KR102025884B1

KR102025884B1 - 옻나무 목질부 추출물을 포함하는 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 및 항산화 조성물

Info

Publication number: KR102025884B1
Application number: KR1020190036662A
Authority: KR
Inventors: 강소영; 정성주; 임재웅; 신수미; 서중경; 이미경; 장재영
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2019-09-26
Also published as: KR20190058394A

Abstract

본 발명은 옻나무 목질부 추출물을 포함하는 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 및 항산화 조성물에 관한 것으로, 옻나무 목질부 추출물을 포함함으로써, 어류 병원성 세균, 기생충 또는 바이러스에 의한 감염 및 감염병을 예방 또는 치료할 수 있으며, 면역증강을 유도하여 어류의 폐사를 방지할 수 있어 어류의 생산량을 증가시킬 수 있고, 천연 항산화 활성물질을 추출물 내에 다량 포함하고 있어 화학약품에 의해 발생할 수 있는 독성 발생 문제 및 사료산패를 최소화시킬 수 있는, 옻나무 목질부 추출물을 포함하는 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 및 항산화 조성물에 관한 것이다.

Description

옻나무 목질부 추출물을 포함하는 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 및 항산화 조성물{Antimicrobial, antiparasite, antiviral and antioxidant compositions of fish comprising Rhus verniciflua lignum extract}

본 발명은 옻나무 목질부 추출물을 포함하는 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 및 항산화 조성물에 관한 것이다.

어류양식어업은 수산자원의 고갈에 대항하는 혁신적인 대안으로 1990년대 중반부터 정부에서 적극 장려하여 현재 넙치, 조피볼락, 새우, 돌돔 등의 주요 어종의 양식이 이루어지고 있으며, 그 중 넙치는 성장이 빠르며 수요도 많아 전체 어류 양식 생산량에 있어서 많은 비중을 차지하고 있다. 그러나, 현재 우리나라 양식의 폐사율은 연간 20%를 상회하며, 그 주요원인으로 수온 상승으로 인한 난치성 질병 발생 및 혼합 감염 (바이러스, 세균, 기생충), 약제 치료효과의 저감이 지목되고 있다.

특히, 어류 병원성 바이러스, 세균 및 기생충에 대한 피해가 지속적으로 발생하며, 발생 시 그 피해가 상당하다. 이에 따라 대량 폐사가 일어나 양식 산업에 있어 큰 문제를 일으키고 있으나, 그 치료를 위해 사용될 수 있는 적절한 약품의 개발은 미미한 실정이다.

한편, 옻나무 (Rhus verniciflua Stokes)는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하며, 중국, 일본 등 동북아시아에서 많이 자라는 낙엽활엽수교목이다.

옻나무의 목질부는 현재까지 건강음료로 사용되고 있고, 강장 (强壯), 암 예방 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있지만, 어류 병원성 세균, 기생충 및 바이러스에 대한 항균, 항기생충, 항바이러스 및 항산화 활성을 가진다는 연구는 아직 보고된 바가 없다.

한국등록특허공보 제10-918326호

본 발명은 어류 병원성 세균, 기생충 또는 바이러스에 대한 항균, 항기생충, 항바이러스 및 항산화 활성을 나타내는 조성물의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 어류 병원성 세균, 기생충 또는 바이러스에 의한 감염으로 발생하는 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 어류의 면역증강을 유도하여 폐사를 방지할 수 있는 조성물의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 어류의 폐사를 방지함으로써 양식 어류의 생산량을 증가시킬 수 있는 조성물의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 화학약품에 의해 발생하는 독성 발생 문제 및 사료산패를 최소화시킬 수 있는 조성물의 제공을 목적으로 한다.

1. 옻나무 목질부 추출물을 포함하는 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

2. 위 1에 있어서 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 혼합용매 추출물인, 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

3. 위 1에 있어서, 상기 추출물은 물 추출물인, 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

4. 위 1에 있어서, 상기 추출물은 10 내지 70부피% 에탄올 수용액 추출물인, 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

5. 위 1에 있어서, 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 혼합용매의 추출물의 유기용매 분획물인, 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

6. 위 5에 있어서, 상기 유기용매는 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 수포화 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

7. 위 1에 있어서, 상기 추출물은 80 내지 110℃에서 추출된 것인, 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

8. 위 1에 있어서, 상기 추출물은 상기 옻나무 목질부 중량의 10 내지 40배의 용매로 추출된 것인, 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

9. 위 1에 있어서, 상기 추출물은 10 내지 30부피%의 에탄올 수용액으로 80 내지 100℃에서 추출된 것인, 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

10. 위 1에 있어서, 상기 추출물은 50 내지 70부피%의 에탄올 수용액으로 80 내지 100℃에서 추출된 것인, 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

11. 갈산 1 내지 10중량%, 푸스틴 10 내지 40중량% 및 피세틴 1 내지 10중량%를 포함하는, 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물.

12. 옻나무 목질부 추출물을 포함하는 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는, 어류의 세균, 기생충 또는 바이러스 감염병 예방 또는 치료 방법.

13. 위 12에 있어서, 상기 투여는 어류의 체중 당 10 내지 350mg을 1 내지 13주동안 경구투여하는 것인, 어류의 세균, 기생충 또는 바이러스 감염병 예방 또는 치료 방법.

14. 갈산 1 내지 10중량%, 푸스틴 10 내지 40중량% 및 피세틴 1 내지 10중량%를 포함하는 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는, 어류의 세균, 기생충 또는 바이러스 감염병 예방 또는 치료 방법.

15. 위 14에 있어서, 상기 투여는 어류의 체중 당 10 내지 350mg을 1 내지 13주동안 경구투여하는 것인, 어류의 세균, 기생충 또는 바이러스 감염병 예방 또는 치료 방법.

본 발명의 조성물은 어류 병원성 세균, 기생충 또는 바이러스에 의한 감염 및 감염병을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물은 어류의 면역을 증강시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 어류가 폐사하는 것을 방지할 수 있다.

본 발명의 조성물은 양식 어류의 폐사율을 낮출 수 있어 생산량을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 천연 항산화 활성물질을 추출물 내에 다량 포함하고 있어, 화학약품을 사용함으로써 발생할 수 있는 독성 발생 문제 및 사료 산패를 최소화시킬 수 있다.

도 1은 옻나무의 부위별 페놀릭 (phenolic) 함량, 플라보노이드 (flavonoid) 함량, DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 옻나무 (Rhus verniciflua Stokes) 추출물의 항균 활성 (A) 및 수득률 (B)의 예비 실험 결과를 그래프로 나타낸 것이다(선은 2차 다항식 추세선을 의미한다).
도 3은 항균 활성 회귀 모형에 대한 잔차 그림을 나타낸 것이다.
도 4는 항스쿠티카충 활성 회귀 모형에 대한 잔차 그림을 나타낸 것이다.
도 5는 수율 회귀 모형에 대한 잔차 그림을 나타낸 것이다.
도 6은 추출물의 항균 활성 및 수율에 대한 예측 최적화 그림을 나타낸 것이다.
도 7은 추출물의 항스쿠티카충 활성 및 수율에 대한 예측 최적화 그림을 나타낸 것이다.
도 8은 두개의 독립 변수 사이의 상호 작용 효과를 나타내는 반응 표면 그림을 나타낸 것으로, A는 항균 활성, B는 수율, C는 BBD (Box-Behnken design)에 의해 예측되는 최적의 활성 및 수율 값을 나타낸 것이다.
도 9는 두개의 독립 변수 사이의 상호작용의 효과를 나타내는 반응 표면 그림을 나타낸 것으로, D는 항스쿠티카충 활성, E는 수율, F는 BBD에 의해 예측되는 최적의 활성 및 수율 값을 나타낸 것이다.
도 10은 20 추출물 및 60 추출물의 화합물 구성을 UV 스펙트럼 (254nm)로 나타낸 것이다.
도 11은 옻나무 추출물들의 전염성 조혈기 괴사증 바이러스 (infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)에 대한 항바이러스 활성을 보여주는 현미경 세포 사진으로, A는 정상 대조구; B는 바이러스 대조구; C는 열수 추출물 3㎍/㎖; D는 20.100.30 추출물 3㎍/㎖; E는 60.85.30 추출물 3 ㎍/㎖; F는 리바비린 (Ribavirin) 3μM을 의미하며, scale bar는 100㎛이다.
도 12은 갈산 (Gallic acid), 푸스틴 (fustin), 피세틴 (fisetin)의 선형성과 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantitation, LOQ)를 나타낸 것이다.
도 13 내지 16은 최적화된 옻나무 목질부 추출물 (20 추출물, 60 추출물) 내 지표성분들의 MRM (multiple reaction monitoring) 데이터와 표준 화합물의 MRM 데이터의 머무름 시간을 비교한 것을 나타내 것이다.
도 17는 옻나무 목질부의 20부피% 에탄올 수용액 추출물을 2주동안 경구투여한 후 E.tarda FJ1408로 감염시킨 넙치 (olive flounder)에서의 누적 폐사율을 나타낸 것이다(NC, 단순 대조구 (naive control); BC, 박테리아 대조구 (bacteria control); RPS, 상대생존률 (relative percent survival); *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001).
도 18는 옻나무 목질부의 60부피% 에탄올 수용액 추출물을 2주동안 경구투여한 후 E.tarda FJ1408로 감염시킨 넙치 (olive flounder)에서의 누적 폐사율을 나타낸 것이다 (NC, 단순 대조구 (naive control); BC, 박테리아 대조구 (bacteria control); RPS, 상대생존률 (relative percent survival); *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001).
도 19은 옻나무 목질부의 20부피% 에탄올 수용액 추출물을 6주동안 경구투여한 후 E.tarda FJ1408로 감염시킨 넙치 (olive flounder)에서의 누적 폐사율을 나타낸 것이다 (NC, 단순 대조구 (naive control); BC, 박테리아 대조구 (bacteria control); RPS, 상대생존률 (relative percent survival); *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001).
도 20은 옻나무 목질부의 60부피% 에탄올 수용액 추출물을 6주동안 경구투여한 후 E.tarda FJ1408로 감염시킨 넙치 (olive flounder)에서의 누적 폐사율을 나타낸 것이다 (NC, 단순 대조구 (naive control); BC, 박테리아 대조구 (bacteria control); RPS, 상대현재생존률 (relative percent survival); *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001).
도 21은 옻나무 목질부의 20부피% 에탄올 수용액 추출물을 10주동안 경구투여한 후 E.tarda FJ1408로 감염시킨 넙치 (olive flounder)에서의 누적 폐사율을 나타낸 것이다 (NC, 단순 대조구 (naive control); BC, 박테리아 대조구 (bacteria control); RPS, 상대현재생존률 (relative percent survival); *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001).
도 22는 옻나무 목질부의 60부피% 에탄올 수용액 추출물을 10주동안 경구투여한 후 E.tarda FJ1408로 감염시킨 넙치 (olive flounder)에서의 누적 폐사율을 나타낸 것이다 (NC, 단순 대조구 (naive control); BC, 박테리아 대조구 (bacteria control); RPS, 상대현재생존률 (relative percent survival); *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001).
도 23은 E.tarda (FJ1408)에 감염된 넙치의 임상적 징후를 나타낸 것으로, A는 병에걸린 물고기의 외부 병변 (복부 팽만 및 탈장); B는 충혈된 구강 내 및 입 주위 병변; C 및 D는 간 및 신장에서 발견된 다양한 크기의 농양, 세균 콜로니를 나타낸 것이다.
도 24은 옻나무 목질부의 20부피% 에탄올 수용액 추출물을 2주동안 경구투여한 후 스쿠티카충으로 감염시킨 넙치에서의 누적 폐사율을 나타낸 것이다.
도 25는 옻나무 목질부의 20부피% 에탄올 수용액 추출물과 60부피% 에탄올 수용액 추출물을 각각 12주동안 경구투여한 후 스쿠티카충으로 감염시킨 넙치에서의 누적 폐사율을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

"추출물"은 상기 옻나무 목질부의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 분산제나 정제물, 추출액 자체 또는 추출액으로 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

"분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹 분획하여 얻어진 결과물을 의미한다.

"예방"은 상기 조성물에 의해 어류 병원성 세균, 바이러스 또는 스쿠티카충 (Scuticociliatids)에 의한 감염 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물에 의해 어류 병원성 세균, 바이러스 또는 스쿠티카충에 의한 감염 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

"물"은 샘물, 해양심층수, 알카리스, 암반수, 천연탄산수, 지하수, 광천수, 용천수, 육각수, 이온수 등 모든 종류의 물을 포함하며, 차가운 물, 미지근한 물, 뜨거운 물(예컨대, 100℃) 등 다양한 온도의 물 또한 포함한다.

본 발명은 일 양태로 어류의 항균 조성물을 제공한다. 상기 균은 어류 병원성 세균을 의미한다.

상기 어류는 어류 병원성 세균이나 바이러스 또는 스쿠티카충에 의한 감염 질환이 발병할 수 있는 모든 어류를 제한 없이 통칭할 수 있다. 상기 어류의 예로 넙치, 조피볼락, 숭어, 참돔, 돌돔, 농어, 가자미, 고등어, 능성어, 참다랑어, 감성동, 연어 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 어류는 넙치일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

어류 병원성 세균은 그람 양성 또는 그람 음성균일 수 있으며, 예컨대, 그람 음성균으로는 비브리오증을 유발하는 비브리오 (Vibrio) 종 (구체적으로, V. anguillarum, V. salmonicida, V. ordalii, V. alginoriticus, V. vulnificus, V. choleraenonO1, V. fisheri, V. harvey, V. splendidus, V. ichthyoenteri, V. scophthalmi, V. rotiferianus, V. coralliilyticus, V. kanaloae, V. pomeroyi, V. chagasii, V. fortis, V. hepatarius, V. neptunus, V. brasiliensis, V. xuii, V. agarivorans, V. lentus 등; 더욱 구체적으로, V. anguillarum, V. salmonicida, V. ordalii, V. alginoriticus, V. vulnificus, V. choleraenonO1, V. harvey, V. splendidus, V. ichthyoenteri, V. scophthalmi, V. rotiferianus 등); 에드와드병을 유발하는 에드와드시엘라 (Edwardsiella) 종 (구체적으로, E. tarda 등); 활주세균증을 유발하는 테나시바쿨럼 (Tenacibaculum) 종 (구체적으로, T. maritimum 등); 대장균 (E. coli) 등이 있으며, 그람 양성균으로는 연쇄구균증을 유발하는 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종 (구체적으로, Streptococcus iniae, S. parauberis, S. difficilis, S. shiloi, S. milleri, S. parauberis 등; 더욱 구체적으로, Streptococcus iniae, S. parauberis 등), 락토코커스 (Lactococcus) 종 (구체적으로 L. garvieae, L. piscicum 등), 바고코커스 (Vagococcus) 종 (구체적으로, V. salmoninarum 등), 엔테로코커스 (Enterococcus) 종 (구체적으로, E. seriolicida, E. faecalis 등), Staphylococcus 종 (구체적으로, S. aureus 등) 등; 또는 살모넬라병을 유발하는 Salmonella 종 (구체적으로, S. enterica, S. bongori) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서 옻나무 목질부 추출물 및 상기 추출물의 분획물이 어류 병원성 세균에 대한 감염 예방 또는 치료에 우수한 효과가 있는 것을 확인하였다 (도 14 내지 19). 이에, 옻나무 목질부 추출물 또는 상기 추출물의 분획물을 포함하는 본 발명의 조성물은 어류 병원성 세균에 대한 항균 또는 상기 세균에 의한 감염병 예방 또는 치료 용도에 적합하다.

본 발명의 어류 병원성 세균에 대한 항균 조성물은 옻나무 목질부 추출물을 포함한다.

옻나무 목질부를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법으로, 예컨대, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 상기 추출 방법은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병행하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

옻나무 목질부 추출물은 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용하여 옻나무 목질부를 추출함으로써 수득할 수 있다. 상기 용매로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로, 에탄올, 메탄올 등 저급 알코올을 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 옻나무 목질부 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 혼합용매 추출물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 옻나무 목질부 추출물은 물, 70 내지 90부피%의 메탄올 수용액 또는 10 내지 70부피% (구체적으로 30 내지 70부피%, 더욱 구체적으로 55 내지 65부피%)의 에탄올 수용액 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 범위 내의 물, 메탄올 수용액 또는 에탄올 수용액으로 추출 시 어류 병원성 세균에 대한 항균 활성이 극대화 되며, 상기 범위를 벗어나는 경우 항균 활성이 감소되어 상기 세균에 대한 감염 또는 치료 효과가 낮아지는 문제가 있다.

옻나무 목질부 추출물을 얻기 위한 방법으로 옻나무 목질부 중량 (구체적으로, 옻나무 목질부 분쇄물의 건조 중량)의 10 내지 60배, 구체적으로 10 내지 40배, 더욱 구체적으로는 25 내지 35배, 보다 더 구체적으로는 27 내지 33배에 달하는 부피의 용매로 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 옻나무 목질부 추출물은 옻나무 목질부 중량의 30배에 달하는 부피의 용매로 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

옻나무 목질부 추출물은 80 내지 110℃에서 추출된 것일 수 있으며, 구체적으로는 82 내지 88℃, 더욱 구체적으로는 84 내지 87℃에서 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 범위 내의 중량비 또는 온도범위로 옻나무 목질부 추출물을 추출하면 어류 병원성 세균에 대한 항균 효과가 극대화되어 상기 세균에 의한 감염병에 대한 예방 또는 치료 효과도 극대화된다. 상기 범위를 벗어나는 경우 상기 항균효과 및 상기 감염병에 대한 예방 또는 치료 효과가 감소하는 문제가 있을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 옻나무 목질부 추출물은 옻나무 목질부 중량의 10 내지 40배에 달하는 50 내지 70부피%의 에탄올 수용액으로 80 내지 90℃에서 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 어류 병원성 세균에 대한 항균 조성물은 옻나무 목질부 추출물의 분획물을 포함할 수 있으며, 구체적으로, 옻나무 목질부 메탄올 수용액 또는 에탄올 수용액 추출물의 유기용매 분획물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 예컨대, 분획물은 옻나무 목질부를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

유기용매로는 에터, 헥산, 사이클로헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 수포화부탄올, 벤젠, 디메틸설폭시드 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 수포화 부탄올 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

옻나무 목질부 추출물의 유기용매 분획물을 얻기 위한 방법으로, 상기에서 얻은 옻나무 목질부 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 현탁액의 1 내지 100배, 구체적으로 1 내지 5배 부피의 유기용매를 가하여 1 내지 10회에 걸쳐 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다.

또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다. 구체적으로, 옻나무 목질부 조추출물을 물에 현탁한 후, 등량의 n-헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 연속 추출하여 옻나무 목질부 각 용매 가용 추출물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 옻나무 목질부 조추출물을 물에 현탁한 후, 동량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다. 또한, 상기 수가용성 분획물에 클로로포름을 가하여 클로로포름 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 상기 수가용성 분획물에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

"담체"란 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 의미하는 것이다. 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량 (10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및 (또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스 (PLURONICS) 등을 들 수 있다.

필요에 따라, 본 발명의 조성물은 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 제형화할 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 다만, 본 발명의 조성물은 어류의 질병 치료라는 목적상 약욕제의 형태로 제공되는 것이 가장 바람직할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 수의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 어류의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소, 기타 수의학 분야 등에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명은 다른 양태로 옻나무 목질부 추출물을 포함하는 어류의 항기생충 조성물을 제공한다. 상기 기생충은 어류 병원성 기생충을 의미한다.

어류는 전술한 어류일 수 있다.

상기 기생충은 원생기생충, 포자충, 흡충, 조충, 서충, 구두충 및 갑각충등의 다양한 생물군이 포함될 수 있으며, 구체적으로, 원생기생충일 수 있다.

원생기생충으로 스쿠티카증을 유발하는 미아미엔시스 (Miamiensis) 종 (구체적으로, M. avidus 등), 필라스테리더스 (Philasterides) 종 (구체적으로, P. dicentrarchi 등), 우로네마 (Uronema) 종 균주 (구체적으로, U. marinum, U. nigricans 등), 테트라히메나 (Tetrahymena) 종, 슈도코닐레더스 (Pseudocohnilemdus) 종 (구체적으로, P. persalinus) 등; 백점병을 유발하는 백점충(Ichthyophthirius multifillis), 해산백점충(Cryptocaryon irritans); 오디늄병을 유발하는 오디늄 (Oodinium); 트리코디나병을 유발하는 트리코디나(Trichodina); 킬로도넬라병을 유발하는 킬로도넬라(Chilodonella); 암비프리야병을 유발하는 암비프리야(Ambiphrya); 아피오소마병을 유발하는 아피오소마(Apiosoma); 에피스틸리스병을 유발하는 에피스틸리스(Epistylis); 카케시움을 유발하는 카케시움(Carchesium); 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 기생충은 미아미엔시스 (Miamiensis) 종 (구체적으로, M. avidus 등), 필라스테리더스 (Philasterides) 종 (구체적으로, P. dicentrarchi 등), 우로네마 (Uronema) 종 균주 (구체적으로, U. marinum, U. nigricans 등), 테트라히메나 (Tetrahymena) 종, 슈도코닐레더스 (Pseudocohnilemdus) 종 (구체적으로, P. persalinus), 백점충(Ichthyophthirius multifillis), 해산백점충(Cryptocaryon irritans), 오디늄 (Oodinium), 트리코디나(Trichodina), 킬로도넬라(Chilodonella) 등의 섬모충일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예서 옻나무 목질부 추출물 및 상기 추출물의 분획물이 우수한 항기생충 효과가 있음을 확인하였다 (도 23 및 25). 이에, 옻나무 목질부 추출물 및 상기 추출물의 분획물을 포함하는 본 발명의 조성물은 항기생충 또는 기생충에 의한 감염병 예방 또는 치료 용도에 적합하다.

옻나무 목질부 추출물은 전술한 추출 방법으로 전술한 용매를 사용하여 옻나무 목질부를 추출함으로써 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 옻나무 목질부 추출물은 물, 메탄올 수용액 또는 에탄올 수용액 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 옻나무 목질부 추출물은 물, 70 내지 90부피%의 메탄올 수용액 또는 10 내지 70부피%의 에탄올(구체적으로, 50 내지 70부피%의 에탄올 수용액, 10 내지 30부피%의 에탄올 수용액, 더욱 구체적으로, 15 내지 25부피%의 에탄올 수용액) 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 옻나무 목질부 추출물은 물, 80부피%의 메탄올 수용액 또는 20부피%의 에탄올 수용액 추출물일 수 있다.

상기 범위 내의 에탄올을 포함 시 어류 병원성 세균에 대한 항균 활성이 가장 우수하다. 상기 범위를 벗어나는 경우 항균 활성이 감소되어 어류 병원성 세균에 대한 감염 또는 치료 효과가 낮아지는 문제가 있다.

옻나무 목질부 추출물은 80 내지 110℃에서 추출된 것일 수 있으며, 구체적으로 90 내지 105℃, 더욱 구체적으로 95 내지 103℃에서 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 추출물은 100℃에서 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 옻나무 목질부 추출물은 옻나무 목질부 중량의 10 내지 40배에 달하는 10 내지 30부피%의 에탄올 수용액으로 90 내지 110℃에서 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 옻나무 목질부 추출물의 유기용매 분획물을 포함할 수 있다.

유기용매는 전술한 유기용매일 수 있다.

분획물은 전술한 분획 방법에 따라 수득할 수 있다. 예컨대, 옻나무 목질부 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 현탁액의 1 내지 100배, 구체적으로 1 내지 5배 부피의 제2 유기용매를 가하여 1 내지 10회에 걸쳐 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 전술한 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다른 양태로, 본 발명은 옻나무 추출물을 포함하는 어류의 항바이러스 조성물을 제공한다. 상기 바이러스는 어류 병원성 바이러스를 의미한다.

어류는 전술한 어류일 수 있다.

어류 병원성 바이러스로 헤르퍼스바이러스 (Herpesvirus)과, 버나바이러스 (Birnavirus)과, 랩도바이러스 (Rhabdovirus)과, 이리도바이러스 (Iridovirus)과, 노다바이러스 (Nodavirus)과 바이러스 등일 수 있으며, 구체적으로 랩도바이러스 (Rhabdovirus)일 수 있다.

버나바이러스과 바이러스로 전염성 췌장 괴사증을 유발하는 전염성 췌장 괴사 바이러스(infectious pacreatic necrosis virus, IPNV); 버나바이러스병을 유발하는 아비버나바이러스 (Avibirnavirus), 아쿠아버나바이러스 (Aquabirnavirus), 브로스나바이러스 (Blosnavirus), 엔토모버나바이러스 (Entomobirnavirus) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

랩도바이러스과 바이러스로 바이러스성 출형성 패혈증을 유발하는 바이러스성 출혈성 패혈 바이러스 (viral hemorhagic septicemia virus, VHSV), 넙치랩도바이러스병을 유발하는 넙치랩도바이러스 (hirame rhabdovirus), 전염성 조혈기 괴사증을 유발하는 전염성 조혈기 괴사 바이러스(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV), 잉어봄바이러스병을 유발하는 잉어봄바이러스 (spring viremia of carp), 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이리도바이러스과 바이러스는 이리도바이러스병을 유발하며, 상기 바이러스로 메갈로시티바이러스 (Megalocytivirus), 라나바이러스 (Ranavirus), 이리도바이러스 (Iridovirus), 클로리리도바이러스 (Chloriridovirus), 림포시스티바이러스 (Lymphocystivirus) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

노다바이러스과 바이러스는 신경괴사증을 유발하며, 상기 바이러스로 알파노다바이러스 (alphanodavirus), 베타노다바이러스 (betanodavirus) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈 바이러스 (viral hemorhagic septicemia virus, VHSV), 넙치랩도바이러스 (hirame rhabdovirus), 전염성 조혈기 괴사 바이러스(infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV), 잉어봄바이러스 (spring viremia of carp) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예서 옻나무 목질부 추출물 및 상기 추출물의 분획물이 어류 병원성 바이러스에 대하여 우수한 항바이러스 효과가 있음을 확인하였다 (도 10). 이에, 옻나무 목질부 추출물 및 상기 추출물의 분획물을 포함하는 본 발명의 조성물은 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 또는 상기 바이러스 감염병 질환의 예방 또는 치료에 적합하다.

옻나무 목질부 추출물은 전술한 추출 방법, 추출 조건 또는 용매로 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 옻나무 목질부 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용액 추출물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 옻나무 목질부 추출물의 유기용매 분획물을 포함할 수 있으며, 구체적으로, 옻나무 목질부 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용액 추출물의 유기용매 분획물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

분획물은 전술한 분획 방법으로 수득할 수 있으며, 추가로 통상의 분획 공정을 수행하여 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

유기용매는 전술한 유기용매일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

옻나무 목질부 추출물은 항산화 활성이 매우 우수하므로(도 1), 본 발명은 다른 양태로 옻나무 목질부 추출물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항산화용 조성물은 어류의 면역증진, 다양한 질병예방, 사료의 산화방지 등 다양한 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 항산화용 조성물은 건강기능식품, 의약품에 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물을 포함하는 건강기능식품의 종류에는 제한이 없으며, 예컨대, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물을 포함하는 건강기능식품 중 음료조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 약 0.01 내지 0.04g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03g일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

그리고 본 발명의 조성물을 포함하는 의약품의 제형은, 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물을 포함하는 의약품은 제제화될 수 있으며, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 어류의 세균, 기생충 또는 바이러스 감염 또는 감염병의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 사용될 수 있기 때문에, 본 발명은 옻나무 목질부 추출물을 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

옻나무 목질부 추출물은 항산화 활성도 뛰어나 (도 1), 사료의 산화도 방지할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 사료 첨가제은 옻나무 목질부 추출물의 유기용매 분획물을 포함할 수 있으며, 구체적으로, 옻나무 목질부 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용액 추출물의 유기용매 분획물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

사료 첨가제는 영양적 또는 특정 목적을 위하여 사료에 미량으로 첨가되는 물질을 총칭하는 것으로, 본 발명의 조성물은 상기 사료 첨가제로서 사료 조성물에 포함될 수 있으며, 사료는 어류에 공급되는 모든 식품을 총칭하는 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에는 품질 저하를 방지하기 위해 첨가되는 결착제, 유화제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있고, 효용 증대를 위하여 첨가되는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태 질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등을 추가로 포함할 수 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.

또한, 어류용 사료 조성물에 통상적으로 사용되는 배합사료로는 어분, 카제인, 육골분, 새우분말 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질원 또는 고구마 전분, 감자전분, 밀 전분 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 탄수화물원 또는 채종유, 대두유, 옥수수유, 명태간유, 오징어간유 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 지질원 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 배합사료와 배합하여 사용하더라도 상기 질환에 대한 예방 또는 개선 효과는 동일하게 발생될 수 있다.

옻나무 목질부 추출물은 갈산, 푸스틴 및 피세틴을 일정 중량%로 포함함으로써 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 활성이 우수하므로, 본 발명은 갈산, 푸스틴 및 피세틴을 포함하는 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 조성물을 제공한다.

갈산은 3,4,5-트리히드록시벤조산의 화학식을 가지며, 푸스틴은 2-(3,4-디히드록시페닐)-3,7-디히드록시-2,3-디히드로크로멘-4-온의 화학식을 가지며, 피세틴은 2-(3,4-디히드록시페닐)-3,7-디히드록시크로멘-4-온의 화학식을 갖는다.

본 발명의 조성물은 갈산 1 내지 10중량%, 푸스틴 10 내지 40중량% 및 피세틴 1 내지 10중량%를 포함한다. 상기 범위 내로 갈산, 푸스틴 및 피세틴을 포함하면 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 활성이 극대화되며, 상기 범위 미만 또는 초과의 갈산, 푸스틴 및 피세틴을 포함하는 경우 어류의 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 활성이 상기 범위 내로 포함되는 경우보다 크게 감소한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 갈산 1 내지 5중량%, 푸스틴 15 내지 25중량%, 피세틴 1 내지 5중량%를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 상기 성분 외에도 옻나무 목질부 추출물에 포함되는 나머지 성분들을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 갈레이트 유도체, 플라보노이드 계열의 화합물 (예컨대, 부틴 (butin), 설푸레틴 (sulfuretin), 부테인 (butein) 등)을 더 포함할 수 있으며, 이들은 상기 갈산, 푸스틴 및 피세틴의 중량% 외 잔량으로 포함될 수 있다.

또한, 상기 성분 외에도 항균, 항기생충, 항바이러스 또는 항산화 활성이 우수하다고 당분야에 공지된 모든 물질이 상기 조성물의 성분의 중량% 외 잔량으로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 옻나무 추출물을 포함하는 조성물을 어류에 투여하는 단를 포함하는 어류의 어류 병원성 세균, 기생충 또는 바이러스에 의한 감염병 치료 방법을 제공한다.

어류는 전술한 어류일 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 어류에 직접 또는 양식장에 투여하는 등 어류에 직접 또는 간접적으로 본 발명의 조성물이 전달되는 모든 수단을 포함할 수 있다. 예컨대, 수단은 어류에 직접적으로 주사, 급이, 약욕 또는 섭식(경구투여)시키는 것 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

예컨대, 본 발명의 방법은 유효농도의 약액을 제조하여 스쿠티카충에 의한 감염으로 병변을 가진 어류를 본 발명의 조성물에 침지시켜 약욕하는 방법일 수 잇으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물의 투여량은 피처리 어류의 중량, 건강상태, 투여시간, 질환의 중증도에 따라 그 범위를 달리할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 어류의 체중 당 10mg 내지 350mg (구체적으로, 20mg 내지 310mg, 더욱 구체적으로, 30mg 내지 300mg)의 옻나무 목질부 추출물을 포함하는 조성물을 1주 내지 13주(구체적으로, 2주 내지 12주)동안 상기 어류에 경구투여할 수 있다.

상기 범위 내의 양 및 기간으로 조성물을 어류에 투여 시 어류 병원성 세균, 기생충 또는 바이러스에 대한 감염 또는 상기 감염에 의한 질병에 대한 예방 또는 치료효과가 극대화될 수 있다.

옻나무 목질부 추출물은 갈산, 푸스틴 및 피세틴을 일정 중량%로 포함함으로써 항균, 항기생충 또는 항바이러 활성이 우수하므로, 본 발명은 갈산, 푸스틴 및 피세틴을 포함하는 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 어류 병원성 세균, 기생충 또는 바이러스에 의한 감염병 치료 방법을 제공한다.

갈산, 푸스틴 및 피세틴은 전술한 갈산, 푸스틴 및 피세틴일 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예로 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예에서 20 추출물은 옻나무 목질부의 20부피% 에탄올 수용액 추출물을 의미하며, 60 추출물은 옻나무 목질부의 60부피% 에탄올 수용액 추출물을 의미한다. 열수 추출물은 옻나무 목질부를 열수로 추출한 추출물을 의미한다.

실험방법

1. 옻나무 부위 선정 실험

1.1. 옻나무 부위별 추출물 제조

옻나무 껍질과 목질부를 조말한 뒤, 시료 10 g을 메탄올 200ml에 3시간 동안 상온에서 침출하여 추출하였다. 또한 각 부위별 분획물 활성을 알아보기 위해 시료 50g을 80% 메탄올 600ml에 초음파를 가하여 추출하였다. 추출액을 모아 Whatman No. 4 filter paper로 여과 후, 감압농축하였다. 잔사를 이틀간 동결건조하였으며, 시료를 막자사발에 곱게 간 뒤, 부위선정 관련된 실험 시료로 사용하였다.

1.2. 옻나무의 부위별 페놀릭 화합물 및 플라보노이드 정량 및 DPPH 라디칼 소거 활성화 측정

옻나무의 잎, 목질부, 껍질 각각 10g을 실온에서 200ml 메탄올에 3시간 동안 상온에서 침출하여 추출하였다. 각각의 추출물을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 녹여 5mg/ml의 농도로 맞추어 페놀릭, 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다.

1.2.1. 페놀릭 정량

페놀릭의 총 함량은 Folin-Ciocalteu assay로 측정하였다. 표준 검량선은 갈산을 사용했으며, 표준품의 농도는 50, 100, 200, 400 또는 800μg/ml로 사용하였다. 농도별로 갈산을 4μl씩 취하여 36μl의 H₂O에 섞어서 96 well plate에 넣어주고, Folin-ciocalteu's phenol reagent를 4μl씩 취하여 넣어 준 다음 5분간 교반기로 섞는다. 7% Na₂CO₃용액을 40μl씩 취하여 넣어 준 다음 4μl의 H₂O를 넣어준다. 90분 동안 암실에 보관한 후 750nm 파장에서 Microplate reader로 흡광도를 측정하여, 표준 검량선을 만든다. 상기 표준 검량선을 Gallic acid Equivalents(GAE)라 하였고, 이를 mg(GAE)/mg(추출물)로 나타냈다.

옻나무의 잎, 목질부, 껍질(5mg/ml)도 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 페놀릭 함량을 측정하였다.

1.2.2. 플라보노이드 정량

플라보노이드의 총 함량은 Aluminium chloride colorimetric assay로 측정하였다. 표준 검량선은 카테친(Catechin)을 사용했으며, 표준품의 농도는 37.5, 75, 150, 300 또는 600μg/ml로 사용하였다. 농도별로 Catechin을 10μl씩 취하여 40μl의 H₂O에 섞어서 96 well plate에 넣어주고, 5% NaNO₂ 3μl씩 취하여 넣어 준 다음 5분동안 교반기로 섞는다. 10% AlCl₃을 3μl씩 취하여 넣어 준 다음 6분동안 교반기로 섞는다. 1M NaOH를 20μl씩 취하여 넣어 준 후, 490nm 파장에서 Microplate reader로 흡광도를 측정하여, 표준 검량선을 만든다. 상기 표준 검량선을 Catechin Equivalents(CE)라 하였으며, mg(CE)/mg(추출물)로 나타냈다.

옻나무의 잎, 목질부, 껍질(5mg/ml)도 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 플라보노이드 함량을 측정하였다.

1.2.3. DPPH 라디칼 소거 활성화 측정

잎, 목질부, 껍질 추출물을 2.5mg/ml 농도로 96 well plate에 2ul씩 넣어주고, 각 well에 메탄올을 50μl씩 넣어준다. DPPH에 메탄올 용액을 첨가하여 0.3mM의 농도로 만든 후 각 well에 50μl씩 넣어준 후, 10분간 방치하였다. 그리고 microplate reader로 550nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

1.3. 항균, 항스쿠티카 및 항바이러스 활성 검색

1.3.1. Disc diffusion assay (항균)

시료의 항균활성은 Disc diffusion assay로 검색하였다. 시료를 각 추출 용매 조성에 따라 absolute ethanol 수용액에 녹인 후 직경 6mm 멸균 disc paper에 3mg/disc 또는 2mg/disc의 용량으로 흡착하여 clean bench에서 용매가 완전히 증발할 때까지 건조하였다. E. tarda를 phosphate buffer saline (PBS)에 10⁸ CFU/ml로 현탁한 후 BHI agar 배지에 100㎕씩 접종한 다음, 건조된 disc를 올렸다. 25℃ 배양기에 24시간 배양하여 disc를 포함한 억제존의 직경을 전자식 캘리퍼스로 mm 단위로 소수점 둘째자리까지 측정하였다. Positive control로서 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline) (30 ㎍)과 아목시실린 (amxicillin) (10 ㎍)의 시중에서 파는 disc를 사용하였다.

1.3.2. Microdilution assay (항균)

최적화된 추출물과 추출물 내의 주요 화합물에 대한 항균활성은 microdilution assay로 검색하였다. 대상 세균을 BHIB 10 ml에 접종 후 25℃에서 24시간 동안 0.5 Mcfarland standard에 준하게 배양한 뒤 최종 세균수를 1x10⁶ CFU/ml로 맞춰 주었다. 추출물 및 화합물을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 잘 녹인 뒤 BHIB를 첨가하여 최종 DMSO 농도를 10%가 되게 조정하였으며, 2배씩 희석하여 준비하였다. 그 후, 96 well plate에 시료 희색액과 세균액을 동량 넣어 최종 부피를 200 ㎕가 되도록 하였으며, 25℃ 배양기에서 24시간동안 배양하였다. PBS에 p-INT를 0.2 mg/ml로 제조한 뒤, well당 30 ㎕ 주입하여 암조건에서 2시간동안 반응시켰으며 염색되지 않은 구간을 최고억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)로 결정하였다. 양성 대조구로 옥시테트라사이클린을 사용하였다.

1.3.3. 항스쿠티카 활성

동결건조 된 시료에 DMSO를 넣어 stock solution을 만든다. 샘플을 DMEM0에 희석하여 DMSO의 최종농도가 1%가 되게 하였다. DMEM0에 단계희석을 통해 원하는 농도를 만든다. 양성 대조구로 포르말린을 사용하였다. 96 well plate에 희석한 시료와 포르말린 희석액을 100㎕씩 분주하였다.

어류주화세포에서 4일 내지 5일간 배양한 스쿠티카충 배양액을 준비하였다. 배양액 내에 cell 부유물이 거의 없고, 활성이 가장 좋은 시기임으로 4 내지 5일간 배양한 스쿠티카충을 사용하였다. 먼저 배양액 내의 스쿠티카 수를 확인한 후, 1000rpm, 10min, 15℃와 같은 조건에서 1차 원심분리 하였다. 1차 원심 후 배양액을 버리고, DMEM0을 넣어 같은 조건에서 원심 후 세척하였다. DMEM0을 제거하고 새로운 DMEM0을 넣어 부유시킨 후 원하는 농도로 희석하였다. 본 실험에서는 well당 3x10³cells/10㎕가 들어갈 수 있도록 스쿠티카충 수를 조정하였다.

최종적으로 샘플희석액이 분주된 well에 스쿠티카충을 접종한 뒤, 15℃ 배양기에서 24시간 반응시킨 후 최소사멸농도 (minimal lethal concentration, MLC)를 확인하였다.

1.3.4. 항바이러스활성

가) 주화세포배양

바이러스 배양을 위한 어류주화세포는 CHSE-214 (Chinook Salmon Embryo-214)와 FHN (Fathead minnow) 세포를 최소기초배지(Eagle's minimum essential medium; MEM)에 100 IU/㎖의 페니실린(penicillin), 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)과 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)가 10% 첨가된 배양액을 사용하여 각 플라스크에 1x10⁶/㎖로 맞추어 20℃에서 20시간 동안 배양한 후 바이러스 접종에 사용하였다.

나) 바이러스배양

실험에 사용한 바이러스주는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorhagic Septicemia Virus; VHSV, Wando 2005) 및 전염성 조혈 괴사 바이러스(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)를 사용하였다. 바이러스는 저장을 위해 FHM 세포주에 바이러스 100 ㎕를 75F 플라스크에 접종하고 15℃에서 10일동안 배양하면서 세포변성효과(Cytopathic effect; CPE)를 관찰한 후 상등액을 마이크로튜브에 분주하여 실험에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

다) 항바이러스 활성

CPE(cytopathic effect) 감소 분석법을 이용하여 시료의 항바이러스 활성을 측정하였다. 간략히 설명하면, 96 well 플레이트에 배양된 세포에 바이러스 희석액과 시료를 1:1로 섞어 4세트로 접종하고 15℃에서 1시간 배양하였다. 3 내지 4일 이후 바이러스 대조구에서 바이러스에 의한 세포변성(CPE)이 모든 well에서 고르게 나타나게 되면 배양을 중지하고 그 때의 각 시료구의 CPE를 현미경으로 관찰하였다. 그리고 상기 각 시료구의 CPE를 바이러스 대조구의 CPE와 비교하여 점수화 하였다. CPE를 50% 감소시키는 농도(EC₅₀)는 각 농도별 CPE 감소율(%)를 그래프로 그려 구하였다.

2. 추출 조건의 최적화

2.1. 추출조건 설정을 위한 예비실험

3g의 옻나무 목질부 시료를 믹서기로 분쇄하여 1mm 체에 거른 후 각기 다른 에탄올 함량(0, 10, 20, 40, 60 또는 80%), 추출온도는 85℃, 시료 대 용매비는 30배로 고정하여 추출하였다. 추출액은 Whatman No 4. filter paper로 여과하여 40℃ 수욕 상에서 진공농축한 뒤 24시간 동결건조하여 활성평가에 사용하였다. 활성 결과를 토대로 실험설계를 위한 독립변수들의 수준을 정하였다.

2.2. 실험설계

옻나무 목질부 시료의 E. tarda에 대한 항균활성과 수율의 최적조건을 분석하기 위해 RSM 중 Box-Behnken design (BBD)를 사용하였다. 추출공정의 독립변수는 예비실험을 통해 에탄올 함량(X1), 추출온도(X2), 시료 대 용매비(X3)로 선택하였으며, 코드화 된 -1, 0, 1의 3수준으로 실험을 설계하였다. 무작위로 설계된 15개의 실험조건을 추출한 뒤 동결건조하여 항균 및 항스쿠티카 활성평가를 진행 하였다. 활성과 수율의 최적 조건을 예측하기 위해 MINITAB^® release 14 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 반응표면분석에서 독립변수의 종속변수에 대한 2차 회귀식은 다음과 같다.

[수학식 1]

모델에서 Y는 종속변수(항균 활성, 수율), X₁ (에탄올 함량), X₂ (추출 온도), X₃ (시료 대 용매비)는 독립변수, β₀는 절편, β_{1, 2, 3}은 선형항 계수, β_{12, 13, 23}은 상호작용항에 대한 계수, β_{11, 22, 33}은 2차항에 대한 계수이다.

변수	기호	코트화된 수준
변수	기호	-1	0	1
에탄올 (%)	X₁	20	40	60
온도 (℃)	X₂	70	85	100
시료 대 용매비	X₃	30	40	50

2.3. 추출방법옻나무 목질부 3g을 250ml 유리병에 담아 BBD에서 설계된 15개의 실험점에 대한 각각의 조건에 따라 추출을 진행하였다. 추출온도가 설정된 항온조에서 추출하였다. 추출시간은 총 10시간으로 1회 3시간 20분, 총 3회 추출하였으며, 추출액은 감압농축하여 용매를 완전히 날린 후 남은 잔사는 24시간 동안 동결건조하여 시료를 수득하였다. 그리고 상기 시료의 항균 및 항스쿠티카 활성을 검색하였고, 상기 시료의 수율도 확인하였다.

3. 최적화된 옻나무 추출물의 in vitro 항균, 항스쿠티카 및 항바이러스 활성

최적화된 추출물의 in vitro 항균, 항스쿠티카 및 항바이러스 활성을 열수추출물과 비교하여 활성을 평가하였다.

4. 최적화된 옻나무 추출물의 지표성분 함량분석

최적화된 추출물의 지표성분의 함량을 분석하기 위해서 LC-MS/MS를 사용하여 화합물들을 동시정량 하였다.

4.1. LC-MS/MS 조건

분석장비로는 Agilent 1260series와 Agilent 6460-triple quadrupole MS를 사용하였다. 분석 column은 Shiseido사의 Capcell pak C18 MG (4.6 x 250 mm, 5 ㎛)을 사용하였으며 column oven을 이용하여 30℃가 유지되도록 설정하였다. 용매는 0.1% formic acid가 첨가된 HPLC grade 메탄올과 물을 하기 표 2의 기울기 조건 (Rt)을 이용하여 유속 0.8 mL/min으로 분석하였으며 분석시간은 30분이었다. 분석 시 시료와 표준용액은 5㎕ 주입하였다. 이온발생기로 electro spray ion (ESI) negative mode를 사용하였다. 기기 파라미터는 capillary voltage 4000volts, 기체온도 350℃, 기체흐름 10L/min, nebulizer pressure 45psi 로 하였다. 갈산, 푸스틴 및 피세틴에 대한 Q1, Q3 질량 및 각 화합물에 대한 충돌 에너지를 하기 표 2에 나타내었다. 용매 조건 중 시간(분)과 메탄올(%)의 조합은 0분 및 25%, 5분 및 35%, 15분 및 35%, 20분 및 100% 또는 30분 및 100%이었다.

화합물	Rt (min)	Q1 질량 (m/z)	Q3 질량 (m/z)	충돌 에너지 (eV)
갈산	5.43	169	125.2	3
푸스틴	15.76	287.4	269.4, 109.1	5, 20
피세틴	22.79	285.4	163.1, 135.2	10, 15

4.2. 표준용액 제조 및 검량선 작성세 화합물의 표준곡선 작성을 위해 메탄올로 각각 1mg/ml의 표준용액을 제조 후 30ppm으로 희석하였다. 희석된 각 표준용액을 동량 합하여 세 화합물이 섞인 형태의 10ppm의 혼합물로 6개의 농도(10, 50, 100, 500, 1000 또는 1500 ng/ml)로 희석하였다. 이후 도출된 크로마토그램에서 각 농도별 peak area로 분석하여 표준곡선을 작성하였으며 회귀분석을 통해 r² 값을 산출하여 직선성을 확인하였다. LOD 및 LOQ는 ICH(International Conference on Harmonization) Q2B 가이드라인에 의거하여 산출하였다.

4.3. 정밀성 측정

1, 3, 5 ㎍/ml의 최적화된 추출물 시료를 제조 후 각 농도 당 intraday (n=3, 3회/일), interday (n=9, 연속 3일)의 세 화합물에 대한 함량의 % RSD (relative standard deviation)를 구하였다.

4.4. 회수율 측정

최적회된 추출물에 활성 화합물들을 각각 하기 표 3의 농도로 첨가하여 분석한 후, 최적화된 추출물에서의 활성 화합물들의 농도 차로 회수율을 구했으며, 하기 식에 도입하여 산출하였다.

[수학식 2]

	20 추출물	60 추출물
화합물	스파이크된 양 (ng/ml, ppb)
갈산	15	15
	30	30
	60	60
푸스틴	90	135
	180	270
	360	540
피세틴	15	15
	30	30
	60	60

4.5. 특이성 측정특이성은 분리, 정제한 화합물과 신규 생약 추출물 내의 MRM data 및 머무름시간을 비교하여 머무름시간이 동일한 peak의 MRM data를 확인한 후 어미 이온 및 산물의 이온을 비교하여 특이성을 확인하였다.

5. 최적화된 옻나무 추출물의 in vivo 항균, 항스쿠티카 및 항바이러스 활성

5.1. 실험어

실험에 사용한 어류는 전남 영광군에 위치한 넙치 종묘장에서 치어(평균 체중: 6.66±1.72g)를 구입한 후 전남 여수 돌산읍에 위치한 전남대학교 수산과학연구소에 순치한 뒤 3개월간 사육 후(평균체중: 13.43±2.20g) 본 실험에 사용하였다.

5.2. 실험어 사육

최적화된 추출물을 투여하기 위해 8개의(각 구당 120마리) 유수식 수조(900L)에 추출물을 흡착한 사료를 30, 100, 300mg/kg b.w.로 2주, 6주 및 10주간 경구투여하였으며, 이때 대조구는 일반사료(참넙치마루 2호, 천하제일사료)를 투여하였다. 추출물 흡착사료 투여 기간 동안 자연 수온(7월 내지 9월, 22.5 내지 28℃) 상태에서 사육하였으며, 차광막을 설치하여 사육하였다.

5.3. 최적화된 옻나무 추출물의 대량제조

600g의 옻나무 목질부 시료를 추출하였다. 추출시간은 총 10시간으로, 매 3시간 20분마다 한번씩 용매를 교체하여 총 3회 추출하였다. 추출액은 Whatman No.4 필터로 여과 후 감압농축하여 용매를 완전히 날렸으며, 감압농축 후 남은 잔사는 이틀 간 동결건조하였다. 동결건조된 시료는 막자사발로 곱게 간 후, 밀폐용기에 담아 4℃ 냉장고에 보관하여 추출물 흡착사료 제조용으로 사용하였다.

5.4. 최적화된 옻나무 추출물 첨가사료 제작 및 투여

동결건조된 옻나무 추출물을 33% 에탄올 수용액에 녹여 30, 100 또는 300mg/kg b.w. (300mg/kg of body weight)로 제작하여 어체중의 2%를 매일 1회로 2주, 6주, 10주간 경구투여하였다.

5.5. E. tarda에 대한 최적화된 옻나무 추출물의 in vivo 인위감염실험

2주, 6주, 10주간 최적화된 추출물을 투여한 넙치를 20L의 해수를 채운 사육수조에 14마리씩 2일간 순치 후, 감염 하루 전부터 30, 100 또는 300 mg/kg 농도로 추출물을 흡착한 사료를 어체중의 0.5%로 급이 하였으며 하루에 두 번씩 나눠서 투여하였다. 감염은 1x10⁶과 5x10⁶ CFU/ml 두 농도의 침지액 3L 상에서 1시간 동안 침지 후 해수 15L를 추가하여 최종적으로 20L를 맞춰주었다. 또한 감염 후에도 먹이를 먹지 않을 때까지 각 농도별로 추출물이 흡착된 사료를 어체중의 0.5%로 투여하였다. 실험 중 해수교환은 50%씩 하루에 두 번 진행하였으며, 수온은 22±0.5℃로 유지되었다. 매일 관찰하여 누적폐사율을 기록하였다.

5.6. 스쿠티카충에 대한 최적화된 옻나무 추출물의 in vivo 인위감염실험

2주, 12주간 최적화된 추출물을 투여한 넙치를 20L의 해수를 채운 사육수조에 15마리씩 2일간 순치 후, 감염 하루 전부터 30, 100 또는 300 mg/kg 농도로 추출물을 흡착한 사료를 어체중의 0.5%로 급이하였으며 하루에 두 번씩 나눠서 투여하였다. 감염은 2주차에 5.24x10⁴과 12주차에 7.7x10⁵cell/fish/100㎕로 근육주사하였다. 실험 중 해수교환은 50%씩 하루에 두 번 진행하였으며, 수온은 22±0.5℃로 유지되었다. 매일 관찰하여 누적폐사율을 기록하였다.

실험 결과

1. 옻나무 부위별 페놀릭, 플라보노이드 함량 및 DPPH 라디칼 소거 활성

옻나무의 잎, 껍질에 비해 목질부에서 총 페놀릭 및 플라보노이드 함량이 4배 많은 것으로 확인되었다. 또한 DPPH 라디칼 소거능도 목질부에서 잎과 껍질에 비해 2배 높은 활성을 나타냈다. 따라서 옻나무 목질부가 껍질에 비해 플라보노이드 및 페놀릭 함량이 월등히 높으며, 이러한 생리활성물질에 기인하여 항산화 활성 또한 우수함을 확인하였다 (도 1).

2. 옻나무 부위별 추출물의 in vitro 항균, 항스쿠티카 활성

모든 시험균주에서 옻나무 목질부 추출물이 가장 우수한 활성을 나타내었고, 또한 옻나무 부위별 추출물 및 분획물 활성에서도 목질부 추출물과 그로부터 얻은 분획물들이 껍질에 비해 매우 우수한 활성을 보여주었다.

따라서 위 실험결과, 옻나무 목질부가 껍질에 비해 높은 플라보노이드 및 페놀릭 함량을 보여주었으며, 우수한 항산화 활성과 항균 및 항스쿠티카 활성을 나타내어 최종적으로 옻나무 목질부를 최종 시료로 선정하였다.

균주		E. tarda KCTC12267	V. anguillarum KCTC2711	S. iniae KCTC3657
유래	부분	2mg/disc (mm)	2mg/disc (mm)	2mg/disc (mm)
목질부		11.74	12.70	10.46
껍질부		-	12.08	7.47
DMSO 비히클		-	-	-
옥시테트라사이클린 30㎍		20.85	19.78	19.81
아목시실린 10㎍		18.55	21.19	22.06
세균수 (CFU/dish)		1.12x10⁷	1.04x10⁷	0.99x10⁷
-: 활성없음

옻나무껍질 또는 목질부의 추출물 또는 이의 분획물		E. tarda KCTC12267	V.anguillarum KCTC2711	S.iniae KCTC3657	M. avidus
옻나무껍질 또는 목질부의 추출물 또는 이의 분획물		2mg/disc (cm)	2mg/disc (cm)	2mg/disc (cm)	ppm (㎍/ml)
껍질부	80% 메탄올 추출물 (T)	0.6	1.1	1.2	500
	추출물의 n-헥산 분획물 (H)	0.0	1.9	2.1	500
	추출물의 클로로포름 분획물 (C)	0.0	1.7	1.8	250
	추출물의 에틸 아세테이트 분획물 (EA)	1.1	0.0	0.0	500
	추출물의 수포화부탄올 분획물 (Bu)	0.0	0.0	0.0	-
	추출물의 물 분획물 (W)	0.0	0.0	0.0	-
목질부	80% 메탄올 추출물 (T)	1.0	1.0	0.9	250
	추출물의 n-헥산 분획물 (H)	0.0	0.0	0.0	1000
	추출물의 클로로포름 분획물 (C)	1.1	1.0	1.0	125
	추출물의 에틸 아세테이트 분획물 (EA)	1.2	1.0	0.9	500
	추출물의 수포화부탄올 분획물 (Bu)	0.0	0.0	0.0	500
	추출물의 물 분획물 (W)	0.0	0.0	0.0	-
	추출물의 열수 추출물.	0.9	0.9	0.8	NT
옥사테트라사이클린 30㎍		2.2	2.0	2.0	포르말린
아목시실린 10㎍		2	2.4	2.4	31.25
세포수 (CFU/dish)		1.76x10⁷	1.77x10⁷	1.71x10⁷	3x10⁵ cell/ml
-: 활성없음, NT: not tested

3. 옻나무 목질부 추출물의 항균, 항스쿠티카 활성 및 수율 최적화3.1. 독립변수들의 수준설정

독립변수의 수준설정을 위해 각기 다른 에탄올 함량으로 추출한 추출액의 항균 활성과 추출 수율을 검토하였다. 두 반응변수 모두 에탄올 함량이 증가할수록 활성과 수율이 증가하는 것을 보여주었고, 항균 활성의 경우 에탄올 함량이 40% 일 때 가장 높은 활성을 나타내었으며 추출 수율의 경우 60%에서 가장 높은 값을 기록하였다 (도 3). 각 점을 2차항으로 추세선을 작성한 결과 비선형임을 확인하였으며 곡률효과가 있는 것으로 판단하여 반응표면분석을 실시하였다. 활성 중심으로 실험조건을 설정하였으며, 최종적으로 반응표면분석을 위한 각 독립변수의 최소점과 최고점 수준은 에탄올 함량 20, 60%, 추출 온도 70, 100℃, 시료 대 용매비 30, 50배로 결정하였다.

3.2. 항균, 항스쿠티카 활성 모델 확립

옻나무 목질부로부터 활성과 수율이 최적화된 추출조건을 얻기 위해 BBD로부터 얻어진 15개의 실험 조건에 대한 활성 및 수율 결과를 얻었으며, 실험결과를 토대로 반응표면회귀분석을 실시하였고, 각 종속변수에 대한 회귀식을 구하였다. 하기 표의 예측값^a는 수학모델로부터 생성하였다. 하기 표 6은 BBD 모델에서의 매트릭스를 나타낸 것이다.

시도 횟수	독립변수			의존변수
	에탄올 % (X₁)	온도 ℃ (X₂)	시료 대 용매중량비 (X₃)	억제 영역 (mm, Y₁)		최소치사농도 (ppm, Y₂)		수율 (%, Y₂)
	에탄올 % (X₁)	온도 ℃ (X₂)	시료 대 용매중량비 (X₃)	실제값	예측값^a	실제값	예측값	실제값	예측값
1	60 (+1)	70 (-1)	40 (0)	10.27	10.56	500	500	9.6	9.7
2	60 (+1)	100 (+1)	40 (0)	11.92	11.99	1000	938	9.3	9.3
3	60 (+1)	85 (0)	30 (-1)	12.09	12.00	500	531	9.9	9.9
4	40 (0)	70 (-1)	50 (+1)	11.56	11.54	500	469	9.0	9.0
5	40 (0)	85 (0)	40 (0)	12.15	12.04	500	500	9.2	9.2
6	60 (+1)	85 (0)	50 (+1)	11.91	11.64	500	531	9.8	9.7
7	20 (-1)	70 (-1)	40 (0)	10.51	10.44	500	562	7.8	7.8
8	20 (-1)	85 (0)	30 (-1)	11.20	11.47	250	219	8.5	8.6
9	20 (-1)	100 (+1)	40 (0)	11.80	11.51	250	250	9.2	9.1
10	20 (-1)	85 (0)	50 (+1)	11.47	11.56	250	219	9.1	9.1
11	40 (0)	100 (+1)	50 (+1)	11.52	11.72	500	531	9.0	9.1
12	40 (0)	100 (+1)	30 (-1)	12.89	12.91	500	531	9.3	9.3
13	40 (0)	85 (0)	40 (0)	12.04	12.04	500	500	9.0	9.2
14	40 (0)	85 (0)	40 (0)	11.92	12.04	500	500	9.3	9.2
15	40 (0)	70 (-1)	30 (-1)	10.81	10.61	500	469	8.5	8.4

가) 항균 활성 모델 확립항균 활성 모델은 회귀 계수 추정과 이차 다항식 모델에 대한 유의성 검정으로 확립하였다.

용어	계수	계수의 표준오차	T	P
상수	12.0367	0.1739	69.222	0.000^*
선형
X₁	0.1512	0.1065	1.420	0.215
X₂	0.6225	0.1065	5.846	0.002^*
X₃	-0.0662	0.1065	-0.622	0.561
원형
	-0.4696	0.1567	-2.996	0.030^*
	-0.4421	0.1567	-2.821	0.037^*
	0.1004	0.1567	0.641	0.550
교호작용
X₁ X₂	0.0900	0.1506	0.598	0.576
X₁ X₂	-0.1125	0.1506	-0.747	0.489
X₂ X₃	-0.5300	0.1506	-3.520	0.017^*
R²=93%, R²(adj)=80.5% *: P < 0.05

모델 방정식의 통계적 유의성은 T-검정으로 평가 되었으며, P < 0.05인 항이 유의적이므로 이 모델에서 X₂,

,

, X₂ X₃ 항은 유의한 인자로 예측할 수 있다. 최종 적합 모델을 확인하기 위해 고차항부터 유의하지 않은 항을 차례로 제거하여 모형을 축소하였다. 단, 유의한 고차항에 포함된 주효과는 P값이 0.05이상이어도 계층적 모형을 유지하기 위해 최종 모델에 포함시켰다. 잔차 그림과 분산분석을 통해 모형의 유효성을 판단하였다. 잔차 그림을 통해 축소된 모형의 정규분포, 모든 적합치에서 분산의 동일성, 시간에 따른 임의성이 적합함을 확인하였으며, 분산분석에서 축소된 모델의 모든 항이 유의적임을 나타내었다. 모형의 적합성을 나타내는 적합성 결여(lack-of-fit) 값은 P > 0.05 임으로 축소된 모형이 적합함을 나타내었으며, 회귀모형의 반응변수에 대한 변동을 설명해주는 R² (adj)값은 84.6%로 확인되었다 (도 3). 축소된 최종적인 모형은 다음 식과 같다.[수학식 3]

하기 표 8은 항균 활성 회귀 모형에 대한 분석 편차를 나타낸 것이다.

소스	DF	MS	F	P
회귀	6	0.98886	13.79	0.001
선형	3	1.10606	15.42	0.001
원형	2	0.74569	10.40	0.006
교호작용	1	1.12360	15.67	0.004
잔여오류	8	0.07172	-	-
적합성 결여	6	0.09122	6.89	0.132
순수오차	2	0.01323	-	-
총합	14	-	-	-
R²=91.2% R²(adj)=84.6% DF: degree of freedom; MS: Sum of square/DF

나) 항스쿠티카 활성 모델 확립

항스쿠티카 활성 모델은 회귀 계수 추정 및 이차 다항식 모델에 대한 유의도 검정으로 확립하였다.

용어	계수	계수의 표준오차	T	P
상수	500.00	32.27	15.492	0.000*
선형
X₁	156.25	19.76	7.906	0.001*
X₂	31.25	19.76	1.581	0.175
X₃	0.00	19.76	0.000	1.000
원형
	-31.25	29.09	-1.074	0.332
	93.75	29.09	3.233	0.023*
	-93.75	29.09	-3.233	0.023*
교호작용
X₁ X₂	187.50	27.95	6.708	0.001*
X₁ X₂	-0.00	27.95	-0.000	1.000
X₂ X₃	0.00	27.95	0.000	1.000
R²=96.4% R²(adj)=89.9% *: P < 0.05

모델 방정식의 통계적 유의성은 T-검정으로 평가 되었으며, P < 0.05인 항이 유의적이므로 이 모델에서

,

, X₁ X₂항은 유의한 인자로 예측할 수 있다. 최종 적합 모델을 확인하기 위해 고차항부터 유의하지 않은 항을 차례로 제거하여 모형을 축소하였다. 단, 유의한 고차항에 포함된 주효과는 P값이 0.05이상이어도 계층적 모형을 유지하기 위해 최종 모델에 포함시켰다. 잔차 그림과 분산분석을 통해 모형의 유효성을 판단하였다. 잔차 그림을 통해 축소된 모형의 정규분포, 모든 적합치에서 분산의 동일성, 시간에 따른 임의성이 적합함을 확인하였으며, 분산분석에서 축소된 모델의 모든 항이 유의적임을 나타내었다. 모형의 적합성을 나타내는 적합성 결여 값은 P > 0.05 임으로 축소된 모형이 적합함을 나타내었으며, 회귀모형의 반응변수에 대한 변동을 설명해주는 R² (adj)값은 89.9%로 확인되었다 (도 4). 축소된 최종적인 모형은 다음 식과 같다.[수학식 4]

하기 표 10은 항스쿠티카 활성 회귀 모형에 대한 분석 편차를 나타낸 것이다.

소스	DF	MS	F	P
회귀	6	69017	28.71	0.000
선형	3	67708	28.17	0.000
원형	2	35176	14.63	0.002
교호작용	1	140625	58.50	0.000
잔여오류	8	19231	-	-
적합성 결여	6	19231	*	*
순수오차	2	0	-	-
총합	14	-	-	-
R²=91.2% R²(adj)=84.6% DF: degree of freedom; MS: Sum of square/DF

다) 수율 모델 확립

수율 모델은 회귀 계수 추정 및 이차 다항식 모델에 대한 유의도 검정으로 확립하였다.

용어	계수	계수의 표준오차	T	P
상수	9.16667	0.07032	130.363	0.000^*
선형
X₁	0.50000	0.04306	11.612	0.000^*
X₂	0.23750	0.04306	5.516	0.003^*
X₃	0.08750	0.04306	2.032	0.098
원형
	0.09167	0.06338	1.446	0.208
	-0.28333	0.06338	-4.470	0.007^*
	0.06667	0.06338	1.052	0.341
교호작용
X₁ X₂	-0.42500	0.06090	-6.979	0.001^*
X₁ X₂	-0.17500	0.06090	-2.874	0.035^*
X₂ X₃	-0.20000	0.06090	-3.284	0.022^*
R²=98.1% R²(adj)=94.8% *: P < 0.05

모델 방정식의 통계적 유의성은 T-검정으로 평가 되었으며, P < 0.05인 항이 유의적이므로 이 모델에서 X₁, X₂,

, X₁ X₂, X₁ X₂, X₂ X₃항은 유의한 인자로 예측할 수 있다. 최종 적합 모델을 확인하기 위해 고차항부터 유의하지 않은 항을 차례로 제거하여 모형을 축소하였다. 단, 유의한 고차항에 포함된 주효과는 P값이 0.05이상이어도 계층적 모형을 유지하기 위해 최종 모델에 포함시켰다. 잔차 그림과 분산분석을 통해 모형의 유효성을 판단하였다. 잔차 그림을 통해 축소된 모형의 정규분포, 모든 적합치에서 분산의 동일성, 시간에 따른 임의성이 적합함을 확인하였으며, 분산분석에서 축소된 모델의 모든 항이 유의적임을 나타내었다. 모형의 적합성을 나타내는 lack-of-fit 값은 P > 0.05 임으로 축소된 모형이 적합함을 나타내었으며, 회귀모형의 반응변수에 대한 변동을 설명해주는 R²(adj)값은 94.0%로 확인되었다 (도 5). 축소된 모형은 다음 식과 같다.[수학식 5]

하기 표 12는 항균 활성 회귀 모형에 대한 분석 편차를 나타낸 것이다.

소스	DF	MS	F	P
회귀	7	0.54880	32.45	0.000
선형	3	0.83750	49.52	0.000
원형	1	0.32411	19.16	0.003
교호작용	3	0.33500	19.81	0.001
잔여오류	7	0.01691	-	-
적합성 결여	5	0.01435	0.61	0.714
순수오차	2	0.02333	-	-
총합	14	-	-	-
R²=97.0% R²(adj)=94.0% DF: degree of freedom; MS: Sum of square/DF

3.3. 다중 반응 최적화

옻나무 추출물의 항균 활성 및 수율의 최종 모델을 통해 항균 활성 12mm 이상과 수율 10% 이상의 두 가지 반응변수에 대하여 반응표면분석을 진행하였으며, 이로부터 최적화된 반응조건은 에탄올 함량 60%, 추출온도 86.1645℃, 시료 대 용매비는 30배로 도출되었다. 이에 따른 종속변수의 반응예측치는 항균활성이 11.9254mm, 수율은 9.8438%로 예측되었으며, 이때의 종합만족도(D)는 0.84733이었다.

항스쿠티카활성 및 수율의 최종 모델을 통해 항스쿠티카활성 200ppm 이하와 수율 9% 이상의 두 가지 반응변수에 대하여 반응표면분석을 진행하였으며, 이로부터 최적화된 반응조건은 에탄올 함량 20%, 추출온도 100℃, 시료 대 용매비 30배로 도출되었다. 이에 따른 종속변수의 반응예측치는 항스쿠티카활성이 173.08ppm, 수율은 9.0625%로 예측되었으며, 이때의 종합만족도는 0.25이었다.

항균, 수율최적화 추출물의 경우, 본 실험실의 추출공정상 한계로 추출온도를 86.1645℃로 설정하는 것이 어렵기 때문에 설정이 가능한 85℃로 추출온도를 조정하여 추출하였다. 다중 반응 최적화를 통한 최적반응조건에 대한 검증 실험을 한 결과 항균활성은 12.09mm, 수율은 10%로 최종회귀모형이 반응변수에 대한 변동을 설명해주고 있다는 것을 확인하였으며, 모델에 대한 신뢰도가 높은 것으로 확인되었다 (도 6).

항스쿠티카, 수율최적화 추출물을 추출하여 검증 실험을 한 결과 항스쿠티카활성은 225ppm, 수율은 9.3%로 최종회귀모형이 반응변수에 대한 변동을 설명해주고 있음을 확인하였으며, 마찬가지로 모델에 대한 신뢰도가 높은 것으로 확인되었다 (도 7).

항균, 항스쿠티카활성과 수율에 영향을 미치는 독립변수들의 상호작용관계를 알아보기 위해 시료 대 용매비율을 30배로 고정한 후, 독립변수들의 3차원 반응표면도를 도 8 및 9에 나타내었다. 항균활성의 경우 추출온도가 올라갈수록 항균활성이 증가되는 경향을 보여주었다. 추출온도 100℃에서 에탄올 함량이 증가할수록 항균활성이 증가하는 패턴을 보여주었으며 에탄올 함량 40 내지 50% 근방에서 최고활성을 나타내는 것을 확인하였다. 항스쿠티카활성은 추출온도 100℃에서 에탄올 함량이 낮아질수록 활성이 좋아지는 경향을 보이며 에탄올 함량 20%에서 최대 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 수율의 경우에는 항균활성과 마찬가지로 추출온도가 증가 할수록 추출 수율이 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한 에탄올 함량이 증가함에 따라 수율도 올라가는 경향을 보여주었으며 에탄올 함량 60%, 추출온도 80 내지 90℃ 사이에서 수율이 최대가 되는 것을 나타내었다. a는 수학모델로 생성된 예측값을 의미하며, B는 테스트하지 않은 것을 의미한다. 최적화 조건 및 다중 반응 최적화에서 결정된 실제값과 예측값을 비교한 것을 하기 표 13에 나타냈다.

반응	최적화 조건			복합 적합도 (D)	실제값	예측값^a	예측용량 (%)
반응	에탄올 % (X1)	온도 (X2)	시료 대 용매비 (X3)	복합 적합도 (D)	실제값	예측값^a	예측용량 (%)
항균 활성(mm)	43	100	30	0.87939	NT^b	12.88	-
항스쿠티카 활성 (ppm)	20	100	30	1.0000	225	173.08	76.92
수율 (%)	60	85	30	0.84474	10.00	9.84	101.63

	다중 반응 최적화			0.84733	-	-	-
항균 활성 (mm)	60	85	30	0.85083	12.09	11.93	101.34
수율 (%)	60	85	30	0.84384	10.00	9.84	101.63
	다중 반응 최적화			0.25000	-	-	-
항스쿠티카 활성(ppm)	20	100	30	1.0000	225	173.08	76.92
Yield (%)	20	100	30	0.06250	9.30	9.06	102.62
예측값^a: 수학모델로 생성한 예측값, NT^b: not tested

하기에서 추출물 중 60.85.30은 옻나무 목질부의 60부피% 에탄올 수용액 추출물을 85℃에서 옻나무 목질부 분쇄물 대 용매비를 1: 30으로 하여 추출한 추출물을 의미하며, 20.100.30은 옻나무 목질부의 20부피% 에탄올 수용액 추출물을 100℃에서 옻나무 목질부 분쇄물 대 용매비를 1: 30으로 하여 추출한 추출물을 의미한다.

4. 최적화된 추출물의 in vitro 항균, 항스쿠티카 및 항바이러스활성

4.1. 항균, 항스쿠티카 활성

옻나무 추출물 및 옻나무 추출물의 주요 화합물들에 대한 항균활성을 검토한 결과, 푸스틴, 피세틴의 경우 1000 ㎍/ml, 갈산은 500 ㎍/ml의 항균활성을 나타내었다. 최적화된 추출물의 MIC는 각각 250 ㎍/ml을 나타내었다. 항스쿠티카활성은 피세틴의 경우 >1000 ㎍/ml, 갈산은 250 ㎍/ml의 활성을 나타내었다. 최적화된 추출물의 MIC는 20, 60 추출물에서 각각 225, 500 ㎍/ml의 MLC를 나타내었다. 일반적으로 천연물을 열수추출물로서 많이 이용하기 때문에 이의 활성을 비교한 결과, 최적화된 추출물의 항균, 항스쿠티카 활성이 열수추출물에 비해 매우 우수하였으며, 마찬가지로 추출 수율 또한 증가한 것을 확인하였다. 또한 추출물을 구성하고 있는 주요화합물들의 항균활성보다 최적화된 추출물의 활성이 높음을 알 수 있으며, 이는 단일 화합물보다 최적화된 추출물의 가치를 더 부여할 수 있는 특징으로 판단된다.

시료	수율 (%)	E. tarda FJ1408	E. tarda KCTC12267	V. anguillarum KCTC2711	S. iniae KCTC3657	M. avidus
시료	수율 (%)	ppm (㎍/ml)	ppm (㎍/ml)	ppm (㎍/ml)	ppm (㎍/ml)	ppm (㎍/ml)
갈산	-	500	>2000	500	500	250
푸스틴	-	1000	1000	1000	1000	NT
피세틴	-	1000	1000	2000	1000	>1000
설퓨레틴	-	1000	1000	NT	NT	NT
20 추출물	9.0	250	250	1000	1000	225
60 추출물	10.0	250	250	1000	1000	500
열수 추출물	7.5	500	NT	NT	NT	500
옥시테트라사이클린	-	0.5	0.5	0.25	0.25	포르말린
옥시테트라사이클린	-	0.5	0.5	0.25	0.25	31.25
세균수 (CFU/ml)	-	7.5x10⁵	6.1x10⁵	7.7x10⁵	8.4x10⁵	3x10⁵ cell/ml
-: 활성없음, NT: not tested

4.2. 항바이러스 활성

도 10에서 나타난 바와 같이, 최적화 추출물 20과 60의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 및 전염성 조혈기 괴사 바이러스에 대한 EC₅₀은 각각 0.68±0.01 및 0.83±0.04 ㎍/㎖과 0.83±0.04 및 0.78±0.12 ㎍/㎖로 나타났다. 또한, 열수추출물 보다 최적화된 추출물은 두 어류병원성바이러스에 대해 우수한 항바이러스활성을 보여주었다. a는 반수 영향 농도를 의미한다.

추출물	EC₅₀ ^a in FHM cells (㎍/㎖)
추출물	VHSV	IHNV
열수 추출물	1.93 ±0.17	1.00 ±0.49
20.100.30	0.68 ±0.01	0.67 ±0.03
60.85.30	0.83 ±0.04	0.78 ±0.12

5. 최적화된 추출물 중 지표성분의 함량분석 (Method validation)5.1. Linearity, LOD 및 LOQ 산출

세 화합물의 선형성 (r²)는 0.9999 이상으로 매우 높은 수준을 보여주었으며 각각의 LOD, LOQ는 하기 표 16에 나타내었다 (도 12).

화합물	선형성 (r²)	LOD (ng/ml)	LOQ (ng/ml)
갈산	0.99998	5.14	15.59
푸스틴	0.99998	4.93	14.94
피세틴	0.99998	5.29	16.03

5.2. 정밀성(precision) 측정

정밀성 측정을 위한 intra-, inter-day 실험결과, 세 화합물 모두 2% 미만의 RSD를 나타내어 본 분석방법의 정밀성이 매우 높은 수준임을 확인하였으며, 각 화합물의 자세한 결과는 하기 표 17에 나타내었다.

20 추출물 (㎍/ml)	정확성: RSD (%)
	Intraday (n=3)			Interday (n=9)
	갈산	푸스틴	피세틴	갈산	푸스틴	피세틴
1	0.80	0.26	0.94	1.88	0.72	0.71
3	1.53	0.39	0.54	1.39	0.53	0.57
5	0.47	1.86	0.32	0.77	1.11	0.25
60 추출물 (㎍/ml)	정확성: RSD (%)
	Intraday (n=3)			Interday (n=9)
	갈산	푸스틴	피세틴	갈산	푸스틴	피세틴
1	1.01	0.23	1.74	0.95	0.37	1.73
3	0.92	0.06	0.84	0.80	0.23	0.55
5	1.19	0.13	0.25	1.44	0.16	0.72

5.3. 회수율(accuracy) 측정세 화합물의 회수율의 범위는 92.09 내지 105.16%의 높은 회수율을 나타내었으며, RSD는 5.5% 미만을 확인하였다. 각 화합물에 대한 자세한 결과는 하기 표 18 및 19에 나타내었다.

화합물	20 추출물
화합물	Original (ng/ml)	Spiked (ng/ml)	Detected (ng/ml)	Recovery (%)	RSD (%)
갈산	29.65	15	44.34	99.31	0.41
		30	54.93	92.09	1.78
		60	86.08	96.02	2.09
푸스틴	188.19	90	268.23	96.42	3.75
		180	355.62	96.59	1.54
		360	542.43	98.95	1.04
피세틴	31.97	15	47.67	101.49	5.31
		30	57.91	93.45	5.44
		60	89.72	97.55	1.98

화합물	60 추출물
화합물	Original (ng/ml)	Spiked (ng/ml)	Detected (ng/ml)	Recovery (%)	RSD (%)
갈산	18.33	15	30.81	92.44	4.34
		30	44.74	92.57	5.03
		60	75.68	96.62	1.58
푸스틴	212.71	135	328.42	94.45	1.86
		270	470.88	97.55	1.48
		540	791.53	105.16	1.27
피세틴	27.31	15	40.34	95.34	3.53
		30	53.98	94.19	2.43
		60	84.53	96.82	1.17

5.4. 특이성(specificity)

최적화된 추출물 내 지표성분들의 MRM data와 각 표준 화합물의 MRM data와 머무름시간을 비교하였다. 그 결과, 표준물질의 머무름시간과 추출물내의 지표성분의 머무름시간이 동일하였으며 fragment pattern에서 정량이온과 정성이온의 비율 또한 일치하는 것을 확인하였다 (도 13 내지 16).

5.5. 지표성분의 함량분석

이상의 분석조건을 이용하여 최적화된 추출물 중 지표성분의 함량분석을 하였다. 1, 3, 5 ㎍/ml 농도의 최적화된 추출물에서의 갈산의 함량은 20 추출물에서 3.07±0.06 %, 60 추출물에서 1.82±0.05 % 이었으며 푸스틴의 함량은 20 추출물에서 19.77±0.42 %, 60 추출물에서 20.90±0.58 % 이었으며 마지막으로 피세틴은 20 추출물에서 2.52±0.02 %, 60 추출물에서 2.12±0.08 %로 확인되었다. 자세한 결과는 하기 표 20 및 21에 나타내었다.

20 추출물 (㎍/ml)	갈산			푸스틴			피세틴
20 추출물 (㎍/ml)	%, 평균 (mean)	SD	RSD (%)	%, 평균 (mean)	SD	RSD (%)	%, 평균 (mean)	SD	RSD (%)
1	3.04	0.06	1.88	20.09	0.14	0.72	2.52	0.02	0.71
3	3.13	0.04	1.39	19.98	0.11	0.53	2.52	0.01	0.57
5	3.04	0.02	0.77	19.23	0.21	1.11	2.51	0.01	0.25
평균(Average)	3.07	0.06	1.95	19.77	0.42	0.02	2.52	0.02	0.62

60 추출물 (㎍/ml)	갈산			푸스틴			피세틴
60 추출물 (㎍/ml)	%, 평균 (mean)	SD	RSD (%)	%, 평균 (mean)	SD	RSD (%)	%, 평균 (mean)	SD	RSD (%)
1	1.83	0.02	0.95	21.34	0.08	0.37	2.19	0.04	1.73
3	1.88	0.01	0.80	21.26	0.05	0.23	2.15	0.01	0.55
5	1.76	0.02	1.14	20.09	0.03	0.16	2.01	0.01	0.72
평균 (Average)	1.82	0.05	2.96	20.90	0.58	2.78	2.12	0.08	3.74

6. E. tarda에 대한 최적화된 옻나무 추출물의 in vivo 효능6.1. 2주 투여구 항균 활성

5x10⁶ 및 1x10⁶CFU/ml의 농도로 침지시켜 E.tarda FJ1408로 감염시킨 시험어 A 및 B에 20 추출물 및 60 추출물을 하루에 30, 100 또는 300 mg/kg으로 2주 동안 투여한 구는 대조구에 비해 상대생존율이 최소 7.1%, 최대 100%를 나타내었으며, 통계적으로 유의한 것으로 확인되었다 (도 17 및 18). 따라서 최적화된 추출물을 어체에 투여 시 어류감염성질병에 매우 우수한 항병효과가 있음이 증명되었다.

6.2. 6주 투여구 항균활성

5x10⁶ 및 1x10⁶CFU/ml의 농도로 침지시켜 E.tarda FJ1408로 감염시킨 시험어 A 및 B에 20 및 60추출물을 30, 100, 300 mg/kg으로 6주동안 투여한 구는 대조구에 비해 상대생존율이 최소 8.3%, 최대 83.3%를 나타내었으며, 통계적으로 유의한 것으로 확인되었다 (도 19 및 20). 따라서 최적화된 추출물을 어체에 투여 시 어류감염성질병에 매우 우수한 항병효과가 있음이 증명되었다.

6.3. 10주 투여구 항균활성

5x10⁶ 및 1x10⁶CFU/ml의 농도로 침지시켜 E.tarda FJ1408로 감염시킨 시험어 A 및 B에 20 및 60추출물을 30, 100, 300 mg/kg으로 10주동안 투여한 구는 대조구에 비해 상대생존율이 최소 54.5%, 최대 90.9%를 나타내었으며, 통계적으로 유의한 것으로 확인되었다 (도 21 및 22). 따라서 최적화된 추출물을 어체에 투여 시 어류감염성질병에 매우 우수한 항병효과가 있음이 증명되었다.

7. 스쿠티카충에 대한 최적화된 옻나무 추출물의 in vivo 효능

7.1. 2주 투여구 항스쿠티카 활성

최적화된 20추출물을 10, 100 mg/kg으로 투여한 구의 상대생존율은 각각 21.4%, 64.3%를 나타내어, 최적화된 추출물이 우수한 항스쿠티카 활성이 있음을 확인하였다 (도 24).

	대조군	10mg/kg	100mg/kg
사망률	93.3	73.3	33.3
RPS	-	21.4	64.3

7.2. 12주 투여구 항스쿠티카 활성최적화된 20추출물과 60추출물을 30, 100, 300 mg/kg으로 투여한 구는 대조구에 비해 상대생존율이 최소 18%, 최대 36%를 나타내어, 최적화된 추출물이 우수한 항스쿠티카 활성이 있음을 확인하였다 (도 25).

Claims

옻나무 목질부 유래 푸스틴을 포함하는 비브리오 안귤라룸(Vibrio anguillarum) 및 스트렙토코크스 이니에(Streptococcus iniae) 중 적어도 1종에 대한 어류의 항균 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 푸스틴은 옻나무 목질부 추출물에 포함된 것이고, 상기 추출물은 물, 10 내지 70부피%의 에탄올 수용액 또는 이의 혼합용매 추출물인 어류의 항균 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 추출물은 물 추출물인, 어류의 항균 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 추출물은 80 내지 110℃에서 추출된 것인, 어류의 항균 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 추출물은 상기 옻나무 목질부 중량의 10 내지 40배의 용매로 추출된 것인, 어류의 항균 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 추출물은 50 내지 70부피%의 에탄올 수용액으로 80 내지 90℃에서 추출된 것인, 어류의 항균 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 추출물은 물, 10 내지 70부피%의 에탄올 수용액 추출물 또는 이의 혼합 용매 추출물의 유기용매 분획물인, 어류의 항균 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 유기용매는 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 수포화 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 어류의 항균 조성물.