JP2009221112A - 免疫機能調節組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】低分子化ペクチンを有効成分として含む免疫機能調節組成物の提供。該組成物を含む飲食品、健康食品、機能性食品、医薬品、飼料等の提供。
【解決手段】平均重合度３〜５０の低分子化ペクチンが免疫機能を有することを見出し、該ペクチンを有効成分とする組成物を提供した。また、該組成物を含む飲食品、健康食品、機能性食品、医薬品、飼料等を提供した。
【選択図】なし

Description

本発明は低分子化ペクチンを有効成分として含む免疫機能調節組成物に関する。さらに、当該組成物を含む飲食品、健康食品、機能性食品、医薬品、飼料等に関する。

ペクチンは高等植物の細胞壁に広く存在しガラクツロン酸を主体とする酸性多糖類である。植物の細胞壁中ではセルロースと結合してプロトペクチンの形で存在し、大量の水分を吸収することで植物に柔軟性を与えている。
市販のペクチンは主にリンゴの搾りかすと柑橘類の皮から抽出され、ジャムのゲル化剤、タンパク質の安定剤として広く用いられている。

ペクチンは、α−Ｄ−ガラクツロン酸がα−１，４結合してなる主鎖に、不均一にラムノース、アラビノース等の中性糖が入り込む形でラムノガラクツロナン鎖を形成している。さらに、分枝してガラクツロン酸や中性糖からなる側鎖を持つと考えられており、平均重合度は２００から１０００といわれている。
平均重合度が３００以下の低分子化ペクチンは乳化作用を有し、平均重合度が１０以下の低分子化ペクチンは抗菌作用を有することが知られている。また、ペクチンは食物繊維としての整腸作用を有することが知られている。

さらに、免疫に作用するペクチンとして、ＩＬ−５及びＩＬ−４の産生抑制やＩＦＮ−γの産生増強を示す一定のエステル度を有するペクチンや、Ｂ細胞の増殖を誘導する特定の植物から精製したペクチン質多糖類等が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。また、多糖類の分解物を必須成分として含有する免疫賦活組成物が開発されており、その分解物の一つとして、低分子化ペクチンが挙げられている（例えば、特許文献３参照）。
しかし、これらの免疫に作用するペクチンは、エステル度や由来植物に特徴を有するものであり、平均重合度が低いペクチンについて検討した例はみつかっていない。

免疫とは、病原体などの非自己物質を認識し、排除する生体防衛機構のことであり、種々の免疫細胞、抗体や補体等が互いに作用し合うことで働いている。そのような免疫系のうち、腸管免疫系は、ヒトの免疫の７０％を担っているといわれている。腸管は、全身の免疫を司るリンパ球の６０〜７０％が存在し、抗体の６０％を作っている。腸管免疫が活性化されることによって、腸管の副交感神経の刺激によって体調を良好に保つことででき、交感神経緊張の持続によってもたらされる病気から免れることができる。そのため経口接種でき、腸管免疫系を介して体の免疫賦活等に作用する物質の提供が望まれている。
〔先行文献〕
特開２００１−２３３７７７号公報 特表２００１−５１９４７１号公報 特開平１０−２７９４８６号公報

本発明は低分子化ペクチンを有効成分として含む免疫機能調節組成物の提供を課題とする。さらに、当該該組成物を含む飲食品、健康食品、機能性食品、医薬品、飼料等の提供を課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、平均重合度が３〜５０の低分子化ペクチンが、マウスやヒトに対して腸管免疫系に作用することを見出した。この低分子化ペクチンを有効成分として含む免疫機能調節組成物を得て、この組成物を含むことによって免疫機能が期待できる飲食品、健康食品、機能性食品、医薬品、飼料等を得て、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は次の（１）〜（８）の免疫機能調節組成物、当該組成物を含む免疫機能調節剤等に関する。
（１）平均重合度が３〜５０の低分子化ペクチンを有効成分として含む免疫機能調節組成物。
（２）平均重合度が３〜５０の低分子化ペクチンを有効成分として含む、腸管免疫系に作用する免疫機能調節組成物。
（３）平均重合度が３〜５０の低分子化ペクチンを有効成分として含む、腸管におけるＢ細胞および／またはＮＫ細胞の増加に作用する免疫機能調節組成物。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の免疫機能調節組成物を含む免疫機能調節剤。
（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の免疫機能調節組成物を含む飲食品。
（６）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の免疫機能調節組成物を含む免疫機能調節作用を有する旨の表示を付した飲食品。
（７）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の免疫機能調節組成物を含む医薬組成物。
（８）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の免疫機能調節組成物を含む飼料組成物。

本発明の免疫機能調節組成物は、食物由来の低分子化ペクチンを有効成分とするため、安全性が高い。この免疫機能調節組成物を用いることにより、免疫賦活効果が期待できる飲食品等を得ることができる。

本発明の「免疫機能調節組成物」とは、平均重合度が３〜５０の低分子化ペクチンを有効成分として含む組成物であって、マウスやヒト等に対して免疫賦活、免疫刺激、免疫調節機能等の機能を有する組成物のことをいう。
本発明の「免疫機能調節組成物」が有する免疫機能は、免疫細胞の増加や抗体産生量の増加等による免疫賦活、免疫刺激、免疫調節機能等のいずれの機能も該当するが、腸管を介して作用する機能であることが好ましく、特に、Ｂ細胞および／またはＮＫ細胞の増加であることが好ましい。
本発明の「免疫機能調節組成物」は、通常のペクチンと比較して粘度が低く、高濃度に溶解することができる平均重合度が３〜５０の低分子化ペクチンを有効成分として含むため、食品、医薬品等の原料とすることができる。

本発明の「低分子化ペクチン」とは、平均重合度が３〜５０に調製されたペクチンのことをいう。
低分子化に用いるペクチンとしては飲食品、等に利用出来るペクチンであればいずれのものも用いることができ、例えば、リンゴや柑橘由来のペクチン等が挙げられる。特にリンゴ由来ペクチンは他のペクチンと比べて豊富な中性糖を含み、腸内細菌バランスへの効果が報告されており好ましい。またＬＭペクチン、ＨＭペクチン、アミド化ペクチン等も挙げられる。

本発明の「低分子化ペクチン」は、既知のいずれの方法でも調製することができる。例えば、１０％程度のペクチンを水に分散させ、酵素分解または加熱による加水分解によって低分子化を行うことができる。
ペクチンの分解酵素としては主にペクチナーゼを用いるのが好ましいが、他の酵素を併用して用いてもよい。他の酵素としては糖質分解酵素であるアミラーゼ、セルラーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘミセルラーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、キチナーゼ、インベルターゼ、トランスグルコシダーゼなどが挙げられる。またプロテアーゼなどを併用してもよい。

酵素反応は用いる酵素の至適ｐＨ、至適温度を考慮して行う必要があるが、ペクチン溶液はｐＨが低いのでそれに適した酵素を選択するか、ｐＨ調整を行うことが好ましい。ペクチナーゼを単独で使用する場合の添加量は５％ペクチン溶液に対して０．００１〜５％、より好ましくは０．０１％以上１％以下である。併用の場合は０．０００１％〜５％、より好ましくは０．００１％以上１％以下である。
酵素分解の反応時間は１５分〜４８時間であることが好ましい。

加熱による加水分解を行う場合は、高温高圧下で加水分解させてペクチン溶液を得て、この溶液に１０％程度を上乗せするという過程を繰り返すのが好ましい。
オートクレーブの条件としては、１００℃以上１４０℃以下が好ましいが、温度に応じて時間を変動させれば前述の温度の限りではない。
オートクレーブによる加温時間は、１５〜５００分程度であることが好ましい。

これらの方法によって調製された低分子化ペクチンの平均重合度は、低分子化ペクチンのウロン酸量と還元末端量を定量することにより下記（１）式より求めることが好ましい。ウロン酸量測定方法は参考文献１に、還元末端量測定方法は参考文献２によることが好ましい。
［式（１）］
平均重合度＝ウロン酸量／還元末端量
参考文献１：Ｚ． Ｄｉｓｃｈｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １６７， １８９ （１９４７）
参考文献２：Ｙ． Ｍｉｌｎｅｒ， Ｇ． Ａｖｉｇａｄ， Ｃａｒｂｏｈｙｄ． Ｒｅｓ．， ４， ３５９−３６１ （１９６７）

本発明の「低分子化ペクチン」は平均重合度が３〜５０の低分子ペクチンであることが好ましい。平均重合度が５０よりも大きい低分子化ペクチンは粘度が高くなるため、製造上や実際の製品に用いる場合に製造適性が悪くなる傾向がある。また、飲料などに高濃度で使用し難い。
本発明の「低分子化ペクチン」はいずれの形態であってもよく、水溶液として得た場合にはそのまま水溶液として用いることができ、水溶液をスプレードライ等により粉末化して用いることもできる。また、低分子化ペクチンの水溶液にエタノールやイソプロパノールを加えて沈殿させ減圧濃縮を行うことにより、さらに濃い溶液あるいは粉末として利用することもできる。
本発明の「低分子化ペクチン」は低分子であるため、通常のペクチンとは異なり、粘度が低くハンドリングが容易である。元来のペクチンに比べて物性が改善されているため、経口的に体内に摂取されても効率的に吸収できる。そのため、飲食品、化粧品、医薬品等の成分として容易に用いることができる。さらに、免疫能力を活性化する機能性飲食品として用いることができる。

本発明の「免疫機能調節剤」は、本発明の「免疫機能調節組成物」を含む剤であればいずれのものも含むことができる。免疫機能調節組成物以外に、必要に応じてビタミン類、アミノ酸類、ミネラル類、βグルカン、乳酸菌、フコイダン、アラビノキシラン、ラクトフェリン、カテキン、キトサン、キトサンオリゴ糖、キチンオリゴ糖、コエンザイムＱ１０等を含むことができる。

本発明の「飲食品」は、本発明の「免疫機能調節組成物」を含む飲食品であればいずれのものも含むことができる。例えば、免疫機能調節組成物以外に、必要に応じて糖類や香料、着色料や乳化剤などを含んでいて差し支えない。また、ペクチン、カラギーナン、ジェランガム、キサンタンガム、グアガム、ローカストビーンガム、アルギン酸塩、寒天、ゼラチン、小麦粉などのゲル化剤ないし増粘剤や、甘味料、着色料、乳化剤、香料等を含んでいても良い。
また、本発明の飲食品には「免疫機能調節作用を有する旨の表示を付した飲食品」が含まれる。
本発明の「飲食品」には、一般的に食されているいずれのものも含まれるが、例えば、飲料、焼き菓子、チルドデザート等が挙げられる。また、打錠品や粉末顆粒等の形態を有するサプリメント等も挙げられる。

本発明の「医薬組成物」は、本発明の「免疫機能調節組成物を」含む医薬組成物であればいずれのものも含むことができる。例えば、錠剤またはカプセル剤の形態の場合、免疫機能調節組成物をラクトース、デンプン、ショ糖、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール等の担体と組み合わせることができる。また液体の経口投与剤とする場合には、免疫機能調節組成物をエタノール、グリセロール、水などの任意の担体と組み合わせることができる。さらに、適当な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤を加えることもできる。

本発明の「飼料組成物」は、本発明の「免疫機能調節組成物」を含む飼料組成物であれば、いずれのものも含むことができる。例えば、免疫機能調節組成物以外にトウモロコシ、小麦、大麦、大豆粕等の植物性原料の他、チキンミール、魚粉等の動物性原料を加えてもよい。また、必要に応じて、炭水化物、脂肪、タンパク質、無機質（例えば、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、リン等）、ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ）等を加えてもよい。
以下、本発明に基づき具体的に説明する。本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。

＜免疫機能調節剤の製造＞
下記方法によって調製した１．〜４．の各低分子化ペクチン水溶液を免疫機能調節剤として用いた。

１．低分子化ペクチン（平均重合度１３）水溶液
温水７２０ｍＬを攪拌しながらＨＭペクチン（ＵＮＩＰＥＣＴＩＮＥ ＳＳ−ＮＤ、Ｃａｒｇｉｌｌ社製：以下ＨＭペクチンは同品を用いた）８０ｇを分散させた。この分散溶液をオートクレーブ（ＨＩＲＡＹＡＭＡ ＨＡ−２４０Ｍ）を用いて１２１℃の高圧下で３０分間加熱した。得られた溶液にＨＭペクチン８８ｇを攪拌分散させ、１２１℃で６０分間加圧加熱を行った。得られた溶液にＨＭペクチン９８ｇを攪拌分散させ、１２１℃で６０分間加圧加熱を行い、濃度２８％、平均重合度１３の低分子化ペクチン水溶液を得た。

２．低分子化ペクチン（平均重合度４６）水溶液
温水４．５Ｌを攪拌しながらＨＭペクチン５００ｇを分散させた。この分散溶液を、高圧蒸気滅菌器（ＨＩＲＡＹＡＭＡ ＬＭ−４２ＭＩＩ）を用いて１０５℃の高圧下で１５分間加熱した。得られた溶液にＨＭペクチン５５０ｇを攪拌分散させ、１０５℃で１５分間加圧加熱を行い、濃度１９％、平均重合度４６の低分子化ペクチン水溶液を得た。

３．低分子化ペクチン（平均重合度７）水溶液
温水４．５Ｌを攪拌しながらＨＭペクチン５００ｇを分散させた。この分散溶液を、高圧蒸気滅菌器（ＨＩＲＡＹＡＭＡ ＬＭ−４２ＭＩＩ）を用いて１２１℃の高圧下で３０分間加熱した。得られた溶液にＨＭペクチン５５０ｇを攪拌分散させ、１２１℃で６０分間加圧加熱を行った。得られた溶液にＨＭペクチン６１０ｇを攪拌分散させ、１２１℃で６０分間加圧加熱を行った。得られた溶液にＨＭペクチン６８０ｇを攪拌分散させ、１２１℃で６０分間加圧加熱を行い、濃度３９％、平均重合度７の低分子化ペクチン水溶液を得た。

４．低分子化ペクチン（平均重合度３）水溶液
温水９５０Ｌを攪拌しながらＨＭペクチン５０ｋｇを分散させ、この分散溶液を３５℃まで加温した後、ペクチナーゼ（ノボザイムズ社Ｐｅｃｔｉｎｅｘ Ｕｌｔｒａ ＳＰ−Ｌ）３００ｇを加え１５時間酵素反応を行った。反応後溶液を９０℃に加温し、１０分間保持することで酵素を失活させ、濃度５％、平均重合度３の低分子化ペクチン水溶液を得た。

＜免疫機能調節剤の免疫賦活活性＞
１．マウスにおける免疫賦活活性
上記実施例１で製造した免疫機能調節剤のうち、低分子化ペクチン（平均重合度１３）水溶液を濃度５％に調整し、免疫機能調節剤として用いた。
この免疫機能調節剤をマウスに経口で自由摂取させ、各臓器［肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、小腸上皮細胞間リンパ球（Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ＩＥＬ）、小腸粘膜固有リンパ球（Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ＬＰＬ）、大腸上皮細胞間リンパ球（Ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ＩＥＬ）、大腸粘膜固有リンパ球（Ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ＬＰＬ）］におけるリンパ球の表現型の変化を調べることで、本発明の免疫機能調節剤における免疫賦活活性を確認した。

２．試験条件
１）コントロールとしてＣ５７ＢＬ／６マウス、９週齢、雌を用いた。
２）Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１０週齢、雌を用い、２週間にわたって上記の免疫機能調節剤を摂取させた（２ＷＰｅｃｔｉｎ）

３．各臓器におけるリンパ球の表現型
上記２．１）、２）のマウスを擬死せしめ各臓器を摘出し、次の手法でリンパ球を分離した。
肝臓は、採取後直ちに２００ｇａｕｇｅステンレスメッシュで濾出し、５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２％の熱失活処理した新生子牛血清を添加したＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地（Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）に懸濁した。培地で洗浄後、１５ｍｌの３５％Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内において２０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により分別した。分別された固形物を赤血球溶解液（１５５ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、１０）に再懸濁した。
腸管は採取後直ちに発光物を除去するためにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗い流した。それから腸間膜とパイエル板は切除した。小腸は縦に切開して１−２ｃｍの小片に切り分けた。これらの小片は２０ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＣａ^２＋およびＭｇ^２＋ｆｒｅｅ Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ＰＢＳ内において３７℃、１５分間ウオーターバス内で恒温振とう培養処理した。その後、上清を採集した。
脾臓は採取後直ちに２００ｇａｕｇｅステンレスメッシュで濾出し、赤血球溶解液に再懸濁して調査した。

各リンパ球におけるＴ細胞系列マーカー分子（αβＴＣＲおよびγδＴＣＲ）およびＢ細胞系列マーカー分子（ＣＤ３およびＢ２２０）の発現を、フローサイトメータを用いて調べた。
その結果、図１および図２に示したように、免疫機能調節剤を摂取させた系では、小腸の上皮間リンパ球中のＣＤ３＋の表現形をもつＢ２２０細胞を有意に増加することが示された。従って、本発明の免疫機能調製剤がＢ細胞の免疫系を刺激することが確認され、本発明の免疫機能調節剤を経口投与は腸管免疫を総合的に活性化することによって、生体ホメオスターシスを正常に維持し、健康増進・疾病予防に役立つことが示唆された。

＜免疫機能調節剤の免疫賦活活性＞
１．ヒトにおける免疫賦活活性
上記実施例１で製造した免疫機能調節剤のうち、低分子化ペクチン（平均重合度３）水溶液をスプレードライにより粉末化し、免疫機能調節剤として用いた。
この免疫機能調節剤を２ｇずつ小袋に充填して被験者に提供した。被験者は健康な年齢３０歳から６９歳、平均年齢４８歳の男女２０名であった。

２．試験条件
上記の免疫機能調節剤を１日４ｇ摂取させた。
３０日間連続して摂取させ、摂取前と摂取後における身体検査と血液検査を行った。

３．結果
１）免疫機能調節剤の安全性
血液検査および身体測定の結果、１ヶ月間の摂取試験前後で異常を示す数値は見当たらなかった。なお、マウスでの単回投与試験および変異原性試験の結果においても異常は認められなかった。
２）免疫機能調節剤投与前後における血液検査
図３、４に示したように、Ｔ細胞数（図４）に比べてＢ細胞数（図３）の増加傾向が認められた。また、ＮＫ細胞（図５）の増加傾向が顕著に認められた。

本発明の免疫機能調節組成物を含むことにより、安全性が高く、かつ免疫賦活効果等が期待できる飲食品、健康食品、機能性食品、医薬品、飼料等を提供ができる。

マウスにおける免疫機能調節剤摂取による免疫賦活活性を示した図である（実施例２）。 マウスにおける免疫機能調節剤摂取による免疫賦活活性を示した図である（実施例２）。 ヒトにおける免疫機能調整剤摂取によるＢ細胞の増加を示した図である（実施例３）。 ヒトにおける免疫機能調整剤摂取によるＴ細胞の増加を示した図である（実施例３）。 ヒトにおける免疫機能調整剤摂取によるＮＫ細胞の増加を示した図である（実施例３）。

Claims (8)

1. 平均重合度が３〜５０の低分子化ペクチンを有効成分として含む免疫機能調節組成物。
2. 平均重合度が３〜５０の低分子化ペクチンを有効成分として含む、腸管免疫系に作用する免疫機能調節組成物。
3. 平均重合度が３〜５０の低分子化ペクチンを有効成分として含む、腸管におけるＢ細胞および／またはＮＫ細胞の増加に作用する免疫機能調節組成物。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の免疫機能調節組成物を含む免疫機能調節剤。
5. 請求項１〜３のいずれかに記載の免疫機能調節組成物を含む飲食品。
6. 請求項１〜３のいずれかに記載の免疫機能調節組成物を含む免疫機能調節作用を有する旨の表示を付した飲食品。
7. 請求項１〜３のいずれかに記載の免疫機能調節組成物を含む医薬組成物。
8. 請求項１〜３のいずれかに記載の免疫機能調節組成物を含む飼料組成物。