KR101250179B1 - 인도산 멀구슬나무 엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인도산 멀구슬나무 (Azadirachta indica A. Juss)의 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 추출물이 LPS-유도 RAW 264.7 세포에서의 생존율시험, tumor necrosis factor-α(TNF-α), NO 생성 및 iNOS 단백질 발현에 미치는 효과뿐만 아니라 C57BL/6 마우스를 이용한 패혈증 동물 모델 실험을 통하여 강력한 억제 효과를 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물은 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품의 제공으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

인도산 멀구슬나무 엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the leaf extract of Azadirachta indica A. Juss as an active ingredient for preventing and treating sepsis or endotoxemia}

본 발명은 인도산 멀구슬나무(Azadirachta indica A. Juss)의 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

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패혈증(Sepsis)은 그 병원학적 기전 및 병의 진행 등에 대한 수많은 연구가 있었음에도 치명적으로 심각한 질환으로 알려져 있다.

패혈성 쇼크(septic shock) 환자들은 발열, 혈압저하, 심근 억제, 탈수, 급성 신부전증 및 호흡정지 등의 증상을 동반한다 (Tracey and Cerami 1994). 패혈증으로 수반되는 높은 이환율 및 치사율은 대식세포 및 단핵세포로부터 전염증성 시토킨(cytokines)인자 분비를 자극하는 박테리아성 내독소에 의하여 부분적으로 기인하다 (Ayala et al. 2000). 그램-음성 박테리아 외막의 리포폴리사카리드(Lipopolysaccharide; LPS)은 대식세포를 활성화시키고 내독성 쇼크(endotoxic shock) 도중에 상당한 양의 전염증성 시토킨 및 일산화질소(NO) 자유 라디칼 (free radical)의 일련의 분비를 촉진시킨다. 추가적으로, 혈중 박테리아성 LPS는 TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β), NO(nitric oxide) 및 PGE₂ (prostaglandin E₂) 등과 같은 다양한 염증성 매개체들의 과발현을 유도한다. 미생물성 센서키나제(microbial sensor kinase QseC) 저해제, LPS 중화제(neutralizing agents), Toll-like receptor (TLR) antagonists 및 IκB kinase complex 저해제 등과 같은 다수의 화합물들은 미생물-개시 염증 신호전달 과정( microbe-initiated inflammatory signaling)을 차단하는 기전으로 패혈증 치료 연구에 사용되어 왔다 (Mora et al. 2005, Ii et al. 2006, Nguyen et al. 2007, Sil et al. 2007, Kim et al. 2008, Rasko et al. 2008). 그러나, 이러한 화합물들의 임상적 유효성에 대하여는 아직 확립되지 않았으며 (Hu et al. 2011) 게다가, TLR4 길항제 중 하나인 TAK-242는 임상실험에서 효과가 없는 것으로 입증되었으며 (Hu et al. 2011), 현재까지 미국식품의약펑(FDA)로부터 유일하게 증증 패혈증의 임상적 치료제로서 승인받은 약물은 재조합 인간 활성화 단백질 C (recombinant human activated protein C; Xigris; Eli Lilly)이다 (Bernard et al. 2001). 그러나, 이 화합물은 경증 패혈증 환자들에게는 효과가 없는 것으로 밝혀졌다 (Toussaint and Gerlach 2009). 따라서, 패혈증에 대한 효과적인 약물 개발이 아직 요구되고 있다.

오래전부터, 인도산 멀구슬나무 (Azadirachta indica A.Juss; 일명 neem)은 Meliaceae에 속하는 인도 및 주변국에서 자생하는 나무로서 식품, 의약품 및 살충제로서 사용되어 왔으며, 그 성분으로는 limonoids, Azadirachtin, salannin, meliantriol 및 nimbin 등의 트리테르펜(triterpenes) 성분이 알려진 바 있다. 그러나, 상기 인도산 멀구슬나무 엽(neem leaf) 추출물의 패혈증 또는 내독소혈증 치료제로서의 유용성에 대해서는 상기 문헌의 어디에도 개시되거나 교시된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 세포생존율시험, tumor necrosis factor-α(TNF-α), NO 생성 및 iNOS 단백질 발현에 미치는 효과뿐만 아니라 C57BL/6 마우스를 이용한 패혈증 동물 모델 실험을 통하여 상기 인도산 멀구슬나무 엽(neem leaf) 추출물의 억제 효과를 확인함으로써 패혈증 또는 내독소혈증에 대한 억제 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인도산 멀구슬나무 엽 (neem leaf) 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 인도산 멀구슬나무 엽 (neem leaf) 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 바람직하게는 물, 메탄올 또는 물 및 메탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 추출물의 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 사용이 가능하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 구슬나무 엽 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 구슬나무 엽를 세척 후, 음건하여 추출 1시간 내지 30시간, 바람직하게는 5시간 내지 25시간 전에 건조된 시료 건조중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 등과 같은 C₁내지 C₄의 저급알코올의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 물, 메탄올 또는 물 및 메탄올 혼합용매로, 약 0 내지 200℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 80℃에서 30분 내지 10시간, 바람직하게는 1시간 내지 5시간 동안 냉침 추출법, 열수 추출, 환류 순환 추출 또는 압력추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출법을 수행하여 감압여과, 농축 및 동결 건조하여 꽈리추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 인도산 멀구슬나무 엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본원 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 인도산 멀구슬나무 엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 선복화 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.

상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 인도산 멀구슬나무 엽 추출물은 RAW 264.7 세포에 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드 (LPS)를 처리한 후 세포생존율시험, tumor necrosis factor-α(TNF-α), NO 생성 및 iNOS 단백질 발현에 미치는 효과뿐만 아니라 C57BL/6 마우스를 이용한 패혈증 동물 모델 실험을 통하여 강력한 억제활성을 나타내어 패혈증 또는 내독소혈증의 치료 및 예방의 유용한 약학조성물 또는 건강기능식품으로서 사용할 수 있다.

도 1은 NLE 시료의 RAW 264.7 세포에서의 LPS-유도 NO 및 TNF-α 생성 감소효과를 나타낸 도이며 (NO (A) 및 TNF-α (B) 생성은 세포를 LPS 및 다양한 농도의 NLE로 처치하여 측정하고 모든 NO 및 TNF-α 생성은 세포에서 어떠한 세포독성없이 NLE 투여에 의하여 유의적으로 감소함 (C); **, p<0.01;***, p<0.001);
도 2는 NLE 시료의 LPS-자극 RAW 264.7 세포에서의 iNOS 발현에 대한 억제효과를 나타낸 도이며 (iNOS 발현 수준을 세포를 다양한 농도의 LPS 및 NLE로 처치한 세포를 이용한 웨스턴 블롯법으로 측정하고 웨스턴 블롯법 및 상응하는 밀도분석법상에서 NLE 투여에 의하여 iNOS 발현이 저해됨);
도 3은 NLE 시료의 LPS-처치 마우스의 생존율에 미치는 효과를 나타낸 도이며 (각각 5마리로 구성된 개개 마우스의 생존율은 측정하였고, 대조군은 실험기간동안 모두 생존하였으며, LPS-처치군은 20% 생존율을 나타냈고 NLE 처치군은 80%의 생존율을 나타냄, p<0.05);
도 4는 LPS-유도 패혈증 쇼크 마우스에서의 혈장 TNF-α (A) 및 NO (B) 수준에 대한 감소효과를 나타낸 도이며 (혈장 TNF-α (A) 및 NO (B) 수준을 LPS 및 NLE를 처치한 후에 측정하였으며, 결과는 5 내지 6마리 동물의 수치로부터 측정된 mean ± SEM로 표시하였으며 혈장 중 모든 NO 및 TNF-α 수준은 NLE 투여에 의하여 유의적으로 감소함,*, p<0.05);
도 5는 NLE의 HPLC 크로마트그램 분석결과이다 (NLE (A), 대조용 표준품 (B) 및 시료 및 대조품 혼합물 (C)을 HPLC로 분석하고 청색피크는 NLE 스펙트럼을 나타냄 (C)).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인도산 멀구슬나무 잎 추출물의 제조

실온에서 건조한 인도산 멀구슬나무 (Azadirachta indica A. Juss)(식물추출물 은행, 대전) 잎을 분쇄한 70 g을 메탄올 1.5 L에 담가 45℃에서 약 3일 동안 sonicator를 이용하여 추출하였다. 이를 무형광 솜으로 여과하고 여과물을 튜브식 건조기 (Biotron coporation, Modul spin 40)에서 24시간 동안 동결 건조한 후에 본 발명의 인도산 멀구슬나무 추출물 (이하 “NLE”라 명명 함) 7.98 g (수율 11.4%)을 수득하였으며, 이를 냉동고에 보관하며 하기 실험예의 시료로 실험 직전에 DMSO에 녹여 사용하였다.

참고예 1. 실험 준비

세포 배양

쥐 대식세포 주 (Mouse macrophage cell line)인 RAW 264.7 (ATCC)을 10% (w/v) fetal bovine serum (FBS)과 penicillin 100U/ml와 streptomycin 100 μg/ml의 항생제를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 실험실에서 37℃, 95% 공기 및 5% CO₂ 공급조건을 갖춘 동물 세포 배양기에서 배양하였다.

세포 배양에 사용된 모든 배지 및 시료는 GIBCO (Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다.

통계 분석

모든 실험은 3회 이상 반복 실험하였으며, 시험 군은 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 간주되는 시험법 (Student’s t-test) 및 데이터 (p<0.05)로 수행하였다.

실험예 1. 세포생존율 시험(Cell viability assay)

상기 실시예에서 수득한 시료의 세포생존율을 확인하기 위하여 키트 (CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI, USA) 를 이용하여 제조사 매뉴얼에 따라 하기와 같이 실험을 실시하였다.

상기 참고예를 통해 배양된 RAW 264.7 세포를 24시간 동안 안정화 시켰다. 24시간 후 배지를 제거하고 LPS를 함유한 새로운 배지 (100 ng/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로 갈아 주었다. 세포를 30분간 배양한 후에 세포들에 다양한 농도의 NLE (200 μg/ml)을 첨가하고 20 μl methanethiosulfonate/phenazine methosulfate solution (MTS)을 개개 웰에 첨가하였다. 세포를 1.5시간 동안 37℃에서 배양하고 배양 종료 후, 판독기 (Tecan Infinite F200 microplate reader, Tecan, M, Switzerland)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험 결과, NLE 시료의 세포독성이 25, 100 및 200 μg/ml에서 시험하였으나, 100 μg/ml 농도까지 독성이 나타나지 않아, 상기 농도를 하기 시험관내 시험의 최대 농도로 사용하였다 (도 1C).

실험예 2. 리포폴리싸카라이드(LPS)를 이용한 염증반응에서의 염증발현 유전자에 대한 효과

상기 실시예에서 얻은 시료의 리포폴리싸카라이드 (LPS)를 이용한 염증유발 사이토카인인 NO 및 TNF-α 생성 및 iNOS 단백질 발현에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

2-1. NO 농도 측정

상기 실시예에서 얻은 시료의 리포폴리싸카라이드 (LPS)를 이용한 염증유발 사이토카인인 NO 생성에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 (Chang, 2007; Phenolic-rich fraction from Rhus verniciflua Stokes (RVS) suppress inflammatory response via NF-B and JNK pathway in lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 macrophages, J Ethnopharmacol, 110 :490-497).

상기 참고 예를 통해 배양된 RAW 264.7세포를 well당 1 × 10⁵ 농도로 준비하여 24시간 동안 96 웰-플레이트에서 100 ng/ml LPS와 배양하고 다양한 농도의 NLE 시료 (0, 25, 100 또는 200 μg/ml)로 처치하였다. NO의 산화 산물인 니트레이트 이온 (NO₂ ^-) 농도를 키트 (iNtRON Biotechnology, Inc. Seoul,Korea)을 이용하여 측정하였다. 배양 상등액 (50 μl)을 동일 용량의 그리스 시약 (Griess reagent: 5%(w/v) phosphoric acid 중 1%(w/v) sulfanilamide 및 0.1%(w/v) N-[1-naphthyl] ethylene diamine dihydrochloride]과 10분간 혼합하였고 540 nm에서 측정하였다.

2-2. TNF -α 유전자 발현억제효과

상기 실시예에서 얻은 시료의 리포폴리싸카라이드 (LPS)를 이용한 염증유발 사이토카인인 TNF-α 생성에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 (Yang, 2010; Inhibitory effect of Jeju endemic seaweeds on the production of pro-inflammatory mediators in mouse macrophage cell line RAW 264.7, J Zhejiang Univ Sci B, 11(5):315-322).

상기 참고예를 통해 배양된 RAW 264.7세포를 well당 1×10⁵ 농도로 준비하여 24시간동안 96 웰-플레이트에서 100 ng/ml LPS와 배양하고 다양한 농도의 NLE 시료 (0, 25, 100 또는 200 μg/ml)로 처치하였다. 세포 배양물을 회수하고 TNF-α 농도를 ELISA 키트 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 제조사 지침에 따라 측정하였다.

상기 실험 결과, LPS-유도 NO 및 TNF-α 생성이 NLE 처치에 의하여 유의적으로 감소되었으며. 도 1A에 나타난 바와 같이, NO은 대조군 수준 (4.76 ± 1.2 μM)에 비하여 100 ng/ml LPS 처치 (58.44 ± 2.8 μM)로 유도되었다. 세포를 NLE로 처치시에, LPS-유도 NO 생성이 농도의존적으로 감소하였다. 25 및 50 mg/ml NLE 처치는 LPS-유도 NO 생성을 각각 45% 및 72% 정도 억제하였으며, 놀랍게도, 100 mg/ml NLE 처치는 LPS-유도 NO 생성을 96% 억제하는 효과를 나타냈다.

또한 TNF-α 도 대조군 수준 (1.24 ± 0.5 ng/ml)에 비하여 100 ng/ml LPS 처치 (6.35 ± 0.1 ng/ml)로 유도되었다. 세포를 NLE로 처치시에, LPS-유도 NO 생성이 농도의존적으로 감소하였다. 25, 50 및 100 mg/ml 3개 용량의 NLE 처치를 하였으나, 25 및 50 mg/ml NLE 처치는 LPS-유도 TNF-α 생성농도가 각각 6.43 ± 0.3 ng/ml 및 5.80 ± 0.5 ng/ml로 억제하지 않았으나, 놀랍게도, 100 mg/ml NLE 처치는 LPS-유도 TNF-α 생성을 유의적으로 억제하는 효과 (4.69 ± 0.1 ng/ml) 를 나타냈다 (p<0.05, 도 1B).

따라서 NLE는 시험관내 방법상 강력한 염증 매개체의 억제제로 작용함을 알 수 있다.

2-3. iNOS 유전자 발현억제효과

상기 실시예에서 얻은 시료의 iNOS 단백질 발현에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 웨스턴-블롯법을 이용하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 (Li, 2009; Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats, Anesth Analg, Vol. 109(5):1591-7).

NLE을 처치한 후에, proteins from RAW 264.7 세포로부터 완충액 (ice-cold radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer; 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate) 중에서 세포를 갈아 단백질을 수득하였다. 모든 세포 분해물 (50 μg)을 10% polyacrylamide gels상에서 전기영동을 수행하고 막 (nitrocellulose membranes)으로 옮기고 프로브 (probe)하였다. 상기 막을 0.05% Tween 20 및 5% nonfat milk을 함유한 Tris-buffered saline (pH 7.6) 중에서 1시간 동안 실온에서 전배양하였다. 상기 니트로셀룰로스 막을 iNOS 및 β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA 및 Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA 구입)에 대한 특이항체와 배양하였다. 그리고 면역반응성 밴드 (Immunoreactive bands)를 horseradish peroxidase와 중합된 anti-mouse IgG와 함께 막을 배양하고, 탐지기 (enhanced chemiluminescence detection system, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, U.S.A.)를 통하여 탐지하였다. β-Actin 을 내부 대조군으로 사용하였다. 밀도계측에 의한 정량을 Image J를 이용하여 수행하였다. 개개 시료 밴드에 대한 상대적 강도를 특정하기 위하여 개개 시료 밴드의 절대 강도를 표준품 (standard, β-Actin)의 절대 강도로 나누었다.

LPS 처치 대식세포에서 NLE에 의한 NO 생성 억제 기전을 확인하기 위하여 iNOS (inducible nitric oxide synthase) 발현에 대한 NLE의 효과를 웨스턴 블롯 분석법 (western blot analysis)으로 측정하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, iNOS 발현은 대조군 조건 (0.23 ± 0.02)에서 매우 낮으나 LPS 처치에 의하여 현저하게 증가하였다 (1.83 ± 0.09). LPS-유도 iNOS 발현은 25 mg/ml NLE 처치 (1.47 ± 0.1)에 의하여 유의적으로 감소하였으나, 놀랍게도 100 mg/ml NLE 처치는 LPS-유도 iNOS 발현 (0.19 ± 0.06)을 완전하게 억제하였다. 이는 NLE가 iNOS 발현을 감소시킴으로서 LPS-처치 세포에서의 NO 분비를 억제함을 의미한다.

실험예 3. 패혈증 동물 실험 모델에서의 효과

상기 실시예에서 얻은 시료의 패혈증 동물 모델 실험에서의 패혈증에 대한 치료 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 (Prakash, 2005: Anti-inflammatory effects of Podophyllum hexandrum (RP-1) against lipopolysaccharides induced inflammation in mice, J Pharm Pharmaceut Sci, 8(1): 107-114).

3-1. 실험 동물 준비

SPF (Specific pathogen-free) 5-주령 암컷 C57BL/6 마우스를 회사 (Koatech, Pyeongtaeki, Gyeonggi-do, Korea)로부터 구입하였다. 동물들을 온도 (23 ± 1℃), 습도 (50 ± 5%) 및 명/암 주기 (12/12h)를 조절하는 특수 방 (SPF barrier room)에서 사육하였다. 모든 동물들을 실험 1주일 전까지 적응시키고 규약 및 지침 (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the US National Institute of Health)에 따라 실험을 수행하였다. C57BL/6 마우스를 각각 5마리의 3개군으로 나누었다. NLE 및 saline을 LPS 투여 24시간 전에 복강투여 (100 mg/kg)하였다. LPS를 복강투여하고 (20 mg/kg) 3일간 주사후 매일 12시간 마다 마우스의 생존율을 측정하였다. 생존 커브 (survival curve)를 서로 상이한 처치법에 의한 생존율과 비교하기 위하여 프로그램 (GraphPad Prism software)을 이용하여 분석하였다.

3-2. 혈장 NO 및 TNF -α 수준측정

마우스에 LPS (20 mg/kg) 도전 24시간 전에 복강주사법으로 NLE (100 mg/kg)를 투여하였다. 혈장 NO 수준 측정을 위하여, 전체 혈액 시료를 LPS 투여 8시간 후에 채취하였고 혈장을 20분간 상기 혈액 시료를 원심분리하여 (3,000 rpm) 분리하고 실험 전까지 70℃에서 보관하였다. 전체 NO (nitrite 및 nitrate)수준을 키트 (Total NO/Nitrite/Nitrate Assay kit (R&D Systems)를 이용하여 분석하였다. 요약하면, 분석 당일에, 시료들을 여과장치(10-kDa cut-off centrifugal filter device, Amicon)로 여과하였고, 시료를 96-well plate에 첨가하였다. 상기 시료에 nitrate reductase 및 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP)를 첨가하고 37℃ 에서 30분간 니트레이트 농도를 측정하기 위하여 배양하였다. 배양 후에, 그리스 시약 (Greiss reagents 1 및 2)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 10분간 배양하였다. 전체 NO를 540 nm에서 분광학적으로 측정하였다. 표준품 커브에 대한 선형 커브 피트 (linear curve fit)를 이용하여, 혈장 NO 농도 (μM)를 표준 nitrite 및 nitrate 용액과의 상대적인 비교로 측정하였다.

또한 혈장 TNF-α 수준 측정을 위하여, 전체 혈액 시료를 LPS 투여 1시간 후에 채취하였고 혈장 시료들을 상기한 바와 같이 준비하였다. 혈장 TNF-α농도를 상기 시험관내 시험법에서 기술한 바와 같이, 동일한 키트(ELISA kit)를 이용하여 측정하였다.

3-3. LPS 유도 패혈증 C57BL /6 동물실험 모델에서의 생존율에 대한 효과

NLE의 마우스 패혈증 실험 모델에서의 치사율에 대한 효과를 하기와 같이 측정하였다.

C57BL/6 마우스를 LPS 단독 또는 NLE와 LPS와의 공동투여법으로 주사하였고 마우스의 생존율을 3일간 검사하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, LPS 단독처치군 (20 mg/kg i.p.)에서는 마우스중 20% 만이 2일간 생존하였으나, NLE (100 mg/kg i.p.)를 LPS와 공동 투여한 경우는 생존율이 80%로 증가하였다. NLE-처치 마우스의 개선된 생존율과 일치하게, 혈장 TNF-α 및 NO 수준도 LPS 단독 처리군에 비하여 NLE 처리군에서 감소하였다 (도 4). NO는 몇 초의 매우 빠른 반감기를 갖고 있어 NO의 안정한 형태인 nitrite 및 nitrate 수준을 혈액에서 측정하였고, 도 4A에 나타난 바와 같이, 대조군에서의 혈장 NO 수준이 0.1 ± 0.02 mM (n = 4) 이나 LPS 처치로 증가하였다 (1.68 ± 0.07 mM, n = 6). NLE 처치군은 LPS (1.40 ± 0.21 mM, n = 6)로 유도된 혈장 NO 생성을 유의적으로 억제하였다. 유사하게, LPS 처치군은 대조군 마우스의 혈장 TNF-α생성 (0.04 ± 0.01 ng/ml, n = 5)에 비하여 혈장 TNF-α 생성을 유도하였다 (1.83 ± 0.23 ng/ml, n = 5). 그러나, LPS에 의하여 증가된 혈장 TNF-α 수준은 NLE 처치군 (0.94 ± 0.21 ng/ml, n = 5)에서 억제되었다 (도 4B).

따라서, 이러한 결과는 NLE가 생체 내 실험 상에서도 패혈증에 대한 강력한 치료제로 사용가능함을 의미한다.

실험예 4. 성분분석 ( HPLC 분석)

상기 인도산 멀구슬나무 잎 추출물의 성분 분석 및 함량분석을 위하여 하기와 같이 HPLC를 수행하였다.

실시예의 시료를 20 mg/ml 농도로 메탄올에 용해시키고 여과기 (Millex PTFE Syring filter, 0.45 μm, Millipore, USA)를 이용하여 여과한 후에 다양한 파장 UV 탐지기 (Agilent, USA, wavelength=254 nm)를 장착한 기기 (Agilent 1200 HPLC System, USA)를 이용한 HPLC 분석을 하기 조건으로 실험을 수행하였다

<HPLC 조건>

- 컬럼: ZORBAX Eclipse Plus C18 (4.6X250 mm, 5μm, Agilent, USA)

- 유출용매: water/acetonitrile (10:90, v/v)

-유출속도: 1.0 ml/min

-column effluent: 254 nm에서 탐지

- run time: 30 min

-시료의 chromatographic peaks는 표준 시료의 retention time 및 UV spectra를 비교하여 확인함

-표준 시료: Rutin (Wako, Kyushu, Japan) 및 quercetin (Sigma-Aldrich Inc, MO, USA)

도 5에 나타난 바와 같이, NLE의 HPLC 양상은 8분의 retention time (min)에서 2개 이상의 특징적인 피크를 나타냈으며 (도 5A), 표준품의 크로마토그램들과 비교시에 플라보노이드 중의 하나인 루틴 (rutin)임을 확인하였다 (도 5B-C).

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

NLE 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

NLE 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

NLE 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

NLE 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na2HPO4,12H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

NLE 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

NLE 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

NLE 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (5)

1. 인도산 멀구슬나무 엽(neem leaf) 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 치료용 약학조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 약학 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 메탄올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물인 약학 조성물.
   
4. 인도산 멀구슬나무 엽(neem leaf) 추출물을 유효성분으로 함유하는 패혈증 또는 내독소혈증의 예방 및 개선용 건강기능식품.
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 건강기능식품 형태는 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.
   

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