50㎎, 전분 46.5㎎, 탈크 1㎎ 및 적량의 스테아린산 마그네슘을 혼합하고 이를 경질 젤라틴 캡슐에 충진함으로써 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 주사액제의 제조

유효성분 10㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 메이스리그난의 염산염 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<적용예 1>

파킨슨병

파킨슨병은 노년층에 다발하는 중추신경계 퇴행성 뇌질환으로, 사지진전, 근육강직, 운동개시 곤란 등의 증세가 나타나고 정신적은 우울증을 동반한다. 파킨슨병의 원인은 중뇌 흑색질 도파민성 신경세포의 사멸이 직접적인 원인으로 알려져 있다(Fahn S., Parkinsons disease in: Diseases of the nervous system, (ED) by A. Asbury, G. Mckhann, pp.1217-1238, Saunders, 1986). 파킨슨병에 동반되는 신경세포의 사멸에 대한 원인으로서 산화 스트레스, 에너지 대사 이상, 미토콘드리아 유전자의 돌연변이, 흥분성 아미노산 독성 등이 보고되었으나, 산화적 스트레스가 가장 주요한 원인이라는 보고가 많다(Fahn S. and Cohen, G., Ann. neurol. 32(6):804-812, 1992; Foley P. and Riederer P., J. Neurol., 247 [Sppl.2] Ⅱ/82-Ⅱ/94, 2000). 따라서 산화적 스트레스에 대하여 뇌세포를 보호하고 아폽토시스에 의한 뇌세포의 사멸을 억제하는 활성을 가지는 본 발명의 약학적 조성물은 파킨슨병을 치료 또는 예방하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

<적용예 2>

알츠하이머성 치매

알츠하이머 질환은 심각한 기억장애와 정신질환을 동반하는 퇴행성 신경질환으로서, 발병율은 10-15%/년 정도이다. 알츠하이머 환자들의 부검 소견을 보면, 노인성 반(Senile Plaque)과 신경섬유의 다발성 병변(Neurofibrillary tangle)을 보인다. 산화적 손상은 노인성 반 유발에 관여하고, 노인성 반 자체는 염증반응을 일으킨다. 이부프로펜과 같은 항염증제가 알츠하이머 질환의 진행을 지연시킨다는 역학적 증거가 보고되었다(McGeer and McGeer, Exp. Gerontol., 33:371-378, 1998). 알츠하이머 질환을 모사한 생쥐에서 이부프로펜의 처리는 병의 진행을 지연시켰다(Lim et al, J. Neurosci., 20:5709-5714, 2000). 따라서 산화적 스트레스에 대하여 뇌세포를 보호하고 항염증 작용을 하는 본 발명의 약학적 조성물은 알츠하이머성 치매를 치료 또는 예방하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

<적용예 3>

뇌졸증

뇌졸중은 뇌에 혈액을 공급하고 있는 혈관이 막히거나 터짐으로써 그 부분의 뇌가 손상되어 나타나는 신경학적 증상을 말한다. 뇌는 수많은 기능을 수행하고 있는데 손상을 당한 부분의 뇌는 그 기능을 못함으로써 운동장애와 기억장애의 증상을 보인다. 뇌졸중은 주로 노년층에서 발생하지만 20대 또는 30대에서도 발생할 수도 있으며, 과거 10년 동안 뇌졸중 발생률은 줄어들지 않고 있다. 뇌졸중의 발병 원인으로는 과분비된 글루타메이트가 NMDA(N-methyl-D-aspartate) 수용체를 과흥분시킴으로써 세포 사멸을 유도하기 때문인 것으로 알려졌다. 미교아세포의 활성은 NMDA 독성에 기여한다(Tikka and Koistinaho, J immunol., 166(12):7527-33, 2001). 또한 산화적 스트레스도 뇌졸중의 한 원인이다. 따라서 산화적 스트레스에 대하여 뇌세포를 보호하고 항염증 작용을 하는 본 발명의 약학적 조성물은 뇌졸증을 치료 또는 예방하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

<적용예 4>

경도 인지장애

상당수의 노인들은 다소의 기억장애를 보일 뿐 정상적인 일상생활에 심각한 어려움은 없다. 이러한 단계를 경도 인지장애(mild cognitive impairment:MCI)라 하는데, 경도 인지장애로 진단받은 노인이 수년 후에 알츠하이머 질환과 같은 퇴행성 신경질환으로 진행될 확률은 높다(10-15%/년). 이와 같이 경도 인지장애는 정상적 노화와 초기 알츠하이머 질환 사이의 전환단계(transitional stage)이고, 퇴행성 신경질환의 전구 증상(predromal)이다. 경도 인지장애 환자들의 부검 소견을 보면, 알츠하미머 질환의 병리 소견인 노인성 반과 신경섬유의 다발성 병변을 보인다. 산화적 손상은 노인성 반 유발에 관여하고, 노인성 반 자체는 염증반응을 일으킨다. 따라서 산화적 스트레스에 대하여 뇌세포를 보호하고 항염증 작용을 하는 본 발명의 약학적 조성물은 경도 인지장애를 치료 또는 예방하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 리그난계 화합물은 뇌세포의 사멸을 유발하는 다양한 매개인자 및 이의 활성을 억제하는 효과가 있다. 특히, 지질 과산화 및 활성 산소종의 생성을 억제하는 항산화 효과, 뇌세포의 아톱토시스를 억제하는 뇌세포 보호 효과 및 항염증 효과가 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 뇌신경질환의 치료 또는 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 치매, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병, 크루츠펠트-제이야콥병, 픽병, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 파킨스-ALS-치매 복합증, 윌슨병, 진행성 핵상 신경마비(progressive supranuclear palsy), 경도 인지장애 및 간질로 이루어진 그룹에서 선택되는 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.

[일반식 Ⅰ]

상기에서, R₁및R₂는C_1-5의 알콕시 또는 히드록시 그룹이고, R₃는
또는
이다.
제1항에 있어서, 상기 리그난계 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 메이스 리그난인 것을 특징으로 하는 조성물.

[화학식 Ⅰ]
미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)를 물 또는 C1-C6의 유기용매로 추출한 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병, 크루츠펠트-제이야콥병, 픽병, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 파킨스-ALS-치매 복합증, 윌슨병, 진행성 핵상 신경마비(progressive supranuclear palsy), 경도 인지장애 및 간질로 이루어진 그룹에서 선택되는 뇌신경질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
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