JP2003516757A - ガラクトマンナン−オリゴサッカライドおよびその製造方法ならびにその使用 - Google Patents

ガラクトマンナン−オリゴサッカライドおよびその製造方法ならびにその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ガラクトマンナン化合物の加水分解方法、および加水分解物の種々の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ガラクトマンノ−オリゴサッカライド、その製造方法ならびに食品
および医薬におけるその使用に関する。
【０００２】 再生し得る天然材料から食品および／または医薬の活性成分および／または添
加剤を得るという需要が常に存在している。この需要は、天然資源から得られる
原料は消費者に容易に受け入れられるだけでなく、それらが環境を配慮した方法
で処理され得ることに由来する。マンナンおよびその誘導体、例えばグルコマン
ナンおよびガラクトマンナンは、このような天然材料である。マンナンは、グル
コース単位の代わりにマンノースから構成されるポリオースである。マンノース
鎖はβ-1,4-結合したマンノース単位からなる。ガラクトマンナンは、β-1,4-結
合したマンノース単位のほかに、これにα-1,6-結合したガラクトースをも有し
、従ってマンノースおよびガラクトースの基礎単位を含む。このようなガラクト
マンナンはグアーガム、カシアガムおよびイナゴマメの種子の粉末の形態で得ら
れ、例えば食品産業においては増粘剤として、また医薬産業においては製錠補助
剤として使用される（Industrial Gums, R. L. Whistler および J. N. BeMille
r 編, 第３版, 1992, Academic Press, New York）。起源の異なるガラクトマン
ナンは、マンノースおよびガラクトースの相対含有量が異なっている。
【０００３】 食品に適する原料を製造するために、ポリオースはしばしば小さい単位に分解
される。従って、ポリサッカライドを希酸により種々の温度で加水分解すること
が知られている。ガラクトマンナンの加水分解により、モノマー、すなわちマン
ノースおよびガラクトースの混合物が生成する。
【０００４】 アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）から得られるエンド-β-マン
ナナーゼ（E.C. 3.2.1.78）は、ガラクトマンナンを酵素的に加水分解すること
が知られている（H. Uhlig, Enzyme arbeiten fuer uns (Enzymes are working
for us), Carl Hanser 出版社, Muenchen, Wien, 1991）。しかしながら、この
酵素はグアーガム由来のガラクトマンナンを加水分解することができず、一方で
はイナゴマメ粉（carob seed meal）由来のガラクトマンナンを部分的にしか加
水分解できない。このように、ガラクトマンナンは起源に応じて、加水分解に対
して異なる適性を示す場合がある。
【０００５】 Ajisaka ら（Carbohydrate Research 270 (1995), 123-130）には、アスペル
ギルス・ニガーから単離されたα-マンノシダーゼを用いて、マンノビオースお
よびマンノトリオースの酵素的合成を可能にする方法が記載されている。通常の
加水分解反応の逆反応により行われるこの合成は、工業的には受け入れられない
約２％の収率で進行する。この生成物はガラクトース単位を含有していない。
【０００６】 K. Newman（Biotechnology in the Feed Industry, Proc. of Alltech's 20th Symposium (1994), 167-174）には、酵母細胞壁から得られたグルコマンノタン
パク質複合体が記載されており、これは病原性微生物のマンノース特異的レクチ
ンに特異的に結合する。この生成物はガラクトース単位を含有していないので、
ガラクトース特異的な微生物性レクチンとの結合を引き起こすことができない。
【０００７】 従って、本発明によって解決すべき技術的問題は、医薬産業および食品技術の
分野において有利に利用され得る、ガラクトマンナンから製造可能な物質ならび
にその製造方法を提供することである。
【０００８】 この技術的問題は、本発明により、ガラクトマンナンの水溶液または水性懸濁
液を製造し、これを細菌由来の酵素活性により、特に細菌由来の酵素的活性剤を
用いて加水分解し、そして ＜ 15 、特に２〜７の重合度（DP）を有する、マン
ノース−およびガラクトース−含有オリゴサッカライドの混合物を得ることを特
徴とする、ガラクトマンナンからマンノース−およびガラクトース−含有オリゴ
サッカライドを製造する方法を提供することによって解決される。本発明はまた
、その基本的問題を、β-1,4-結合したマンノース単位、およびそれにα-1,6-結
合したガラクトース単位を含み、＜ 15 、特に２〜７の重合度（DP）を有する、
このように製造しうるガラクトマンノ−オリゴサッカライドを提供することによ
って解決する。驚くべきことに、これらのガラクトマンノ−オリゴサッカライド
は、栄養物、食品、嗜好品および医薬において、またはこれらとして使用する際
に、疾患の予防および治療を可能にするとともに、健康状態の改善に一般的に役
立ち得るという有利な点を提供する。
【０００９】 本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカライドは、嗜好品および食品の血
糖指数を低下させ、病原性微生物がヒトまたは動物の上皮に付着するのを防止ま
たは減少させることによって感染症を抑制および／または予防し、炎症性の慢性
腸疾患を抑制および／または予防し、腸癌または結腸癌の発生を防止または抑制
し、一般の感染症に対する免疫防御性を強化し、調節し、これにより炎症性疾患
を抑制および／または防止し、そしてカルシウムの吸収を改善し、これにより特
に骨粗鬆症を防止するという事実によって特に優れている。
【００１０】 本発明に関連して、「疾患」とは、主観的に感知するかまたは客観的に確認し
うる肉体的、精神的、または心理的な変化をもたらす器官または生物全体におけ
る生活過程の障害を意味する。本発明に関連して、「疾患」には欠乏症（defici
encies）も含まれる。
【００１１】 本発明に関連して、「活性成分」とは、生きた生物またはその部分において生
物学的な作用を引き起こす物質を意味する。「薬剤」とは、疾患の予防、軽減、
治癒または診断のために寄与することのできる活性成分を意味する。「医薬」と
は、ヒトまたは動物に投与するために定められた処方の薬剤を意味する。
【００１２】 本発明に関連して、「栄養物」または「食品」とは、主として生命機能の維持
に役立つ物質を意味し、その一方で、「嗜好品」とは、主としてその摂取に際し
て消費者の満足感を高める物質を意味する。
【００１３】 従って、本発明はまた、＜ 15 、特に２〜７の重合度（DP）を有する、ガラク
トマンノ−オリゴサッカライドとも呼ばれるマンノース−およびガラクトース−
含有オリゴサッカライドに関し、ここで、マンノース単位はβ-1,4-結合してお
り、ガラクトース単位はマンノース単位にα-1,6-結合している。本発明に係る
ガラクトマンノ−オリゴサッカライドは、口腔、胃および小腸の領域内で一般的
な加水分解条件に対して安定であり、従って本質的に変化せずに大腸に達するこ
とができ、そこでその望ましい健康増進作用を発揮することができる。
【００１４】 本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカライドは、それら自体が小腸内の
加水分解条件下で安定であるばかりでなく、更に粘膜に存在するα-グルコシダ
ーゼ（グルコアミラーゼ／マルターゼおよびサッカラーゼ／イソマルターゼ）を
阻害する。従って、これらは、本発明に従い、嗜好品および食品の血糖指数を低
下させるために使用することができる。
【００１５】 本発明によれば、本発明のガラクトマンノ−オリゴサッカライドは、病原性微
生物が上皮細胞に付着するのを減少または防止し、これによって感染症を予防及
び治療することができる。更に、本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカラ
イドは、腸のビーカー状細胞からの粘液分泌を刺激し、従って種々の腸疾患の進
行に良好な影響を与えることができる。
【００１６】 上記のように、本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカライドは小腸で加
水分解されるのではなくて、実質的に変化せずに大腸に達し、次いでそこに存在
する微生物による実質的な発酵によって短鎖脂肪酸、特に酪酸に分解される。こ
の発酵により生じる pH の低下は、クロストリジウム属菌のような有害微生物の
生存に必要な条件を悪化させると同時に、有用なビフィドバクテリウム属菌およ
び乳酸桿菌属菌の生存条件を向上させる。このように、本発明に係るガラクトマ
ンノ−オリゴサッカライドは、プレバイオティック効果を示す。上記の酪酸の生
成の増加は、結腸癌の発生および成長を減少及び／または防止することができる
。
【００１７】 最後に、本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカライドはまた、腸領域で
無機栄養成分からのカルシウムの吸収を改善する点で有利であり、従って特に、
骨粗鬆症、とりわけ原発性骨粗鬆症、例えば閉経後または老人性の骨粗鬆症、あ
るいは続発性骨粗鬆症の予防および防止に使用される。
【００１８】 更に、本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカライドは、細胞性免疫系と
の直接的相互作用を示す点においても有利であり、従って、一方では免疫防御性
を強化し、他方では免疫応答を調節して炎症の経過を軽減または抑制することを
可能にする。
【００１９】 従って、本発明はまた、本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカライドを
含有する嗜好品、食品またはいわゆる機能性食品に関する。このような食品とし
ては、例えばバター、ヨーグルト、凝乳のような乳製品、フライ（またはベーク
ド）製品、スープおよびソース用粉末、パン用スプレッド、マーガリン、料理用
脂肪及びショートニング、香辛料混合物、ジャム、砂糖漬け果実、非アルコール
性飲料等が挙げられる。嗜好品としては、例えばハードまたはソフトキャラメル
（またはキャンディー）、チューインガム、チョコレート、なま棒チョコ、クッ
キー（またはビスケット）製品、クラッカー、アイスクリーム（または氷菓子）
、メレンゲ及びグミ状砂糖製品、ドラジェー、アルコール飲料および非アルコー
ル飲料等が挙げられる。
【００２０】 本発明はまた、本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカライドを、場合に
より薬学的に許容される好適な担体、添加剤または助剤と一緒に、薬学的有効量
で含有する医薬に関する。このような担体、添加剤または助剤は、例えば滑剤、
分離（または離型）剤、増粘剤、安定剤、乳化剤、保存剤、レシチン、強力人工
甘味料、甘味料、着色剤、矯味矯臭剤、香料、増量剤、すなわち充填剤などであ
ってよい。
【００２１】 医薬は、例えば丸剤、カプセル、錠剤、糖衣錠、坐剤、溶液、懸濁液、エマル
ジョン、注射溶液、注入溶液、滴剤、シロップ、軟膏、クリーム、ジェリー、エ
アゾール、吸入剤の形態、または他の慣用の投与形態で使用することができる。
【００２２】 本発明はまた、ヒトまたは動物の身体を外科的または治療的に処置する方法に
使用するための本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカライドに関する。更
に、本発明はまた、II型糖尿病、感染症、腸疾患、結腸癌、炎症性疾患および骨
粗鬆症を予防または治療するための本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカ
ライドの使用、ならびに上記目的の医薬を製造するための、本発明に係るガラク
トマンノ−オリゴサッカライドの使用に関する。
【００２３】 本発明はまた、ガラクトマンナンを含有する原料、特にグアーガム、例えばグ
アー粉、カシアガムまたはイナゴマメ粉から、ガラクトマンナンの水溶液または
水性懸濁液を製造し、細菌由来の酵素活性によって、特に細菌由来の酵素的活性
剤を使用して加水分解し、そして ＜ 15 、好ましくは２〜７の重合度を有する
、マンノース−およびガラクトース−含有オリゴサッカライドの混合物の水溶液
を得ることを特徴とする、本発明に係るガラクトマンノ−オリゴサッカライドを
製造する方法に関する。この生成物溶液から、例えば噴霧乾燥により、生成物の
乾燥混合物が得られる。
【００２４】 このように、本発明は、細菌由来の酵素活性により、ガラクトマンナンを含有
する材料、例えばグアーガム、カシアガムまたはイナゴマメ粉から、ガラクトマ
ンナンを加水分解して、それぞれ同様に高い効率で、本発明に係るガラクトマン
ノ−オリゴサッカライドを得ることができるという驚くべき教示を提供する。
【００２５】 水溶液中のガラクトマンナンの濃度は好ましくは１〜５％であり、pH 値は好
ましくは５〜８であり、溶液の温度は好ましくは 30〜40 ℃である。
【００２６】 本発明に関連して、「酵素的活性剤」とは、ガラクトマンナンを加水分解して
、特に ＜ 15 、好ましくは２〜７の重合度を有するガラクトマンノ−オリゴサ
ッカライドを生成することのできる、細菌、特に桿菌細胞、または生きたまたは
死んだ細菌からの完全または部分的に精製された酵素または粗抽出物を意味する
。粗抽出物は、機械的溶菌法、例えばボールミルもしくはフレンチプレス、また
は科学的もしくは電気的溶菌方法、例えば電場の発生、または超音波処理のよう
な慣用方法によっても得ることができる。
【００２７】 本発明の特に好ましい実施形態において、枯草菌の種類、特に Braunschweig
所在の German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM)) に 1999 年12月６日
に受託番号 DSM 13182 として寄託された枯草菌の株の細菌が用いられる。
【００２８】 使用される細菌は、天然に存在するものであっても、または遺伝子操作された
細菌であっても良く、特に桿菌であってよいことは自明である。例えば、使用さ
れる細菌は、特定の抗生物質に対して耐性であってよく、この場合、酵素的活性
剤を特に簡単に製造することができる。細菌由来の酵素は、天然起源であっても
よく、または野生型アミノ酸配列を有するものでもよいが、天然に存在する酵素
と比較してアミノ酸の変更、例えばアミノ酸の欠失、挿入、転移、置換または付
加、あるいは一般にないアミノ酸の使用を有してもよい。酵素は、場合により修
飾、例えばグリコシル化その他を示してもよい。酵素はまた、ガラクトマンナン
を上記の生成物に加水分解できる限り、他のタンパク質またはペプチドとの融合
タンパク質として、または酵素断片として存在することもできる。
【００２９】 本発明はまた、ガラクトマンナンを加水分解するための酵素的活性剤の使用に
関し、この場合、酵素的活性剤を遊離形態または固定化形態で加水分解に使用す
ることができる。従って本発明によれば、細菌、好ましくは枯草菌の休眠（dorm
ant）細胞を用いて加水分解を行うことができる。細胞を最初に安定な不活性マ
トリックスに固定化し、こうして生成したバイオ触媒をガラクトマンナンの加水
分解に使用することもできる。本発明によれば、酵素、細菌または粗抽出物を同
様に固定化することもできる。固定化は、支持体との結合、架橋、包含またはカ
プセル封入により行うことができる。架橋は、例えばグルタルアルデヒドを用い
て行うことができる。支持体への結合は、吸着結合または共有結合により行うこ
とができ、一方、包含のためには、例えばゲル、マイクロカプセルまたはファイ
バーの形態の半透過性膜が用いられる。カプセル封入された酵素または微生物は
、半透過性膜により周囲の基質溶液及び生成物溶液から分離される。
【００３０】 本発明はまた、得られたマンノース−およびガラクトース−含有オリゴサッカ
ライドの混合物をクロマトグラフィー分離法にかける上記の方法に関し、この方
法により、特定の重合度を有する所望のオリゴサッカライドを得ることができる
。
【００３１】 本発明の他の有利な実施形態は、従属請求項から明らかになる。
【００３２】 本発明を以下の実施例により詳細に説明する： 実施例１： バイオ触媒の製造 傾斜寒天培養物からの枯草菌 SZ 100（DSM 13182）株の接種物を、カゼインペ
プトン（15/g/L）、ダイズ粉ペプトン（5/g/L）、NaCl（5/g/L）およびグアーガ
ム（1/g/L）からなる培地の入った振盪フラスコに入れて一緒にし、振盪しなが
ら 30 ℃で 24 時間インキュベートする。
【００３３】 次いでこの振盪培養物を 10 L の発酵槽に移し、振盪培養物と同じ組成の培地
中でさらに培養する。
【００３４】 24 時間成長させた後、細胞を遠心分離し、３％アルギン酸ナトリウム溶液に
再懸濁させ、次いで撹拌しながら２％塩化カルシウム溶液中に滴下する。生成さ
れた、枯草菌（DSM 13182）細胞を含有するアルギン酸カルシウムペレット（バ
イオ触媒）を洗浄し、乾燥し、冷蔵する。
【００３５】 実施例２： グアーガムの加水分解 実施例１に従って製造したバイオ触媒をグアーガム水溶液（濃度１〜５％）中
で膨潤させ、37 ℃に保温したカラムに移す。次いでグアーガム溶液をカラムに
連続的に通過させることにより、グアーガムの加水分解を行う。通過する液を、
モノ-、オリゴ- およびポリサッカライドの含有量について HPLC 分析により検
査し、下記の組成を得る： モノサッカライド ２％ オリゴサッカライド ７０％ ポリサッカライド ２８％ 加水分解は、半連続式またはバッチ式で行うこともできる。後者の場合、実施
例１に従って製造したバイオ触媒を、撹拌式反応器中でグアーガム溶液と接触さ
せる。
【００３６】 加水分解を行うためには、枯草菌（DSM 13182）からの酵素の粗抽出物を使用
することもできる。この場合、発酵後のバイオマスを遠心により単離し、リン酸
緩衝液に再懸濁させ、次いで分解する（超音波、フレンチプレス、ボールミルな
ど）。細胞破片を遠心により除去し、こうして得られた粗抽出物をさらに精製す
ることなく、加水分解すべきグアーガム溶液に加える。
【００３７】 それそれの加水分解により得られた水溶液は、DP ＜ 15 、特に DP ２〜７を
有する所望のガラクトマンノ-オリゴサッカライドのほかに、より高分子量の成
分を少量含有する。これらは、本来公知の分離法、例えばカルシウムを負荷した
強酸性カチオン交換体上でのクロマトグラフィー、または分別アルコール沈殿ま
たは限外濾過により簡単に除去することができ、その結果 DP ＜ 15 、特に DP
２〜７のガラクトマンノ-オリゴサッカライドが純粋な形態で水溶液として得ら
れ、この水溶液から本来公知の方法で（例えば噴霧乾燥により）、ガラクトマン
ノ-オリゴサッカライドを乾燥状態で得ることができる。
【００３８】 実施例３： 口腔、胃および小腸内でのガラクトマンノ-オリゴサッカライ ドの安定性口腔領域内での安定性 ： 実施例２により得られた本発明に係るオリゴサッカライドの口腔内のフローラ
に対する安定性を、口腔領域に存在する細菌株であるストレプトコッカス・ミュ
ータンス DSM 20523 およびストレプトコッカス・ソブリヌス NCTC 10922 なら
びに新鮮な歯垢を用いて試験した。
【００３９】 ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・ソブリヌスを
、液体 DSM 培地 92 中で嫌気性条件下に 37 ℃で 24 時間培養した。対数的成
長期が終わった段階で、細胞を遠心分離し（15 分、4000 xg）、pH 7.5 の最初
の 20 mM 炭酸塩緩衝液の10 ％に再懸濁させた。続いて本発明に係るオリゴサッ
カライドの溶液（20 mM 炭酸塩緩衝液中１％、pH 7.5）９mL に、細菌懸濁液の
１mL を加えて接種し、37 ℃で２時間インキュベートした。一定の間隔で試料を
採取し、そのオリゴサッカライド含有量を検査した（結果は下記参照）： ３日間歯磨きをしなかった３人のボランティア男性から、歯垢試料を採取し、
それぞれの場合 10 mg の歯垢を１mL のオリゴサッカライド溶液（20 mM 炭酸塩
緩衝液中１％、pH 7.5）に懸濁させた。37 ℃で２時間のインキュベーション時
間の間に、試料を採取し、そのオリゴサッカライド含有量を検査した。
【００４０】結果 ： コントロールとして随伴させたサッカロースは、120 分以内に両方のストレプ
トコッカス株によるだけでなく歯垢の混合培養によっても完全に加水分解された
のに対し、本発明に係るオリゴサッカライドの分解は２時間後でも認められなか
った。
【００４１】胃内での安定性 ： 胃を通過する際の物質の安定性は、pH 1.0 または 2.0 における加水分解率を
測定することにより示すことができ、コントロールとしてのサッカロースと比較
することができる： この目的のために、１％ガラクトマンノ-オリゴサッカライド溶液を、pH-値 1
.0（0.1 M HCl）および pH-値 2.0（0.01 M HCl）において 37 ℃で３時間イン
キュベートした。反応混合物から 60、120 および 180 分後に試料を採取し、こ
れらを HPAEC により分析した。この場合、サッカロースおよび 1-ケストース（
1-kestose）をコントロール物質として使用した。
【００４２】
【表１】 表Ｉから、ガラクトマンノ-オリゴサッカライドは損傷を受けずに胃を通過で
きることが明らかである。
【００４３】膵臓酵素に対する安定性 ： 膵臓分泌液は多数のヒドロラーゼ、なかでも、α-1,4-グルカン（澱粉、グリ
コーゲン）を優先的にマルトースおよびマルト-オリゴサッカライドに分解する
α-アミラーゼのような炭水化物分解酵素を含んでいる。
【００４４】 膵臓酵素に対するガラクトマンノ-オリゴサッカライドの安定性の試験を、下
記のように行った：必要な溶液 ： ・ 20 mMリン酸 Na緩衝液、pH 7.0、プラス ６mM NaCl（溶液１） ・ 溶液１中の１％澱粉溶液（Zulkowski による可溶性澱粉） ・ 溶液１中の１％ガラクトマンノ-オリゴサッカライド溶液 ・ 溶液１に溶解した 0.2 ％パンクレアチン（Sigma 社）
【表２】 サーモミキサー（間欠的振盪）中で 37 ℃において 210 分間インキュベート
した後、95 ℃に 15 分間加熱することにより反応を終了させ、試料を HPAEC に
より分析した。これに先立って、澱粉含有試料を予め１M HCl 中で 95 ℃におい
て加熱することにより、完全に加水分解させた。
【００４５】
【表３】 表IIIは、本発明に係るガラクトマンノ-オリゴサッカライドが膵臓酵素により
影響されないことを示している。
【００４６】 実施例４： 小腸-α-グルコシダーゼによる分解性 小腸の粘膜内酵素複合体であるサッカラーゼ／イソマルターゼおよびグルコア
ミラーゼ／マルターゼはインビボで、小腸に達した後、ジサッカライドであるマ
ルトースとサッカロース、および一部マルトオリゴサッカライドがモノサッカラ
イドに分解し、これら自体が腸管壁から循環系に到達できることを確実なものと
している。
【００４７】 これらの酵素に対する本発明に係るガラクトマンノ-オリゴサッカライドの安
定性の試験を、下記のように行った：酵素の単離 ： 酵素複合体であるサッカラーゼ／イソマルターゼ（SI-複合体）およびグルコ
アミラーゼ／マルターゼ（GM-複合体）を、ブタ細腸から H. Heymann の方法（
論文、Hannover, 1991）により単離した。
【００４８】 小腸-α-グルコシダーゼによる、本発明に係るガラクトマンノ-オリゴサッカ
ライドの分解性を、下記のように測定した：必要な溶液 ： ・ トリエタノールアミン（TRA）緩衝液、0.1 M、pH 7.0 ・ ガラクトマンノ-オリゴサッカライド、TRA 緩衝液中の１％溶液 ・ コントロール物質としてのマルトースおよびサッカロース、TRA 緩衝液中 １％ ・ 粘膜内酵素、TRA 緩衝液に溶解反応混合物 ： 37 ℃に加温してある 1.2 mL の炭水化物溶液に、0.7Ｕの酵素複合体であるサ
ッカラーゼ／イソマルターゼまたはグルコアミラーゼ／マルターゼを、時間ｔ＝
０で加えて混合し、37 ℃でインキュベートした。２時間後に、その混合物を95
℃に 15 分間加熱することにより反応を停止した。生成したモノサッカライドな
らびに使用した試験物質を HPAEC により定量した。
【００４９】
【表４】 表IVは、SI-酵素複合体の場合はサッカロースおよびマルトースが、ならびに
GM-酵素複合体の場合はマルトースがほとんど完全に加水分解される選択された
条件下で、ガラクトマンノ-オリゴサッカライドは、両方の酵素複合体によって
実質的に分解されないことを示している。
【００５０】 実施例５： 単離された酵素複合体（SI-複合体および GM-複合体）による 分解性 ブタ小腸から単離された酵素複合体であるサッカラーゼ／イソマルターゼ（SI
-複合体）およびグルコアミラーゼ／マルターゼ（GM-複合体）（実施例４参照）
を、本発明に係るガラクトマンノ-オリゴサッカライドによる阻害効果について
、SI-複合体の場合は物質サッカロースとマルトースの存在下に、GM-複合体の場
合はマルトースの存在下に試験した。基質-阻害剤の比は、全ての場合に 10:1
であった。
【００５１】 混合物： - 0.7 ml の基質溶液、0.1 Mリン酸 Na緩衝 液中 1.43 ％、pH 7.0 - 0.1 ml のガラクトマンノ-オリゴサッカ ライド、１％ - 0.1 ml の 0.1 Mリン酸 Na緩衝液、pH 7.0 予備インキュベーション： 15 分、37 ℃ ゼロ試料の採取 開始： 0.1 ml の酵素溶液（初期混合物中 0.5 U/ml の マルターゼ活性） 試料の採取： 30 分および 60 分後にそれぞれ試料 0.15 ml 反応の停止： 95 ℃で２分 分析法： HPAEC、標準溶液はそれぞれ 10 ppm のグルコー ス、フルクトース、それぞれ 20 ppm のサッカ ロース、マルトースを含む
【表５】 表Ｖにまとめたように、SI-酵素複合体によるサッカロースとマルトースの分
解は、ガラクトマンノ-オリゴサッカライドの存在下で阻害される。これに対し
て、GM-複合体によるマルトースの分解は、ガラクトマンノ-オリゴサッカライド
の添加によって影響されない。
【００５２】 実施例６： 上皮細胞への病原性微生物の付着の防止上皮細胞 朝の初尿から遠心により得られたヒトの尿路上皮性細胞微生物 黄色ブドウ球菌２株および大腸菌２株（それぞれ 109 微生物/mL を含む懸濁
液として）試験 上皮細胞および微生物懸濁液を一緒にし、37 ℃で 30 分間インキュベートし
た。次いで、付着しなかった微生物から上皮細胞を膜濾過（８μ）により分離し
た。このフィルターを数回洗浄し、生理食塩水に入れ、上皮細胞を懸濁させた。
この食塩水中の懸濁液を遠心した後、ペレットをスライドグラスに載せ、メイ-
グリュンワルド法およびギムザ法により染色した。50 の上皮細胞に付着した微
生物の数を計数した。この数値をブランク値とした。コントロールとしては、微
生物懸濁液を加えていない上皮細胞を用いた。
【００５３】 本試験において、最初に上皮細胞を種々の濃度のガラクトマンノ-オリゴサッ
カライド溶液とともに、１、２及び３時間インキュベートした。次いでこれらを
微生物懸濁液と一緒にし、上記のようにさらに処理した。 50 の上皮細胞に付着
した微生物の数を測定値とした。
【００５４】結果 ： 例えばラフィノース、ナイストース（Nystose）およびイソメレジトース（iso
melezitose）のような比較として用いた「中性」炭水化物においては、上皮細胞
への微生物の付着の減少は全く確認されなかった。本発明に係るガラクトマンノ
-オリゴサッカライドを用いると、試験した全ての微生物の付着がほとんど完全
に（阻害：＞ 95 ％）防止された。
【００５５】 実施例７： 結腸における粘液分泌の上昇 屠殺したばかりのブタの切除結腸を充分に洗浄した後、末端部分から１cm２
の大きさの切片を切り出した。こうして調製した切片を、クロラムフェニコール
およびアンピシリン（それぞれ 50μg/mL）を加えたハンクス緩衝液中で、酸素
を通気し撹拌しながら 37 ℃で５時間インキュベートした。この緩衝液は、さら
に、粘液分泌に対するその刺激作用を試験すべき本発明により製造されたガラク
トマンノ-オリゴサッカライドを１％含んでいた。コントロールとして、10個の
結腸切片を試験すべき各バッチに用いた。そのバッチの一つは炎症性腸疾患の治
療に慣用されるヒドロコルチゾンを含んでいた。
【００５６】 粘液分泌の上昇に関する尺度として、上澄み液中の全炭水化物増加量を測定し
た。このために、インキュベーション中に種々の時点でサンプルを採取し、それ
ぞれ10μLのサンプルに20μLのレゾルシン溶液（６mg/mL）および100μLの75％
硫酸を加え、80℃で60分間インキュベートした後、吸光度をλ＝450 nmで測定し
た。
【００５７】結果 ： 本発明に係るガラクトマンノ-オリゴサッカライドは、コントロールと比較し
て、粘液分泌を約2.4倍上昇させ、一方、ヒドロコルチゾンによる上昇は約5.3倍
であった。最近の研究において、コルチコステロイドのような物質について、こ
れらの物質は、結腸上皮細胞の生検から得られた細胞培養物中で内因性の粘液分
泌の刺激を刺激し得ることが見出されている（Finnie I.A. ら, Clinical Scien
ce, 91 (1996, 359-364)。これによって、本発明に係るガラクトマンノ-オリゴ
サッカライドからなる食品成分により、炎症性腸疾患に好ましい影響を与える可
能性が明らかである。
【００５８】 実施例８： 結腸におけるミクロフローラに対する影響 結腸におけるミクロフローラの構成に対する本発明に係るガラクトマンノ-オ
リゴサッカライドの影響を検査するために、ヒト大便中に存在する細菌の種々の
純粋培養物を、唯一の炭素源としてガラクトマンノ-オリゴサッカライドを含む
下記の培地中で培養した： トリプチカーゼ／トリプトン 1.50 g 酵母エキス 1.00 g KH2PO4 0.24 g Na2HPO4 0.24 g (NH4)2SO4 1.24 g NaCl 0.48 g MgSO4.7H20 0.10 g CaCl2.2H20 0.06 mg FeSO4.7H20 2 mg レサズリン 1 mg システイン/HCl 0.50 g ビタミン溶液（DSM 141 による） 0.50 mL 微量元素溶液（DSM 141 による） 9.00 mL NaHCO3 2.00 g ガラクトマンノ-オリゴサッカライド 5.00 g 蒸留水を加えて全量 1000 ml、pH 7.0とした。
【００５９】 試験は下記の微生物を用いて行った： バクテロイデス・アサッカロリティカス (Bacteroides asaccharolyticus) バクテロイデス・ディスタソニス (Bacteroides distasonis) バクテロイデス・フラギリス （Bacteroides distasonis） バクテロイデス・テタイオミクロン (Bacteroides tetaiotaomicron) ビフィドバクテリウム・アドレセンティス （Bifidobacterium adolescenti
s） ビフィズス・ビフィダム (Bifidobacterium bifidum) ビフィドバクテリウム・ブレベ （Bifidobacterium breve） ビフィドバクテリウム・インファンティス (Bifidobacterium infantis) ビフィドバクテリウム・ロングム (Bifidobacterium longum) ユーバクテリウム・レンタム (Eubacterium lentum) ユーバクテリウム・リモスム (Eubacterium limosum) ラクトバチルス・カゼイ (Lactobacillus casei) ラクトバチルス・ファーメンタム (Lactobacillus fermentum) クロストリジウム・ブチリカム (Clostridium butyricum) クロストリジウム・ディフィシル (Clostridium difficile) クロストリジウム・パーフリンゲンス (Clostridium perfringens) エンテロバクター・クロアカエ (Enterobacter cloacae) 大腸菌 クレブシェラ肺炎桿菌 （Klebsiella pneumoniae） ネズミチフス菌 (Salmonella typhimurium) セラチア・マルセッセンス (Serratia marcescens) 黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) これらの微生物を、それぞれ嫌気性条件下で 37 ℃において 24 時間培養した
。実験期間中、サンプルを特定の時点で採取し、pH値およびオリゴサッカライド
濃度について検査した。さらに、吸光度測定により細胞数の増加を求めた。
【００６０】 ビフィドバクテリウム属菌および２種類の乳酸桿菌だけが、本発明に係るガラ
クトマンノ-オリゴサッカライドを代謝し、それによって増殖することができた
。他の全ての試験細菌は、培地上での増殖は全く確認されなかった。これによっ
て、本発明に係るガラクトマンノ-オリゴサッカライドを含有する食品は結腸の
ミクロフローラの構成を良好に変化させうることが明らかである。
【００６１】 実施例９： 免疫防御性の強化食作用の強化 食細胞（単球、顆粒球）の機能に対する本発明に係るガラクトマンノ-オリゴ
サッカライドの影響は、食細胞作用アッセイによって調べることができる。食細
胞作用の刺激において、予め食細胞をガラクトマンノ-オリゴサッカライドとと
もにインキュベートした（100μｇのグリカン/0.11 ml の全血液、37 ℃、10 分
）。相当するブランクを、同様に氷浴中で 10 分間インキュベートした。次いで
本来の食作用試験を下記の条件下で行った： 0.11 ml の予備インキュベーション溶液を、氷浴中に 10 分間放置し、次いで
0.01 ml のオプソニン処理していない大腸菌（フルオレセインイソチオシアネ
ート(FITC)標識、１ml 当たり 109、ORPEGEN）または 0.01 ml のオプソニン処
理していない黄色ブドウ球菌（１ml 当たり 15x106、FITC標識、MOLECULAR PROB
ES）を加えた。これらのバッチを 37 ℃で １0 分間インキュベートした（二重
測定）。これらのバッチをそれぞれ３mLの洗浄緩衝液（ORPEGEN）で２回洗浄し
、それぞれ 250 ｘｇで５分間４ ℃で遠心した。
【００６２】 沈降物中の赤血球の溶解を、２ml の溶解緩衝液（ORPEGEN）を用いて室温で 2
0 分間行い、続いてこのバッチを１回洗浄した。沈降物に 0.2 ml の DNA染色溶
液（沃化プロピジウム）を加え、氷浴中に 10 分間放置した。
【００６３】 フローサイトメーター（励起：488 nm、発光 FL-1：520 nm）を用いて測定を
行い、この際、単球と顆粒球とは分離せずに識別することができる（前方散乱光
(FSC) 対 側方散乱光(ESC)）。結果を食作用-陽性細胞の％割合として示す（下
記の表６参照）： 食作用効果のないコントロール物質としては、ラフィノースを用いた。
【００６４】
【表６】 これらの結果は、単球または顆粒球を本発明に係るガラクトマンノ-オリゴサ
ッカライドとともに予備インキュベートした後、食作用の刺激が得られたことを
示している。
【００６５】付着アッセイ 付着アッセイにおいて、Ｂ細胞系（例えば Reh）および正常ヒトＢリンパ球の
上皮細胞（結腸腫瘍細胞系、HT 29）への付着挙動に関する本発明に係るガラク
トマンノ-オリゴサッカライドの影響を測定した。使用したオーバーレイアッセ
イにおいて、蛍光測定法で測定を行うことができるように、リンパ球をカルセイ
ンを用いて細胞内標識した。
【００６６】 最初に、マイクロタイタープレート（24ウェル Costar(登録商標)プレート）
に付着性結腸上皮細胞系（HT 29）を塗布した。コンフルエントな層が形成され
るまでインキュベートした（37 ℃、一夜）。これはできるだけ無血清培地中で
行った。接種：１ｘ 104 細胞。次いで付着性細胞を、後続のアッセイの前に PB
S（リン酸緩衝生理食塩溶液）で３回洗浄し、同様に PBS + １％ウシ血清アルブ
ミン（BSA）を用いて室温で１時間ブロックした。
【００６７】 試験すべき未処理のＢ細胞系または単離されたＢリンパ球を、蛍光性カルセイ
ンを用いて標識し（２ml の RPMI培地 ＋ HEPES ＋ 10μLのカルセイン AM、30
分、37 ℃；次いで HBSS（ハンクス緩衝液）＋ 0.25 ％の BSA で２回洗浄）、
そして１ウェル当たり 0.5 ml の PBS ＋ 0.25 ％ HBSS 中の１ｘ 106 細胞を１
時間インキュベートした。培養プレートを振盪装置上に 10 秒間置き、１ウェル
当たり、PBS 中の 0.2 ％グルタルアルデヒド ＋ 0.2 ％の BSA の 0.5 ml を加
え、振盪装置上で 10 分間インキュベートした。プレートの蛍光を蛍光測定装置
で測定した（494、517 nm）。
【００６８】 最初の測定値は100 ％値に対応した。次いでプレートを４回洗浄し、改めて測
定した。この測定値は特異的付着に対応し、100％値−自己蛍光値（標識されて
いない細胞）の百分率で示される。コントロール物質としては、ガラクトースま
たはグルコースを用いた。
【００６９】 結腸細胞系 HT 29 への Reh（pre-Ｂ）の付着
【表７】 コントロール物質の D-グルコースおよび D-ガラクトースと比較して、ガラク
トマンノ-オリゴサッカライドの存在下では、結腸細胞系 HT 29 へのＢ細胞系（
Reh）の明確に強化された付着挙動が明らかになった。
【００７０】 実施例１０： カルシウム吸収の改善実験の準備 それぞれ約 100ｇの体重を有する雄 SD系ラットを、脱イオン水および下記の
標準餌に自由にアクセスさせて４日の馴化期間保持した： カゼイン 250 g コーン油 50 g 無機塩混合物（Caおよび Fe不含） 25 g 炭酸カルシウム 7.5 g ビタミン混合物 10 g ビタミンＥ 1 g 酒石酸水素コリン（choline bitartarate） 4 g サッカロースを加えて全量 1000 gとした。
【００７１】 次いでラットを二つのグループに分けた。第１グループにおいては、動物の胃
を完全に除去し（胃切除グループ）、第２グループはコントロールとした（コン
トロールグループ）。手術後、ラットを食物および水なしで 24 時間保持し、次
いで牛乳を与えて２〜３日間保持し、引き続き標準餌で４日の馴化期間保持した
：実験 試験グループをさらにそれぞれ２つのグループに分けた。それぞれサブグルー
プの一方を標準餌で飼育したが、他方のサブグループにはガラクトマンノ-オリ
ゴサッカライドを含む餌（50ｇ/kg の餌）を与えた。３週間の実験期間にわたり
、３日目から糞便サンプルを集め、排泄されたカルシウムを検査した。実験の終
わりに、盲腸の内容物を分析した。
【００７２】結果 ： 標準餌を用いると、胃摘出グループのカルシウム吸収は、コントロールグルー
プのカルシウム吸収の僅かに約１／４であった。
【００７３】 本発明に係るガラクトマンノ-オリゴサッカライドを混合することにより、胃
摘出グループのカルシウム吸収を約２倍にすることができ、従って、このオリゴ
サッカライドはコントロールグループのカルシウム吸収の約50％まで高めた。
【００７４】 本発明に係るガラクトマンノ-オリゴサッカライドを含有する餌で飼育したラ
ットにおいて、盲腸内容物の分析値は、著しく高められたプロピオン酸濃度を示
した。これは、測定されたカルシウム吸収と有意な関係を有する。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年１月７日（２００２．１．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｃ０８６ 3/14 3/14 ４Ｃ０９０ 19/10 19/10 29/00 29/00 31/04 31/04 35/00 35/00 37/04 37/04 Ｃ０７Ｈ 3/06 Ｃ０７Ｈ 3/06 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｇ Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ 9/24 9/24 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:125 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 クリンゲベルグ，ミカエル ドイツ連邦共和国 67269 グルンシュタ ット，ウルメンウェグ 14 (72)発明者 ルッドウィッヒ，エヴァ ドイツ連邦共和国 69181 ライメン，フ ェールターウェグ 28 (72)発明者 ムニル，モハメド ドイツ連邦共和国 67271 キンデンハイ ム，アム キンダーバッハ １ (72)発明者 リティッヒ，フランク ドイツ連邦共和国 67269 グルンシュタ ット，アム ベーゲル ７ Ｆターム(参考） 4B018 MD31 ME04 MF12 4B050 CC01 DD02 GG10 LL05 4B064 AF04 CA21 CA32 CB07 DA07 4B065 AA19X AC14 BB18 BC41 CA21 CA31 CA41 CA44 4C057 AA02 AA19 BB04 CC01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA01 EA20 MA01 MA04 MA13 MA17 MA22 MA23 MA28 MA31 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14 ZA66 ZA97 ZB09 ZB11 ZB26 ZC21 ZC35 4C090 AA01 AA04 AA09 BA70 BA74 BA92 BB13 BB14 BB32 BB33 BB36 BB38 BB52 BC11 BC24 BD35 CA42 CA43 DA23

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ガラクトマンナンの水溶液または水性懸濁液を製造し、これ
    を細菌由来の酵素的活性剤によって加水分解し、そして ＜ 15 の重合度（DP）
    を有する、マンノース−およびガラクトース−含有オリゴサッカライド混合物の
    水溶液を得ることを特徴とする、ガラクトマンナンからマンノース−およびガラ
    クトース−含有オリゴサッカライドを製造する方法。
  2. 【請求項２】 重合度（DP）が２〜７である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）の種類の細菌である、
    請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 細菌が DSM に受託番号No. 13182 として寄託された株の細
    菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 酵素的活性剤が細菌の生細胞または死細胞である、請求項１
    〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 酵素的活性剤が細菌からのガラクトマンナン加水分解酵素、
    または細菌の細胞からの粗抽出物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の
    方法。
  7. 【請求項７】 酵素的加水分解を細菌の固定化細胞、固定化粗抽出物または
    固定化酵素を用いて行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 得られたマンノース−およびガラクトース−含有オリゴサッ
    カライドの混合物をクロマトグラフィー分離法にかける、請求項１〜７のいずれ
    か１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 β-1,4-結合したマンノース単位、およびそれにα-1,6-結合
    したガラクトース単位を含み、＜ 15 、特に２〜７の重合度（DP）を有する、請
    求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により製造し得るガラクトマンノ−オリ
    ゴサッカライド。
  10. 【請求項１０】 治療剤または診断剤として使用するための、β-1,4-結合
    したマンノース単位、およびそれにα-1,6-結合したガラクトース単位を含み、
    ＜ 15 、特に２〜７の重合度を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方
    法により製造し得るガラクトマンノ−オリゴサッカライド。
  11. 【請求項１１】 枯草菌株 DSM 13182 から製造し得る、ガラクトマンナン
    を加水分解する能力を有する酵素。
  12. 【請求項１２】 枯草菌株 DSM 13182 の細胞の破砕によって製造し得る、
    ガラクトマンナンを加水分解する能力を有する粗抽出物。
  13. 【請求項１３】 枯草菌株 DSM 13182 。
  14. 【請求項１４】 請求項９に記載のガラクトマンノ−オリゴサッカライドを
    、場合により製薬上適合し得る担体と組み合わせて含む医薬。
  15. 【請求項１５】 請求項９に記載のガラクトマンノ−オリゴサッカライドを
    含む食品または嗜好品。
  16. 【請求項１６】 嗜好品および／もしくは食品の製造のための、および／ま
    たは嗜好品および／もしくは食品の血糖指数を低下させるための、請求項９に記
    載のガラクトマンノ−オリゴサッカライドの使用。
  17. 【請求項１７】 感染症の予防、腸疾患の予防、結腸における発癌の予防、
    一般的感染症に対する免疫防御性の強化、炎症性疾患の予防、および／または骨
    粗鬆症の予防のための、請求項９に記載のガラクトマンノ−オリゴサッカライド
    または該ガラクトマンノ−オリゴサッカライドを含有する食品の使用。
  18. 【請求項１８】 感染症の予防、腸疾患の予防、結腸における発癌の予防、
    一般的感染症に対する免疫防御性の強化、炎症性疾患の予防、および／または骨
    粗鬆症の予防のための医薬を製造するための、請求項９に記載のガラクトマンノ
    −オリゴサッカライドの使用。
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