RU2313572C2

RU2313572C2 - Штамм bifidobacterium bifidum, обладающий галактозидазной активностью, галактоолигосахаридная композиция для стимуляции роста бифидобактерий, синбиотическая композиция для улучшения состояния кишечника, их применение (варианты) для получения лекарственных препаратов и способ получения стимулятора роста бифидобактерий

Info

Publication number: RU2313572C2
Application number: RU2005129997/13A
Authority: RU
Inventors: Энтони Грэхем УИНН (GB); Энтони Грэхем УИНН; Гленн ГИБСОН (GB); Гленн Гибсон; Яцек Витольд СЛУПИНСКИ (ZA); Яцек Витольд Слупински; Георгиос ЦОРЦИС (GB); Георгиос ЦОРЦИС
Original assignee: Класадо Инк.
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-30
Publication date: 2007-12-27
Also published as: NO20056004L; AU2004254110A1; PL1644482T5; JP4384656B2; EP1644482A1; JP2007527199A; KR100857500B1; NZ542482A; EP1644482B8; IL172553A0; MXPA05010349A; NO335413B1; EP1644482B2; EP1644482B1; BRPI0408911A; ES2284028T5; PL1644482T3; PT1644482E; DE602004006133T2; JP2009189374A

Abstract

Штамм Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 проявляет способность продуцировать фермент, обладающий галактозидазной активностью, посредством которой лактоза превращается в смесь галактоолигосахаридов, содержащую дисахарид, трисахарид, тетрасахарид и пентасахарид. Галактоолигосахаридная композиция предназначена для стимулирования роста бифидобактерий. Синбиотическая композиция на основе штамма В. bifidum NCIMB 41171 и галактоолигосахаридной композиции обеспечивает улучшение состояния кишечника. Композиции могут быть включены в многочисленные пищевые продукты или корма для животных для улучшения состояния кишечника посредством стимулирования роста бифидобактерий в толстой кишке и подавления роста патогенной микрофлоры. 9 н. и 11 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к новым штаммам Bifidobacterium bifidum, которые продуцируют фермент, проявляющий новую галактозидазную активность, посредством которой лактоза превращается в новую смесь галактоолигосахаридов. Галактоолигосахариды являются неперевариваемыми углеводами, устойчивыми к действию пищеварительных ферментов желудочно-кишечного тракта млекопитающих, но которые перевариваются специфическими кишечными бактериями. Изобретение также относится к применению бифидобактериального штамма для продуцирования новой галактоолигосахаридной композиции, проявляющей способность стимулировать рост бифидобактерий в кишке. Изобретение также относится к новой композиции галактоолигосахаридных продуктов.

Кишечная флора человека включает в себя патогенные, благоприятные и полезные виды микробов. Преобладание первых может привести к кишечным расстройствам, которые могут быть как острыми (например, гастроэнтерит), так и хроническими (например, воспалительное кишечное заболевание, синдром раздраженной толстой кишки и некоторые кишечные злокачественные опухоли). Исследователями были предприняты попытки повлиять на баланс кишечной флоры в пользу полезных микроорганизмов, таких как бифидобактерии, путем добавления одного или более таких микробных штаммов к соответствующему пищевому носителю. Такая живая микробная пищевая добавка известна как пробиотик. Однако трудно гарантировать жизнеспособность живых бактерий в продуктах питания и также после переваривания.

Альтернативным подходом к регулированию кишечной микрофлоры является использование пребиотика, который определяют как неперевариваемый пищевой ингредиент, благотворно воздействующий на хозяина путем избирательной стимуляции роста и/или активности одного или ограниченного числа бактерий в толстой кишке, что приводит к улучшению здоровья хозяина.

Микрофлора толстой кишки человека приобретается при рождении. У вскормленного грудью ребенка преобладают бифидобактерии, которые легко конкурируют с другими видами. Такой факт объясняется тем, что компоненты человеческого молока являются стимуляторами. В противоположность, вскормленный молочной смесью ребенок имеет более сложную флору, которая напоминает кишку взрослого в том, что бактероиды, клостридии, бифидобактерии, молочнокислые бактерии, грамположительные кокки, колиформные бактерии и другие группы представлены в довольно равных частях. Бифидобактерии обычно рассматривают как защитные микроорганизмы от инфекций толстой кишки, и это отличие, вероятно, объясняет значительно меньшее наличие инфекций у вскормленных грудью детей по сравнению с детьми, вскормленными молочной смесью.

Некоторые компоненты кишечной флоры вовлечены в этиологию заболевания. Например, микобактерии связаны с болезнью Крона, язвенный колит может быть инициирован бактериями, способствующими восстановлению сульфата, и бактерии могут быть вовлечены в развитие рака кишки. Очевидно, что поддержание избирательного роста природных благотворных кишечных бактерий путем приема пребиотика окажет благоприятное действие. В результате такого действия патогенная микрофлора будет подавлена.

Одной группой соединений, которые классифицируют как пребиотики, являются галактоолигосахариды, которые представляют собой галактозосодержащие олигосахариды типа Glc α1-4[β Gal 1-6]_n, где n=2-5, и которые образуются из лактозного сиропа посредством фермента β-галактозидазы, проявляющего транс-галактозидазную активность (Crittenden, (1999) Probiotics: A Critical Review. Tannock, G. (ed) Horizon Scientific Press, Wymondham, pp. 141-156). В настоящее время три продукта являются коммерческими препаратами, мало отличающимися по составу. Первый из них, транс-галактозилированные олигосахариды (TOS), продуцируется с помощью β-галактозидазы из Aspergillus oryzae (Tanaka et al., (1983) Bifidobacteria Microflora, 2, 17-24), и состоит из три-, тетра-, пента- и гексагалактоолигосахаридов. Второй представляет собой Олигомат 55, который получают с помощью фермента β-галактозидазы из A. oryzae и Streptococcus thermophilus (Ito et al. (1990), Microbiol Ecology in Health and Disease, 3, 285-292) и содержит 36% три-, тетра-, пента- и гексагалактоолигосахаридов, 16% дисахаридов галактозилглюкозы и галактозилгалактозы, 38% моносахаридов и 10% лактозы. И наконец, препарат транс-галактозилированного дисахарида (TD) получают с помощью фермента β-галактозидазы из S. thermophilus (Ito et al. (1993), J. Nutritional Science and Vitaminology, 39, 279-288).

Известно, что члены семейства бифидобактерий продуцируют β-галактозидазные ферменты, которые участвуют в бактериальном метаболизме лактозы. В публикации Moller, P.L. et al. in Appl. & Environ. Microbiol., (2001), 62, (5), 2276-2283 описаны выделение и характеристика трех генов β-галактозидазы из штамма Bifidobacterium bifidum.

Патентная публикация США № 2002/0086358 описывает новую β-галактозидазу из Bifidobacterium bifidum, в частности усеченный вариант фермента, который проявляет высокую транс-галактозилирующую активность. Хотя было установлено, что инкубация с лактозой может иметь место в присутствии 0,5-60% лактозы, приведенный в качестве примера максимальный выход галактоолигосахарида, образованного в реакциях транс-галактозилирования, составил 44% (мг образованного олигосахарида на мг добавленной лактозы). Кроме того, из определения, данного в этой патентной публикации США, очевидно, что продукт состоит, по крайней мере, из трех связанных молекул сахара.

Исследователь Dumortier с соавторами в публикации Carbohydrate Research, 201, (1990), 115-123, описывают образование олигосахаридов реакцией транс-галактозилирования при гидролизе лактозы посредством Bifidobacterium bifidum DSM 20456. Проведенный ими анализ структуры смеси образованных олигосахаридов показал, что связями между молекулами были β-(1→3), β-(1→6) и β-(1→4)-D-галактозильные связи. Исследователь Dumortier предположил, что соединения, продуцируемые с помощью Bifidobacterium bifidum, участвуют в процессе прилипания бактерий в толстой кишке.

В настоящее время обнаружены штаммы бифидобактерий, которые не только проявляют способность продуцировать ферменты, обладающие галактозидазной активностью, посредством которых лактоза превращается в смесь галактоолигосахаридов, но также продуцируют смесь галактоолигосахаридов, которая содержит вплоть до 35% дисахарида галабиозы (Gal(α1-6)-Gal). Последний, как известно (смотри Paton, J.C. & Paton, A.W. (1989), Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350), является антиадгезивным средством, способным предотвратить адгезию токсинов, например шигатоксина, и патогенов, таких как E. coli, к стенке кишки.

Согласно изобретению предлагается штамм Bifidobacterium bifidum, способный продуцировать фермент с галактозидазной активностью, который превращает лактозу в смесь галактоолигосахаридов, содержащую, по крайней мере, один дисахарид, по крайней мере, один трисахарид, по крайней мере, один тетрасахарид и, по крайней мере, один пентасахарид. Предпочтительно смесь содержит от 20 до 35% мас./об. дисахарида, от 20 до 35% мас./об. трисахарида, от 15 до 25% мас./об. тетрасахарида и от 10 до 20% пентасахарида.

Термин «ферментативная активность», используемый в тексте в отношении галактозидазной ферментативной активности согласно настоящему изобретению, означает активность, проявляемую, по крайней мере, одним ферментом галактозидазой.

В одном аспекте было обнаружено, что смесь галактоолигосахаридов содержит дисахарид Gal-Gal, трисахарид Gal-Gal-Glc, тетрасахарид Gal-Gal-Gal-Glc и пентасахарид Gal-Gal-Gal-Gal-Glc, где Gal представляет собой остаток галактозы и Glc представляет собой остаток глюкозы.

С помощью анализа посредством метилирования и ферментативного гидролиза смеси галактоолигосахаридов было обнаружено, что смесь содержит Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc тетрасахарид; Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc и Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc трисахариды; Gal(β1-3)-Glc, Gal(β1-3)-Gal, Gal(β1-6)-Gal и Gal(α1-6)-Gal дисахариды.

Штамм Bifidobacterium bifidum, способный продуцировать фермент с галактозидазной активностью, который превращает лактозу в смесь галактоолигосахаридов, как определено выше, был депонирован под инвентарным номером NCIMB 41171 в Национальной коллекции промышленных и морских бактерий, г. Абердин (Шотландия) 31 марта 2003.

Такой штамм Bifidobacterium bifidum или его биологически функциональный эквивалент может быть использован для продуцирования смеси галактоолигосахаридов, как определено выше. Смесь галактоолигосахаридов может быть частью продукта, используемого для улучшения состояния кишки путем стимулирования роста бифидобактерий в кишке, особенно исходного штамма-продуцента. Такой продукт может быть выбран из группы, состоящей из молочных продуктов (например, жидкого молока, сухого порошкового молока, такого как цельное сухое молоко, снятое сухое молоко, обогащенное жирами сухое молоко, порошковая сыворотка, молока для младенцев, мороженого, йогурта, сыра, сброженных молочных продуктов), напитков, детского питания, крупяных продуктов, хлеба, сухого печенья, кондитерских изделий, тортов, пищевых добавок, добавок к рациону, кормов для животных, кормов для домашней птицы или любого другого продукта питания или напитка.

Смесь олигосахаридов также может быть использована для получения лекарственных препаратов, направленных на предотвращение адгезии патогенов или токсинов, продуцируемых патогенами, к стенке кишки. Смесь может быть введена больному после курса терапии антибиотиками, который часто изменяет или даже разрушает нормальное состояние кишечной флоры, или после операции на кишке, для того, чтобы "вновь посеять" или восстановить в кишке нормальную флору, присущую здоровой кишке. Смесь галактоолигосахаридов может быть использована в комбинации со штаммом Bifidobacterium bifidum, указанным выше, или биологически функциональным эквивалентом.

Фраза "биологически функциональный эквивалент" используется для обозначения штамма Bifidobacterium bifidum, который проявляет способность продуцировать фермент с галактозидазной активностью, который превращает лактозу в смесь галактоолигосахаридов, как определено выше.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предлагается галактоолигосахаридная композиция для стимулирования роста бифидобактерий, содержащая в качестве эффективных компонентов, по крайней мере, один дисахарид, по крайней мере, один трисахарид, по крайней мере, один тетрасахарид и, по крайней мере, один пентасахарид.

Галактоолигосахаридная композиция предпочтительно представляет собой смесь галактоолигосахаридов, как описано в тексте выше.

Предпочтительно галактоолигосахаридная композиция содержит от 20 до 35% мас./об. дисахарида, от 20 до 35% мас./об. трисахарида(ов), от 15 до 25% мас./об. тетрасахарида и от 10 до 20% мас./об. пентасахарида.

Согласно другому аспекту изобретения предлагается способ производства вещества, предназначенного для стимулирования роста бифидобактерий, отличающийся тем, что лактозу или лактозосодержащий материал обрабатывают штаммом Bifidobacterium bifidum, как определено выше.

Подходящий лактозосодержащий материал может быть выбран из коммерческой лактозы, цельного молока, полуснятого молока, снятого молока, сыворотки и обогащенного жирами молока. Такие молочные продукты могут быть получены из молока коров, самок буйвола, овец или коз. Обогащенное жирами молоко определяют как цельное молоко, с которого сняты сливки для удаления молочных жиров, которые впоследствии заменяют путем добавления растительных жиров или масла.

Используя среду для роста, дополненную углеводными субстратами, отличными от лактозы, обнаружили, что Bifidobacterium bifidum согласно изобретению может утилизировать мальтозу, раффинозу, ксилан и фруктозу. Культивирование бактерий в среде, дополненной одним из указанных углеводов, индуцирует экспрессию α-глюкозидазы, α-галактозидазы, ксилозидазы и β-фруктофуранозидазы соответственно и, таким образом, приводит к продуцированию α-глюкоолигосахаридов, α-галактоолигосахаридов, ксилоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов соответственно.

В исследовании, которое привело к настоящему изобретению, изолированные кишечные бактерии были проверены с целью выявления бактерий, способных продуцировать галактозидазу и, таким образом, имеющих высокий потенциал для продуцирования галактоолигосахарида(ов). В результате было обнаружено, что некоторые бактерии, принадлежащие к роду бифидобактерий, в частности Bifidobacterium bifidum, были способны не только продуцировать фермент с галактозидазной активностью, но также, что фермент мог превращать лактозу в галактоолигосахаридную смесь, содержащую от 20 до 35% мас./об. дисахарида, от 20 до 35% мас./об. трисахарида, от 15 до 25% мас./об. тетрасахарида, от 10 до 20% мас./об. пентасахарида. Отдельный экземпляр Bifidobacterium bifidum был депонирован 31 марта 2003 в NCIMB, г. Абердин, под инвентарным номером 41171.

Для культивирования указанных бактерий может быть использован любой питательный источник, при условии, что он может усваиваться бактериями. Соответствующая культуральная среда может быть приготовлена, например, с углеводами, такими как лактоза, сахароза или глюкоза; азотсодержащими неорганическими или органическими питательными источниками, такими как дрожжевой экстракт, триптон, мясной экстракт (Lab Lemco) и тому подобное; неорганическими питательными источниками, такими как фосфаты, калий и тому подобное. Для культивирования рН питательной среды должен находиться в диапазоне от 6,0 до 8,0, предпочтительно 7,0, и культивирование осуществляют в анаэробных условиях при температуре, находящейся в диапазоне от 35 до 40°С, предпочтительно 37°С, в течение от 40 до 64 часов, предпочтительно 50 часов.

Штамм может быть культивирован любым из известных способов выращивания культур, таких как стационарная культура, анаэробная взвешенная культура или культура, выращенная при встряхивании. Бактериальные клетки собирают центрифугированием или фильтрацией, и клетки могут быть использованы как таковые в качестве катализатора реакции без дальнейшей обработки. В качестве альтернативы, клетки могут быть использованы в иммобилизованном состоянии посредством соответствующей процедуры иммобилизации.

Бактерии Bifidobacterium bifidum согласно изобретению могут быть использованы для превращения лактозы как таковой или лактозы, содержащейся в молочном продукте, в новую галактоолигосахаридную композицию согласно изобретению. После превращения бактериальные клетки могут быть удалены центрифугированием. Любой присутствующий моносахарид может быть удален, например, путем инкубации с дрожжами Saccharomyces cerevisiae. Впоследствии смесь может быть подвергнута центрифугированию и микрофильтрации. Полученный раствор GOS затем может быть высушен распылением с образованием порошка.

Молоко, содержащее галактоолигосахаридную композицию согласно изобретению, приготовленную данным способом, могут употреблять дети, взрослые или животные. В качестве альтернативы композиция может быть использована для получения продуктов, таких как хлеб, кондитерские изделия или тому подобное, где устойчивость галактоолигосахаридов при кислых условиях и при высокой температуре делает возможным использовать их без разложения. В качестве альтернативы порошок GOS может быть добавлен к продуктам, перечисленным выше.

Порошок GOS может быть введен больным, страдающим от таких кишечных расстройств, как воспалительное кишечное заболевание и синдром раздраженной кишки, в таком случае больной может употреблять суточную дозу от 2 до 20 г, предпочтительно от 5 до 10 г, наиболее предпочтительно 7 г, в виде двух отдельных доз.

В качестве альтернативы галактоолигосахаридная композиция согласно изобретению может быть смешана с культурой Bifidobacterium bifidum согласно изобретению для получения смеси с целью улучшения состояния кишечника. Такую смесь классифицируют как синбиотическая, которую определяют как "смесь пробиотика и пребиотика, которая благотворно действует на хозяина за счет улучшенной жизнеспособности и введения живой микробной пищевой добавки в желудочно-кишечный тракт» (смотри Gibson and Roberfroid, 1995, Dietary modulation of the human microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition 125, 1401-1412). Такая комбинация повышает жизнеспособность пробиотика в неблагоприятной среде толстой кишки благодаря предоставлению доступного селективного субстрата. Бактериальный пробиотик может быть микроинкапсулированным в галактоолигосахаридном пребиотике в виде, например, порошка, который затем можно добавлять к молочным продуктам, таким как йогурт, или использовать как пищевую добавку.

Преимущество употребления молока или других продуктов, содержащих галактоолигосахаридную композицию согласно изобретению, заключается в том, что оно стимулирует повышение уровней благоприятных бифидобактерий в кишке при обеднении других менее желательных бактерий, присутствующих в кишечной микрофлоре, таких как клостридии. Таким образом, происходит уменьшение некоторых природных бактерий, которые могут оказывать вредное воздействие на состояние здоровья индивидуума. Этот эффект должен привести к сокращению инфекций желудочно-кишечного тракта. Галактоолигосахаридная композиция помогает предотвратить или лечить колит, уменьшает случаи диареи и снижает риск хронических кишечных заболеваний, таких как язвенный колит и рак. Она также может помочь в ослаблении симптомов синдрома раздраженной толстой кишки.

Вес сельскохозяйственных животных, содержащихся на корме с добавленной галактоолигосахаридной композицией согласно изобретению в виде, например, порошка, может улучшаться благодаря питанию.

Настоящее изобретение будет описано далее посредством ссылки на примеры.

ПРИМЕР 1

1 л среды (рН 7,0), содержащей 10,0 г/л триптона, 5,0 г/л Lab-LEMCO (мясной экстракт), 5,0 г/л дрожжевого экстракта, 3,0 г/л К₂НРО₄, 0,05 г/л цистеина·HCl, 10 г/л лактозы и 1 мл/л твин 80, стерилизовали при 121°С в течение 15 мин. После стерилизации среду засевали 1,0% (об./об.) свежей культурой Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 и инкубировали при анаэробных условиях при 37°С в течение 50 ч. Бактериальные клетки собирали центрифугированием (30000 g в течение 20 мин). После промывки дважды фосфатным буфером (0,02 М, рН 7,0) клетки были готовы к использованию в реакциях синтеза олигосахаридов.

Бактериальные клетки (40 единиц β-галактозидазной активности) вновь суспендировали в 100 мл фосфатного буфера (0,02 М, рН 7,0), содержащего 50 г лактозы. Реакцию проводили при 40°С, и после 7 ч смесь состояла из 35% (мас./об.) продуктов гидролиза (глюкоза, галактоза), 37% (мас./об.) лактозы и 18% (мас./об.) галактоолигосахаридов со степенью полимеризации между 2 и 5. После удаления бактериальных клеток центрифугированием (3000 g в течение 20 мин) моносахариды (глюкоза и галактоза) удаляли посредством инкубации с дрожжами Saccharomyces cerevisiae. Впоследствии дрожжи удаляли центрифугированием (10000 g в течение 10 мин) и затем смесь фильтровали через микрофильтр 0,1 мкм, чтобы обеспечить микробиологические показатели продукта. Раствор сахара затем сушили распылением для получения порошка. Продукты количественно анализировали посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя систему Merck-Hitachi LaChrom (Merck, Poole, Dorset, UK), снабженную колонкой APEX Carbohydrate (Jones Chromatography, Mid Glamorgan, UK) и детектор Merck-Hitachi LaChrom R1. В качестве элюента использовали 70% (об./об.) ацетонитрил при 25°С и скорости потока 0,8 мл/мин. Галактоолигосахаридная смесь состояла из 25% Gal-Gal, 35% Gal-Gal-Glc, 24% Gal-Gal-Gal-Glc и 16% Gal-Gal-Gal-Gal-Glc.

ПРИМЕР 2

Клетки Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 получали способом примера 1 и добавляли к 500 мл снятого молока в перемешиваемом резервуаре, добавляли (300 единиц β-галактозидазной активности). Превращение лактозы происходило при 40°С. После 8 ч концентрация галактоолигосахаридов составляла 22% (мас./об.), и смесь содержала 28% Gal-Gal, 32% Gal-Gal-Glc, 21% Gal-Gal-Gal-Glc и 19% Gal-Gal-Gal-Gal-Glc.

ПРИМЕР 3

In vitro модель кишки

Условия, имеющие место в толстой кишке, воспроизводили в трехстадийном непрерывном ферментере (Macfarlane et al., 1998, Microbiol Ecology, 35, 180-187), в который вносили 10% (мас./об.) фекального гомогената от здоровых добровольцев в среде для роста без GOS смеси и с 1% (мас./об.) GOS смеси, приготовленной способом примера 1 (таблица 2). Модель состояла из трех сосудов, V1, V2 и V3, с соответствующими рабочими объемами 270, 300 и 300 мл. Температуру устанавливали на 37°С и ее вместе с рН контролировали автоматически. рН культур в трех сосудах поддерживали при 5,5, 6,2 и 6,8, соответственно. Каждый ферментер перемешивали с помощью магнита, и в нем поддерживали анаэробные условия путем непрерывного барботирования смеси N₂, свободного от O₂ (15 мл/мин). Среда для роста содержала следующие ингредиенты: крахмал 8 г/л, муцин 4 г/л, казеин 3 г/л, пептонную воду 5 г/л, триптонную воду 5 г/л, желчь № 3 0,4 г/л, дрожжи 4,5 г/л, FeSO₄ 0,005 г/л, NaCl 4,5 г/л, KCl 4,5 г/л, КН₂РО₄ 0,5 г/л, MgSO₄·7H₂O 1,25 г/л, CaCl₂·6H₂O 0,15 г/л, NaHCO₃ 1,5 г/л, твин 80 1 мл, гемин 0,05 г/л, цистеин·HCl 0,8 г/л. Среду подавали к V1 посредством перистальтического насоса, и V1 последовательно снабжал V2 и V3 через серию трубок. Система работала при времени удерживания приблизительно 36 часов. Модель кишки оставляли на ночь, чтобы уравновесить систему до того, как подключали насос для подачи среды, и он работал в течение, по крайней мере, 10 дней до того, как была введена среда, содержащая тестируемый субстрат, и систему оставляли в течение еще 10 дней. Образцы отбирали в начале и в конце каждого цикла. Объем удаленного образца составлял 5 мл, и это количество использовали для установления количества группы бактерий.

Гибридизация in situ с применением флуоресцентно меченных зондов (FISH)

Различия между бактериальными популяциями оценивали посредством использования метода FISH с олигонуклеотидными зондами, сконструированными для нацеливания на диагностические области 16S рРНК. Данные олигонуклеотиды были коммерчески синтезированными и меченными флуоресцентным красителем Cy3 (предоставленным Eurogentec UK Ltd). Использованные молекулярные зонды представлены в таблице 1. Для общего бактериального счета использовали краситель нуклеиновых кислот 4,6-диамино-2-фенилиндол (DAPI). Образцы, взятые из ферментационных сосудов, разбавляли в 4% (мас./об.) параформальдегиде и фиксировали в течение ночи при 4°С. Затем клетки центрифугировали при 1500g в течение 5 минут, промывали дважды забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS; 0,1 М, рН 7,0), вновь суспендировали в смеси PBS/99% этанол (1:1 мас./об.) и хранили при -20°С в течение, по крайней мере, 1 часа. Затем суспензию клеток добавляли к гибридизуемой смеси и гибридизовали при соответствующей для каждого зонда температуре в течение ночи. Гибридизованную смесь подвергали вакуум-фильтрации, используя мембранный фильтр Isopore 0,2 мкм (Millipore Corporation, Herts, UK). Фильтр отставляли, помещали на предметное стекло с SlowFade (Molecular Probes, Eugan, OR, USA) и проверяли с помощью флуоресцентного микроскопа (Nicon Eclipse, E400). Клетки, окрашенные с помощью DAPI, проверяли в УФ-свете, и гибридизованные клетки оценивали, используя фильтр DM510. Для каждого предметного стекла было оценено, по крайней мере, 15 различных полей зрения.

Результаты

Заключение

Из таблицы 3 видно, что GOS смесь, приготовленная согласно настоящему изобретению, проявляла лучшие пребиотические свойства (т.е., наблюдали более значительное увеличение бифидобактерий, а также уменьшение бактероидов, чем наблюдали для коммерческого эквивалента GOS (смотри таблицу 2). Пребиотический эффект был более выраженным в сосуде 1 (V1) и 2 (V2), что объясняется тем фактом, что GOS смесь согласно настоящему изобретению состоит из низкомолекулярных олигосахаридов.

ПРИМЕР 4

Метод метилирования

Синтетические галактоолигосахаридные продукты, полученные по способу примера 1, очищали гель-фильтрацией на колонке Biogel P2 (Pharmacia), производя элюирование водой со скоростью 3 мл·мин^-1.

Положения связей для соответствующих галактоолигосахаридных препаратов определяли методом метилирования. Лиофилизированные образцы (5-6 мг) диспергировали в сухом диметилсульфоксиде (DMSO) при 20°С в течение 16 ч после продувания аргоном. Образцы метилировали посредством последовательного добавления порошков гидроокиси натрия (0,5 г) и йодометана (4 мл) (Ciucanu and Kerek, 1984; MacCormick et al., 1993). После элюции-экстракции на С18-связанном картридже (Sep-Pak, Waters, Watford, UK) метилированные углеводы сушили, экстрагировали смесью CHCl₃/CH₃OH (1:1, об./об.) и упаривали досуха. Образцы гидролизовали с помощью трифторуксусной кислоты (Blakeney et al., 1983) и превращали в частично метилированные алдитолацетаты (PMAAs) путем восстановления с помощью NaBD₄ и ацетилирования уксусным ангидридом и N-метилимидазолом (Albercheim et al., 1967).

PMAAs анализировали посредством ГХ на колонке с поперечно-связанным носителем 50% цианопропилметил-50% фенилметилполисилоксаном (Thames Chromatography, Maidenhead, UK), используя пламенно-ионизационный детектор и температурную программу: 55°С (2 мин), +45°С мин^-1 (1,9 мин), 140°С (2 мин), +2°С мин^-1 (35 мин), 210°С (40 мин). PMAAs идентифицировали путем измерения их времени удерживания относительно мио-инозитолгексаацетата и сравнения относительного времени удерживания со временем удерживания внешних стандартов. Смесь стандартов для каждого сахара приготовляли путем целевого метилирования метилгликозидов (Doares et al., 1991). Площади пиков были представлены как относительные молярные количества, используя факторы эффективности ответов углеводородов (Sweet et al., 1975).

Идентичности PMAAs были подтверждены их электронно-ионизационными масс-спектрами (Carpita and Shia, 1989). Анализ ГХ-МС выполняли на идентичном ГХ в серии с масс-спектрометром Fisons Analytical Trio 1S, используя температуру источника 200°С и потенциал ионизации 70 эВ.

Для того, чтобы определить аномерную конфигурацию продукта синтеза, олигосахариды обрабатывали α-галактозидазой и β-галактозидазой (Melibiase; Sigma) при оптимальных условиях в течение 30 мин. Продукты реакции анализировали посредством ВЭЖХ.

Результаты

Исходя из описанного выше анализа, была установлена структура олигосахаридов, которая была для тетрасахаридной фракции Gal(β 1-6)-Gal(β 1-6)-Gal(β 1-4)-Glc, трисахаридной фракции Gal(β 1-6)-Gal(β 1-4)-Glc; Gal(β 1-3)-Gal(β 1-4)-Glc и дисахаридной фракции Gal(β 1-4)-Glc (субстрат лактоза); Gal(β 1-3)-Glc; Gal(β 1-3)-Gal; Gal(β 1-6)-Gal; Gal(α 1-6)-Gal (галабиоза).

Gal: галактоза, Glc: глюкоза

Ссылки

1. Albersheim P.D., D.J. Nevins, P.D. English and A. Karr. 1967. A method for the analysis of sugars on plant cell-wall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydr Res 5: 340-345.

2. Blakeney A.B., P.J.Harris, R.J. Henry and B.A. Stone. 1983. A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydr Res 113: 291-299.

3. Carpita N.C. and E.M. Shia. 1989. Linkage structure of carbohydrates by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS) for partially methylated alditol acetates, p. 157-216. In CJ. Biermann and G.D. McGinnis (ed.), Analysis of carbohydrates by gas-liquid chromatography and mass spectroscopy. CRC Press Роса Raton, Fla.

4. Ciucanu L and F. Kerek. 1984. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res 131: 209-217.

5. Doares S.H., P. Albersheim and A.G. Darvill. 1991. An improved method for the preparation of standards for the glycosyl-linkage analysis of complex carbohydrates. Carbohydr Res 210: 311-317.

6. MacCormick C.A., J.E. Harris, A.P. Cunning and V.J. Morris. 1993. Characterization of a variant of polysaccharide acetan produced by a mutan of Acetobacter xylinumstrain CR 1/4. J Appl Bacteriol 74: 196-199.

7. Sweet D.P., R. Shapiro and P. Albersheim. 1975. Quantitative analysis by various GLC response-factor theories for partially methylated and partially ethylated alditol acetates. Carbohydr Res 40: 217-225.

ПРИМЕР 5

Материалы и методы

Клеточная линия НТ29 была получена из Европейской коллекции культур клеток для прикладной микробиологии и исследования. Линии клеток культивировали при 37°С в увлажненной 5% СО₂ в стандартной среде, включающей в себя модифицированную по Дульбекко среду Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненную 5% (об./об.) телячьей фетальной сывороткой (FBS), 100 мМ пенициллином, 0,1 М стрептомицином, несущественными аминокислотами (NEAAЧ100) и 200 мМ α-глутамином. Клетки обеспечивали питанием путем смены среды каждые 48 часов и пассировали до тех пор, пока клетки не достигали конфлюентного состояния.

Анализ чувствительности к олигосахаридам

Сывороточную стандартную среду (1% об./об.), дополненную различными концентрациями олигосахаридов (0,01, 0,1, 1, 10, 100 мМ), использовали для анализа чувствительности к олигосахаридам по методу Olano-Martin et al., 2003. Клетки «подпитывали» экспериментальной средой (содержащей интересующий олигосахарид) ежедневно, и измерение прилипающих клеток осуществляли путем удаления экспериментальных сред и промывания клеток физиологическим раствором без Ca⁺⁺, забуференным фосфатом (рН 7, 9,6 гл^-1). Затем прилипшие клетки трипсинизировали и нейтрализовали равным объемом сывороточной стандартной среды. Клеточную суспензию разбавляли в Isoton II и клетки подсчитывали на счетчике Coulter Counter. Степень выживания клеток, выраженную в процентах, рассчитывали следующим образом (фигура 1):

% выживания = (среднее поглощение обработанных клеток/среднее поглощение контроля) х 100

Анализ адгезии

НT29 клетки выращивали в 12-луночных планшетах для культуры ткани до состояния >90% конфлюентности с помощью стандартной среды. Для последнего до выполнения анализа питания клеток использовали среду без антибиотика.

Патогены выращивали в анаэробных условиях в культуральной среде без антибиотика в течение, по крайней мере, трех пересевов. В день анализа свежую предварительно восстановленную среду для культуры ткани засевали 10% патогенной культурой, выращенной в течение ночи, и инкубировали в течение 4 ч до анализа.

Основной раствор испытуемых олигосахаридов приготовляли при концентрации 5 М в забуференном фосфатом физиологическом растворе и подвергали стерилизации фильтрованием.

Разбавление 1/1000 патогенной культуры, инкубированной в течение 4 ч, осуществляли в PBS, и число клеток оценивали путем подсчета планшетов. Среду удаляли из планшетов для культуры ткани и клетки промывали один раз в PBS (1 мл).

Для каждого испытуемого олигосахарида 0,5 мл раствора олигосахарида (5 М) добавляли к трем лункам. Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) без какого-либо олигосахарида включали в качестве контроля. Суспензию культуры 0,5 мл добавляли ко всем лункам, планшет встряхивали и инкубировали в аэробных условиях при 37°С в течение 2 ч.

Культуру удаляли и все лунки промывали три раза в стерильном PBS (1 мл на лунку). После конечной промывки PBS удаляли и 70 мкл раствора трипсин/EDTA добавляли к каждой лунке, перемешивали и оставляли в течение 5 минут при 37°С.

На лунку добавляли 1 мл PBS и пипеткой перемешивали для того, чтобы удостовериться, что все клетки удалены со дна лунки и что слипшиеся комочки разбиты.

Клеточную суспензию в количестве 1 мл с помощью пипетки помещали в универсальную бутыль MRD (Maximum Recovery Diluent) и далее разводили как предназначено. Разведенные суспензии помещали на агаровые пластины для счета (РСА) и инкубировали при 37°С в течение 24 ч.

После инкубации колонии подсчитывали и ингибирование адгезии рассчитывали как отношение бактерий (КОЕ мл^-1), присутствующих в образце, к контролю (PBS) (фигура 2).

Заключение

Результаты, представленные на фигуре 2, указывают на значительное ингибирование адгезии E. coli EPEC и S. typhimurium в присутствии фракции дисахаридов, причем указанное ингибирование также свойственно смеси GOS. Меньший анти-адгезивный эффект наблюдается в присутствии фракции, более высокой, чем трисахарид (>три) в смеси, против S. typhimurium.

Анализ чувствительности к олигосахаридам осуществляли для того, чтобы убедиться в том, что олигосахаридная смесь не является токсичной по отношению к клеткам НТ29 (фигура 1).

Ссылки

Olano-Martin E., Williams M.R., Gibson G.R., Rastall R.A. 2003. Pectins and pectic-oligosaccharides inhibit Escherichia coli 0157: H7 Shiga toxin as directed towards the human colonic cell line HT29. FEMS Microbiol Letters 218 (1): 101-105

Фигура 1. Выживаемость клеток, на которые воздействовали добавлением различных концентраций олигосахаридов (0,01-100 мМ), после 24 и 48 ч инкубации

Фигура 2. Влияние смеси олигосахаридов (всех) и различных фракций смеси на адгезию E. coli EPEC, E. coli VTEC и Salmonella typhimurium к клеткам НТ29.

ПРИМЕР 6

Продукт GOS, используемый в данном эксперименте, был произведен, как описано ранее (пример 1), и инулин был получен от Orafti (Belgium).

Сорок некастрированных поросят, отлученных от матки, приобретали от JSR Genetics Ltd, Southburn, Driffield, Yorkshire. YO25 9ED.

По прибытии в Редингский университет поросят помещали в четыре группы по десять поросят в течение периода семь дней, чтобы дать поросятам время успокоиться после транспортировки и привыкнуть к секции и питанию. Средний вес поросят при доставке был 14,70 кг.

После семидневного периода привыкания поросят перемещали в индивидуальные небольшие загоны, в одной и той же секции. Средний вес поросят при содержании в индивидуальном загоне был 17,46 кг.

Поросят идентифицировали с помощью уникальной татуировки на ушах, их также индивидуально нумеровали, используя водостойкий маркер. Каждый индивидуальный загон нумеровали таким же идентификационным номером, который использовали, чтобы отметить каждого поросенка.

Десяти поросятам устанавливали одну из четырех диет, контрольную диету (NEG), диету с добавлением к контрольной диете 1,6% (мас./мас.) GOS, полученных способом примера 1, диету с добавлением к контрольной диете 4% (мас./мас.) GOS или диету с добавлением к контрольной диете 1,6% (мас./мас.) инулина.

Поросятам подстилали опилки в течение всего исследования, кроме того, обеспечивали соломой для улучшения окружающей обстановки, а также были игрушки, чтобы способствовать ослаблению апатии.

В течение всего исследования поросята получали гранулы Deltawean 15 NGP (ABN, ABN House, PO Box 250, Oundle Rd, Woodston, Peterborough. PE 9QF), полнорационный комбикорм, которым кормили ad-libitum для роста поросят.

Питательный/минеральный состав Deltawean 15 NGP
Питательное вещество	Включение
Масло	3,3%
Белок	19,2%
Волокно	2,8%
Зола	4,8%
Влага	13,8%
Витамин А	9500 МЕ/кг
Витамин Е, альфа токоферол	100 МЕ/кг
Витамин D3	1850 МЕ/кг
Селен, селенит натрия	0,30 мг/кг
Лизин	1,32%
Медь, сернокислая медь	170 мг/кг

Пища поросят также содержала разрешенные антиоксиданты, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ) и этоксихин.

Поросят размещали произвольно для обработки, хотя двух или трех поросят, подвергаемых одинаковой пищевой обработке, индивидуально помещали на одну и ту же площадку группового загона. Поросят группировали таким путем, чтобы избежать смешивания обработок, на случай, если они выбегали из индивидуального загона, т.е. могли есть только пищу, предназначенную для соответствующей пищевой обработки такого отдельного поросенка. Индивидуально помещенных поросят, в группах из двух или трех, при одинаковой обработке, размещали произвольно по всему отсеку.

Фекальные образцы собирали от каждого поросенка в начале диеты и после четырех недель содержания на испытуемой диете, и фекальные микробные популяции определяли методом FISH (таблица 4), как описано ранее (пример 3). В конце эксперимента поросят забивали для получения образцов содержимого проксимальных и дистальных сегментов толстой кишки. Величины рН (таблица 5), короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA) (таблица 6) и микробные популяции (таблица 7) определяли в содержимом проксимальных и дистальных сегментов толстой кишки. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение (SD). Различия анализировали посредством t-критерия Стьюдента. Различия считали значительными при Р<0,05.

КОЕ log₁₀/г фекалий; каждая величина является средней ± SD,

^* n=40, ^† n=10; различия анализировали посредством t-критерия Стьюдента. Средние значения в ряду с верхними индексами значительно отличались (Р<0,05) ^а от NEG, ^bот GOS 1,6%, ^с от времени 0.

Каждая величина представляет собой среднее значение ± SD, n=10. Различия анализировали посредством t-критерия Стьюдента. Средние значения в ряду с верхними индексами значительно отличались (Р<0,05) ^а от NEG, ^bот GOS 1,6%, ^с от инулина.

Каждая величина представляет собой среднее значение ± SD, n=10. Различия анализировали посредством t-критерия Стьюдента. Средние значения в ряду с верхними индексами значительно отличались (Р<0,05) ^а от NEG, ^bот GOS 1,6%, ^с от инулина. ND не определяли; ^* мкмоль/г в расчете на влажный материал.

КОЕ log₁₀/г с учетом влаги; каждая величина является средней ± SD, n=10; различия анализировали посредством t-критерия Стьюдента. Средние значения в ряду с верхними индексами значительно отличались (Р<0,05) ^а от NEG, ^bот GOS 1,6%,^с от инулина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таблица 5: наблюдается снижение рН в проксимальных сегментах кишки в присутствии GOS (для 1,6% и особенно для 4%), что в сочетании с данными SCFA (таблица 6) свидетельствует о том, что продукт GOS достигает проксимальных частей кишки (продукты брожения повышены).

Таблица 7: в присутствии GOS (4%) наблюдается значительное увеличение в числе популяций благотворных бактерий (бифидобактерии, молочнокислые бактерии) в проксимальных частях кишки. Указанное увеличение числа популяций ниже в дистальной части и в фекальных образцах, что можно объяснить тем фактом, что продукт GOS, по-видимому, подвергается брожению, главным образом, в проксимальной части кишки. Результаты обработки 1,6% GOS показали подобную тенденцию.

В проксимальных сегментах кишки увеличение числа популяции бифидобактерий можно наблюдать, а также увеличение продукции уксусной кислоты (главный продукт брожения бифидобактерий). На основании полученных данных полагают, что продукт GOS является весьма избирательным относительно видов бифидобактерий.

ПРИМЕР 7

Изучение отдельных случаев

Изучение случая 1 - Воспалительное кишечное заболевание (IBD)

Приводится случай с 43-летней больной женщиной с диагнозом язвенный колит (одна из основных форм IBD), которая подвергалась лечению продуктом GOS, приготовленным способом примера 1.

Больная страдала от язвенного колита в течение 5 лет и не принимала лечение до и в течение периода испытаний. Противовоспалительное средство сульфасалазин использовали ранее, но без положительного эффекта. Больная имела затруднения в переваривании пищи, была на стандартной диете, страдала от тошноты, диареи и боли в животе. Боль была в левой стороне толстой кишки, что коррелировало с диагнозом колит на основании воспаления нисходящей ободочной кишки.

Общая суточная доза GOS 7 г/день (в 2 раздельные дозы) была употреблена. В течение 4 дней приема симптомы начали ослабевать. Больная могла лучше переваривать пищу, кишечные боли начали отступать и тошнота уменьшилась. Клинического анализа посредством эндоскопии сделано не было, но, тем не менее, больная испытывала ощущение улучшения здоровья. Единственным изменением в диете было добавление GOS. Через шесть недель этот эффект сохранялся.

Хотя многократное исследование на больных не контролировали с плацебо, данный конкретный случай представил отдельное доказательство положительного эффекта пребиотика GOS для одной основной формы IBD.

Изучение случая 2 - Синдром раздраженной кишки (IBS)

Мужчина 27 лет, который страдал от IBS в течение 3 лет, в течение 3 недель принимал 7 г/день GOS, приготовленные способом примера 1, в виде двух раздельных доз. До этого периода он испытывал вздутие живота, запор, кишечную боль и вялость. Наблюдались классические симптомы, ассоциированные с IBS. Больной не принимал антибиотики в течение 6 месяцев и был на диете без пшеницы/глютена и сахара.

После приема пребиотиков наблюдали значительное ослабление симптомов в течение 3 дней, и эффект сохранялся. Субъект говорит о заметном улучшении общего состояния и состояния кишки, а именно: «Я теперь готов пробежать марафон», Он принимает нормальную пищу без трудностей.

Данное сообщение не контролировалось испытанием, но явилось отдельным примером, показывающим, что GOS могут улучшать состояние IBS и качество жизни больного.

Claims

1. Штамм Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171, обладающий галактозидазной активностью, способный превращать лактозу в галактоолигосахаридную смесь, содержащую, по крайней мере, один дисахарид, по крайней мере, один трисахарид, по крайней мере, один тетрасахарид и, по крайней мере, один пентасахарид.

2. Штамм по п.1, отличающийся тем, что в галактоолигосахаридной смеси дисахаридом является Gal-Gal, трисахаридом является Gal-Gal-Glc, тетрасахаридом является Gal-Gal-Gal-Glc и пентасахаридом является Gal-Gal-Gal-Gal-Glc, где Gal представляет собой остаток галактозы и Glc представляет собой остаток глюкозы.

3. Штамм по п.2, отличающийся тем, что галактоолигосахаридная смесь содержит Gal(α1-6)-Gal, Gal(β1-6)-Gal((β1-4)-Glc, Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc, Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc и Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc.

4. Штамм по п.3, отличающийся тем, что галактоолигосахаридная смесь содержит от 20 до 35% мас./об. дисахарида, от 20 до 35% мас./об. трисахарида, от 15 до 25% мас./об. тетрасахарида и от 10 до 20% мас./об. пентасахарида.

5. Галактоолигосахаридная композиция для стимулирования специфического роста бифидобактерий, включающая в качестве активных компонентов смесь, по крайней мере, одного дисахарида, представляющего собой Gal-Gal, по крайней мере, одного трисахарида, представляющего собой Gal-Gal-Glc, по крайней мере, одного тетрасахарида, представляющего собой Gal-Gal-Gal-Glc, и, по крайней мере, одного пентасахарида, представляющего собой Gal-Gal-Gal-Gal-Glc.

6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что она содержит Gal(α1-6)-Gal, Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc, Gal(β1-3)-Gal(β1-4)-Glc, Gal((β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc и Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-6)-Gal(β1-4)-Glc.

7. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что она содержит от 20 до 35% мас./об. дисахарида, от 20 до 35% мас./об. трисахарида, от 15 до 25% мас./об. тетрасахарида и от 10 до 20% мас./об. пентасахарида.

8. Синбиотическая композиция для улучшения состояния кишечника, отличающаяся тем, что она содержит культуру штамма Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 по любому из пп.1-4 и галактоолигосахаридную композицию по любому из пп.5-7.

9. Применение галактоолигосахаридной композиции по любому из пп.5-7 для приготовления лекарственного препарата для предотвращения адгезии патогенов или токсинов, продуцируемых патогенами, к стенке кишечника.

10. Применение синбиотической композиции по п.8 для приготовления лекарственного препарата для предотвращения адгезии патогенов или токсинов, продуцируемых патогенами, к стенке кишечника.

11. Применение галактоолигосахаридной композиции по любому из пп.5-7 для приготовления лекарственного препарата для восстановления нормальной кишечной флоры после лечения антибиотиками или операции.

12. Применение синбиотической композиции по п.8 для приготовления лекарственного препарата для восстановления нормальной кишечной флоры после лечения антибиотиками или операции.

13. Применение штамма Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 по любому из пп.1-4 для получения галактоолигосахаридной композиции, определенной в любом из пп.5-7.

14. Применение по п.13, отличающееся тем, что галактоолигосахаридная композиция является частью продукта, предназначенного для улучшения состояния кишечника.

15. Применение по п.14, отличающееся тем, что продукт выбран из группы, состоящей из молочных продуктов, напитков, детского питания, крупяных продуктов, сухого печенья, кондитерских изделий, кексов, пищевых добавок, добавок к рациону, кормов для животных, кормов для домашней птицы или любого другого продукта питания или напитка.

16. Применение по п.14, отличающееся тем, что продукт представляет собой молочный продукт, выбранный из группы, состоящей из жидкого молока, сухого молочного порошка, порошка цельного молока, порошка снятого молока, молочных порошков, обогащенных жирами, порошков сыворотки, молочных продуктов для питания детей, мороженого, йогурта, сыра и ферментированных молочных продуктов.

17. Способ производства вещества для стимулирования роста бифидобактерий, отличающийся тем, что лактозу или лактозосодержащий материал обрабатывают штаммом Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 по любому из пп.1-4.

18. Способ по п.17, отличающееся тем, что лактозосодержащий материал выбирают из группы, состоящей из коммерческой лактозы, цельного молока, полуснятого молока, снятого молока, сыворотки и обогащенного жирами молока.

19. Способ по п.18, отличающееся тем, что молоко получают от коров, самок буйвола, овец или коз.

20. Способ по п.17, отличающееся тем, что после удаления клеток Bifidobacterium bifidum вещество сушат распылением с образованием порошка.

Приоритет по пунктам:

30.06.2003 по пп.1, 2, 4-7, 14-19;

16.01.2004 по пп.3, 6, 8, 13;

30.06.2004 по пп.9-12, 20.