JP2000229865A - ヘリコバクター・ピロリ定着阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安全で効果的なヘリコバクター・ピロリの定
着阻害剤を得て、食品に添加して消化性潰瘍等に対する
予防、改善用食品を提供する。 【解決手段】 ムチン、特に牛乳汁または鶏卵卵白由来
のムチンを有効成分とするヘリコバクター・ピロリ定着
阻害剤、およびムチンと胃酸分泌抑制剤を含有するヘリ
コバクター・ピロリ定着阻害剤、並びにムチンを含有す
る抗ヘリコバクター・ピロリ機能性食品や医療用食品な
どの食品。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、消化性潰瘍の発生
に関与するヘリコバクター・ピロリを胃内から排除しう
るヘリコバクター・ピロリ定着阻害剤、およびこの定着
阻害剤を含有する食品、特に抗ヘリコバクター・ピロリ
機能性食品に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、消化性潰瘍の根治的治療にはヘリ
コバクター・ピロリ（Helicobacter pylori : 以下Ｈp)
の除菌が不可欠であると考えられており、その除菌療法
として以下に説明するように抗生物質と胃酸分泌抑制剤
との併用療法が広く提唱されている。

【０００３】Ｈp は、一端に数本の鞭毛(flagella)を持
つ、螺旋型をしたグラム陰性桿菌で、ヒトの胃粘膜に生
息する菌である。この菌は、1983年オーストラリアのMa
rshall,B.J. とWarren,J.Rによって胃炎、胃潰瘍患者の
胃生検材料から高率に検出されることが報告された。当
時は形態および増殖性状からカンピロバクターに類似し
ていたので、カンピロバクター・ピロリ(Campylobacter
pylori)と命名された。その後、外膜の脂肪酸組成やリ
ポゾームの16S-RNA 配列の相同性がカンピロバクターと
大きく相違していることが分かり、新たにヘリコバクタ
ー属が設けられて、今日、この菌はＨp と呼ばれてい
る。

【０００４】以来、疫学的研究から、この菌は胃炎、胃
潰瘍、十二指腸潰瘍の起因菌であり、さらには胃癌など
の疾患と関連があるとの報告が相次いで発表されてい
る。Ｈp が一旦胃粘膜に定着すると、感染に対する免疫
応答が強い (抗体価が高い) にもかかわらず、除菌され
ず胃内に生息し続ける。そのため、抗生物質による治療
によって完全に除菌できない限り、投薬を中止すると約
１ヶ月以内に治療前の感染状態に戻ってしまう。しかも
胃内は酸度の高い塩酸によってpHが非常に低く保たれて
いるので、多くの抗生物質は不活化される。このような
理由で、Ｈp の除菌には、胃酸分泌を強力に抑制するプ
ロトンポンプインヒビターと除菌薬 (抗生物質) が併用
の形でしばしば常用量を超える量で使用されている。ま
た、現状ではＨp の除菌には次サリチル酸ビスマス(bis
muth subsalicylate) 、メトロニダゾールおよびテトラ
サイクリンの新３剤併用療法が最も高い除菌率を示すこ
とが分かっているが、この併用に使うメトロニダゾール
は単独使用で耐性発現が急速に起こることが知られてい
る。発展途上国では下痢患者に対してこの薬剤が広く使
用された結果、メトロニダゾールに耐性のＨp 感染が高
率で生じているとの報告もある。このように、抗生物質
の長期間投与は、その副作用に加え、耐性菌の増加とい
う非常に重大な問題が危惧される。

【０００５】除菌を目的とした抗生物質の投与による副
作用および耐性菌の増加などの問題を解決する方法とし
て、現在、経口ワクチンによる免疫療法のアプローチが
見られる。しかし、この目的の達成には、Ｈp に対する
感染モデル動物の作出が必須の条件であるが、マウスや
ラット等の小動物には感染が容易に成立せず、そのため
無菌動物を用いなければならなかったり、また、感染を
長期間持続させるには新鮮分離株を用いる必要があるな
どの複雑な条件が障害となって、新しい予防、治療法の
確立を目指した研究はほとんど進展していない。また、
経口ワクチンではアジュバントとして大腸菌由来の易熱
性毒素(LT)、コレラトキシンを加えることが普通であ
り、これらのアジュバントなしでは粘膜免疫は成立しな
い。実用化への問題点として、大腸菌のLTもコレラトキ
シンも毒性のレベルが非常に高く、ヒトへの応用に関し
て安全性の面で未解決な問題を抱えている。また、ワク
チンはあくまで予防を主体とするものであり、一旦Ｈp
が感染した患者に対しては効果は望めない。

【０００６】さらに、ワクチンに代わる免疫療法とし
て、Ｈｐ全菌体を抗原として得られた鶏卵抗体の使用が
提案されているが、全菌体に対する抗体では完全な除菌
は望めず、また実際の胃内での除菌効果については確認
されていない。

【０００７】一方、ある種のビフィズス菌や乳酸菌の菌
体、これらの菌体から抽出した多糖類が胃潰瘍の予防、
治療に有用であること (特開平４−5236号公報）、ある
種の海藻由来のラムノース多糖・ラムナンやラムノース
オリゴ糖が抗潰瘍剤として有用である（特開平６−2478
61号公報) と報告されている。

【０００８】また、モズク由来の多糖類であるフコイダ
ンがＨｐの胃粘膜への定着を阻止し、抗潰瘍性を有する
とされている (特開平７−138166号公報) が、この公報
における潰瘍治癒作用の証明には、Ｈｐによる潰瘍形成
とは病理発生が基本的に異なる酢酸誘発潰瘍が用いられ
ており、従ってＨｐの定着阻害の効果を示すものではな
い。さらに、この公報にはフコース（単糖類）が定着因
子と考えられるとの記載があり、その考えに基づき、Ｈ
ｐのフコイダンによる定着阻害をみるインビトロ実験に
おいてはビオチン化フコースが接着マーカーとして使用
されているが、現時点ではフコースは接着因子とは考え
られていないので、やはりＨｐ定着阻害の効果を示すも
のではない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、Ｈp を
除菌するために、抗生物質を長期にわたり使用すると副
作用と共に耐性菌の増加の恐れがある等種々の問題があ
った。本発明の目的は、消化性潰瘍の発生に関与するＨ
ｐの胃内での定着を有効に阻害する物質であり、従来の
抗生物質の使用に伴う副作用や耐性菌増加等の欠点を持
たず効果的で安全性の高いＨｐの定着阻害剤を提供する
ことである。また、消化性潰瘍の改善または予防に有用
な機能性食品、医療用食品等を含む食品を提供すること
である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】一般に細菌の感染が成立
するためには細菌が宿主細胞に接着し、そこで増殖する
ことによって定着することが感染の第一歩となる。細菌
が宿主細胞に接着するには接着因子(adhesin) が宿主細
胞表面の受容体(receptor)に結合しなくてはならない。
細菌の感染部位特異性はこの接着因子と受容体の組合せ
によって決まる。細菌が宿主細胞に接着する際に、受容
体分子が共存すると競合阻止(competitive inhibition)
が起こり感染は成立しない。

【００１１】Ｈp においても接着因子とヒト胃粘膜がも
つ受容体はいずれもＨp の感染阻止の標的分子と考えら
れる。本発明者等は、Ｈp の接着機構に関する研究を通
して、これまで解明されていなかったＨp の接着因子が
Ｈｐが産生するウレアーゼであることを明らかにし、こ
のウレアーゼに対する鶏卵黄抗体をＨp 定着マウスに経
口投与したところ、Ｈp の胃内増殖を顕著に抑制するこ
とを示した (特開平10−287585号) 。

【００１２】本発明者等はウレアーゼの胃粘膜への付着
を阻止しうる物質を種々検討した結果、牛乳汁由来ムチ
ンや鶏卵卵白由来ムチン等のムチンが、Ｈp の菌体表層
に局在している接着因子であるウレアーゼに特異的に結
合することによって胃内に定着しているＨp を排除する
機能のあることを見出し、本発明を完成させた。

【００１３】本発明の要旨は、哺乳動物の消化管由来の
ムチン以外のムチンを有効成分とするヘリコバクター・
ピロリ定着阻害剤にある。この定着阻害剤は消化性潰瘍
の予防または改善に有用である。使用するムチンとして
は牛乳汁または鶏卵卵白由来のムチンが好ましい。

【００１４】また、本発明は、上記のヘリコバクター・
ピロリ定着阻害剤を含有する食品にも関し、ムチンとし
ては、牛乳汁または鶏卵卵白由来のものが好ましい。ム
チンは食品中0.5 〜60重量％含まれるのが好ましい。

【００１５】さらに、本発明によれば、哺乳動物の消化
管由来のムチン以外のムチンおよび胃酸分泌抑制剤を含
むヘリコバクター・ピロリ定着阻害剤も提供される。こ
の定着阻害剤は消化性潰瘍の予防または治療に有用であ
る。使用するムチンとしては牛乳汁または鶏卵卵白由来
のムチンが好ましい。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明では定着阻害剤の有効成分として哺乳動物の
消化管由来のムチン以外のムチンを用いる。

【００１７】一般に、ムチンは、動物の粘膜や唾液腺な
どが生産する粘液性物質として知られ、種々の糖タンパ
ク質からなる。ムチンは哺乳動物の初乳や常乳にも含ま
れており、また、鶏卵の卵白、カラザ、卵黄膜等にも多
量に含まれている。

【００１８】ムチンは10⁶ 〜10⁷ もの超高分子量を有す
る巨大な重合体であり、10〜20重量％のタンパク質と80
〜90重量％の糖質で構成されている。ムチンの構成成分
であるムチン型糖タンパク質は、D-ガラクトース、シア
ル酸、L-フコース、N-アセチル-D- ガラクトサミン等か
らなる糖鎖がペプチドに結合した複合タンパク質であ
り、N-アセチル-D- ガラクトサミンがセリンやトレオニ
ンのヒドロキシル基にO-グリコシド結合することによ
り、糖鎖とペプチドが結合している点が特徴である。ま
た、糖鎖の一部は硫酸基を含む。

【００１９】本発明において用いるムチンは、哺乳動物
の消化管の粘膜からのムチン以外であれば、その由来は
限定されず、哺乳動物の乳汁、鳥類の卵の卵白、カラ
ザ、卵黄膜などから調製できるが、牛乳汁および鶏卵卵
白由来のものがその効果の面から好ましい。

【００２０】しかも、本発明定着阻害剤の有効成分であ
るムチンの原料として牛乳汁または鶏卵卵白を用いる場
合、これらの原料は安価にしかも大量に入手でき、また
これらからのムチンの分離、精製は簡便な方法で容易に
行うことができる。さらに、酵素等の夾雑物の混入が少
なく純度の高いムチンを得ることができる。また、牛乳
汁ムチンの調製においては、これまでチーズ等の製造工
程で副産物として大量にでるにもかかわらず、有効な利
用方法がなく廃棄されていた乳清（ホエー）を用いるこ
ともできるので、工業規模で大量のムチンを製造するこ
とも可能であり、価格的にも実用的にも非常に有利であ
る。

【００２１】また、牛乳汁または鶏卵卵白中のムチンは
安定性が高く、加熱によっても、また低pHにおいてもそ
の生理活性を失わないので、原料からの回収、精製が容
易であるばかりでなく、食品や医薬品への配合、加工、
貯蔵においても有利である。牛乳汁中には様々な生理活
性を有する物質が含まれ、一例をあげると、ラクトフェ
リンは抗菌、抗ウイルス、抗がん作用等の多用な生理活
性の所在が報告されている。糖タンパク質からなる巨大
分子のムチンに関しては抗ロタウイルス作用の報告があ
るのみで、その他の生理機能についての報告はない。

【００２２】また、鶏卵タンパク質 (リゾチーム、オボ
インヒビター、アビジン、オボトランスフェリンなど)
においても多用な生理機能のあることが古くから知られ
ている。最近では、鶏卵タンパク質をプロテアーゼで消
化することによって得られるペプチドが抗高血圧作用、
ファゴサイトーシス作用などを示すことが報告されてい
る。また、オボムチン（鶏卵卵白由来ムチン）は抗ロタ
ウイルス作用を示すこと、あるいは、オボムチン、カラ
ザ並びに卵黄膜に共通して存在する硫酸化糖ペプチドが
マクロファージを活性化することによって腫瘍壊死因子
やサイトカインの放出を促進し、乳がん細胞のみを殺傷
する、との報告もある。

【００２３】ムチンの抽出、分離、精製には、任意の既
知の方法が使用できる。消化管粘膜や粘膜ゲル層などに
存在するムチンの回収は、ムチンをホモゲナイズや超音
波処理により可溶化した後、ゲル濾過やエタノール沈殿
により高分子量画分を分離回収する方法が一般的であ
る。ムチンの可溶化は、グアニジン塩酸、尿素、塩溶
液、界面活性剤により抽出する方法や、還元剤やプロテ
アーゼ処理によってもよい。また、ムチンの種類によっ
ては、第４級アンモニウム塩と不溶性複合体を形成させ
たり、酸性条件下で沈殿させて回収する方法が使用でき
る。

【００２４】牛乳汁からのムチンの調製では、例えば、
乳汁から常法により乳脂肪およびカゼインを除去して乳
清を得て、これからリポタンパク質を除去し、必要に応
じて濃縮、透析を行う。こうして得られたムチンを含む
材料から、セファロースカラム等を用いたゲル濾過、膜
処理等によりムチンを精製する。さらに、低分子化ムチ
ンが必要であればプロテアーゼ処理、アルカリ加水分解
等の処理を行う。なお、牛乳汁は、初乳、常乳のいずれ
も利用できる。

【００２５】鶏卵卵白からムチンを得るには、例えば次
のような方法がある。集めた卵白から濃厚卵白を分離
し、超遠心分離によりゲル状部分を得て、これから不溶
型オボムチンを調製する。これを、超音波処理、ホモゲ
ナイズ等の方法により可溶化し、得られた可溶化物から
ゲル濾過、膜処理等の方法でムチンを回収する。さらに
必要であればゲル濾過等の処理により精製してもよい。

【００２６】本発明で用いるムチンは、以下の実施例で
実証されるように、Ｈｐの産生するウレアーゼが胃粘膜
のムチンに接着するのを抑制する。ウレアーゼはＨｐ菌
体表面に局在しているので、胃内において本発明のムチ
ンは、ウレアーゼに優先的に結合することにより接着因
子であるウレアーゼをマスクしてＨｐの胃粘膜の受容体
への接着を阻止することができる。これは、動物実験に
おいても確認され、本発明ムチンの胃内におけるＨｐ除
菌効果が認められた。従って、ムチンはＨｐ定着阻害剤
として使用でき、消化性潰瘍等の予防、改善に有用であ
る。また、本発明で使用するムチンは、天然物由来であ
り安全性が高い。

【００２７】従って、ムチンはＨｐ定着阻害剤として、
医薬や食品に配合して利用することができる。特に、牛
乳汁由来もしくは鶏卵卵白由来のムチンでは食経験があ
るので、食品に配合し、抗Ｈｐ機能性食品や健康食品と
して、あるいは抗Ｈｐ作用を有する医療用食品として利
用することができる。

【００２８】本発明の定着阻害剤は、通常の任意の製剤
化方法によりムチンと担体あるいは賦形剤を混合して製
造すればよい。必要に応じて、その他の添加剤や薬剤、
例えば制酸剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウ
ム、沈降炭酸カルシウム、合成ヒドロタルサイト等）、
胃粘膜保護剤（合成ケイ酸アルミニウム、スクラルファ
ート、銅クロロフィリンナトリウム等）や消化酵素（ビ
オジアスターゼ、リパーゼ等）を加えてもよい。本発明
定着阻害剤の投与は経口により行い、投与量は成人１日
当たりムチンとして通常0.6 〜2.6 ｇ（乾物量）、好ま
しくは１〜２ｇである。

【００２９】また、ムチンからなるＨｐ定着阻害剤は、
胃酸分泌抑制剤を併用することにより一層その効果を高
めることができる。使用できる胃酸分泌抑制剤として
は、ファモチジン、ニザチジン、ロキサチジン、ラニチ
ジン、シメチジン等のＨ₂ インヒビターや、オメプラゾ
ール、ランソプラゾール、ラベプラゾールナトリウム等
のプロトンポンプインヒビターがある。胃酸分泌抑制剤
の投与量は成人１日当たり20〜30mgが好ましい。

【００３０】ムチンを食品へ添加して機能性食品あるい
は医療用食品として利用する場合、食品へ通常0.5 〜5.
0 重量％程度、好ましくは1.0 〜3.0 重量％添加する。
機能性食品としては、食品の種類は限定されないが、菓
子類、粉末スープ類、飲料等継続して摂取できるものが
好ましい。医療用食品としては、一例としてムチンにデ
キストリン等の賦形剤、カゼインナトリウム等の粘着
剤、必要に応じ、ビタミン類、ミネラル類等の栄養剤、
乳化剤、安定剤、香料等を添加し、流動食の形態としう
る。また、スープ、飲料、流動食等の食品にムチンを添
加して各種形態の医療用食品とすることができる。ムチ
ンを健康食品として利用する場合は、ムチンを有効成分
として30〜60重量％程度含有させ、これに乳糖、トウモ
ロコシデンプン、結晶セルロース、PVP 等の賦形剤や結
合剤を配合し、必要に応じビタミン類やミネラル等の栄
養剤を添加して、細粒、錠剤、顆粒剤等の各種形態に成
形して利用することができる。以下に、本発明を詳細に
説明するために実施例を示すが、本発明はそれらによっ
て限定されるものではない。

【００３１】

【実施例】〔実施例１〕牛乳汁由来ムチンの調製 牛乳汁は分娩直後のもの (初乳) と分娩後10日目のもの
(常乳) を各々約1,000 ml準備した。乳脂肪を除去する
ため10,000r.p.m.で30分(+４℃) 遠心し、その上清を得
た。次に、カゼインを除去するため1Mの酢酸をpHが4.5
になるまで滴下し、室温に１時間静置し、その後遠心し
てカゼインを取り乳清を得た。次に、リポタンパク質を
除去するため、1NのNaOHでpHを中性にし、それを乳清１
mlに対して1MのCaCl₂ 0.1ml と10％硫酸デキストラン−
500 を0.02ml加え、室温に１時間放置後10,000r.p.m.で
30分(+４℃) 遠心して上清を得た。各々の上清を約1/20
に濃縮した後、100 倍量の精製水で透析し、使用時まで
−30℃以下で保存した。

【００３２】上記の乳清からムチン (糖タンパク質) を
精製するため、0.15M NaCl+2mM EDTA+0.02％ NaN₃ 含有
50mM Tris-HCl 緩衝液(pH8.0) で平衡化したセファロー
スCl-2B ゲルカラムに試料をアプライし、フラクション
コレクターで10mlずつ分画した。タンパク質の溶出パタ
ーンからF1、F2、F3およびF4の４分画に分けた。各分画
液をSDS-PAGEで分析した結果、F1分画は高濃度の糖タン
パク質を含有しており、巨大な構造体であることを認め
た。この巨大分子の糖タンパク質含量は初乳由来と常乳
由来で特別な差は認められなかった。そこで入手しやす
いことから常乳を用いてムチンの大量精製を行ったとこ
ろ、常乳1,000 mlから約100 mg（乾物量）が得られた。

【００３３】〔実施例２〕鶏卵卵白由来ムチン（オボムチン）の調製 白色レグホン種鶏の産卵１週間以内の無精卵50個から卵
白のみを集め、フルイにかけ濃厚卵白を分離した。さら
に、超遠心分離(100,000ｇ×60分) により得たゲル状部
分を２％KCl 溶液にて繰り返し洗浄し、不溶型オボムチ
ンを調製した。精製水で洗浄した後、メンゼル緩衝液(p
H9.5、イオン強度＝0.01) に懸濁し、100W、9KH₂(2℃)
で10分間超音波処理することにより可溶化した。この可
溶化物を「牛乳汁由来ムチンの調製」の項に記載したと
同様のセファロース CL-2Bゲルカラムにアプライし、F1
分画を回収した。その性状をSDS-PAGEで分析したとこ
ろ、乳汁ムチンと同様で高濃度の糖タンパク質を含有し
ていた。分子量はおよそ 5.5〜8.3 ×10⁶ であった。約
2,000 mg (乾物量) の鶏卵卵白由来ムチンを回収し、以
下の実験例に使用した。

【００３４】〔実験例１〕インビトロ実験 実施例１で製造した牛乳汁由来ムチンおよび実施例２で
製造した鶏卵卵白由来ムチンを用いて、Ｈｐが産生する
ウレアーゼの胃粘膜への定着阻害効果をインビトロ実験
系において調べた。

【００３５】比較対照物質としては、特開平７−138166
号公報においてＨp の胃粘膜への定着を阻止すると記載
された、モズク由来多糖体の一種、フコイダン（シグマ
社製）を用いた。なお、上記公報に記述されているイン
ビトロ実験系はＨｐの接着因子がフコースとの前提で組
み立てられており、また上記公報においては、Ｈｐ感染
マウスにフコイダンを投与したときの定着阻止効果に関
しては明らかにされていない。

【００３６】(実験材料および方法)本発明者等は、先
に、Ｈｐの接着因子がＨｐが産生するウレアーゼである
ことを見出したが、このウレアーゼは胃粘膜のムチンに
結合するので、ウレアーゼの付着試験に用いる豚胃ムチ
ンを以下のようにして調製した。

【００３７】豚胃ムチンの調製 約２ヶ月齢の健康な豚を屠殺し、胃部を摘出し、内部に
0.1Mリン酸塩＋0.15MNaCl＋5mM N-エチルマレイミド(NE
M) ＋1mM フェニルメチルスルホニルフルオライド(PMS
F)＋1mM EDTA含有PBS(pH7.4)を加えて洗浄した。胃を切
開し、粘膜を削り取り、上記の緩衝液に浮遊させた。こ
の粘膜浮遊液を氷冷しながらポリトロンホモゲナイザー
を用いて均一にした。これを15,000×ｇで遠心し上清を
得た。この上清を25,000×ｇで再び遠心し、上清を回収
し、蒸留水で透析した後、凍結乾燥して粗精製胃ムチン
を得た。次いで、この乾燥粗精製胃ムチンをPBS(pH6.8)
(6M塩酸グアニジンおよびプロティアーゼインヒビター
(5mM NEM, mM PMSF, 1mM EDTA を含む) に溶解し、これ
を塩化セシウム密度勾配(1.5g/ml) に重層し、34,000×
ｇで48時間遠心した。シアル酸含有分画の検出はニトロ
セルローズ膜ブロッティングと過ヨウ素酸シフ試薬によ
る染色によって行った。発色した分画をプールし、再び
塩化セシウム密度勾配に重層して遠心した。染色陽性分
画をプールし、凍結乾燥した。次いで、0.1Mリン酸緩衝
液(0.1M NaCl含有、pH6.8)で平衡化したセファロースCL
-4B カラムを通してゲル濾過を行い、分画した。PAS 染
色陽性で、蛋白濃度の高い分画をプールし、PBS(pH6.8)
で透析し、精製豚胃ムチンを得た。これを使用時まで−
80℃に保存した (精製豚胃ムチン) 。なお、精製豚胃ム
チンはSDS-PAGEの結果、66kDの糖タンパク質であること
を認めた。

【００３８】豚胃ムチンへのウレアーゼ接着試験 ウレアーゼ接着試験用マイクロプレートは次のようにし
て作製した。96ウエルマイクロプレートの各々のウエル
に1.25％グルタルアルデヒド溶液を100 μl ずつ加え、
５分間感作した。次に、ウエルを蒸留水で３回洗浄し、
精製豚胃ムチン(1.27mg/ml) をウエル当たり50μl ずつ
加え、４℃に一夜静置することによって固相化した。使
用時には各々のウエルに３％BSA を加えて37℃60分間反
応させることによってブロッキングした後、0.05％ツイ
ン20加PBS で３回洗浄したプレートをウレアーゼ接着試
験に供した。

【００３９】上記で作製したマイクロプレート上の固相
化された豚胃ムチンへのウレアーゼ接着試験は以下のよ
うに行った。精製したビチオン化ウレアーゼはpH域の異
なる接着培地(20mM リン酸緩衝液に0.01％ツイン20およ
び0.15M NaClを含む。接着培地のpHは予め2.0 、3.0 、
4.0、4.5 、5.0 、5.5 、6.0 および6.5 に調整してお
く) を用いて最終濃度が7.0μg/mlとなるように希釈し
た。調整したウレアーゼを前述のムチン固相化マイクロ
プレートの２穴ずつに加え、37℃で60分間感作した。次
に、各々のウエルを接着培地で３回洗浄した後、直ちに
10％中性ホルマリン(pH7.4) を加え、プレートを37℃で
30分静置することによって固定した。ウエルに接着した
ウレアーゼ量を測定するため、ストレプトアビジンHRP
を各々のウエルに加え、37℃で60分間反応させた。次い
で、基質としてオルトーフェニレンジアミン２塩酸およ
びH₂O₂を加え反応させた。反応停止液には3N H₂SO₄を用
いた。なお、ライニングプレートには２倍段階希釈した
既知量のウレアーゼを置いて、そのカリブレーションカ
ーブから未知量のサンプルを測定した。

【００４０】ウレアーゼ接着抑制試験 本発明のムチン (牛乳汁由来ムチン、鶏卵卵白由来ムチ
ン) およびフコイダン（対照）を用いてウレアーゼ接着
抑制試験を行った。まず、種々の濃度に調整した試料と
ビオチン化ウレアーゼを混合し、この混合物を37℃で60
分間振盪しながら感作した。次に、この混合物を豚胃ム
チンを固相化した96ウエルマイクロプレートのウエルに
移し、プレートを振盪しながら再び37℃で60分間感作し
た。その後マイクロプレートのウエルを接着培地(pH3.
0) で３回洗浄し、各々のウエルを65℃10分間加熱する
ことによって固定した。固定した各々のウエルをPBS-ツ
イン20(0.5％)(pH6.8)で３回洗浄し、豚胃ムチンに接着
したビオチン化ウレアーゼを検出するため、各々のウエ
ルにストレプトアビジンHRP を加えた後、前述のELISA
により測定した。

【００４１】(結果)精製胃ムチンに対するウレアーゼの接着パターン 図１に示すように豚胃ムチンにウレアーゼは特異的に接
着し、この接着パターンはpHに依存している。pH3.0 領
域でのウレアーゼ接着反応は胃粘膜におけるＨp の定着
性を反映していると考えられ、このpH域でウレアーゼの
接着が阻止できる物質はＨp の胃内定着を阻止する機能
があると考えられる。

【００４２】ムチンによるウレアーゼ接着阻止 図２に示したように、豚胃ムチンへのウレアーゼの接着
は牛乳汁由来ムチンおよび鶏卵卵白由来ムチンによって
用量依存的に抑制されたが、フコイダンはウレアーゼ接
着阻止能が低かった。ウレアーゼはＨｐ菌体表面に局在
しているので、胃内において、これらのムチンが菌体の
ウレアーゼに結合することによって接着因子であるウレ
アーゼがマスクされ感染阻止 (除菌) が起こりうる。

【００４３】〔実験例２〕インビボ実験 実験例１の結果をさらに動物実験により確認した。 (方法)実験動物としてＨp 感染に対して最も高感受性を
示すヘアレスマウス(NS: Hr/ICR 系、財団法人動物繁殖
研究所、受託番号 IAR-NHI-9701)（ATCC#72024)(Clin.D
iagn.Lab.Immunol. 5: 578-582,1998)を用いた。NSP335
株(1×10⁹ CFU/マウス) をマウスに経口接種して１週間
飼育した後、飲水に各種濃度に溶解した試料を４週間投
与した。これ以外に、試料を含まない飲水を投与する群
も設定した。供試マウス数は各群とも10匹とした。マウ
スの１日当たりの飲水量は４〜８mlであった。投与終了
時に各群のマウスを屠殺し、胃を摘出し、内容物を除去
した後、ボルテックスミキサーを用いてPBS(pH7.2)で８
回洗浄し、ホモゲナイザーで乳剤を作製し、Ｈp 検出用
材料とした。Ｈp の検出は乳剤をＨp 検出用培地 (ポア
メディアＨp 分離培地、栄研化学) に接種し、ガスパッ
ク法で37℃、５日間培養し、コロニー数を計測すること
によって行った。

【００４４】(結果)Ｈp 定着マウスにおける牛乳汁由来ムチンおよび鶏卵卵
白由来ムチンの除菌効果 図３に示したように、牛乳汁由来ムチンおよび鶏卵卵白
由来ムチンは濃度依存的に胃内のＨp を除菌した。これ
に対し、フコイダンは高用量投与群においても本発明の
ムチン投与群と異なり、顕著な定着阻害効果は認められ
なかった。なお、対照群はＨp に100 ％(10/10) 感染し
ていた。これらの実験から、牛乳汁由来ムチンおよび鶏
卵卵白由来ムチンはＨp の産生するウレアーゼと優先的
に結合することによって接着因子であるウレアーゼをマ
スクし、感染阻止が起こると考えられる。

【００４５】〔実験例３〕インビボ実験 ムチンと胃酸分泌抑制剤（Ｈ₂ インヒビター、プロトン
ポンプインヒビター)との併用効果を動物実験により調
べた。

【００４６】ムチンとしては、実験例２の動物実験にお
いて高い除菌率を示した牛乳汁由来ムチンを使用した。
動物実験の方法は実験例２と同じであるが、ただし、Ｈ
₂ インヒビター（ファモチジン）またはプロトンポンプ
インヒビター（オメプラゾール）は攻撃１週間後から強
制経口投与にて１週間投与し、牛乳汁由来ムチンは攻撃
１週間後から飲水投与にて２週間投与した。表１に胃内
のＨｐ除菌効果を示す。

【００４７】

【表１】

【００４８】表１に示したように、ムチンと胃酸分泌抑
制剤を併用すると、実験例２よりも投与期間が短く、ム
チン投与量が少ないにもかかわらず高い除菌率を示し
た。このように、ムチンと胃酸分泌抑制剤との併用にお
いてはムチン単独での投与よりも優れた除菌効果が得ら
れることが明らかである。以下の製造例においてムチン
としては実施例１で製造した牛乳汁由来ムチンを用い
た。

【００４９】〔製造例１〕食品 (チューインガム) ガムベース 25.0 炭酸カルシウム 2.0 ソルビトール 54.0 マンニトール 16.0 香料 1.0 本発明のムチン １．０ 水 残量 ─────────────────── 全量 １００（重量％) 。

【００５０】(アイスクリーム) クリーム (脂肪率40％) 32.54 牛乳 (脂肪率3.7 ％) 33.16 無糖脱脂練乳 16.08 砂糖 11.75 コーンシロップ 4.67 安定剤 0.3 本発明のムチン 1.5 ─────────────────── 全量 100(重量％) 。

【００５１】(粉末スープ) 調理用豆粉末 66.5 小麦粉 3.5 小麦胚芽 2.5 乾燥酵母粉末 2.5 オニオンパウダー 4.8 肉エキス末 15.5 食塩 0.2 香辛料 (ホワイトヘ゜ッハ゜ー等) 1.8 調味料 (アミノ酸等) 0.2 本発明のムチン 2.5 ─────────────────── 全量 100(重量％) 。

【００５２】(乾燥スープ) 10.0g/200ml 鶏卵 3.6 肉エキス 1.0 オニオンエキス 1.7 キャロットペースト 2.1 昆布エキス 0.1 乳化剤 0.1 食塩 0.2 香辛料 (レッドペッパー) 0.2 調味料 (アミノ酸等) 0.2 本発明のムチン 0.8 ─────────────────── 全量 10.0ｇ。

【００５３】〔製造例２〕 健康食品 処方例１ (細粒) 100g中 本発明のムチン 45ｇ 乳糖 (200M) 35ｇ トウモロコシデンプン 15ｇ PVP(K-30) 5ｇ 上記成分をとり、湿式造粒法を用いた通常の方法により
細粒を得た。

【００５４】処方例２ (顆粒) 100g中 本発明のムチン 33ｇ 乳糖 (200M) 44ｇ トウモロコシデンプン 18ｇ PVP(K-30) 5ｇ 上記成分をとり、押し出し造粒法で通常の方法により顆
粒剤を得た。

【００５５】

【００５６】

【００５７】

【発明の効果】上述のように、本発明によれば、安全で
優れたＨｐ定着阻害剤およびそれを含有する食品が提供
される。従って、Ｈｐによって引き起こされる消化性潰
瘍等を、副作用を生じることなく効果的に抑制すること
ができる。本発明で使用するムチンの原料として、安価
で大量に入手しうる牛乳汁や鶏卵を用いることもでき、
これらから簡便な方法で効果の優れたムチンを調製しう
る。また、従来消化性潰瘍の治療に用いられてきた抗生
物質とは異なり、耐性菌の問題も生じず、胃内のＨｐを
特異的に除菌することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ウレアーゼの精製胃ムチンに対する接着パター
ンを示す図である。

【図２】ウレアーゼ接着抑制率を示す図である。

【図３】Ｈｐ定着マウスにおける除菌率を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/04 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 木村 修武 埼玉県入間郡大井町鶴ケ岡５丁目３番１号 日清製粉株式会社ファインケミカル研究 所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物の消化管由来のムチン以外のム
   チンを有効成分とするヘリコバクター・ピロリ定着阻害
   剤。
2. 【請求項２】 ムチンが牛乳汁または鶏卵卵白由来のム
   チンである請求項１記載の定着阻害剤。
3. 【請求項３】 消化性潰瘍の予防または改善のための請
   求項１または２記載のヘリコバクター・ピロリ定着阻害
   剤。
4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかの項記載の
   ヘリコバクター・ピロリ定着阻害剤を添加した食品。
5. 【請求項５】 ムチンを食品中0.5 〜60重量％添加した
   請求項４記載の食品。
6. 【請求項６】 哺乳動物の消化管由来のムチン以外のム
   チンおよび胃酸分泌抑制剤を含むヘリコバクター・ピロ
   リ定着阻害剤。
7. 【請求項７】 ムチンが牛乳汁または鶏卵卵白由来のム
   チンである請求項６記載の定着阻害剤。
8. 【請求項８】 哺乳動物の消化管由来のムチン以外のム
   チンおよび胃酸分泌抑制剤を含む、消化性潰瘍の予防剤
   および治療剤。
9. 【請求項９】 ムチンが牛乳汁または鶏卵卵白由来のム
   チンである請求項８記載の予防剤および治療剤。