KR20190132891A

KR20190132891A - 잣나무 부산물 추출물을 함유하는 헬리코박터파일로리균 제균 효과를 갖는 조성물

Info

Publication number: KR20190132891A
Application number: KR1020180058022A
Authority: KR
Inventors: 김배용; 이운규
Original assignee: (주) 피러스
Priority date: 2018-05-21
Filing date: 2018-05-21
Publication date: 2019-11-29
Also published as: CN112153975A; WO2019225953A2; WO2019225953A3

Abstract

본 발명은 잣나무 부산물 추출물의 헬리코박터파일로리균 제균 효과를 갖는 조성물에 관한것으로 잣나무 부산물을 증류수로 추출하고 이를 제형화한 조성물을 통해, H.pyloriIgG 항체가 감소하였으며, 위 점막조직에서 CLO검사를 통하여 치료율을 환산한 결과 높은 치료율을 나타내었고, 위 점막에서의 cytokine 변화를 알아보기 위해 측정한 TNF-α, IL-1β의 결과 농도감소가 나타났다.

Description

잣나무 부산물 추출물을 함유하는 헬리코박터파일로리균 제균 효과를 갖는 조성물{composition for removing helicobacter pyloricomprising extract from pine-tree by-product}

본 발명은 잣나무 부산물 추출물을 포함하는 헬리코박터파일로리균 제균효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.

헬리코박터는 그램음성(gram-negative) 박테리아로서 인체에 만성, 급성위염, 위궤양 및 위암 등을 유발하는 것으로 알려진 병원체이다. 산업사회의 경우 60세 이상의 인구 중 과반수 이상이 감염되어 있으며, 개발도상국가에서는 대부분의 인구가 유년기부터 감염되어 있는 것으로 보고되어 있다. 2살부터 8살사이 유아의 경우 약10%가 매년 감염되기 때문에 10대 청소년이 되면 거의 대부분이 감염되는 추세를 보이고 있다. 2017년 현재 국내에서는 회사원이나 전문직 직업을 갖은 사람에게서 높은 감염률을 보이고 있으며, 20대 이후 70%이상의 높은 감염률을 보이고 있다. 이전에는 위염, 위궤양과 같은 위장 질환이 일차적으로 위산과다 즉, 과량의 위산 분비에 기인하며, 원인으로 스트레스, 식품 및 유전적 요인 등에 의하여 염증이 생긴다고 알려져 왔지만, 최근에 와서는 헬리코박터에 의하여 감염되었을 때 염증이 발생한다는 것이 정설로 되어있다. 염증이 위장내 점막하층까지 퍼지게 되면 위궤양으로 발전하게 되고, 위암으로 바로 진행되는 것은 아니지만, 헬리코박터에 감염되면 위암으로 진행될 가능성이 3~5배 정도 높아지는 것으로 알려지고 있다. 수 년 전까지 이들 질환의 치료를 위하여 제산제(antacid), 히스타민 수용체의 길항작용제 등이 사용되어 왔다. 미국국립보건원은 90년대 중반에 와서야 헬리코박터와 위장질환과의 관계를 인정하여 테트라사이클린(tetracycline)이나 아목시실린(amoxicillin)과 같은 항생제의 사용을 다른 치료제와 병행하여 사용할 수 있도록 허용하고 있다. 최근 헬리코박터 박멸을 위한 3중 치료법(triple therapy)은 2~3주 동안 intensive한 치료를 요구하고 있다. 그러나 항생제의 사용에 따른 인체내의 축적, 부작용 및 내성을 갖는 박테리아의 출현 때문에 궁극적으로는 위질환을 치료할 수 있는 대체약품의 개발이 요구되고 있다. 국내외 위질환 치료제 및 예방용 제재의 개발현황을 보면, 면역시스템이나 항균제를 이용하거나, 박테리아 세포의 배출효소를 이용한 키트의 제조가 주류를 이루고 있으며 아직까지 세포인식에 관여하는 당배합체를 이용한 제재의 개발은 전무한 상태이다.

종래에 보고된 바에 의하면 헬리코박터는위장내 점막 상피세포에 결합하는데, 결합 기작이 주로 탄수화물과 이를 인식하는 박테리아 표면 단백질간의 상화작용에 의존하는 것으로 보고되고 있다. 특히 인식 탄수화물로는 뮤신(mucin) 당단백질의황산화당(sulfated carbonhydrate), 사이알릭락토스(sialyllactose) 및 퓨코실루이스 비 항원(fucosylatedlewis b antigen) 등이 보고되어 있다. 최근에는 글라이코스핑고리피드(glycosphingolipid)나 침속에 있는 뮤신 단백질을 이용하여 박테리아의 세포결합을 저해하려는 노력이 경주되고 있다. 이미 박테리아 표면 단백질수용체(adhesion)의 분리와 동정이 이루어져 있고, 인식 탄수화물을 이용한 당배합체의 개발은 매우 중요한 발명대상에 속한다. 기존의 항생제나 화학약품을 이용하면 부작용 뿐만 아니라 개발기술이 세포 파괴적인 반면, 숙주세포 표면의 탄수화물 인식 및 상호작용을 저해하는 신물질은 세포간 결합을 위장밖으로 유출시켜 위염증을 최소화하는 비파괴적 기술이라는 점에서 중요한 의미를 갖고 있다.

그러나 아직까지 헬리코박터파일로리의 위장내 증식 및 활동을 저해하는 잣나무 부산물 추출물에 대해 연구된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 점에 착안하여 헬리코박터파일로리의 위장내 증식 및 활동을 저해하는 생리활성 물질로 잣나무 부산물을 추출하여 얻어낸 잣나무 부산물 추출물을 부형제와 결합시켜 헬리코박터파일로리의 저해활성이 있는 헬리코박터파일로리균 제균 효과를 갖는 조성물을 제공하는 것을 해결 과제로 한다.

전술한 과제를 해결하기 위한 수단으로서,

본 발명의 헬리코박터파일로리제균효과를 갖는 조성물은 잣나무 부산물 추출물을 유효성분으로 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 파인플로우를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 헬리코박터파일로리의 제균방법은 헬리코박터파일로리균이 존재하는 환경에, 잣나무 부산물 추출물을 병존시킴으로써, 상기 헬리코박터파일로리균의 증식을 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한, 잣나무 부산물 추출물은 파인플로우와 혼합된 것을 특징으로 한다.

헬리코박터파일로리균에 의한 위질환 치료에 기존의 항생제나 화학의약품을 사용하는 경우 부작용이 나타날 뿐만 아니라, 개발기술이 세포 파괴적인 것인 반면, 본 발명의 헬리코박터파일로리균 제균 효과를 갖는 조성물은 소화기 장애 동물모델에서 시험물질 잣나무 부산물 추출물 투여에 의한 유효성을 평가한 결과, 헬리코박터파일로리균의 항체 감소 및 염증 cytokine을 감소시키는 비파과적 기술이므로 헬리코박터파일로리균에 의한 위질환 치료에 뛰어난 효과가 있으며, 헬리코박터파일로리균 저해활성물질의 탐색에 있어서 물질의 상대적인 농도에 따른 활성의 비례관계 뿐만 아니라 탐색대상인 물질들의 정량적 분석을 할 수 있어, 식품산업상 및 의약 산업상 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 동물 실험 설계에 관한 시간의 흐름에 따른 개략적 모식도이다.
도 2는 각 시점의 마우스 체중 측정 결과 그래프이다.
도 3은 각 시점의 마우스 사표섭취량 결과 그래프이다.
도 4는 각 시점의 마우스 음수섭취량 결과 그래프이다.
도 5는 혈청 내 H.pylori 항체(IgG) 검사에 대한 시험물질의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 H.pylori 감염에 대한 시험물질의 영향을 알아보기 위한 마우스 위 조직의 개별 관찰 이미지이다.
도 7은 H.pylori 감염에 대한 시험물질의 영향을 알아보기 위한 마우스의 조직 병리 검사 이미지이다.
도 8은 조직 병리학적 검사에서 각 시험군에 대한 염증 스코어를 나타낸 그래프이다.
도 9는 조직 병리학적 검사에서 각 시험군에 대한 위축 변화 스코어를 나타낸 그래프이다.
도 10은 조직 병리학적 검사에서 각 시험군에 대한 총점을 나타낸 그래프이다.
도 11은 각 시험군에 대한 CLO score를 나타낸 그래프이다.
도 12는 각 시험군에 대한 CLO 검사값을 나타낸 이미지이다.
도 13은 각 시험군에 대한 TNF-α값을 나탄낸 그래프이다.
도 14는 각 시험군에 대한 IL-1β값을 나타낸 그래프이다.
도 15는 각 시험군에 대한 PCR 검사 결과를 나타낸 그래프이다(레인 1~10 :동물 샘플, 레인P :PCR 양성대조군, 레인N : PCR 음성대조군).
도 16은 각 시험군에 대한 쥐 분변 항원 검사 이미지이다.

본 발명의 잣나무 부산물 추출물은 헬리코박터파일로리균을 제균 하는데 이용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 잣나무 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터파일로리 제균 효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 파인플로우를 더 포함할 수 있고, 잣나무 부산물 추출물과 파인플로우가 혼합되어 있다.

본 발명의 잣나무 부산물 추출물은 잣나무 구과 추출물인 것이 바람직하다.

본 발명의 잣나무 부산물 추출물을 함유하는 헬리코박터파일로리 제균 효과를 갖는 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등 경구 투여용 제형, 멸균 주사용액, 좌제 및 경피 투여용 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 분해제, 계면활성제 등의 부형제를 사용하여 제형화한다.

한 양태로서, 본 발명의 잣나무 부산물 추출물은 경구 투여용 고상 제제로 제형화할 수 있다. 경구 투여를 위한 고상 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되는데, 이러한 고상 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제협화된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 잣나무 부산물 추출물을 함유하는 조성물을 경구 투여용 액상 제제로 제형화할 수도 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 이러한 액상 제제에는 통상적으로 사용되는 불황성 희석제(예를 들면, 정제수, 에탄올, 리퀴드 파라핀) 이외에 여러가지부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명의 잣나무 부산물 추출물을 함유한 조성물은 비경구, 바람직하게는 복강내 투여를 위한 제제로 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 멸균된 수용액으로는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충용액을 이용할 수 있으며, 비수성용제로, 현탁제로는프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 이용될 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염 및 또는 완충제를 이용할 수 있다. 한편, 좌제의 경우에는 이의 통상적인 기제인 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 조성물은 유효량으로 비경구 또는 경구(경피, 피하, 정맥, 근육, 복강 등)를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기 "유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택될 수 있다.

또한, 또 다른 관점으로서, 본 발명의 잣나무 부산물 추출물은 식품학적으로 허용된 담체와 혼합하여 식품 조성물로서 제공될 수 있다. 본 발명의 잣나무 부산물 추출물은 식품 또는 음료 첨가물로 사용할 경우, 상기 잣나무 부산물 추출물을 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 잣나무 부산물 추출물의 혼합양은 그의 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

건강을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우, 상기 잣나무 부산물 추출물은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에, 장기간 복용이 가능하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소제시, 빵, 초콜릿류, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1- 잣나무 부산물 추출물의 제조

잣나무 부산물을 추출기 탱크에 투입하고, 85℃의 스팀을 760mmHg의 증기압을 유지하면서 추출기탱크내에 잣나무 부산물(구과)을 통과시키고, 스팀이 추출기 탱크 외부의 냉각기를 통과할 때의 온도를 8℃로 하여, 이때 추출된 추출물을 증류해서 정유 성분을 얻어 잣나무 부산물 추출물을 제조한다.

실시예 2- 잣나무 부산물 추출물을 함유한 헬리코박터파일로리균 증식 억제 조성물(시험물질)의 제조

잣나무 부산물 추출물 40 중량%와 파인플로우 60 중량%를 골고루 섞은 후 헬리코박터파일로리균 억제 시험에 사용하였다.

실험예 1- 헬리코박터 파일로리 감염 마우스에서의 잣나무 부산물 추출물 제균 효과에 관한 실험

도 1과 같이, H.pylori SS1(한국헬리코박터은행) 균주를 5% 양의 피가 첨가된 Trypticase Soy 한천배지에 접종하여 10% CO₂, 37℃ 및 micro-aerobic 조건에서 2~3일간 배양하였다.

본 시험에는 C57BL/6 마우스를 사용하였고, H.pylori감염율을 높이기 위해 H.pylori 감염 전 2일 및 감염 당일 제산제를 투여하였다. 모든군에 마우스용 존데(zoned)를 이용하여 5% Sodium Bicarbonate(NaHCO₃)를 마우스당 0.2ml, 1회씩 총 3일 동안 경구 투여하였다.

H. pylori 감염 전 마우스는 12시간 절식시켰다. G1(음성대조군)을 제외한 모든 군에 배양된 H. pylori는 5.0Х10⁹/mL colony-forming unit (CFU)의 균수로 맞추어 마우스용 존데(zonde)를 이용하여 0.2 mL씩 2일 간격으로 3회 경구투여하여 감염시켰다.

H. pylori 감염을 유발한 후 감염의 유지를 확인하기 위하여 H. pylori 감염 1주 후 모든 마우스에서facial vein에서 혈액을 채취하여 혈장을 분리하였다. H. pylori항체 측정은 Mouse H. pylori antibody(IgG) ELISA Kit (Cusabio Biotech Co., USA)를 이용하여 감염에 의해 항체 상승이 확인된 개체들만 선발하여 시험에 사용하였다.

시험군의 구성 및 투여 용량은 하기 표 1과 같고, 시험물질은 D.W에 현탁하여 마우스 kg 당 10ml씩 매일 같은 시간에 경구 투여하고, 일 1회씩 14일간(G3은 1주차, 1일 1회, 7일) 투여하였다.

시험군	질환유발	Name	시험물질	투여용량 (ml/kg)	동물 수
G1	PBS	Negative control	D.W	10	10
G2	H. pylori	Vehicle control	D.W	10	10
G3		Positive control	AMX + CLR + PPI(omeprazole)	10	10
G4		Positive control	25 mg/kg 감초추출물	10	10
G5		시험물질	100 mg/kg잣나무부산물 추출물	10	10
G6		시험물질	200 mg/kg잣나무부산물 추출물	10	10
G7		시험물질	400 mg/kg잣나무부산물 추출물	10	10

G1: Negative control (PBS + D.W), n=10G2: Vehicle control (H.pylori + D.W), n=10

G3: Positive control 1 (H.pylori + 14.25 mg/kg AMX + 7.15 mg/kg CLR + 400 μmol/kg omeprazole), n=10

G4: Positive control 2 (H.pylori + 25 mg/kg 감초추출물), n=10

G5: Test article (H.pylori + 100 mg/kg 잣나무부산물 추출물), n=10

G6: Test article (H.pylori + 200 mg/kg 잣나무부산물 추출물), n=10

G7: Test article (H.pylori + 400 mg/kg 잣나무부산물 추출물), n=10

AMX :Amoxicillin

CLR :Clarithromycin

PPI :Omeprazole

(1) 일반 증상 관찰 결과

시험기간 중 일반증상 및 사망/빈사동물 발생여부에 대하여 개체 별로 관찰하고, 특이증상을 보이는 개체에 한하여 기록을 유지하였다(정상인 경우 기록하지 않음). 그 결과 시험기간 동안 특이 증상이 있는 동물은 관찰되지 않았으며, 그 결과는 하기 표 2와 같다.

동물 임상 관찰 실험 결과

Group	H. pyloriinfection	Positive control /Test article	Number of mouse	Clinical Observations
G1	PBS	D.W	10	N
G2	H. pyloriinfection	D.W	10	N
G3		AMX + CLR + PPI(omeprazole) (Positive control 1)	10	N
G4		감초추출물 (Positive control 2)	10	N
G5		잣나무부산물 추출물	10	N
G6			10	N
G7			10	N

N : normal

(2) H.pylori 감염의 유지 확인 및 군 구성 결과

감염 유발 1주 후, H.pylori 감염된 마우스의 Facial skin 에서 혈액을 채취한 후 분리된 혈장과 실험 종료 시점에 복대정맥으로부터 채혈 후 분리된 혈장을 Mouse H.pylori antibody, IgG ELISA kit를 이용하여 각각 혈장 내 H.pylork 항체역가를 측정하여 군간 비교하였다.

H. pylori 항체를 측정하여 평균 및 표준편차를 산정한 결과는 하기 표 3과 같이, 비감염군G1(음성대조군)은 0.21±0.03,감염군인 G2 내지 G7의 평균값은 0.47±0.16로 측정되었다. H. pylori 항체는 비감염군에 비해 감염군에서 123.8%로 통계적으로 유의하게 상승하였다(p<0.01, 표 3).

H.pylori 항체 IgG 테스트 결과

Group	Number of mouse	H. pyloriIgG test
Non-Infection	10	0.21 ± 0.03
Infection	60	0.47 ± 0.16**

데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 통계 분석은 sigma plot 통계를 사용하여 수행하였으며, p 값은 비감염 그룹과 비교하는 수준에서 설정되었다.**p<0.01

(3) 체중 및 사료섭취량, 음수소비량 측정 결과

체중은 제산제 투여 시점(-1 week post infection, w.p.i.), H. pylori 3회 반복 감염 종료 후(0 week post infection, w.p.i.), 감염 유지 확인 후 군 분리 전(1 w.p.i.), 2주 휴지기 후에 시험물질 투여 개시 시점(2 w.p.i.)및 2 주간 연일 시료 투여하고 시험 종료 시점(3w.p.i.)에 체중을 측정하였다(도 1 참조). 사료공급량과 음수 소비량은 주 1회 측정하였다

그 결과 실험기간 중 모든 군에서 체중, 사료섭취량, 음수 섭취량의 유의적인 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 하기 표 4 내지 6 및 도 2 내지 4에서 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

실험기간동안 체중 변화

Group	HP	Treatment	Body weight (g)
Group	HP	Treatment	(-1) w.p.i	0 w.p.i	1 w.p.i	2 w.p.i	3 w.p.i
G1	-	D.W	13.5 ± 0.53	16.9 ± 0.74	19.9 ± 1.54	21.0 ± 1.41	21.8 ± 1.72
G2	+	D.W	14.5 ± 1.09	18.2 ± 0.70	20.8 ± 1.11	21.7 ± 1.57	23.4 ± 1.17
G3		AMX+CLR+PPI	15.1 ± 1.28	19.4 ± 1.06	21.1 ± 1.44	22.8 ± 1.11	24.1 ± 1.83
G4		감초추출물	14.5 ± 0.25	18.4 ± 1.12	20.7 ± 1.23	21.3 ± 1.30	22.1 ± 1.51
G5		100 mg/kg 잣나무부산물 추출물	14.1 ± 0.92	18.7 ± 0.90	20.8 ± 1.24	21.9 ± 1.51	22.5 ± 1.38
G6		200 mg/kg 잣나무부산물 추출물	15.0 ± 1.20	19.1 ± 1.19	19.9 ± 1.83	21.3 ± 0.97	22.6 ± 1.44
G7		400 mg/kg 잣나무부산물 추출물	15.1 ± 0.90	18.9 ± 1.08	20.7 ± 1.15	21.6 ± 1.62	22.8 ± 1.96

실험기간 동안 사료섭취량 변화

Group	HP	Treatment	Food consumption (g)
Group	HP	Treatment	(-1) w.p.i	0 w.p.i	1 w.p.i	2 w.p.i	3 w.p.i
G1	-	D.W	2.1 ± 0.24	3.2 ± 0.05	3.0 ± 0.42	3.1 ± 0.32	3.2 ± 0.17
G2	+	D.W	2.6 ± 0.17	3.1 ± 0.47	2.9 ± 0.42	2.9 ± 0.07	3.1 ± 0.69
G3		AMX+CLR+PPI	2.7 ± 0.27	3.1 ± 0.42	2.8 ± 0.24	3.0 ± 0.13	3.3 ± 0.35
G4		감초추출물	2.4 ± 0.26	3.0 ± 0.09	2.8 ± 0.15	3.0 ± 0.14	3.2 ± 0.10
G5		100 mg/kg 잣나무부산물 추출물	2.2 ± 0.11	2.8 ± 0.29	3.0 ± 0.05	3.2 ± 0.26	3.5 ± 0.17
G6		200 mg/kg 잣나무부산물 추출물	2.2 ± 0.22	2.9 ± 0.16	2.8 ± 0.10	3.4 ± 0.27	3.5 ± 0.10
G7		400 mg/kg 잣나무부산물 추출물	2.4 ± 0.12	3.0 ± 0.25	3.0 ± 0.28	3.5 ± 0.20	3.6 ± 0.10

실험기간 동안 음수섭취량 변화

Group	HP	Treatment	Water consumption (ml)
Group	HP	Treatment	(-1) w.p.i	0 w.p.i	1 w.p.i	2 w.p.i	3 w.p.i
G1	-	D.W	3.7 ± 0.16	4.2 ± 0.31	4.1 ± 0.12	4.7 ± 0.96	5.3 ± 0.44
G2	+	D.W	4.1 ± 1.02	4.3 ± 0.61	4.2 ± 1.05	4.9 ± 0.78	5.3 ± 0.72
G3		AMX+CLR+PPI	3.9 ± 0.71	4.5 ± 0.86	4.6 ± 0.77	5.2 ± 0.82	5.2 ± 1.00
G4		감초추출물	3.6 ± 0.22	3.9 ± 0.13	3.8 ± 0.19	4.6 ± 0.37	5.2 ± 0.36
G5		100 mg/kg 잣나무부산물 추출물	4.0 ± 0.59	4.1 ± 0.29	4.1 ± 0.30	4.8 ± 0.47	5.5 ± 0.48
G6		200 mg/kg 잣나무부산물 추출물	3.6 ± 0.56	4.1 ± 0.51	4.0 ± 0.21	4.6 ± 0.72	5.1 ± 0.18
G7		400 mg/kg 잣나무부산물 추출물	3.7 ± 0.32	4.7 ± 0.00	4.5 ± 0.60	4.9 ± 0.45	5.5 ± 0.48

(4) 혈중 헬리코박터 항체 IgG역가 비교 결과

감염 유발 1주 후 H. pylori감염된 마우스의 Facial skin에서 혈액을 채취한 후 분리된 혈장과 실험 종료 시점에 복대정맥으로부터 채혈 후 분리된 혈장을 Mouse H. pylori antibody, IgG ELISA kit를 이용하여 각각 혈장 내 H. pylori 항체역가를 측정하여 군간 비교하였고, 그 결과는 하기 표 7 및 도 5에 나타나 있다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 통계 분석은 sigma plot 통계를 사용하여 수행하였으며, p 값은 G2와 비교하는 수준에서 설정되었다. **p<0.01, ns: not significant.

헬리코박터 항체 IgG 평가 결과(감염 4주 후)

Group	HP	Treatment	H. pyloriIgG test
G1	-	D.W	0.25 ± 0.06^**
G2	+	D.W	0.63 ± 0.18
G3		AMX+CLR+PPI	0.41 ± 0.04^**
G4		감초추출물	0.33 ± 0.07^**
G5		100 mg/kg 잣나무부산물 추출물	0.41 ± 0.09^**
G6		200 mg/kg 잣나무부산물 추출물	0.41 ± 0.11^**
G7		400 mg/kg 잣나무부산물 추출물	0.44 ± 0.11^**

**p<0.01

부검시혈액에서의 H. pylori항체를 측정하여 평균 및 표준편차를 산정한 결과G1(음성대조군): 0.25±0.06, G2(부형제대조군): 0.63±0.18, G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군): 0.41±0.04, G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군):0.33± 0.07, G5(100 mg/kg 잣나무부산물부산물 추출물 투여군):0.41±0.09, G6(200 mg/kg 잣나무부산물부산물 추출물 투여군):0.41±0.11, G7(400 mg/kg 잣나무부산물부산물 추출물 투여군):0.44±0.11로 측정되었다.

H. pylori 가 감염된 G2(부형제대조군)은 H. pylori 가 감염되지 않은 G1(음성대조군)에 비해 152.0% 이상 H. pylori 항체 상승이 측정되어, 통계적으로 유의하게 H. pylori가 감염되었음을 확인하였다(p<0.01). 양성대조물질인 G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군), G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)에서는 G2(부형제대조군)에 비해 각34.9%, 47.6% 통계적으로 유의하게 H. pylori 항체가 감소하였다(p<0.01). 시험물질 잣나무 부산물 추출물의 G5(100 mg/kg 투여군), G6(200 mg/kg 투여군) 및 G7(400 mg/kg 투여군)에서는 G2(부형제대조군)에 비해 각 34.9%, 34.9%, 30.2% 통계적으로 유의하게 H. pylori 항체가 감소하였다(p<0.01).

시험물질 잣나무부산물부산물 추출물의G5(100 mg/kg 투여군) 및 G6(200 mg/kg투여군)은 G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군)과 비교하여 동등한 항체가 감소율을 나타냈다.

H. pylori항체 검사 결과값이 낮은 순으로정리하면 아래와 같다.

감초추출물< 100 mg/kg 잣나무부산물 추출물, 200 mg/kg 잣나무부산물 추출물 및 AMX+CLR+PPI<400 mg/kg 잣나무부산물 추출물.

(5) 위 조직 육안 병변 관찰 및 조직병리학적 분석 검사

부검 당일 적출한 위 조직은 식도(esophagus)로부터큰굽이 (great curvature)를 따라 샘창자(십이지장, duodenum)쪽으로 세로 방향으로 절개하여 펼쳐 안쪽 점막의 특이적 병변을 관찰하였다. 육안 병변 관찰 후 펼친 위 조직을 10% 중성 포르말린에 고정하고 병리조직학적 검사를 위한 통상적인 방법을 사용하여 파라핀 포매한 후, 4 ㎛ 두께로 절편하여hematoxylin and eosin (H&E) 염색 후 병리조직학적인 검사를 수행하였다. 조직병리학적 점수는 개체 당 Corpus와 Antrum 전반적인 부위에 종합적으로 나타난 염증세포(neutrophils & mononuclear cells)의 침윤 정도(노란색 화살표 표기)와 위축성 변형을 동반한 위염(atrophic gastritis)의 정도(도 7의 노란색 점선칸)를 표 8의 기준에 따라 관찰한 후, 각 조직의 등급을 점수로 환산하며 기록하였다(도 7 및 표 8 참조). 각 조직별 세부 점수의 합을 구한 후, 각 군의 평균 점수를 구하였으며, 객관성을 높이기 위하여 서로 다른 연구자 2명의 관찰 및 자문을 통하여 score를 산출하였다.

부검 후 적출한 위 조직을 육안으로 관찰한 결과 비감염군 G1(음성대조군)과 감염군인 G2~G7에서 특이 병변은 관찰할 수 없었다(도 6).

조직병리 결과 위 조직에서 관찰된 소견은 참고문헌1(Lee YJ. No Correlation of Inflammation with Colonization of Helicobacter pylori in the Stomach of Mice Fed High-salt Diet. Journal of Cancer Prevention (2014) 19(2): 144-151.)의 기준에 따라 염증세포 침윤(inflammatory cell infiltration), 위축변형(atrophic change)에 대하여 점수화한 결과 G1(음성대조군)에서는 염증세포침윤: 0.75±0.50 이었으며 위축변형에 의한 위염증상은 관찰되지 않았다. Total score: 0.30 ± 0.48; G2(부형제대조군)에서는 염증세포 침윤: 2.38±0.74, 위축변형: 1.00±1.07, Total score: 3.38± 1.77; G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군)에서는 염증세포 침윤: 1.17± 0.72, 위축변형: 0.08± 0.29, Total score: 1.25±0.87; G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)에서는 염증세포 침윤: 1.00± 0.95, 위축변형: 0.17± 0.58, Total score: 1.17±1.40; G5(100 mg/kg 잣나무부산물 추출물 투여군)에서는 염증세포 침윤: 1.17± 1.03, 위축변형: 0.08± 0.29, Total score: 1.25±1.22; G6(200 mg/kg 잣나무부산물 추출물 투여군)에서는 염증세포 침윤: 0.92± 0.67, 위축변형: 0.08± 0.29, Total score: 1.00 ±0.85; G7(400 mg/kg 잣나무부산물 추출물 투여군)에서는 염증세포 침윤: 0.92±1.16, 위축변형: 0.17± 0.39, Total score: 1.08± 1.51로 관찰되었다. 군 별 Total score를 비교한 결과 G2(부형제대조군)은 G1(음성대조군)에 비해 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었고(p<0.01), 양성대조물질인 G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군), G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)에서는 G2(부형제대조군)에 비해 각63.0%, 65.4% 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.01). 시험물질 잣나무 부산물 추출물의 G5(100 mg/kg 투여군), G6(200 mg/kg 투여군), G7(400 mg/kg 투여군)에서는 G2(부형제대조군)에 비해 각 63.0%, 70.4%, 68.0% 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다(p<0.01, 도 7 내지 10, 표 8).

조직병리학적 검사 결과, H. pylori감염에서 시험물질 투여에 의한 염증 및 위축변형 소견을 순서대로 정리하면 아래와 같다.

200 mg/kg 잣나무부산물 추출물< 400 mg/kg 잣나무부산물 추출물<감초추출물 <AMX+CLR+PPI 및 100 mg/kg 잣나무부산물 추출물

위 조직에서 조직 병리 검사의 스코어

Group	HP	Treatment	Histologic Score
Group	HP	Treatment	Inflammation	Atrophic change	Total score
G1	-	D.W	0.75 ± 0.50^**	0.00 ± 0.00^*	0.30 ± 0.48^**
G2	+	D.W	2.38 ± 0.74	1.00 ± 1.07	3.38 ± 1.77
G3		AMX+CLR+PPI	1.17 ± 0.72^**	0.08 ± 0.29^*	1.25 ± 0.87^**
G4		감초추출물	1.00 ± 0.95^**	0.17 ± 058^*	1.17 ± 1.40^**
G5		100 mg/kg 잣나무부산물 추출물	1.17 ± 1.03^**	0.08 ± 0.29^*	1.25 ± 1.22^**
G6		200 mg/kg 잣나무부산물 추출물	0.92 ± 0.67^**	0.08 ± 0.29^*	1.00 ± 0.85^**
G7		400 mg/kg 잣나무부산물 추출물	0.92 ± 1.16^**	0.17 ± 0.39^*	1.08 ± 1.51^**

데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 통계 분석은 sigma plot 통계를 사용하여 수행하였으며, p값은 G2 그룹과 비교하는 수준에서 결정되었다. **p<0.01, *p<0.05

(6) 신속요소분해효소 검사 결과

신속요소분해효소검사는 위 점막에 H. pylori가 존재하는 경우 검사시약의 배지에서 균이 증식하면서 요소분해효소를 분비하게 되어 검사시약에 존재하는 요소를 가수분해시키며 암모니아를 생성하여 시약의 전체 pH가 상승하게 되고 검사시약에 포함되어있는 pH 지시약의 색상 변화(적색)를 알아보았다.

1) 치료율 계산

부검 당일 적출한 위 점막 조직을 무균적으로 채취하여 CLO(campylobacter-like organism) 검사 시약인 (Asan Pharm Co., Ltd., 한국)를 이용하여 시험하였다. Incubator에서 37℃로 2시간 배양 후 결과의 색이 노란색에서 적색으로 바뀐 경우 양성으로 판단하고 양성으로 판정된 개체의 수를 백분율로 구하여 양성율을 구하고 시료 처치에 의한 H. pylori제균에 대한 치료율은 아래의 식으로 구하였다.

CLO신속요소분해효소검사하여 양성 검체수의 백분율을 산정한 결과 G1(음성대조군) 0%; G2(부형제대조군) 100%; G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군)40%;G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)50%; G5(100 mg/kg 잣나무부산물 추출물 투여군) 50%, G6(200 mg/kg 잣나무부산물 추출물투여군) 40%, G7(400 mg/kg 잣나무부산물 추출물투여군) 40%로 나타났다.

각 시험군의 치료율를 산정한 결과 G2(부형제대조군) 0%로 통계적 유의한H. pylori 의한 감염이 확인되었으며(p<0.01), 양성대조물질인G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군), G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)에서는 각 60%, 50%의 통계적으로 유의한 치료율을 보였다(p<0.01). 시험물질잣나무부산물 추출물의 G5(100 mg/kg 투여군), G6(200 mg/kg 투여군), G7(400 mg/kg 투여군)에서는 G2(부형제대조군)에 비해 각 50%, 60%, 60% 치료율을 나타냈으며 통계적인 유의성이 확인되었다(p<0.01, 표 9-10).

CLO 검사 결과, H. pylori 감염에서 시험물질 투여에 의한 치료율을 순서대로 정리하면 아래와 같다.

400 mg/kg 잣나무부산물 추출물, 200 mg/kg 잣나무부산물 추출물 및 AMX+CLR+PPI>100 mg/kg 잣나무부산물 추출물 및 감초추출물.

신속요소분해효소(CLO) 검사의 검체

Group

HP

Treatment

Animal No.

Ratio

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Positive

Partially
positive

Negative

G1

-

D.W

○

0/10

10/10

G2

+

D.W

●

10/10

0/10

G3

+

AMX+CLR+PPI

○

●

○

◐

○

◐

●

2/10

6/10

G4

+

감초추출물

◐

●

◐

○

◐

●

2/10

3/10

5/10

G5

+

100 mg/kg 잣나무부산물 추출물

○

◐

○

●

○

2/10

3/10

5/10

G6

+

200 mg/kg 잣나무부산물 추출물

○

◐

○

●

◐

1/10

3/10

6/10

G7

+

400 mg/kg 잣나무부산물 추출물

○

◐

●

◐

○

◐

○

1/10

3/10

6/10

○, negative; ◐, partially positive; ●, positive

위 조직에서의 신속요소분해효소(CLO)의 치료율

Group	HP	Treatment	Number of mouse	Positive Number	Therapeutic
G1	-	D.W	10	0	100%^**
G2	+	D.W	10	10	0%
G3		AMX+CLR+PPI	10	4	60%^**
G4		감초추출물	10	5	50%^**
G5		100 mg/kg 잣나무부산물 추출물	10	5	50%^**
G6		200 mg/kg 잣나무부산물 추출물	10	4	60%^**
G7		400 mg/kg 잣나무부산물 추출물	10	4	60%^**

데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 통계 분석은 sigma plot 통계를 사용하여 수행하였으며, p값은 G2 그룹과 비교하는 수준에서 결정되었다. **p<0.01

2) CLO score

CLO 검사 후 배지의 색깔 변화가 없는 경우를 0점, 약간 붉은색을 나타낼 경우 1점, 연한 자주색을 나타낼 경우 2점, 진한 자주색을 나타낼 경우 3점으로 측정하여 각 군의 평균 및 표준편차를 구하고 군간 값의 차이를 비교하여 하기 표 11 및 도 11-12에 나타내었다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 통계 분석은 sigma plot 통계를 사용하여 수행하였으며, p값은 G2 그룹과 비교하는 수준에서 결정되었다. (**p<0.01, ns : not significant)

신속요소분해효소를 측정하여 평균 및 표준오차를 산정한 결과 G1(음성대조군): 0.00 ± 0.00; G2(부형제대조군): 3.00 ± 0.00; G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군): 0.90 ±1.29; G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군): 1.10 ± 1.29; G5(100 mg/kg 잣나무부산물 추출물 투여군): 1.10 ± 1.29; G6(200 mg/kg 잣나무부산물 추출물 투여군): 0.60 ± 0.97; G7(400 mg/kg 잣나무부산물 추출물 투여군): 0.70 ±1.06로 각각 측정되었다(Figure 11, Table 10, Appendix 1).G1(음성대조군)에 비해 G2(부형제대조군)은 통계적으로 유의한 증가를 보였으며(p<0.01), 양성대조물질인 G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군), G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)에서는 G2(부형제대조군)비해 각 70.0%, 63.3% 통계적으로 유의한 감소를 보였다(p<0.01). 시험물질 잣나무부산물 추출물의 G5(100 mg/kg 투여군), G6(200 mg/kg 투여군), G7(400 mg/kg 투여군)에서는 G2(부형제대조군)에 비해 각 63.3%, 80.0%, 76.7% 통계적으로 유의한 감소를 보였다(p<0.01).

CLO score가 낮은 순서대로 정리하면 아래와 같다.

200 mg/kg 잣나무부산물 추출물 < 400 mg/kg 잣나무부산물 추출물<AMX+CLR+PPI<100 mg/kg 잣나무부산물 추출물 및 감초추출물

신속요소분해효소(CLO)의 스코어

Group	HP	Treatment	CLO score
G1	-	D.W	0.00 ± 0.00^**
G2	+	D.W	3.00 ± 0.00
G3		AMX+CLR+PPI	0.90 ± 1.29^**
G4		감초추출물	1.10 ± 1.29^**
G5		100 mg/kg 잣나무부산물 추출물	1.10 ± 1.29^**
G6		200 mg/kg 잣나무부산물 추출물	0.60 ± 0.97^**
G7		400 mg/kg 잣나무부산물 추출물	0.70 ± 1.06^**

( 7)위점막 조직 내 cytokine 분석( TNF -α, IL- 1 β ) 결과

위점막 조직 내 pro-inflammatory cytokine을 측정하기 위하여 무균적으로 채취한 위 조직을 액화질소(liquid nitrogen)으로 잘게 파쇄하여 cell lysis buffer를 이용하여 protein을 추출하여 분석에 사용하였다. 분리한 단백질은 R&D system (Minneapolis, MN, USA)에서 구입한 ELISA kit를 이용하여 TNF-α (tumor necrosis factor-α) 및 Interleukin-1β를 분석하였다

위 점막 조직 내 TNF-α를 측정하여 평균 및 표준오차를 산정한 결과 G1(음성대조군): 5.02± 0.44; G2(부형제대조군): 7.41±1.66; G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군): 5.00±1.19; G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군): 4.89±1.10; G5(100 mg/kg 잣나무부산물 추출물 투여군): 4.32± 0.86; G6(200 mg/kg 잣나무부산물 추출물투여군): 3.83± 0.69; G7(400 mg/kg 잣나무부산물 추출물투여군): 4.08± 0.84로 각 측정되었다(도 13, 표 12).G1(음성대조군)에 비해 G2(부형제대조군)은 47.6% 통계적으로 유의한 증가를 보였으며(p<0.01), 양성대조물질인 G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군), G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)에서는 G2(부형제대조군)비해 각 32.5%, 34.0% 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다(p<0.01). 시험물질 잣나무 부산물 추출물의 G5(100 mg/kg 투여군), G6(200 mg/kg 투여군), G7(400 mg/kg 투여군)에서는 G2(부형제대조군)에 비해 각 41.7%, 48.3%, 44.9% 통계적으로 유의한 감소를 보였다(p<0.01). 시험물질 G6(200 mg/kg 투여군) 및 G7(400 mg/kg 투여군)에서는 G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군)에 비해 각 23.4%, 18.4% 통계적으로 유의하게 감소하였고(p<0.01, p<0.05), G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)에 비해 각 21.7%, 16.6% 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.05).

TNF-α 값이 낮은 순으로 정리하면 아래와 같다.

200 mg/kg 잣나무부산물 추출물 < 400 mg/kg 잣나무부산물 추출물 < 100 mg/kg 잣나무부산물 추출물 < 감초추출물 <AMX+CLR+PPI

위 점막 조직 내 IL-1β를 측정하여 평균 및 표준오차를 산정한 결과 G1(음성대조군): 17.91±3.43; G2(부형제대조군): 25.26±4.77; G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군): 16.2±2.76; G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군): 18.47±2.86; G5(100 mg/kg 잣나무부산물 추출물투여군): 13.42±3.55; G6(200 mg/kg 잣나무 부산물 추출물 투여군): 14.06±3.57; G7(400 mg/kg 잣나무 부산물 추출물 투여군): 11.98±2.71로 각 측정되었다(도 14, 표 13).

G1(음성대조군)에 비해 G2(부형제대조군)은 41.0% 통계적으로 유의한 증가를 보였으며(p<0.01), 양성대조물질인 G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군), G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)에서는 G2(부형제대조군)비해 각 35.9%, 26.9% 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다(p<0.01). 시험물질 잣나무 부산물 추출물의 G5(100 mg/kg 투여군), G6(200 mg/kg 투여군), G7(400 mg/kg 투여군)에서는 G2(부형제대조군)에 비해 각 46.9%, 44.3%, 52.6% 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다(p<0.01). G5(100 mg/kg 투여군) 및 G7(400 mg/kg 투여군)에서는G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군)에 비해 각 17.2%, 26.0% 통계적으로 유의한 감소를 나타내었으며(p<0.05, p<0.01), G5(100 mg/kg 투여군), G6(200 mg/kg 투여군) 및 G7(400 mg/kg 투여군)에서는 G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)에 비해 각 27.3%, 23.9%, 35.1% 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.01)

IL-1β 값이 낮은 순으로 정리하면 아래와 같다.

400 mg/kg 잣나무부산물 추출물<100 mg/kg 잣나무부산물 추출물<200 mg/kg 잣나무부산물 추출물<AMX+CLR+PPI< 감초추출물

위 조직에서의 TNF-α cytokine 값

Group	HP	Treatment	TNF-α (pg/μg tissues)
G1	-	D.W	5.02 ± 0.44^**
G2	+	D.W	7.41 ± 1.66
G3		AMX+CLR+PPI	5.00 ± 1.19^**
G4		감초추출물	4.89 ± 1.10^**
G5		100 mg/kg 잣나무부산물 추출물	4.32 ± 0.86^**
G6		200 mg/kg 잣나무부산물 추출물	3.83 ± 0.69^{**, §§, ¶}
G7		400 mg/kg 잣나무부산물 추출물	4.08 ± 0.84^{**, §, ¶}

데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 통계 분석은 sigma plot 통계를 사용하여 수행하였으며, p값은 G2 그룹과 비교하는 경우 **p<0.01, G3 그룹과 비교하는 경우 ^§§p< 0.01,^§p< 0.05, G4 그룹과 비교하는 경우 ^¶p< 0.05.

위 조직에서의 IL-1β cytokine 값

Group	HP	Treatment	IL-1β (pg/μg tissues)
G1	-	D.W	17.91 ± 3.43^**
G2	+	D.W	25.26 ± 4.77
G3		AMX+CLR+PPI	16.20 ± 2.76^**
G4		감초추출물	18.47 ± 2.86^**
G5		100 mg/kg 잣나무부산물 추출물	13.42 ± 3.55^{**, §, ¶¶}
G6		200 mg/kg 잣나무부산물 추출물	14.06 ± 3.57^{**, ¶¶}
G7		400 mg/kg 잣나무부산물 추출물	11.98 ± 2.71^{**, §§, ¶¶}

데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 통계 분석은 sigma plot 통계를 사용하여 수행하였으며, p값은 G2 그룹과 비교하는 경우 **p<0.01, G3 그룹과 비교하는 경우 ^§§p< 0.01,^§p< 0.05, G4 그룹과 비교하는 경우 ^¶¶p< 0.01.

(8) 위 점막 H.pylori PCR (polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 검사 결과

시험 종료 후 무균적으로 채취한 위 점막 조직으로부터 genomic DNA를 채취하고 헬리코박터 PCR 검사를 아래 조건으로 수행하였다.본 실험에서 사용한 타겟 유전자는 H. pylori에만 특이적으로 존재하는 독소형 유전자인 CagA로 인간이나 마우스에는 존재하지 않는 유전자이다. 따라서 H. pylori PCR의 target size는 298bp 특이 밴드이며 각 군별로 특이 밴드를 확인하고 양성 개체를 판정하였다.

1) PCR 정보- 프라이머

H-cagA-F(5'-ATA ATG CTA AAT TAG ACA ACT TGAA GCG A)

H-cagA-R(5'-TTA GAA TAA TCA ACA AAC ATC ACG CCA T)

2) PCR 정보- 반응조건

Denaturation at 94°Cfor 5 min		298bp
95°C for 1 min	35 cycles
57°Cfor 30 s
72°C for 30 s
Final extension step72°C for 10 min,

위 점막 조직에서H. pylori 유무를 PCR로 측정한 결과 양성 검체수 의백분율은 다음과 같다. G1(음성대조군) 0%; G2(부형제대조군) 100%; G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군)40%; G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군) 30%; G5(100 mg/kg 잣나무부산물 추출물 투여군) 60%, G6(200 mg/kg 잣나무부산물 추출물투여군)30%, G7(400 mg/kg 잣나무부산물 추출물투여군) 30%로 나타났다.

각 시험군의 치료율를 산정한 결과 G2(부형제대조군) 0%로 통계적 유의한H. pylori 의한 감염이 확인되었으며(p<0.01), 양성대조물질인 G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군), G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군)에서는 각 60%, 70%의 통계적으로 유의한 치료율을 보였다(p<0.01). 시험물질 잣나 무부산물 추출물의 G5(100 mg/kg 투여군), G6(200 mg/kg 투여군), G7(400 mg/kg 투여군)에서는 G2(부형제대조군)에 비해 각 40%, 70%, 70% 치료율을 나타냈으며 통계적인 유의성이 확인되었다(p<0.01, 도 15, 표 15-16).

PCR 검사 결과, H. pylori 감염에서 시험물질 투여에 의한 치료율을 정리하면 아래와 같다

200 mg/kg 잣나무부산물 추출물, 400 mg/kg 잣나무부산물 추출물 및 감초추출물>AMX+CLR+PPI>100 mg/kg 잣나무부산물 추출물.

PCR 테스트 검체

Group

HP

Treatment

Animal No.

Ratio

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Positive

Partially
positive

Negative

G1

-

D.W

○

0/10

10/10

G2

+

D.W

●

10/10

0/10

G3

+

AMX+CLR+PPI

○

●

○

◐

○

◐

○

1/10

3/10

6/10

G4

+

감초추출물

○

●

○

●

○

●

○

3/10

0/10

7/10

G5

+

100 mg/kg 잣나무부산물 추출물

●

○

●

◐

●

○

5/10

1/10

4/10

G6

+

200 mg/kg 잣나무부산물 추출물

○

●

○

●

○

●

3/10

0/10

7/10

G7

+

400 mg/kg 잣나무부산물 추출물

○

●

○

●

○

●

○

3/10

0/10

7/10

○, negative; ◐, partially positive; ●, positive

PCR 테스트 치료율

Group	HP	Treatment	Number of mouse	Positive Number	Therapeutic
G1	-	D.W	10	0	100%^**
G2	+	D.W	10	10	0%
G3		AMX+CLR+PPI	10	4	60%^**
G4		감초추출물	10	3	70%^**
G5		100 mg/kg 잣나무부산물 추출물	10	6	40%^**
G6		200 mg/kg 잣나무부산물 추출물	10	3	70%^**
G7		400 mg/kg 잣나무부산물 추출물	10	3	70%^**

(9) 분변 내 헬리코박터 세균 항원 검사 결과

H. pylori세균이 분변으로 배출되는지를 확인하기 위하여 시험 종료일에 채취된 마우스 분변을 채취하여 SD BiolineH. pylori Ag kit (Standard Diagnostics, Inc)를 이용하여 분변 항원 검사를 수행하였다.

H. pylori세균이 분변으로 배출되는지를 확인하기 위하여 시험 종료일에 채취된 마우스 분변을 채취하여 측정한 결과 G1(음성대조군), G2(부형제대조군), G3(양성대조군 1: AMX + CLR + PPI 투여군), G4(양성대조군 2: 감초추출물 투여군), G5(100 mg/kg 잣나무부산물 추출물 투여군), G6(200 mg/kg 잣나무부산물 추출물투여군), G7(400 mg/kg 잣나무부산물 추출물투여군) 모든 개체에서 H. pylori Stool Ag test 검사 결과 양성의 개체를 발견할 수 없었다(도 16).

상기 제균 시험 결과, 잣나무 부산물 추출물을 경구 투여하였을 때, H. pylori 감염시킨 마우스 모델에서 H.pylori 항체 감소 및 치료율 증가, 조직병리학적인 병변의 호전, 염증 cytokine 감소로 H.pylori 제균에 효과가 있는 것으로 나타났다.

즉, 헬리코박터파일로리균이 존재하는 환경에, 잣나무 부산물 추출물을 병존시킴으로써 헬리코박터파일로리균의 증식을 선택적으로 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다.

Claims

잣나무 부산물 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터파일로리 제균 효과를 갖는 조성물.
제 1 항에 있어서, 파인플로우를 더 포함하는 헬리코박터파일로리 제균 효과를 갖는 조성물.
헬리코박터파일로리균이 존재하는 환경에, 잣나무 부산물 추출물을 병존시킴으로써, 상기 헬리코박터파일로리균의 증식을 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터파일로리의 제균방법.
제 3 항에 있어서, 잣나무 부산물 추출물은 파인플로우와 혼합된 것을 특징으로 하는 헬리코박터파일로리의 제균방법.