DE602004006133T2 - Neue galactooligosaccharidzusammensetzung und herstellung davon - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neuartige Bifidobacterium bifidum-Stämme, die eine neuartige Galactosidase-Enzymaktivität erzeugen, die Lactose in ein neuartiges Gemisch aus Galactooligosacchariden umwandeln kann. Galactooligosaccharide sind unverdauliche Kohlehydrate, die gegenüber den gastrointestinalen Verdauungsenzymen von Säugetieren beständig sind, jedoch von spezifischen Darmbakterien vergoren werden. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung eines Bifidobakterienstammes zur Erzeugung einer neuartigen Galactooligosaccharid-Zusammensetzung, die das Wachstum von Bifidobakterien im Darm begünstigen kann. Sie bezieht sich außerdem auf die neuartige Zusammensetzung der Galactooligosaccharid-Produkte.
  • Die Darmflora des Menschen umfasst pathogene, gutartige und zuträgliche Mikrobengattungen. Das Vorherrschen ersterer kann zu akuten Darmkrankheiten (z.B. Gastroenteritis) und chronischen Darmkrankheiten (z.B. entzündlicher Darmerkrankung, Reizdarmsyndrom und einigen Darmkrebsarten) führen. Es wurden Versuche unternommen, das Gleichgewicht der Darmflora zugunsten zuträglicher Mikroorganismen wie z.B. der Bifidobakterien durch Zusatz eines oder mehrerer Mikrobenstämme zu einem geeigneten Nahrungsmittelvehikel zu beeinflussen. Ein solches lebendes mikrobielles Nahrungsergänzungsmittel ist als Probiotikum bekannt. Es ist jedoch schwierig, das Überleben lebender Bakterien in Nahrungsmitteln sowie nach der Verdauung zu garantieren.
  • Ein alternativer Ansatz einer dietätischen Beeinflussung der Darmmikroflora ist die Verwendung eines Präbiotikums, bei dem es sich definitionsgemäß um einen unverdaulichen Nahrungsmittelbestandteil handelt, der den Wirt durch selektive Stimulation des Wachstums und/oder der Aktivität eines oder einer begrenzten Anzahl von Bakterien im Darm günstig beeinflusst, was zu einer Verbesserung der Gesundheit des Wirts führt.
  • Die Mikroflora des menschlichen Dickdarms wird bei der Geburt erworben. Bei Babies, die gestillt werden, überwiegen die Bifidobakterien zahlenmäßig im Vergleich zu anderen Gattungen. Der Grund hierfür ist, dass die Bestandteile der Muttermilch stimulierend wirken. Im Gegensatz dazu entwickeln mit der Flasche gefütterte Babies eine komplexere Flora, die insofern dem Darm von Erwachsenen ähnelt, dass Bacteroides, Clostridia, Bifidobakterien, Laktobakterien, gram-positive Kokken, Coliforme und andere Gruppen in mehr oder weniger gleich großen Mengen vorliegen. Bifidobakterien schützen nach allgemeiner Ansicht den Dickdarm vor Infektionen; dieser Unterschied erklärt wahrscheinlich die wesentlich geringere Häufigkeit von Infektionen bei gestillten Babies im Vergleich zu Flaschenkindern.
  • Bestimmte Bestandteile der Darmflora sind an der Ätiologie von Darmkrankheiten beteiligt. Myobakterien werden z.B. mit Morbus Crohn in Verbindung gebracht, ulzeröse Kolitis kann durch schwefelreduzierende Bakterien ausgelöst werden und Bakterien können an der Entwicklung von Darmkrebs beteiligt sein. Es wäre eindeutig von Vorteil, wenn das selektive Wachstum von einheimischen zuträglichen Darmbakterien durch Einnahme eines Präbiotikums unterstützt werden könnte. Dies hätte die Wirkung, dass die pathogene Mikrofloradauerhaft unterdrückt würde.
  • Eine Gruppe von Verbindungen, die als Präbiotika klassifiziert werden, sind die Galactooligosaccharide, d.h. galactosehaltige Oligosaccharide der Form Glc α1-4[β Gal 1-6]n mit n = 2 – 5, die infolge der Transgalactosylase-Aktivität des Enzyms β-Galactosidase aus Lactosesirup erzeugt werden (Crittenden, 1999, Probiotics: A Critical Review. Tannock, G. (Hrsg.) Horizon Scientific Press, Wymondham, S. 141–156). Derzeit sind drei Produkte mit drei etwas unterschiedlichen Zusammensetzungen im Handel erhältlich. Das erste – transgalactosylierte Oligosaccharide (TOS) – wird mit Hilfe von δ-Galactosidase aus Aspergillus oryzae erzeugt (Tanaka et al., 1983, Bifidobacteria Microflora, 2, 17–24) und besteht aus Tri-, Tetra-, Penta- und Hexagalactooligosacchariden. Das zweite ist Oligomate 55, hergestellt mit Hilfe von β-Galactosidase aus A. oryzae und Streptococcus thermophilus (Ito et al., 1990, Microbial Ecology in Health and Disease, 3, 285–292); es enthält 36% Tri-, Tetra-, Penta- und Hexagalactooligosaccharide, 16% Disaccharid (Galactosylglucose und Galactosylgalactose), 38% Monosaccharide und 10% Lactose. Schließlich wird ein Präparat aus transgalactosyliertem Disaccharid (TD) mit Hilfe von δ-Galactosidase aus S. thermophilus erzeugt (Ito et al., 1993, J. Nutritional Science and Vitaminology, 39, 279–288).
  • Es ist bekannt, dass Mitglieder der Bifidobakterien β-Galactosidase-Enzyme erzeugen, die an dem bakteriellen Metabolismus der Lactose beteiligt sind. Moller, P.L. et al. in Appl. & Environ. Microbiol., 2001, 62(5), 2276–2283 beschreiben die Isolierung und Charakterisierung von drei β-Galactosidase-Genen aus einem Bifidobacterium bifidum-Stamm.
  • Die US-Patentveröffentlichung Nr. US 2002/0086358 beschreibt eine neue β-Galactosidase aus Bifidobacterium bifidum, insbesondere eine trunkierte Version des Enzyms mit hoher Transgalactosylierungsaktivität. Es wurde zwar angegeben, dass die Inkubation mit Lactose in Gegenwart von 0,5 bis 60% Lactose erfolgen könnte, doch die maximale beispielhafte Ausbeute des in Transgalactosylierungsreaktionen erzeugten Galactooligosaccharids betrug 44% (mg erzeugtes Oligosaccharid pro mg zugesetzter Lactose). Darüber hinaus geht aus der Definition des Oligosaccharids in dieser US-Patentveröffentlichung hervor, dass das Produkt aus mindestens drei verbundenen Zuckermolekülen besteht.
  • Dumortier et al. in Carbohydrate Research, 201, 1990, 115–123 beschreiben die Bildung von Oligosacchariden mittels einer Transgalactosylierungsreaktion während der Hydrolyse der Lactose mit Bifidobacterium bifidum DSM 20456. Ihre Analyse der Struktur des erzeugten Oligosaccharidgemisches zeigte, dass es sich bei den Bindungen um β-(1→3)-, β-(1→6)- und β-(1→4)-D-Galactosylbindungen handelte. Dumortier weist darauf hin, dass durch Bifidobacterium bifidum erzeugte Verbindungen am Anhaften von Bakterien im Dickdarm beteiligt sind.
  • Es hat sich nun herausgestellt, dass Bifidobakterienstämme nicht nur eine Galactosidase-Enzymaktivität erzeugen können, die Lactose in ein Galactooligosaccharid-Gemisch umwandelt, sondern auch ein Galactooligosaccharid-Gemisch, das bis zu 35% des Disaccharids Galabiose (Gal (α1-6)-Gal) enthält. Letzeres ist als Antihaftmittel bekannt, welches das Anhaften von Toxinen wie z.B. Shiga-Toxin und Krankheitserregern wie z.B. E. coli an der Darmwand verhindern kann (siehe Paton, J.C. & Paton, A.W., 1989, Clin. Microbiol. Revs., 11, 450–479; Carlsson, K.A., 1989, Ann. Reviews Biochem., 58, 309–350).
  • Erfindungsgemäß wird ein Bifidobacterium bifidum-Stamm bereitgestellt, der eine Galactosidase-Enzymaktivität erzeugt, die Lactose in ein Galactooligosaccharid-Gemisch aus dem Disaccharid Gal (α1-6) Gal, mindestens einem Trisaccharid ausgewählt aus Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc und Gal (β1-3)-Gal (β1-4)-Glc, dem Tetrasaccharid Gal (β1-6)-Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc und dem Pentasaccharid Gal (β1-6)-Gal (β1-6)-Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc umwandelt. Vorzugsweise umfasst das Gemisch 20 bis 35% w/v Disaccharid, 20 bis 35% w/v Trisaccharid, 15 bis 25% w/v Tetrasaccharid und 10 bis 20% w/v Pentasaccharid.
  • Der Begriff „Enzymaktivität", wie er im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Galactosidase-Enzymaktivität verwendet wird, ist die aus mindestens einem Galactosidase-Enzym resultierende Aktivität.
  • Ein Bifidobacterium bifidum-Stamm, der eine Galactosidase-Enzymaktivität erzeugen kann, die Lactose in das zuvor definierte Galactooligosaccharid-Gemisch umwandelt, wurde am 31. März 2003 unter der Anschaffungsnummer NCIMB 41171 bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria in Aberdeen hinterlegt.
  • Solch ein hinterlegter Bifidobacterium bifidum-Stamm oder sein biologisch funktionelles Äquivalent kann zur Erzeugung des zuvor definierten Galactooligosaccharid-Gemisches verwendet werden. Das Galactooligosaccharid-Gemisch kann Teil eines Produktes zur Verbesserung der Darmgesundheit durch Begünstigung des Wachstums von Bifidobakterien im Darm sein, insbesondere des ursprünglichen Erzeugerstammes. Ein solches Produkt kann aus der Gruppe bestehend aus Milchprodukten (z.B. Flüssigmilch, getrocknetem Milchpulver wie Milchpulver aus Vollmilch, Milchpulver aus Magermilch, Milchpulver mit Fettzusatz, Molkepulver, Babymilch, Eiskrem, Yoghurt, Käse, vergorenen Milchprodukten), Getränken, Babynahrung, Cerealien, Keksen, Konfekt, Kuchen, Nahrungsergänzungsmitteln, dietätischen Lebensmitteln, Tiernahrung, Geflügelfutter oder anderen Nahrungsmitteln oder Getränken ausgewählt sein.
  • Das Oligosaccharidgemisch kann auch zur Herstellung eines Medikamentes zur Verhinderung des Anhaftens von Krankheitserregern oder von Krankheitserregern erzeugten Toxinen an der Darmwand verwendet werden. Das Gemisch kann einem Patienten nach einer Antibiotikabehandlung, die häufig die normale gesunde Darmflora verändert oder sogar zerstört, oder nach einer Darmoperation verabreicht werden, um im Darm erneut die normale Flora eines gesundes Darms zu „säen" bzw. wiederherzustellen. Das Galactooligosaccharid-Gemisch kann in Kombination mit dem oben genannten Bifidobacterium bifidum-Stamm oder einem biologisch funktionellen Äquivalent eingesetzt werden.
  • Der Begriff „biologisch funktionelles Äquivalent" soll einen Bifidobacterium bifidum-Stamm bedeuten, der eine Galactosidase-Enzymaktivität erzeugen kann, die Lactose in das zuvor definierte Galactooligosaccharid-Gemisch umwandelt.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Galactooligosaccharid-Zusammensetzung zur Begünstigung des Wachstums von Bifidobakterien bereitgestellt, die als wirksame Bestandteile das zuvor beschriebene Galactooligosaccharid-Gemisch umfasst.
  • Vorzugsweise umfasst die Galactooligosaccharid-Zusammensetzung 20 bis 35% w/v Disaccharid, 20 bis 35% w/v Trisaccharid(e), 15 bis 25% w/v Tetrasaccharid und 10 bis 20% w/v Pentasaccharid.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz zur Begünstigung des Wachstums von Bifidobakterien bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Lactose oder ein lactosehaltiges Material mit einem Bifidobacterium bifidum-Stamm wie zuvor definiert behandelt wird.
  • Geeignete lactosehaltige Materialien können aus im Handel erhältlicher Lactose, Vollmilch, Halbfettmilch, Magermilch, Molke und Milch mit Fettzusatz ausgewählt sein. Solche Milchprodukte können von Kühen, Büffeln, Schafen oder Ziegen gewonnen werden. Milch mit Fettzusatz ist definitionsgemäß Vollmilch, deren Milchfett entfernt und anschließend durch pflanzliches Fett oder Öl ersetzt worden ist.
  • Es hat sich herausgestellt, dass das erfindungsgemäße Bifidobacterium bifidum bei Einsatz von Wachstumsmedien mit anderen Kohlehydratsubstraten als Lactose Maltose, Raffinose, Xylan und Fructose nutzen kann. Die Züchtung der Bakterien in einem Medium mit einem dieser Kohlehydrate induzierte die Expression von α-Glucosidase, α-Galactosidase, Xylosidase bzw. β-Fructofuranosidase und führte so zur Erzeugung von α-Glucooligosacchariden, α- Galactooligosacchariden, Xylooligosacchariden bzw. Fructooligosacchariden.
  • In der Untersuchung, die zu der vorliegenden Erfindung führte, wurden Darmbakterien daraufhin untersucht, welche von ihnen Galactosidase erzeugen konnten und so das größte Potential zur Erzeugung von Galactooligosaccharid(en) aufwiesen. Als Ergebnis stellte sich heraus, dass bestimmte Bakterien, die zur Gattung Bifidobacterium, insbesondere Bifidobacterium bifidum gehören, nicht nur eine Galactosidase-Enzymaktivität erzeugen konnten, sondern das Enzym auch Lactose in ein Galactooligosaccharid-Gemisch aus 20 bis 35% w/v Disaccharid, 20 bis 35% w/v Trisaccharid, 15 bis 25% w/v Tetrasaccharid und 10 bis 20% w/v Pentasaccharid verwandeln kann. Ein spezifisches Beispiel für ein Bifidobacterium bifidum wurde am 31. März 2003 unter der Anschaffungsnummer NCIMB 41171 in Aberdeen hinterlegt.
  • Zur Züchtung dieser Bakterien kann eine Nährstoffquelle genutzt werden, vorausgesetzt sie kann von den Bakterien assimiliert werden. Geeignete Kulturmedien lassen sich z.B. mit Kohlehydraten wie Lactose, Saccharose oder Glucose, stickstoffhaltigen anorganischen oder organischen Nährstoffquellen wie Hefeextrakt, Trypton, Fleischextrakt (Lab Lemco) und dergleichen sowie anorganischen Nährstoffquellen wie Phosphaten, Kalium und dergleichen formulieren. Zur Züchtung sollte der pH-Wert des Nährstoffmediums im Bereich von 6,0 bis 8,0, vorzugsweise bei 7,0 liegen; die Züchtung erfolgt anaerob in einem Temperaturbereich von 35 bis 40 °C, vorzugsweise bei 37 °C über 40 bis 64 Stunden, vorzugsweise über 50 Stunden.
  • Der Stamm lässt sich nach jedem bekannten Kultivierungsverfahren wie z.B. in einer stationären Phase, einer anaeroben Submerskultur oder einer Schüttelkultur züchten. Die Bakterienzellen werden mittels Zentrifugieren oder Filtration geerntet und können als solche ohne weitere Behandlung als Reaktionskatalysator dienen. Als Alternative können die Zellen nach einem geeigneten Immobilisierungsverfahren im immobilisierten Zustand eingesetzt werden.
  • Das erfindungsgemäße Bifidobacterium bifidum kann zur Umwandlung von Lactose selbst oder in einem Milchprodukt enthaltener Lactose in die erfindungsgemäße neuartige Galactooligosaccharid-Zusammensetzung eingesetzt werden. Nach der Umwandlung können die Bakterienzellen mittels Zentrifugieren entfernt werden. Vorhandene Monosaccharide können z.B. durch Inkubation mit der Hefe Saccharomyces cerevisiae entfernt werden. Anschließend kann das Gemisch zentrifugiert und einer Mikrofiltration unterzogen werden. Die entstandene GOS-Lösung kann dann sprühgetrocknet werden, so dass ein Pulver entsteht.
  • Milch, die die auf diese Weise hergestellte erfindungsgemäße Galactooligosaccharid-Zusammensetzung enthält, kann direkt an Kinder, Erwachsene oder Tiere verabreicht werden. Alternativ kann sie zur Erzeugung von Produkten wie Brot, Konfekt oder dergleichen eingesetzt werden, wobei die Stabilität der Galactooligosaccharide unter sauren und Hochtemperaturbedingungen ihre Verwendung ohne Zersetzung ermöglicht. Alternativ kann das GOS-Pulver auch einem der zuvor aufgeführten Produkte zugesetzt werden.
  • Das GOS-Pulver kann Patienten verabreicht werden, die an Darmkrankheiten wie entzündlicher Darmerkrankung und Reizdarmsyndrom leiden; diese Patienten können eine Tagesdosis von 2 bis 20 g, vorzugsweise 5 bis 10 g und am bevorzugtesten 7 g in zwei Einzeldosen einnehmen.
  • Alternativ kann die erfindungsgemäße Galactooligosaccharid-Zusammensetzung zur Erzeugung eines Gemisches zur Verbesserung der Darmgesundheit mit einer erfindungsgemäßen Bifidobacterium bifidum-Kultur gemischt werden. Ein solches Gemisch wird als Synbiotikum eingestuft, definitionsgemäß ein „Gemisch aus einem Probiotikum und einem Präbiotikum, das den Wirt durch Verbesserung des Überlebens und der Einpflanzung lebender mikrobieller dietätischer Lebensmittel im Magendarmtrakt günstig beein-flusst" (siehe Gibson und Roberfroid, 1995, Dietary modulation oft he human microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, 125, 1401–1412). Eine solche Kombination verbessert das Überleben des Probiotikums in der feindlichen Umgebung des Darms, indem es ein verfügbares selektives Substrat bietet. Das bakterielle Probiotikum kann z.B. in dem Galactooligosaccharid-Präbiotikum mikroverkapselt sein, so dass ein Pulver entsteht, das anschließend Milchprodukten wie Yoghurt zugesetzt oder als dietätisches Lebensmittel eingesetzt werden kann.
  • Der Vorteil der Verabreichung von Milch oder anderen, die erfindungsgemäße Galacto-oligosaccharid-Zusammensetzung enthaltenden Produkten ist, dass dies eine Zunahme der Menge der zuträglichen Bifidobakterien im Darm zu Ungunsten weniger erwünschter Bakterien in der Mikroflora des Darms wie z.B. den Clostridia begünstigt. Daher nimmt die Menge bestimmter einheimischer Bakterien, die eine schädliche Wirkung auf die Gesundheit des Patienten haben könnten, ab. Dies führt dann zu einer Reduktion der Infektionen des Magendarmtraktes und trägt dazu bei, Kolitis zu verhindern oder zu behandeln, Durchfälle zu verkürzen und das Risiko chronischer Darmerkrankungen wie ulzeröser Kolitis und Krebs zu reduzieren. Es kann auch dazu beitragen, die Symptome des Reizdarmsyndroms zu lindern.
  • Bei Nutztieren, die Futter erhalten, das die erfindungsgemäße Galactooligosaccharid-Zusammensetzung z.B. in Pulverform enthält, kommt es unter Umständen zu einer verbesserten Umwandlung der Nahrung in Gewicht.
  • Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf die nachfolgenden Beispiele näher beschrieben.
  • Beispiel 1
  • 1 l Medium (pH 7,0) mit 10,0 g/l Trypton, 5,0 g/l Lab-LEMCO (Fleischextrakt), 5,0 g/l Hefeextrakt, 3,0 g/l KHPO, 0,05 g/l Cystein HCl, 10 g/l Lactose und 1 ml/l Tween 80 wurde 15 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert. Nach der Sterilisation wurde das Medium mit 1,0 Vol.-% einer frischen Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171-Kultur beimpft und unter anaeroben Bedingungen 50 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Bakterienzellen wurden mittels Zentrifugieren (30.000 g über 20 Minuten) geerntet. Nach zweimaligem Waschen mit Phosphatpuffer (0,02M, pH 7,0) waren die Zellen bereit für den Einsatz in Oligosaccharid-Synthesereaktionen.
  • Die Bakterienzellen (40 Einheiten β-Galactosidase-Aktivität) wurden in 100 ml 50 g Lactose enthaltendem Phosphatpuffer (0,02M, pH 7.0) erneut suspendiert. Man ließ die Reaktion bei 40 °C ablaufen; nach 7 Stunden bestand das Gemisch aus 35% w/v Hydrolyseprodukten (Glucose, Galactose), 37% w/v Lactose und 18% w/v Galactooligosacchariden mit einem Polymerisationsgrad von 2 bis 5. Nach Entfernung der Bakterienzellen mittels Zentrifugieren (3000 g über 20 Minuten) wurden die Monosaccharide (Glucose und Galactose) durch Inkubation mit der Hefe Saccharomyces cerevisiae entfernt. Anschließend wurde die Hefe durch Zentrifugieren (10.000 g über 10 Minuten) entfernt und das Gemisch durch einen 0,1 μm großen Mikrofiltrationsfilter filtriert, um die mikrobiologische Qualität des Produktes zu gewährleisten. Dann wurde die Zuckerlösung sprühgetrocknet, so dass die Pulverform entstand. Die Produkte wurden mittels Hochleistungsflüssigchromatographie auf einem Merck-Hitachi LaChrom-System (Merck, Poole, Dorset, UK) mit einer APEX-Kohlehydratsäule (Jones Chromatography, Mid Glamorgan, UK) und einem Merck-Hitachi LaChrom RI-Detektor quantitativ analysiert. Als Eluierungsmittel dienten 70 Vol.-% Acetonitril bei 25 °C, die Fließgeschwindigkeit betrug 0,8 ml/min. Das Galactooligosaccharid-Gemisch bestand aus 25% Gal-Gal, 35% Gal-Gal-Glc, 24% Gal-Gal-Gal-Glc und 16% Gal-Gal-Gal-Gal-Glc.
  • Beispiel 2
  • Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171-Zellen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt und 500 ml Magermilch in einem gerührten Tank zugesetzt (300 Einheiten β-Galactosidase-Aktivität). Man ließ die Lactoseumwandlung bei 40 °C vonstatten gehen. Nach 8 Stunden betrug die Galactooligosaccharid-Konzentration 22% w/v und das Gemisch umfasste 28% Gal-Gal, 32% Gal-Gal-Glc, 21% Gal-Gal-Gal-Glc und 19% Gal-Gal-Gal-Gal-Glc.
  • Beispiel 3
  • In vitro-Darmmodell
  • Die Bedingungen im Darm wurden in einem dreistufigen kontinuierlichen Gärtank (Macfarlane et al., 1998, Microbial Ecology, 35, 180–187) repliziert, der mit 10% w/v Kothomogenat gesunder menschlicher Probanden in einem Wachstumsmedium ohne und mit 1% w/v des wie in Beispiel 1 hergestellten GOS-Gemisches beimpft worden war (Tabelle 2). Das Modell bestand aus drei Tanks (V1, V2 und V3) mit einem Betriebsvolumen von 270, 300 bzw. 300 ml. Die Temperatur wurde auf 37 °C eingestellt und zusammen mit dem pH-Wert automatisch gesteuert. Der pH-Wert der Kulturen in den drei Tanks wurde bei 5,5, 6,2 bzw. 6,8 gehalten. Die Gärtanks wurden jeweils magnetisch gerührt und durch kontinuierliches Besprühen mit O2-freiem N2 (15 ml/min) unter anaeroben Bedingungen gehalten. Das Wachstumsmedium enthielt folgende Inhaltsstoffe: Stärke 8 g/l, Mucin 4 g/l, Casein 3 g/l, Peptonwasser 5 g/l, Tryptonwasser 5 g/l, Galle Nr. 3 0,4 g/l, Hefe 4,5 g/l, FeSO4 0,005 g/l, NaCl 4,5 g/l, KCl 4,5 g/l, KH2PO4 0,5 g/l, MgSO47H2O 1,25 g/l, CaCl26H2O 0,15 g/l, NaHCO3 1,5 g/l, Tween 80 1 ml, Hemin 0,05 g/l und Cystein HCl 0,8 g/l. Das Medium wurde mittels einer peristaltischen Pumpe in V1 und von dort durch eine Reihe von Schläuchen in V2 und V3 geleitet. Das System wurde mit einer Rückhaltezeit von etwa 36 Stunden betrieben. Man ließ das Darmmodell zwecks Äquilibrierung vor dem Einschalten der Mediumpumpe über Nacht stehen, ließ es vor Zugabe des das Testsubstrat enthaltenden Mediums mindestens 10 Tage lang laufen und ließ es dann erneut für 10 Tage stehen. Proben wurden jeweils zu Beginn und am Ende der Zyklen entnommen. Das entnommene Probenvolumen betrug 5 ml; diese Menge wurde zur Zählung der Bakteriengruppen verwendet.
  • Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH)
  • Die Bewertung der Unterschiede zwischen den Bakterienpopulationen erfolgte durch Einsatz von FISH mit Oligonukleotidsonden, die so konzipiert sind, dass sie diagnostische Regionen von 16S-rRNA avisieren. Sie wurden kommerziell synthetisiert und mit dem fluoreszierenden Farbstoff Cy3 (von Eurogentec UK Ltd.) markiert. Die verwendeten Molekularsonden sind in Tabelle 1 dargestellt. Für die Zählung der Gesamtbakterienzahl wurde die Nukleinsäurefarbe 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) verwendet. Die aus den Gärtanks gewonnenen Proben wurden mit 4% w/v Paraformaldehyd verdünnt und über Nacht bei 4 °C fixiert. Anschließend wurden die Zellen mit 1500 × g 5 Minuten lang zentrifugiert, zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,1M, pH 7,0) gewaschen, in einem Gemisch aus PBS und 99% Ethanol (1:1, w/v) erneut suspendiert und bei –20 °C mindestens eine Stunde lang aufbewahrt. Dann wurde die Zellsuspension dem Hybridisierungsgemisch zugesetzt und dieses über Nacht zur Hybridisierung bei der geeigneten Temperatur für die jeweilige Sonde stehen gelassen. Das hybridisierte Gemisch wurde mittels eines 0,2 μm großen Isopore-Membranfilters (Millipore Corporation, Herts, UK) vakuumfiltriert. Der Filter wurde entfernt, auf einen gläsernen Objektträger mit SlowFade (Molecular Probes, Eugan, OR, USA) platziert und unter einem Fluoreszenzmiskroskop (Nicon Eclipse, E400) untersucht. Die DAPI-gefärbten Zellen wurden unter UV-Licht untersucht, die hybridisierten Zellen durch einen DM510-Filter. Pro Objektträger wurden mindestens 15 verschiedene Gesichtsfelder gezählt.
  • Tabelle 1. Oligonukleotidsonden zur Charakterisierung der Darmmikroflora mittels FISH
    Figure 00130001
  • ERGEBNISSE
  • Tabelle 2. Mittels FISH in einem in vitro-Darmmodell bestimmte Bakterienpopulationen bei Verwendung kommerzieller GOS (Vivinal (RTM)) als Substrat (7 g/d)
    Figure 00130002
  • Tabelle 3. Mittels FISH in einem in vitro-Darmmodell bestimmte Bakterienpopulationen bei Verwendung der erfindungsgemäßen synthetisierten GOS als Substrat (7 g/d)
    Figure 00140001
  • SCHLUSSFOLGERUNG
  • Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dass das erfindungsgemäße GOS-Gemisch bessere präbiotische Eigenschaften (d.h. einen höheren Anstieg der Bifidobakterien und eine Abnahme der Bacteroides) als das kommerzielle GOS-Äquivalent aufweist (siehe Tabelle 2). Die präbiotische Wirkung war in Gartänk 1 (V1) und 2 (V2) stärker, was dadurch erklärt wird, dass die erfindungsgemäßen GOS aus Oligosacchariden eines geringen Molekulargewichts bestehen.
  • Beispiel 4
  • Methylierungsanalyse
  • Gemäß Beispiel 1 hergestellte Galactooligosaccharid-Syntheseprodukte wurden mittels Gelfiltration auf einer Biogel P2-Säule (Pharmacia) bei 3 ml/min–1 mit Wasser eluiert und gereinigt.
  • Die Bindungspositionen der entsprechenden Galactooligosaccharid-Präparate wurden mittels Methylierungsanalyse bestimmt. Die gefriergetrockneten Proben (5–6 mg) wurden nach dem Spülen mit Argon in trockenem Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 20 °C 16 Stunden lang dispergiert. Sie wurden durch die aufeinander folgende Zugabe von pulverförmigem Natriumhydroxid (0,5 g) und Jodmethan (4 ml) methyliert (Ciucanu und Kerek, 1984; MacCormick et al., 1993). Nach der Eluierung/Extraktion auf einer C18-Kartusche (Sep-Pak, Waters, Watford, UK) wurden die methylierten Kohlehydrate getrocknet, in CHCl3/CH3OH (1:1, Vol.-%) extrahiert und bis zur Trockne verdampft. Die Proben wurden mit Trifluoressigsäure hydrolysiert (Blakeney et al., 1983) und durch NaBD4-Reduktion und Acetylierung mit Essigsäureanhydrid und N-Methylimidazol in teilweise methylierte Alditolacetate (PMAA) umgewandelt (Albersheim et al., 1967).
  • Die PMAA wurden mittels Gelchromatographie auf einer Säule mit kreuzgebundenem Cyanopropylmethyl und Phenylmethylpolysiloxan (50%:50%) (Thames Chromatography, Maidenhead, UK) mit Flammenionisationsdetektor und einem Temperaturprogramm (55 °C (2 min), +45 °C min–1 (1,9 min), 140 °C (2 min), +2 °C min–1 (35 min), 210 °C (40 min)) analysiert. Die PMAA wurden durch Messung ihrer Rückhaltezeiten in Relation zu Myoinositolhexaacetat und Vergleich der relativen Rückhaltezeiten mit denen externer Standards identifiziert. Durch absichtliche Methylierung von Methylglycosiden wurde ein Standardgemisch für jeden Zucker hergestellt (Doares et al., 1991). Die Peakflächen wurden mittels wirksamer Kohlenstoff-Responsefaktoren als relative Molmengen dargestellt (Sweet et al., 1975).
  • Die Identität der PMAA wurde durch ihre Elektronenionisationsmassenspektren bestätigt (Carpita und Shia, 1989). Bei einer Ausgangstemperatur von 200 °C und einem Ionisationspotential von 70 eV wurde eine GC-MS-Analyse auf einem identischen, mit einem Fisons Analytical Trio 1S Massenspektrometer in Reihe geschalteten GC durchgeführt.
  • Zur Bestimmung der anomeren Konfiguration des Syntheseproduktes wurden die Oligosaccharide unter den vorgeschlagenen optimalen Bedingungen 30 Minuten lang mit α-Galactosidase oder β-Galactosidase (Melibiase, Sigma) behandelt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels HPLC analysiert.
  • Ergebnisse
  • Gemäß der obigen Analyse ist die Oligosaccharidstruktur für die Tetrasaccharidfraktion schätzungsweise Gal (β1-6)-Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc, für die Trisaccharidfraktion schätzungsweise Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc, Gal (β1-3)-Gal (β1-4)-Glc und für die Disacchardifraktion schätzungsweise Gal (β1-4)-Glc (Lactosesubstrat), Gal (β1-3)-Glc, Gal (β1-3)-Gal, Gal (β1-6)-Gal, Gal (α1-6)-Gal (Galabiose).
    Gal: Galactose, Glc: Glucose
  • Literatur
    • 1. Albersheim P.D., D.J. Nevins, P.D. English und A. Karr, 1967. A method for the analysis of sugars on plant cellwall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydr Res 5:340–345
    • 2. Blakeney A.B., P.J. Harris, R.J. Henry und B.A. Stone, 1983. A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydr Res 113: 291–299
    • 3. Carpita N.C. und E.M. Shia, 1989. Linkage structure of carbohydrates by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS) for partially methylated alditol acetates, S. 157–216. In C.J. Biermann und G.D. Mc Ginnis (Hrsg.) Analysis of carbohydrates by gas-liquid chromatography and mass spectroscopy. CRC Press Boca Raton, Florida
    • 4. Ciucanu I. und F. Kerek, 1984. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res 131: 209–217
    • 5. Doares S.H., P. Albersheim und A.G. Darvill, 1991. An improved method for the preparation of standards for the glycosyl-linkage analysis of complex carbohydrates. Carbohydr Res 210: 311–317
    • 6. MacCormick C.A., J.E. Harris, A.P. Cunning und V.J. Morris, 1993. Characterization of a variant of polysaccharide acetan produced by a mutant of Acetobacter xylinum strain CR 1/4. J Appl Bacteriol 74: 196–199
    • 7. Sweet D.P., R. Shapiro und P. Albersheim, 1975. Quantitative analysis by various GLC response-factor theories for partially methylated and partially ethylated alditol acetates. Carbohydr Res 40: 217–225
  • Beispiel 5
  • Materialien und Verfahren
  • Die HT29-Zelllinie wurde von der European Collection of Cell Cultures for Applied Microbiology and Research bezogen. Das Zellausgangsmaterial wurde bei 37 °C in angefeuchtetem 5% CO2 in einem Standardmedium mit DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) eines hohen Glucoseanteils, das mit 5 Vol.-% fötalem Rinderserum (FBS), 100 mM Penicillin, 0,1M Streptomycin, nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA × 100) und 200 mM a-Glutamin versetzt war, kultiviert. Die Zellen wurden alle 48 Stunden mit dem Nährmedium versorgt und vor Erreichen der Konfluenz passiert.
  • Oligosaccharidempfindlichkeitstest
  • Für den Oligosaccharidempfindlichkeitstest nach Olano-Martin et al., 2003 wurde ein Serumstandardmedium (1 vo1.-%) mit unterschiedlichen Oligosaccharidkonzentrationen (0,01, 0,1, 1, 10, 100 mM) verwendet. Die Zellen wurden täglich mit dem experimentellen Medium (das das Oligosaccharid von Interesse enthielt) versorgt und die anhaftenden Zellen durch Entfernung der experimentellen Medien und Abwaschen der Zellen mit Ca++-freier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7, 9,6 gl–1) gemessen. Anschließend wurden die anhaftenden Zellen trypsiniert und mit der gleichen Menge Serumstandardmedium neutralisiert. Die Zellsuspension wurde mit Isoton II verdünnt und die Zellen in einem Coulter-Zähler gezählt. Der Prozentsatz des Zellüberlebens wurde wie folgt berechnet (1): % Überleben = (mittleres Absorptionsmaß der behandelten Zellen/mittleres Absorptionsmaß der Kontrolle) × 100
  • Anhafttest
  • In Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen wurden unter Verwendung des Standardmediums HT29-Zellen bis zu > 90% Konfluenz gezüchtet. Vor Durchführung des Tests wurden die Zellen zuletzt mit antibiotikafreiem Medium versorgt.
  • In anitibiotikafreiem Zellkulturmedium wurden für mindestens drei Subkulturen anaerob Krankheitserreger gezüchtet. Am Tag des Tests wurde frisches, zuvor reduziertes Gewebekulturmedium mit 10% einer über Nacht gewachsenen Erregerkultur beimpft und vor dem Test 4 Stunden lang inkubiert.
  • Es wurde eine Stammlösung der Testoligosaccharide in einer Konzentration von 5M in phosphatgepufferter Kochsalzlösung hergestellt und filtersterilisiert.
  • Es wurde eine 1:1000-Verdünnung der 4 Stunden lang inkubierten Erregerkultur in PBS hergestellt und mittels Plattenzählung gezählt. Das Medium wurde von der Gewebekulturplatte abgesaugt und die Zellen einmal in PBS (1 ml) gewaschen.
  • Pro Testoligosaccharid wurden drei Vertiefungen mit 0,5 ml Oligosaccharidlösung (5M) versetzt. Als Kontrolle diente phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Oligosaccharide. Allen Vertiefungen wurden 0,5 ml der Kultursuspension zugesetzt, die Platte vermischt und aerob 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
  • Die Kultur wurde abgesaugt und alle Vertiefungen wurden dreimal in steriler PBS (1 ml pro Vertiefung) gewaschen. Nach dem letzten Waschgang wurde die PBS abgesaugt und jede Vertiefung mit 70 μl Trypsin/EDTA-Lösung versetzt, gemischt und 5 Minuten lang bei 37 °C stehen gelassen.
  • Die Vertiefungen wurden jeweils mit 1 ml PBS versetzt und mit Hilfe einer Pipette gemischt, um sicherzustellen, dass alle Zellen vom Boden der Vertiefung entfernt und Klümpchen zerkleinert wurden.
  • 1 ml der Zellsuspension wurde in eine Universalflasche mit MRD (MRD = Maximum Recovery Diluent) pipettiert und ggf. weiter verdünnt. Die Verdünnungen wurden auf Plattenzählagar (PCA) verstrichen und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
  • Nach der Inkubation wurden die Kolonien gezählt und die Inhibition der Anhaftung als Verhältnis der Bakterien in der Probe (cfu, ml–1) zu der Kontrolle (PBS) berechnet (2).
  • SCHLUSSFOLGERUNG
  • Die in 2 dargestellten Ergebnisse deuten auf eine starke Inhibition der Anhaftung von E. coli EPEC und S. typhimurium in Gegenwart der Disaccharidfraktion hin, wobei die Inhibition auch in dem GOS-Gemisch auftritt. In Gegenwart einer höheren Fraktion als der Trisaccharidfraktion des Gemisches gegen S. typhimurium ist die Antihaftwirkung geringer.
  • Der Oligosaccharidempfindlichkeitstest wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Oligosaccharidgemisch für HT29-Zellen nicht toxisch ist (1).
  • Literatur
    • Olano-Martin E., Williams M.R., Gibson G.R., Rastall R.A. 2003. Pectins and pectic oligosaccharides inhibit Escherichia coli O157 : H7 Shiga toxin as directed towards the human colonic cell line HT29. FEMS Microbiol Letters 218(1):101–105
  • 1. Zellüberleben nach Zugabe verschiedener Oligosaccharidkonzentrationen (0,01 bis 100 mM) nach 24- und 48-stündiger Inkubation
    Oligosaccharidempfindlichkeitstest
    Zellüberlebensfähigkeit
    Kontrolle
    Oligosaccharid mM
  • 2. Wirkung des Oligosaccharidgemisches (ALL) und der verschiedenen Fraktionen des Gemisches auf die Anhaftung von E. coli EPEC, E. coli VTEC und Salmonella typhimurium an HT29-Zellen
    Wirkung der Oligosaccharidfraktionen auf die Bakterienanhaftung
    Bakterienanhaftung relativ zum Impfmaterial
    PBS-Kontrolle
    Oligosaccharidfraktion
  • Beispiel 6
  • Das in dieser Untersuchung verwendete GOS-Produkt wurde wie zuvor beschrieben (Beispiel 1) hergestellt; das Inulin wurde von Orafti (Belgien) bezogen.
  • Von JSR Genetics Ltd., Southburn, Driffield, Yorkshire, Y025 9ED wurden 40 lebende entwöhnte männliche Schweine erworben.
  • Bei Ankunft in der Universität Reading wurden die Schweine über einen Zeitraum von sieben Tagen in vier Gruppen von jeweils zehn Schweinen untergebracht, um den Schweinen Zeit zu geben, nach dem Transport zur Ruhe zu kommen und sich an die Anlage und das Futter zu gewöhnen. Das Durchschnittsgewicht der Schweine betrug bei ihrer Ankunft 14,70 kg.
  • Nach der 7-tägigen Akklimatisierungsphase wurden die Schweine innerhalb der Anlage in Einzelkoben überführt. Das Durchschnittsgewicht der Schweine in den Einzelkoben betrug 17,46 kg.
  • Die Schweine wurden anhand einer einzigartigen Ohrtätowierung identifiziert und mittels einer wasserfesten Viehmarkierung einzeln nummeriert. Die Koben erhielten jeweils dieselbe Identifikationsnummer, mit der die Schweine markiert wurden.
  • Jeweils zehn Schweine wurden einer von vier Diäten zugeordnet: einer Kontrolldiät (NEG), einer mit 1,6 Gew.-% GOS (hergestellt nach Beispiel 1) ergänzten Kontrolldiät, einer mit 4 Gew.-% GOS ergänzten Kontrolldiät oder einer mit 1,6 Gew.-% Inulin ergänzten Kontrolldiät.
  • Die Schweine lagen während der gesamten Studie auf Sägemehl; für eine abwechslungsreiche Umgebung wurde außerdem Stroh bereitstellt sowie Spielzeug gegen die Langeweile.
  • Während der gesamten Studie erhielten die Schweine Deltawean 15 NGP-Pellets (ABN, ABN House, Postfach 250, Oundle Rd, Woodston, Peterborough, PE 9QF), eine Kom-plettnahrung zur Fütterung ad libitum in der Schweinezucht.
  • Nährstoff/Mineralien-Zusammensetzung von Deltawean 15 NGP
    Figure 00210001
  • Das Schweinefutter enthielt außerdem Antioxidantien, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT) und Ethoxychin.
  • Zwar wurden die Schweine nach dem Zufallsprinzip einer Behandlung zugeordnet, doch zwei oder drei Schweine, die dasselbe Futter erhielten, wurden innerhalb des Kobenbereiches derselben Gruppe einzeln untergebracht. Die Schweine wurden auf diese Weise gruppiert, um ein Confounding der Behandlungen zu verhindern, sollten Schweine aus den Einzelkoben entweichen (sie könnten nur Futter fressen, das die richtige Diätbehandlung für diese speziellen Schweine enthält). Die einzeln – in Gruppen von zwei oder drei Tieren – untergebrachten Schweine, die dasselbe Futter erhielten, wurden innerhalb der Anlage nach dem Zufallsprinzip ausgewählt.
  • Zu Beginn und nach 4-wöchiger Verfütterung der Testdiäten wurden von jedem Schwein Kotproben genommen und, wie zuvor beschrieben (Beispiel 3), mittels FISH (Tabelle 4) Mikrobenpopulationen im Kot bestimmt. Am Ende des Experimentes wurden die Schweine geschlachtet, so dass man Proben des Inhalts des proximalen und distalen Kolons erhielt. Es wurden pH-Wert (Tabelle 5), kurzkettige Fettsäuren (SCFA) (Tabelle 6) und Mikrobenpopulationen (Tabelle 7) im Inhalt des proximalen und distalen Kolons bestimmt. Die Daten sind als Mittel ± Standardabweichung dargestellt. Die Unterschiede wurden mit Hilfe des Student-t-Tests analysiert. Die Unterschiede galten bei p < 0,05 als signifikant.
  • Tabelle 4. Wirkung der präbiotischen Behandlung und Diät auf die Mikrobenpopulation im Kot von Schweinen zu Beginn und nach 4-wöchiger Testphase
    Figure 00220001
  • cfu log10/g Kot. Jeder Wert ist das Mittel ± Standardabweichung, * n = 40, ✝ n = 10. Die Unterschiede wurden mit Hilfe des Student-t-Tests analysiert. Mittel in einer Reihe mit hochgestellten Zeichen signifikant unterschiedlich (p < 0,05) a zu NEG, b zu GOS 1,6%, ° zu Zeit 0.
  • Tabelle 5. Wirkung der präbiotischen Behandlung und Diät auf den pH-Wert der Proben des Inhalts des proximalen und distalen Kolons
    Figure 00230001
  • Jeder Wert ist das Mittel ± Standardabweichung, n = 10. Die Unterschiede wurden mit Hilfe des Student-t-Tests analysiert. Mittel in einer Reihe mit hochgestellten Zeichen signifikant unterschiedlich (p < 0,05) a zu NEG, b zu GOS 1,6%,c zu Inulin.
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001
  • SCHLUSSFOLGERUNG
  • Tabelle 5: Es kommt in Gegenwart von GOS (bei 1,6% und insbesondere bei 4%) zu einem Abfall des pH-Wertes im proximalen Kolon, was in Kombination mit den SCFA-Daten (Tabelle 6) darauf hinweist, dass das GOS-Produkt den proximalen Kolon erreicht (Vergärungsprodukte haben zugenommen).
  • Tabelle 7: Die Gegenwart von GOS (4%) zeigt eine signifikante Zunahme der Anzahl zuträglicher Bakterienpopulationen (Bifidobakterien, Laktobakterien) im proximalen Kolon. Diese Zunahme der Populationszahl ist im distalen Teil und in den Kotproben geringer, was sich dadurch erklären lässt, dass das GOS-Produkt hauptsächlich im proximalen Kolon vergoren zu werden scheint. Die Behandlung mit 1,6% GOS zeigte ähnliche Trends.
  • Die Zunahme der Anzahl von Bifidobakterienpopulationen im proximalen Kolon zeigt sich auch in der zunehmenden Produktion von Essigsäure (Hauptvergärungsprodukt der Bifidobakterien). Dies deutet darauf hin, dass das GOS-Produkt gegenüber Bifidobakterienspezies sehr selektiv ist.
  • Beispiel 7 Fallstudien
  • Fallstudie 1 – Entzündliche Darmerkrankung (IBD)
  • Eine 43-jährige Patientin mit diagnostizierter ulzeröser Kolitis (einer der beiden Hauptformen von IBD) wird als Fallstudie über die Wirkung des nach Beispiel 1 hergestellten GOS-Produktes genannt.
  • Die Patientin litt seit 5 Jahren an ulzeröser Kolitis und nahm vor bzw. während des Testzeitraumes keine Medikamente ein. Zuvor war der Entzündungshemmer Sulphasalazin eingenommen worden, jedoch ohne positive Wirkung. Die Patientin hatte Schwierigkeiten bei der Nahrungsverdauung, führte eine Standarddiät durch, litt unter Übelkeit, Durchfall und Bauchschmerzen. Letztere traten im Dickdarm links auf, was mit der Diagnose einer Kolitis auf der Basis einer Entzündung des absteigenden Kolons korrelierte.
  • Sie nahm eine GOS-Gesamttagesdosis von 7 g/d (in zwei Einzeldosen) ein. Nach 4-tägiger Einnahme begannen sich die Symptome zu bessern. Die Patientin konnte ihre Nahrung besser verdauen, die Bauchschmerzen nahmen langsam ab und die Übelkeit ging zurück. Zwar erfolgte keine klinische Analyse mittels Endoskopie, dennoch war das Wohlbefinden der Patientin deutlich verbessert. Die einzige Änderung der Diät bestand im Zusatz von GOS. Sechs Wochen später hielt diese Wirkung noch immer an.
  • Diese Fallstudie ist zwar keine placebo-kontrollierte Studie mit mehreren Patienten, doch sie belegt an einem Einzelfall die positive Wirkung von präbiotischen GOS bei einer Hauptform von IBD.
  • Fallstudie 2 – Reizdarmsyndrom (IBS)
  • Ein 27-jähriger Mann, der seit 3 Jahren an IBS litt, nahm 3 Wochen lang 7 g/d der nach Beispiel 1 hergestellten GOS in zwei Einzeldosen ein. Vor diesem Zeitraum litt er unter Völlegefühl, Verstopfung, Bauchschmerzen und Müdigkeit, klassischen Symptomen der IBS. Der Patient hatte 6 Monate lang keine Antibiotika eingenommen und ernährte sich weizen/gluten- und zuckerfrei.
  • Nach Einnahme des Präbiotikums besserten sich seine Symptome innerhalb von 3 Tagen deutlich; diese Wirkung hielt an. Der Proband berichtet von einer dramatischen Besserung seines Gesamtbefindens und seiner Bauchgesundheit: „Ich könnte jetzt einen Marathon laufen." Er kann sich jetzt ohne Schwierigkeiten normal ernähren.
  • Dieser Bericht ist keine kontrollierte Studie, belegt aber an einem Einzelfall, dass GOS IBS verbessern und eine bessere Lebensqualität für den Patienten wiederherstellen kann.

Claims (17)

  1. Unter der Anschaffungsnummer NCIMB 41171 bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Großbritannien am 31. März 2003 hinterlegter Bifidobacterium bifidum-Stamm, der eine Galactosidase-Enzymaktivität erzeugt, die Lactose in ein Galactooligosaccharid-Gemisch aus Disaccharid Gal (α1-6)-Gal, mindestens einem Trisaccharid ausgewählt aus Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc, Gal (β1-3)-Gal (β1-4)-Glc, Tetrasaccharid Gal (β1-6)-Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc und Pentasaccharid Gal (β1-6)-Gal (β1-6)-Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc umwandelt.
  2. Stamm nach Anspruch 1, bei dem das Galactooligosaccharid-Gemisch 20 bis 35% w/v Disaccharid, 20 bis 35% w/v Trisaccharid, 15 bis 25% w/v Tetrasaccharid und 10 bis 20% w/v Pentasaccharid umfasst.
  3. Galactooligosaccharid-Zusammensetzung zur Förderung des spezifischen Wachstums von Bifidobakterien, die als wirksame Bestandteile ein Gemisch aus Disaccharid Gal (α1-6)-Gal, mindestens einem Trisaccharid ausgewählt aus Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc, Gal (β1-3)-Gal (β1-4)-Glc, Tetrasaccharid Gal (β1-6)-Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc und Pentasaccharid Gal (β1-6)-Gal (β1-6)-Gal (β1-6)-Gal (β1-4)-Glc enthält.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, die 20 bis 35% w/v Disaccharid, 20 bis 35% w/v Trisaccharid, 15 bis 25% w/v Tetrasaccharid und 10 bis 20% w/v Pentasaccharid umfasst.
  5. Zusammensetzung zur Verbesserung der Darmgesundheit, die eine Kultur des Bifidobacterium bifidum-Stammes nach Anspruch 1 oder 2 in Kombination mit der Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4 umfasst.
  6. Zusammensetzung zur Förderung des Wachstums des Bifidobakteriums nach einem der Ansprüche 3 bis 5 zur Verwendung bei einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Menschen oder eines Tieres.
  7. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 5 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verhinderung des Anhaftens von Krankheitserregern oder von Krankheitserregern erzeugten Toxinen an der Darmwand.
  8. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 5 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Wiederherstellung einer normalen Darmflora nach einer antibiotischen Behandlung oder einer Operation.
  9. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 5 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Darmkrankheiten, z.B. entzündlicher Darmerkrankung oder Reizdarmsyndrom.
  10. Verwendung eines Bifidobacterium bifidum-Stammes nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung des Galactooligosaccharid-Gemisches nach Anspruch 3 oder 4.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Galactooligosaccharid-Gemisch Teil eines Produktes zur Verbesserung der Darmgesundheit ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Produkt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Milchprodukten, Getränken, Babynahrung, Cerealien, Keksen, Konfekt, Kuchen, Nahrungsergänzungsmitteln, dietätischen Lebensmitteln, Tiernahrung, Geflügelfutter oder anderen Nahrungsmitteln oder Getränken.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Milchprodukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Flüssigmilch, getrocknetem Milchpulver, Milchpulver (Vollmilch), Milchpulver (Magermilch), Milchpulver (mit Fettzusatz), Molkepulver, Babymilch, Eiscreme, Yoghurt, Käse und fermentierten Milchprodukten.
  14. Verfahren zur Herstellung einer Substanz zur Förderung des Wachstums von Bifidobakterien, dadurch gekennzeichnet, dass Lactose oder ein lactosehaltiges Material mit einem Bifidobacterium bifidum-Stamm nach Anspruch 1 oder 2 behandelt wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das lactosehaltige Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus im Handel erhältlicher Lactose, Vollmilch, Halbfettmilch, Magermilch, Molke und Milch mit Fettzusatz.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Milch von Rindern, Büffeln, Schafen und Ziegen stammt.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, bei dem die Substanz nach Entfernung der Bifidobacterium bifidum-Zellen sprühgetrocknet wird, so dass ein Pulver entsteht.
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