JP2003034650A

JP2003034650A - 腸管感染症予防化合物及びそれを含む飲食物

Info

Publication number: JP2003034650A
Application number: JP2001219680A
Authority: JP
Inventors: Ryoko Konishi; 良子小西; Tomio Amano; 富美夫天野
Original assignee: National Institute of Infectious Diseases
Current assignee: National Institute of Infectious Diseases
Priority date: 2001-07-19
Filing date: 2001-07-19
Publication date: 2003-02-07

Abstract

(57)【要約】【課題】腸感染症起因菌によって引き起こされる感染
症を予防する効果を有する新規化合物、特に、腸管で消
化吸収されにくく、効果の持続性が高い感染症予防化合
物、及びそれを含む飲食物を提供する。【解決手段】感染症起因菌の腸管細胞との接着阻害作
用を有するオリゴ糖結合ペプチドと、難消化性多糖類が
結合されてなる腸管感染症予防化合物及びそれを含む飲
食物である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、腸管感染症起因菌
によって引き起こされる感染症を予防するための腸管感
染症予防化合物に関する。より詳しくは、食品成分中の
オリゴ糖結合タンパク質をプロテアーゼ処理して得られ
るオリゴ糖結合ペプチドを難消化性多糖類に化学的及び
酵素的方法によって結合させ、腸管感染症起因菌の宿主
細胞への接着阻害作用により感染症を予防するための腸
管感染症予防化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、細胞表面に結合している種々の糖
タンパク質の研究から、オリゴ糖類の生物学的意義が明
らかになりつつある。そして、腸管感染症起因菌の宿主
細胞への接着阻害作用により感染予防効果があり副作用
の少ない予防法として使用される可能性がある。例え
ば、マンノースを含有するオリゴ糖が、サルモネラ菌の
宿主細胞接着阻害作用を有することが知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、腸感
染症起因菌によって引き起こされる感染症を予防する効
果を有する新規化合物を提供することを課題とする。特
に、本発明の目的は、腸管で消化吸収されにくく、効果
の持続性が高い感染症予防化合物を提供することであ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】食品成分由来オリゴ糖結
合タンパク質からプロテアーゼによりオリゴ糖結合ペプ
チドを作製し、化学的又は酵素的反応により難消化性多
糖類に結合させる。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明において、腸管感染症と
は、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌、腸管ビブリオ
菌、コレラ菌、カンピロバクター菌など、腸管を経由し
て、ヒト、家畜、ペットなどに感染する感染症を意味す
る。Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Vib
rio cholerae, Campylobacter jejumi, Campylobacter
coliなどの細菌類が挙げられる。

【０００６】本発明において、オリゴ糖結合ペプチド
とは、オリゴ糖とペプチドが結合したものを指す。さら
に、本発明におけるオリゴ糖結合ペプチドは、腸管感染
症起因菌の宿主細胞（腸管細胞）への接着阻害作用を有
することが必要である。ここで、腸管感染症起因菌の宿
主細胞（腸管細胞）への接着阻害作用とは、オリゴ糖結
合ペプチド又はこれを含む化合物を添加せずに、腸管感
染症起因菌と宿主細胞（腸管細胞）を接着させた場合の
接着菌数（陽性対照）に対して、オリゴ糖結合ペプチド
又はこれを含む化合物をあらかじめ腸管感染症起因菌と
インキュベートした後に宿主細胞（腸管細胞）を接着さ
せた場合の接着菌数の割合を測定することにより得るこ
とができる。

【０００７】本発明において用いられるオリゴ糖結合
ペプチドとしては、腸の微繊毛膜において、細菌、ウィ
ルス、原虫、又はそれら由来の毒素が接着する際のレセ
プターとして知られているオリゴ糖を含むペプチドを用
いることができ、感染防止の目的に応じて、選択するこ
とができる。それらの例を表１に示す。

【０００８】

【表１】

【０００９】また、本発明においては、特に

【化１】の構造を有するシアリルグリコペプチド（以下ＳＧＰと
称する）は、Salmonellaenteritidisに対して、接着阻
害作用を示す。

【００１０】本発明において、オリゴ糖結合ペプチド
と結合される難消化性多糖類とは、いわゆる食物繊維の
中心的な物質で、植物細胞壁の構造物や細胞内容物起源
であり消化されにくいものをさす。植物細胞壁構造物と
してはセルロース、ヘミセルロース、リグニンなどが挙
げられる。細胞内容物としては植物ガム、ペクチン、粘
質物、海藻多糖類が挙げられる。

【００１１】本発明の化合物は、感染症起因菌の腸管
細胞との接着阻害作用を有するオリゴ糖結合ペプチド
と、難消化性多糖類が結合されてなる腸管感染症予防化
合物であるので、対応するオリゴ糖ペプチド単独で摂取
するよりも、腸内で消化吸収されず、腸内の滞留時間が
長く、接着阻害作用を発揮する時間が長くなるので、そ
の分、腸管感染症予防効果が高められる。

【００１２】次に、本発明の化合物の製造方法につい
て説明する。まず、オリゴ糖結合タンパク質を調製する
が、その方法としては特に限定されるものではなく、周
知の方法を用いることができる。一例を挙げれば、ま
ず、タンパク質源となる材料、好ましくはタンパク質含
有量の高い、牛乳、卵白、卵黄又はその加工品などから
周知の糖タンパク質精製方法により得ることができる。
例えば、これらのタンパク質源に、トリクロロ酢酸など
を用いてタンパク質画分を沈澱させ、周知の方法により
精製した後、糖とレクチンとの親和性を利用したクロマ
トグラフィーにより糖タンパク質画分を精製する。

【００１３】本発明におけるオリゴ糖結合ペプチド
は、この糖タンパク質画分から、腸管感染症起因菌の宿
主細胞への接着阻害作用を指標に、接着阻害作用のある
糖タンパク質画分を同定し、さらにプロテアーゼ処理し
て得ることができる。ここで、腸管感染症起因菌の宿主
細胞（腸管細胞）への接着阻害作用は、例えば、まず、
被検感染症起因菌を、試験管内で培養し、これを感染症
起因菌の宿主細胞（ヒト腸管培養細胞など）に一定時間
反応させる。その後、細胞に接着しなかった余分な菌を
洗浄し、菌と結合した腸管細胞を表面活性剤により溶解
する。溶解液を、細菌測定用の寒天培地にまき、生菌数
を測定することにより、オリゴ糖結合ペプチド非存在化
の接着数を定量的に検出することができる。接着阻害作
用は、被検体と菌をあらかじめ反応させた後、感染症起
因菌の宿主細胞に接着した菌数を被検体を加えていない
菌の接着菌数と比較する。

【００１４】次に、プロテアーゼを作用させる。用い
られるプロテアーゼとしては、特に制限されるものでは
なく、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイ
ン、コラゲナーゼ、ズブチリシン、カルボキシペプチダ
ーゼなどが挙げられる。プロテアーゼ作用後、周知の方
法により、分解物をゲルろ過カラムで分画し、前述の方
法を用いて、接着阻害作用を保持する画分を分離し、脱
塩後、乾燥させて目的とするオリゴ糖結合ペプチドを得
る。

【００１５】こうして得られたオリゴ糖結合ペプチド
のアミノ基をこれらの難消化性多糖類に化学的又は酵素
的に結合させることによって、難消化性の食中毒菌接着
阻害作用をもつでんぷんを調製することができる。オリ
ゴ糖ペプチドと難消化性多糖類の化学的結合は、例え
ば、難消化性多糖類にあらかじめモノクロロ酢酸と過酸
化ソーダを含むメチルアルコールと４０℃、５−４８時
間反応することによってカルボキシメチル基を付加した
難消化性多糖類を作成する。アミノ基の存在するオリゴ
糖ペプチドとカルボキシメチル基を付加した難消化性多
糖類を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＥＤＣ）ハイドロクロライドと酸
性化で反応させ、カルボキシメチル基とアミノ基の共有
結合を行なう。

【００１６】オリゴ糖ペプチドと難消化性多糖類の酵
素的結合は、例えば、難消化性多糖類を過酸化酵素など
でカルボキシメチル化させ、カルボキシメチル基を付加
した難消化性多糖類を作製する。アミノ基を含むオリゴ
糖ペプチドをペプチドシンセダーゼで結合させる。

【００１７】本発明の腸管感染症予防化合物は、賦形
剤、増量剤として通常使用される小麦粉、デンプン、デ
キストリン、ブドウ糖、乳糖、セルロース、トレハロー
ス等と共に使用することができ、糖衣錠やタブレット、
シロップ剤もしくはカプセルなどとして使用できる。ま
た各種飲食品、例えば清涼飲料水、乳飲料、果汁飲料、
醗酵飲料、ゼリー、プリン、アイスクリーム、ヨーグル
ト、キャンディー、チューインガム、ビスケット・クッ
キーなどの焼き菓子、パン・ケーキなどのベーカリー製
品、饅頭・団子・和菓子類、ラーメン・うどんなどの麺
類、スープ類、惣菜類、育児粉乳など通常の形態の飲食
品に配合し、使用することができる。また、家畜、ペッ
トなどの動物飼料に配合して使用することもできる。

【００１８】本発明の化合物の摂取量は特に制限はな
いが、０．１〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重／日程度が好まし
い。摂取回数は１日１回〜数回程度である。

【００１９】

【実施例】（１）オリゴ糖結合タンパク質の調製新鮮な卵黄に等量の水を加えて得られた希釈卵黄液に、
フェノール：水混合液（９：１、ｗ/ｗ）を加え激しく
攪拌した。得られたエマルジョンにさらに水を加え希釈
液を調製し、遠心分離（６０００ｒｐｍ、３０分）後、
得られた上清を減圧下で濃縮した。更に沈澱を除去し、
上清をゲルろ過カラム（Sephadex G-50,0.1M NaCl）に
叫し、シアル酸反応陽性画分を分離した。得られた画分
は同カラムで同様の操作を繰り返し、夾雑物を除去し精
製した。得られた画分を脱塩後、陰イオン交換カラム
（DEAE-Toyoperal 650M,5mM Tris-HCl緩衝液、pH8.0）
に供した。得られたシアリルオリゴ糖ペプチド画分は分
離後、脱塩し凍結乾燥した。

【００２０】（２）腸管感染菌に対するオリゴ糖結合
タンパク質の接着阻害作用の検出オリゴ糖タンパク質を適度な濃度０．１〜１ｍＭに調整
し、１×１０⁸／ｍｌの濃度の腸管感染菌と３０分室温
で反応させた。その後、プラスチックプレート上に培養
したヒト腸管培養細菌の絨毛面に１×１０²細胞／ｌで
添加し、４℃で１時間反応させた。その後、接着しなか
った菌を洗浄後、腸管細胞を０．１％トライトンＸで破
壊し、腸管細胞に結合した菌数を測定した。オリゴ糖タ
ンパク質と反応させていない菌を陽性対照とし、その菌
数と比較し、接着阻害作用を検出した。

【００２１】（３）プロテアーゼ処理と分画糖タンパク質５ｇを２００ｍｌの１ｍＭＣａＣｌ２を
含む０．０５Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ７．８）に溶解
し、少量のトルエン存在下で、糖タンパク質に対して２
％プロナーゼＰ（１００ｍｇ）を加え、４８時間後、７
２時間後、各々の１％のプロナーゼＰを加えて合計９６
時間３７℃で消化した。消化物を凍結乾燥した後、水に
溶解し、Sephadex G-25カラムクロマトグラフィーを行
なった。フェノール‐硫酸陽性画分を集めて、同様にプ
ロナーゼ消化を行なった。プロナーゼは糖ペプチドに対
して、当初５％、２４時間後に５％加えて４８時間消化
した。消化物は、Sephadex G-50カラムクロマトグラフ
ィーを用いて水で溶出した。糖ペプチド２５０ｍｇを１
ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解し、DEAE-
Sephadex A-25カラム(２．１×５５ｃｍ)にのせ、５ｍ
Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）から２０ｍＭリン酸
バッファー（ｐＨ７．０）まで濃度勾配をかけた。つい
で２０ｍＭリン酸バッファーから１５０ｍＭリン酸バッ
ファーまでの濃度勾配の系で溶出した。凍結乾燥後、脱
塩し、レクチン‐アフィニティークロマトグラフィーで
さらに糖の種類別に分画した。

【００２２】（４）オリゴ糖ペプチドとセルロースと
の結合オリゴ糖ペプチドは、オリゴ糖タンパク質にプロテアー
ゼを反応させ、レクチンとの親和性クロマトグラフィー
により精製した。セルロースはモノクロロ酢酸と過酸化
ソーダを含むメチルアルコールと４０℃、５〜４８時間
反応させることによって、カルボキシメチル化セルロー
スを作製した。カルボメチル化セルロースとオリゴ糖ペ
プチドをＥＤＣ存在下で３時間反応させ、共有結合させ
た。透析により精製し、乾燥させ、目的のＳＧＰとセル
ロースが結合した化合物（以下ＳＧＰ−セルロースとい
う）を得た（２５０ｍｇ）。

【００２３】（５）アシアロＳＧＰ−セルロースの調
製ＳＧＰ‐セルロース溶液に同量の０．２ＮＨ₂ＳＯ₄を
加え、８０℃、１時間加熱した後、Sephadex G-25カラ
ムを用いて脱塩し、アシアロSGP-セルロースを得た。こ
れらの化合物の感染症予防効果を確認するために、以下
の試験を行なった。

【００２４】（６）腸管滞留試験同位元素¹⁴Ｃを含むセルロースとペプチド部分にクロラ
ミンＴ法でヨード¹²⁵Ｉを結合させたオリゴ糖ペプチド
を、マウスに経口投与で同時に投与した。経時的に、
尿、分、血液を採取した。また、投与７２時間目には殺
処分とし、盲腸内容物を採取した。それぞれの検体に含
まれる放射性物質のうちヨード¹²⁵Ｉはそのまま一定量
をガンマーカウンターにより測定した。¹⁴Ｃはサンプル
オキシダイザーにより、検体を燃焼させるときに発生す
る炭素に含まれる放射性物質の量を測定した。投与した
放射性物質の量と各検体から検出された放射性物質の量
の割合から腸管滞留時間を推定した。

【００２５】得られた結果を図１及び図２に示す。Ｓ
ＧＰに比較して、本発明の化合物ＳＧＰ−セルロース
は、腸管（盲腸滞留時間を指標とする）に腸時間残存し
（図１）、糞中に長い期間排出され続けることが明らか
である（図２）。

【００２６】（７）ヒト腸管細胞を用いた接着阻害作
用試験プラスチックプレートにヒト腸管細胞を約１０日間培養
し、腸管上皮細胞と同様の形態を形成させた（腸絨毛、
タイトジャンクションなど）。一晩前培養させたサルモ
ネラ菌、大腸菌などを被検体とともに３０分室温で反応
させた液または菌のみの液を１×１０²（菌数）／ｌ
（細胞）の割合で、培養した腸管の絨毛を有する側（腸
管腔側）に添加した。４℃１時間反応させた後、接着し
なかった余分な菌を洗浄して取り除き、腸管細胞を０．
１％トライトンを用いて破壊し、段階希釈して寒天培地
にまき、一昼夜３７℃で培養した。この方法で測定した
菌数が細胞の表面に結合した菌を表す。被検体と反応さ
せた菌の腸管細胞への結合数と菌のみの腸管細胞への結
合数との比率が阻害効果となる。

【００２７】その結果を図３及び図４に示す。ヒト腸
管細胞を用いた接着阻害作用もサルモネラエンテリティ
ディスに対しては、オリゴ糖単体と同等に阻害し（図
３）、大腸菌に対してはオリゴ糖単体より効果的に阻害
していた（図４）。

【００２８】（８）マウスを用いたサルモネラの感染
実験４週齢の近交系マウスBalb/cのメスを５匹１群として、
オリゴ糖ペプチド結合難消化性多糖類を感染３日前から
飲水で与えた。濃度は０．１％であった。対照群には水
道水を与えた。感染はＬＤ₅₀の菌数の２分の１である５
×１０⁵菌／匹のサルモネラエンテリティディスを経口
投与した。感染９日後の生死を観察して感染予防効果を
測定した。被検体の飲水は感染実験の間継続して飲ませ
ていた。その結果を表２に示す。

【００２９】

【表２】

【００３０】マウスを用いたサルモネラの感染実験で
は、対照群の水のみを飲ませた群で約６０％が生存する
菌数のサルモネラを経口投与させた場合、ＳＧＰ‐セル
ロース（糖鎖を含む難消化性多糖類）を０．１％飲み水
で飲ませた群では生存率は１００％に高まった。以上、
本発明を実施例により説明したが、本発明の範囲はこれ
に限定されるものではなく、感染症起因菌と腸管細胞と
の接着に対する阻害作用を有しているオリゴ糖結合タン
パク質と、難消化性多糖類が結合してなる化合物を全て
包含するものである。

【００３１】

【発明の効果】本発明は、オリゴ糖ペプチドを難消化性
多糖類に結合させ、腸滞留時間を長くし、吸収しにくい
形状にすることにより、その感染予防硬化を増強し、か
つ安全性を高めることができる。糖鎖ペプチドを結合さ
せた難消化性多糖類は、腸管内の安定性、長時間滞留
性、予防効果に優れ、腸管感染症予防生成物として幼
児、老人など抗生物質の使用が懸念される人への食事素
材として利用価値が高い。糖ペプチドのアミノ基を化工
デンプンに共有結合やメイラード反応、酵素反応などで
結合させることにより多機能の糖鎖をもつ難消化性の食
品素材を創製することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】投与７２時間後の盲腸において検出された放
射性物質の量の、投与した放射線物質の量に対する比率
を示したグラフである。

【図２】糞中に検出される¹²⁵Ｉ−ＳＧＰと¹⁴ＣＳ
ＧＰ−セルロースの経時変化を示すグラフである。

【図３】種々の化合物の、Salmonella entritidisの
ヒト腸管細胞への接着阻害作用を、無添加の場合の接着
率を１００として比較した示すグラフである。

【図４】種々の化合物の、E. coliのヒト腸管細胞へ
の接着阻害作用を、無添加の場合の接着率を１００とし
て比較した示すグラフである。

フロントページの続き (72)発明者小西良子東京都杉並区清水２−21−22 (72)発明者天野富美夫神奈川県横浜市神奈川区斎藤分町85−９Ｆターム(参考） 4B018 MD20 MD31 MD33 MD35 ME09 MF12 4C084 AA01 ZA66 ZB31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】感染症起因菌の腸管細胞との接着阻害作
用を有するオリゴ糖結合ペプチドと、難消化性多糖類が
結合されてなる腸管感染症予防化合物。
【請求項２】オリゴ糖結合ペプチドがシアリルオリゴ
糖結合ペプチドであり、難消化性多糖類がセルロースで
ある請求項１記載の化合物。
【請求項３】請求項１又は２記載の化合物を含む飲食
物。