JP2017018135A - ガラクトオリゴ糖含有組成物およびそれを生産する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ガラクトオリゴ糖を含有する組成物を生産する方法、及び、ガラクトオリゴ糖含有組成物の提供。
【解決手段】１またはそれ以上のガラクトオリゴ糖を含有する組成物を生産する方法であって、ａ）ガラクトシル供与体、及び、ガラクトシル受容体が特定の割合で含む混合物を提供する段階、ｂ）β−ガラクトシダーゼ活性を有し、最大でも０．６のＴ値を有する酵素を提供して、前記酵素を前記混合物と接触させる段階、（ここで、Ｔ値＝生産されたガラクトースの量（モル）／使用されたラクトースの量（モル）である）、及び、ｃ）酵素により放出させたガラクトシル供与体のガラクトシル基をガラクトシル受容体に転移させることで、ガラクトオリゴ糖を含有する組成物を得る段階、を含む方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ガラクトオリゴ糖含有組成物ならびにそれを生産する効率的な方法に関する。

ヒトの母乳は、母乳で育てられる乳児の有益な健康効果の一部の原因とされる、多くの異なるオリゴ糖類を含むことが知られている（Ｋｕｎｚ ｅｔ ａｌ．（２０００））。例えば、ＦＯＳ、ＧＯＳまたはイヌリンなどの一部のオリゴ糖類はいわゆるプレバイオティクスであり、プレバイオティクスとは、それらが胃腸系の有益な細菌を促進し、有害な細菌を嫌うことを意味する。オリゴ糖類は、それらの健康促進効果のゆえに、乳児用調製粉乳および臨床栄養などの機能性食品において頻繁に使用される。

オリゴ糖類の生産にはいくつかのアプローチがある。１つのアプローチは、天然に生じる供給源からオリゴ糖を単離することに基づく。フルクトースオリゴ糖（ＦＯＳ）およびイヌリンは、例えばキクイモ（エルサレムアーティチョーク）、ゴボウ、チコリ、リーキ、タマネギおよびアスパラガス中で天然に認められ、これらの作物から単離し得る。チコリの根からのイヌリンの調製は、例えばＦｒａｎｋ（２００２）に述べられている。オリゴ糖類の生産へのこのアプローチは、適切な作物の利用可能性によって限定され、またより複雑なオリゴ糖類を実現することは不可能であると考えられる。

別のアプローチは、酵素がオリゴ糖類の合成を触媒する酵素的合成に基づく。Ｙｕｎ（１９９６）は、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を使用し、スクロースを酵素のための基質として用いるフルクトオリゴ糖の酵素的生産を述べている。酵素的合成の別の例は国際公開第０１／９０，３１７号に記載されており、これは、特別なβ−ガラクトシダーゼ酵素を使用し、ラクトースを基質として用いて式Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃのガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生産する方法を開示する。

国際公開第０１／９０，３１７号

本発明の１つの目的は、ガラクトオリゴ糖を生産する改善された方法を提供することである。さらに、ガラクトオリゴ糖を含有する改善された組成物を提供することが本発明の１つの目的である。

本発明人は、驚くべきことに、β−ガラクトシダーゼ活性を有し、好ましくは最大でも０．９のＴ値を有する酵素が、ガラクトシル受容体がガラクトシル供与体とは異なる、特別な型のガラクトオリゴ糖の極めて有効な合成のために使用できることを認めた。

したがって、本発明の一態様は、１またはそれ以上のガラクトオリゴ糖を含有する組成物を生産する方法であって、
ａ）−脱離基に結合したガラクトシル基を含むガラクトシル供与体、
−ガラクトシル供与体とは異なるガラクトシル受容体
を含む混合物であって、ガラクトシル受容体とガラクトシル供与体のモル比が少なくとも１：１０であり、少なくとも０．０５モル／Ｌのガラクトシル受容体を含む混合物を提供する段階、
ｂ）β−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素を提供し、前記酵素を混合物と接触させる段階、
ｃ）酵素にガラクトシル供与体の脱離基を放出させ、ガラクトシル供与体のガラクトシル基をガラクトシル受容体に転移させて、このようにしてガラクトオリゴ糖を形成し、それにより１またはそれ以上のガラクトオリゴ糖を含有する組成物を得る段階
を含む方法に関する。

本発明は、高い収率での、複雑なガラクトオリゴ糖組成物の安価で効率的な生産を開発する。本発明はさらに、組成物から除去するには費用のかかる望ましくない副産物を生じさせ得る、ガラクトシル供与体の自己ガラクトシル化の程度を低減すると思われる。

好ましくは、酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性に加えてトランスガラクトシル化活性を有する。また、酵素が最大でも０．９のＴ値を有することも好ましいと考えられる。

本発明に関連して、β−ガラクトシダーゼ酵素の「トランスガラクトシル化活性」という用語は、酵素が供与体分子、例えばラクトース分子からガラクトシル基を非水分子、例えば別のラクトース分子に転移する能力に関する。

Ｔ値は、ラクトースをガラクトシル供与体および受容体の両方として使用するβ−ガラクトシダーゼ酵素のトランスガラクトシル化効率の尺度である。β−ガラクトシダーゼ酵素のＴ値の測定は、実施例２で述べるアッセイおよび式に従って実施される。Ｔ値は、式：
Ｔ値＝生産されたガラクトースの量（モル）／使用されたラクトースの量（モル）
を用いて計算される。

トランスガラクトシル化活性を全く有さないラクターゼ酵素は、各々の使用されたモルのラクトースについて１モルのガラクトースを生産し、１のＴ値を有する。極めて高いトランスガラクトシル化活性を有するβ−ガラクトシダーゼは、ラクトースからのほとんどすべてのガラクトシル基を、ガラクトースを生成する代わりにトランスガラクトシル化のために使用し、その結果として０に近いＴ値を有する。

さらに、本発明の一態様は、１またはそれ以上のガラクトオリゴ糖を含有する組成物に関し、前記組成物は本明細書で述べる方法によって得られる。

本発明のさらなる目的および利点を以下で述べる。

図１−ａは、酵素と共にインキュベートする前の実施例３で述べる混合物（ラクトースおよびＬ−フコースを含む）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１−ｂは、酵素と共にインキュベートした後の実施例３の混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、Ｌ−フコース含有ガラクトオリゴ糖のピーク（ピーク６、７および８）が明確に存在する。 酵素反応の間の実施例３の混合物のラクトース、グルコースおよびガラクトースの濃度（任意単位）のプロットを含む。 酵素反応の間の実施例３の混合物のオリゴ糖、Ｇａｌ−Ｆｕｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ／Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ／Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃの濃度（任意単位）のプロットを含む。 酵素反応の間の実施例４の混合物のオリゴ糖、Ｇａｌ−Ｆｕｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ／Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ／Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃの濃度（任意単位）のプロットを含む。 酵素反応の間の実施例５の混合物のオリゴ糖、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ／Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ／Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃの濃度（任意単位）のプロットを含む。 酵素反応の間の実施例６の混合物のオリゴ糖、Ｇａｌ−Ｘｙｌ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ／Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ／Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃの濃度（任意単位）のプロットを含む。

上述したように、本発明の一態様は、１またはそれ以上のガラクトオリゴ糖を含有する組成物を生産する方法であって、
ａ）−脱離基に結合したガラクトシル基を含むガラクトシル供与体、
−ガラクトシル供与体とは異なるガラクトシル受容体
を含む混合物であって、ガラクトシル受容体とガラクトシル供与体のモル比が少なくとも１：１０であり、少なくとも０．０５モル／Ｌのガラクトシル受容体を含む混合物を提供する段階、
ｂ）β−ガラクトシダーゼ活性を有し、好ましくは最大でも０．９のＴ値を有する酵素を提供し、前記酵素を混合物と接触させる段階、および
ｃ）酵素にガラクトシル供与体の脱離基を放出させ、ガラクトシル供与体のガラクトシル基をガラクトシル受容体に転移させて、このようにしてガラクトオリゴ糖を形成し、それにより１またはそれ以上のガラクトオリゴ糖を含有する組成物を得る段階
を含む方法に関する。

本発明に関連して、「グリコシル基」という用語は、単糖または二糖もしくは三糖などの低分子量オリゴ糖から、または対応する糖アルコールから１または２個のヒドロキシル基を除去することによって得られる基に関する。この用語は、本明細書ではガラクトシル供与体、ガラクトシル受容体およびオリゴ糖の様々な構築ブロックを表すために使用される。

最も一般的な糖類の略語およびそれらの対応するグリコシル基を以下に示す。

本発明に関連して、「オリゴ糖」という用語は、異なるかまたは同じ型であってよい少なくとも２個のグリコシル基、好ましくは少なくとも３個のグリコシル基を含む分子に関する。少なくとも２個のグリコシル基は、好ましくはＯ−グリコシル結合によって結合されている。オリゴ糖は、グリコシル基の直鎖であり得るかまたは分枝構造を有し得る。オリゴ糖は、例えば化学量論式、例えば（Ｇａｌ）３Ｇｌｃとして、または一般式、例えばＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−ＧａｌもしくはＧａｌ−（Ｇａｌ−）Ｇｌｃ−Ｇａｌとして表され得る。化学量論式は、オリゴ糖またはオリゴ糖の群がいずれのグリコシル基を含むかについての情報を提供するが、これらの相対的な位置に関する情報は提供せず、一方一般式は、グリコシル基の相対的な位置についての一般的な情報も含む。

本発明に関連して「ホモオリゴ糖」という用語は、１つだけの型のグリコシル基を含むオリゴ糖に関する。ホモオリゴ糖の例はＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌおよびＧｌｃ−Ｇｌｃ−Ｇｌｃである。

本発明に関連して「ヘテロオリゴ糖」という用語は、異なるグリコシル基を含むオリゴ糖、例えばＧａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃまたはＧａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃに関する。

本発明に関連して、「オリゴ糖」という用語と共に使用される「ガラクト」という接頭語は、オリゴ糖がガラクトシル基を反復単位として含むことを指示する。「ホモ」または「ヘテロ」という接頭語は、「ガラクト」という接頭語と共に使用され得る。Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌはどちらもガラクトオリゴ糖である。Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃはヘテロガラクトオリゴ糖であり、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌはホモガラクトオリゴ糖である。

本発明に関連して、「Ｘ」は、本明細書で定義されるガラクトシル受容体を表す。「−Ｘ」は、ガラクトシル受容体に対応するグリコシル基、特に別の基に結合したグリコシル基を表す。「−」は、結合を記号で表す。グリコシル基は、好ましくはグリコシル基の３、４、５または６位を介して、および好ましくはＯ−グリコシル結合によって結合されている。本発明に関連して、「Ｇａｌ−」は、好ましくはガラクトシル基の１位を介して、および好ましくはＯ−グリコシル結合によって別の基に結合したガラクトシル基を表す。

本発明に関連して、「−Ｇａｌ−」は、２つの他の基に結合したガラクトシル基を表す。左側の結合は、好ましくはガラクトシル基の４位または６位を介して、および好ましくはＯ−グリコシル結合によって行われる。右側の結合は、好ましくはガラクトシル基の１位を介して、および好ましくはＯ−グリコシル結合によって行われる。

２個のガラクトシル基の間の結合は、典型的には１−４または１−６結合であり、通常はＯ−グリコシル結合である。ガラクトシル基と窒素含有受容体の間の結合は、選択的にＮ−グリコシル結合であり得る。

本発明に関連して、「方法」および「工程」という用語は交換可能に使用される。

段階ａ）は、その中でオリゴ糖が生産される混合物を提供することを含む。

混合物は、好ましくは液体混合物であり、例えばガラクトシル受容体およびガラクトシル供与体を含む水溶液であり得る。

本発明の一部の実施形態では、段階ａ）の混合物のガラクトシル受容体とガラクトシル供与体のモル比は、少なくとも１：５、好ましくは少なくとも１：１、なお一層好ましくは少なくとも５：１である。例えば、段階ａ）の混合物のガラクトシル受容体とガラクトシル供与体のモル比は、少なくとも１０：１、例えば少なくとも１５：１であり得る。

段階ａ）の混合物のガラクトシル受容体とガラクトシル供与体のモル比は、例えば１：１０〜１００：１の範囲内であり得る。

本発明の一部の実施形態では、段階ａ）の混合物のガラクトシル受容体とガラクトシル供与体のモル比は、１：１０〜５０：１の範囲内、好ましくは１：５〜３０：１の範囲内、なお一層好ましくは１：１〜２０：１の範囲内である。例えば、段階ａ）の混合物のガラクトシル受容体とガラクトシル供与体のモル比は、例えば２：１〜４０：１の範囲内、好ましくは４：１〜３０：１の範囲内、なお一層好ましくは１０：１〜２５：１の範囲内であり得る。

上述したように、ガラクトシル供与体は、脱離基に共有結合したガラクトシル基を含む。ガラクトシル基は、好ましくはβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基である。さらに、ガラクトシル基は、好ましくはガラクトシル基の１位からＯ−グリコシド結合によって脱離基に結合している。

ガラクトシル供与体の脱離基は、例えばグリコシル基および／または糖アルコール基であり得る。脱離基が単糖または二糖または対応する糖アルコールのグリコシル基である場合、ガラクトシル基は、好ましくはガラクトシル基の１位からＯ−グリコシド結合によって脱離基に結合しており、前記結合は単糖型脱離基の４位または二糖型脱離基の４’位に連結する。

本発明に関連して、「Ｙおよび／またはＸ」という語句は、「Ｙ」または「Ｘ」または「ＹおよびＸ」を意味する。同様の論理で、「Ｘ１、Ｘ２、．．．Ｘｉ−１および／またはＸｉ」という語句は、「Ｘ１」または「Ｘ２」または．．．または「Ｘｉ−１」または「Ｘｉ」または成分の任意の組合せ：Ｘ１、Ｘ２、．．．Ｘｉ−１およびＸｉを意味する。

本発明の一部の実施形態では、ガラクトシル供与体は最大でも１０００ｇ／モルのモル重量を有する。例えば、ガラクトシル供与体は最大でも５００ｇ／モルのモル重量を有し得る。ガラクトシル供与体は最大でも３５０ｇ／モルのモル重量を有することが一層好ましいと考えられる。

二糖は、現在のところ好ましい型のガラクトシル供与体である。あるいはまたは付加的に、三糖もガラクトシル供与体として使用し得る。したがって、混合物は異なるガラクトシル供与体の組合せを含み得ることが想定される。

本発明の一部の好ましい実施形態では、ガラクトシル供与体はラクトースである。有用なガラクトシル供与体の別の例はラクツロースである。さらに、有用なガラクトシル供与体の一例はラクチトールである。

本発明に関連して「ラクトース」という用語は、乳糖とも称される、ウシ乳の最も主要な糖である二糖、β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースに関する。

ガラクトシル供与体は、任意の有用なガラクトシル供与体供給源によって、工業的に精製された供給源、例えば精製ラクトースおよび／または天然供給源、例えばホエー透過物、すなわち乳清の限外ろ過によって調製される脱タンパクホエーの両方によって提供され得る。

ガラクトシル受容体は、酵素からガラクトシル基を受け取ることができる任意の分子であり得、典型的にはヒドロキシル基、好ましくはアルコール性ヒドロキシル基を含む。「受け取る」という用語は、供与体のガラクトシル基が、例えばＯ−グリコシル結合によって、受容体に共有結合されることを意味する。

本発明の一部の実施形態では、ガラクトシル受容体は１またはそれ以上のアルコール性ヒドロキシル基を含む。例えば、ガラクトシル受容体はポリオールであり得る。

本発明に関連して「ポリオール」という用語は、少なくとも２個のアルコール性ヒドロキシル基を含む分子に関する。

本発明の一部の好ましい実施形態では、ガラクトシル受容体はラクトースではない。さらに、ガラクトシル受容体はグルコースでないことが好ましいと考えられる。

本発明の一部の好ましい実施形態では、ガラクトシル受容体はガラクトシル供与体とは異なる。ラクトースなどの比較的安価なガラクトシル供与体をガラクトシル供給源として使用し、フコースなどの生物学的に興味深い受容体をガラクトシル受容体として使用することが特に好ましい。

本発明の一部の実施形態では、ガラクトシル受容体は、ラクトース、ガラクトースまたはグルコースではない。

本発明の一部の実施形態では、ガラクトシル受容体は、グルコースまたは一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｉＧｌｃ［式中、ｉは負ではない整数、すなわち例えば０、１、２、３または４である］のオリゴ糖ではない。

本発明の一部の実施形態では、ガラクトシル受容体は、ガラクトースまたは一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｉＧａｌ［式中、ｉは負ではない整数である］のオリゴ糖ではない。

様々なモル重量を有するガラクトシル受容体を使用し得るが、少なくとも１００ｇ／モルのモル重量を有するガラクトシル受容体が現在のところ好ましい。

本発明の一部の実施形態では、ガラクトシル受容体は最大でも１０００ｇ／モルのモル重量を有する。例えば、ガラクトシル受容体は最大でも５００ｇ／モルのモル重量を有し得る。ガラクトシル受容体は最大でも３５０ｇ／モルのモル重量を有することがなお一層好ましいと考えられる。ガラクトシル受容体は、例えば最大でも２００ｇ／モルのモル重量を有し得る。

本発明の一部の好ましい実施形態では、ガラクトシル受容体は糖である。ガラクトシル受容体は、例えば単糖であり得る。あるいは、ガラクトシル受容体は二糖であり得る。

例えば、ガラクトシル受容体はペントースであり得る。ガラクトシル受容体は、例えばアラビノースであり得る。有用なペントースの別の例はキシロースである。さらに、有用なペントースの一例はリボースである。ガラクトシル受容体は、例えばアラビノース、キシロースおよびリボースから成る群より選択されるペントースであり得る。

ヘキソースは、有用なガラクトシル受容体の別の群である。ガラクトシル受容体は、例えばマンノースであり得る。有用なヘキソースの別の例はガラクトースである。さらに、有用なヘキソースの一例はタガトースである。有用なヘキソースのさらなる例はフルクトースである。ガラクトシル受容体は、例えばマンノース、ガラクトース、タガトースおよびフルクトースから成る群より選択されるヘキソースであり得る。

本発明の一部の好ましい実施形態では、ガラクトシル受容体はデオキシヘキソースである。ガラクトシル受容体は、例えばフコース、例えばＤ−フコース、Ｌ−フコースまたはそれらの混合物であり得る。

あるいは、ガラクトシル受容体は、例えば二糖または三糖などのオリゴ糖であり得る。有用な二糖の一例はマルトースである。有用な二糖の別の例はラクツロースである。
さらに、ガラクトシル受容体の１つの有用な群は糖誘導体である。

本発明に関連して「糖誘導体」という用語は、１またはそれ以上の非ヒドロキシル官能基を含む糖に関する。そのような官能基の例は、カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基および／またはチオール基である。１位にアルデヒド基または２位にケトン基を含む糖は、その糖が上述した非ヒドロキシル官能基のいくつかを含まない限り、糖誘導体とはみなされない。

有用な糖誘導体の一例はＮ−アセチルガラクトサミンである。有用な糖誘導体の別の例はシアル酸である。さらに、有用な糖誘導体の一例はシアリルラクトースである。したがって、ガラクトシル受容体は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸およびシアリルラクトースから成る群より選択される糖誘導体であり得る。

有用なガラクトシル受容体の別の群は糖アルコールである。したがって、本発明の一部の実施形態では、ガラクトシル受容体は糖アルコールである。有用な糖アルコールの例は、ソルビトール、キシリトール、ラクチトールおよび／またはマルチトールである。

上記のガラクトシル受容体と異なり、本発明人は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルコースがあまり効率的でないガラクトシル受容体であることを認めた。したがって、本発明の一部の実施形態では、ガラクトシル受容体はグルコースまたはＮ−アセチルグルコサミンではない。

混合物は、１番目の型のガラクトシル受容体とは異なる１またはそれ以上のさらなるガラクトシル受容体を含み得る。混合物の異なる型のガラクトシル受容体は、例えば本明細書で言及するガラクトシル受容体型の中から選択され得る。

本発明の一部の好ましい実施形態では、生産されたガラクトシル化受容体は新しい型のガラクトシル受容体として働き、同様にガラクトシル化することができる。このようにして、化学量論式Ｇａｌｉ＋１Ｘ［式中、ｉは負ではない整数である］を有するガラクトオリゴ糖を生産し得る。通常、最も主要な種はＧａｌＸ、Ｇａｌ２ＸおよびＧａｌ３Ｘである。

本発明の他の好ましい実施形態では、生産されたガラクトシル化受容体は新しい型のガラクトシル受容体として働き、同様にガラクトシル化することができる。このようにして、一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｉ−Ｘ［式中、ｉは負ではない整数である］を有するガラクトオリゴ糖を生産し得る。通常、最も主要な種はＧａｌ−Ｘ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＸおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘである。

本発明の一部の実施形態では、段階ａ）の混合物は、最大でも０．７モル／Ｌ、好ましくは最大でも０．４モル／Ｌ、なお一層好ましくは最大でも０．２モル／Ｌの濃度でガラクトシル供与体を含む。混合物は、例えば０．００１〜０．７モル／Ｌの範囲内、好ましくは０．０１〜０．５モル／Ｌの範囲内、なお一層好ましくは０．０２〜０．２モル／Ｌの範囲内の濃度でガラクトシル供与体を含み得る。

あるいは、段階ａ）の混合物は、最大でも０．３モル／Ｌ、好ましくは最大でも０．１モル／Ｌ、なお一層好ましくは最大でも０．０５モル／Ｌの濃度でガラクトシル供与体を含み得る。混合物は、例えば０．００１〜０．２モル／Ｌの範囲内、好ましくは０．００５〜０．１モル／Ｌの範囲内、なお一層好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌの範囲内の濃度でガラクトシル供与体を含み得る。

ガラクトシル化されたガラクトシル受容体およびガラクトシル化されたガラクトシル供与体は、限られた程度でガラクトシル供与体として働き得るが、ガラクトシル化されたガラクトシル受容体およびガラクトシル化されたガラクトシル供与体は、本発明に関連してガラクトシル供与体とはみなされず、本明細書で言及するガラクトシル供与体の濃度または比率に寄与しないことが留意されるべきである。

ガラクトシル受容体は種々の濃度範囲で使用され得る。しかし、過剰のガラクトシル受容体は通常、本発明のガラクトオリゴ糖含有組成物から除去しなければならないので、混合物をガラクトシル受容体で飽和させないようにすることが好ましい。

本発明の一部の実施形態では、段階ａ）の混合物は、少なくとも０．０５モル／Ｌ、好ましくは少なくとも０．１０モル／Ｌ、なお一層好ましくは少なくとも０．３０モル／Ｌの量でガラクトシル受容体を含む。なお一層高い濃度のガラクトシル受容体が好ましいと考えられ、したがって段階ａ）の混合物は、例えば少なくとも０．５モル／Ｌ、好ましくは少なくとも０．７モル／Ｌ、なお一層好ましくは少なくとも１モル／Ｌの量でガラクトシル受容体を含み得る。

混合物は、例えば０．０５モル／Ｌ〜５モル／Ｌの範囲内、好ましくは０．１モル／Ｌ〜２モル／Ｌの範囲内、なお一層好ましくは０．３モル／Ｌ〜１モル／Ｌの範囲内の濃度でガラクトシル受容体を含み得る。

しかし、一部の実施形態では比較的低濃度のガラクトシル受容体が好ましく、この場合混合物は、例えば最大でも２モル／Ｌ、好ましくは最大でも０．５モル／Ｌ、なお一層好ましくは最大でも０．２モル／Ｌの濃度でガラクトシル受容体を含み得る。例えば、混合物は、０．０５モル／Ｌ〜２モル／Ｌの範囲内、好ましくは０．０６モル／Ｌ〜１モル／Ｌの範囲内、なお一層好ましくは０．０８モル／Ｌ〜０．８モル／Ｌの範囲内の濃度でガラクトシル受容体を含み得る。

ガラクトシル受容体およびガラクトシル供与体に加えて、混合物は、酵素反応についての条件を最適化するために様々な添加物をさらに含み得る。

混合物は、例えば、混合物のｐＨを酵素のｐＨ最適値に調整するために１またはそれ以上のｐＨ緩衝剤を含み得る。あるいはまたは加えて、混合物は、１またはそれ以上の金属イオンを含有する水溶性塩を含み得る。特定の酵素に依存して、例えばＣａ２＋、Ｚｎ２＋またはＭｇ２＋などの金属イオンを使用し得る。しかし、一部の酵素は混合物中の金属イオンの存在に対して非感受性であることに留意しなければならない。

オリゴ糖を合成する従来の方法は、しばしば、例えばグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水分活性低下剤を使用する。本発明は、好都合には、そのような水分活性低下剤を使用せずにガラクトオリゴ糖の効率的な合成を実施することを可能にする。したがって、本発明の一部の好ましい実施形態では、混合物は、混合物の重量に対して最大でも５重量％、好ましくは最大でも１重量％、なお一層好ましくは最大でも０．１重量％の量で水分活性低下剤を含む。例えば、混合物は、混合物の重量に対して最大でも０．０５重量％の量で水分活性低下剤を含み得る。

段階ａ）の混合物または混合物を形成する成分は、酵素との反応の前に、反応の間の微生物増殖を避けるために熱処理されていてもよい。通常の熱処理工程、例えば低温殺菌法（例えば７２℃で１５秒間）、高温殺菌法（例えば９０℃で１５秒間）またはＵＨＴ処理（例えば１４０℃で４秒間）を使用し得る。熱処理温度に不安定な酵素の場合は注意しなければならない。

段階ｂ）は、好ましくはβ−ガラクトシダーゼ活性を有し、および好ましくは最大でも０．９のＴ値を有する酵素を提供することを含む。本発明の方法は、付加的な酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ活性またはトランスグリコシル化活性とは異なる酵素活性を有する酵素の使用をさらに含み得ることが留意されるべきである。

本発明に関連して「β−ガラクトシダーゼ活性」という用語は、ラクトースなどのβ−Ｄ−ガラクトシド中の末端非還元β−Ｄ−ガラクトース残基の加水分解の酵素触媒に関する。本発明で使用される酵素は、好ましくはＥＣ３．２．１．２３のクラスに属する。

本発明の一部の実施形態では、酵素のＴ値は、最大でも０．８、好ましくは最大でも０．７、なお一層好ましくは最大でも０．６である。例えば、酵素のＴ値は最大でも０．５であり得る。好ましくは、酵素のＴ値は最大でも０．４であり得る。酵素のＴ値は最大でも０．３であることがなお一層好ましいと考えられる。

最大でも０．２などの、なお一層低いＴ値は好ましいと考えられる。

有用な酵素は、例えば配列番号：１のＤＮＡ配列によってコードされるペプチドに由来し得る。有用な酵素が由来し得るそのようなペプチドの一例は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドである。

配列番号：１および配列番号：２は、ＰＣＴ出願国際公開第０１／９０，３１７号に見出すことができ、その中でそれらは配列番号：１および配列番号：２と称されている。加えて、さらなる有用な酵素もＰＣＴ出願国際公開第０１／９０，３１７号において見出され得る。

本発明の一部の好ましい実施形態では、酵素は、配列番号：２のペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、酵素は、配列番号：２のペプチドと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の場合には、酵素は、配列番号：２のペプチドと少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

本発明に関連して「配列同一性」という用語は、等しい長さの２つのアミノ酸配列の間または等しい長さの２つの核酸配列の間の同一性の程度の定量的尺度に関する。比較する２つの配列が等しい長さでない場合は、それらを可能な限りの最良適合に整列しなければならない。配列同一性は、
（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）×１００／（Ｎｒｅｆ）
［式中、Ｎｄｉｆは、整列したとき２つの配列中で同一でない残基の総数であり、Ｎｒｅｆは、２つの配列の１つにおける残基の数である］
として計算することができる。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列同一性を有する（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）。ギャップは特定の残基の非同一性として数えられ、すなわちＤＮＡ配列ＡＧＴＧＴＣは、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣと７５％の配列同一性を有する（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）。配列同一性は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），ＵＳＡによって提供されるＢＬＡＳＴｐアルゴリズムのような適切なＢＬＡＳＴプログラムを使用して計算することができる。

本発明の他の好ましい実施形態では、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する。例えば、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のペプチドと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有し得る。一部の場合には、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のペプチドと少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。

本発明の一部の好ましい実施形態では、酵素は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＧｌｙ（１７５２）までのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、酵素は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＧｌｙ（１７５２）までのアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の場合には、酵素は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＧｌｙ（１７５２）までのアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

本発明の他の好ましい実施形態では、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＧｌｙ（１７５２）までのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。例えば、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＧｌｙ（１７５２）までのアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有し得る。一部の場合には、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＧｌｙ（１７５２）までのアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。したがって、酵素は、例えば配列番号：２のＭｅｔ（１）からＧｌｙ（１７５２）までのアミノ酸配列を有し得る。

本発明の一部の好ましい実施形態では、酵素は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、酵素は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の場合には、酵素は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

本発明の他の好ましい実施形態では、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。例えば、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有し得る。一部の場合には、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。

本発明の一部の現在好ましい実施形態では、酵素は、配列番号：２のＭｅｔ（１）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列を有する。

本発明の一部の実施形態では、酵素は、配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、酵素は、配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の場合には、酵素は、配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

本発明の他の実施形態では、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。例えば、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、なお一層好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有し得る。一部の場合には、酵素のアミノ酸配列は、配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。したがって、酵素は、例えば配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列を有し得る。

本発明の一部の現在好ましい実施形態では、酵素は、配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列を有する。

本発明の一部の実施形態では、酵素は、例えば表１に示すアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。酵素は、例えば表１に示すアミノ酸配列を含み得る。あるいは、酵素のアミノ酸配列は、表１に示すアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。酵素は、例えば表１に示すアミノ酸配列を有し得る。
（表１）
表１ 有用なアミノ酸配列（ＡＡＳ）

本発明の一部の実施形態では、酵素は、例えば表２に示すアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。酵素は、例えば表２に示すアミノ酸配列を含み得る。あるいは、酵素のアミノ酸配列は、表２に示すアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。酵素は、例えば表２に示すアミノ酸配列を有し得る。
（表２）
表２ 有用なアミノ酸配列（ＡＡＳ）

本発明の一部の実施形態では、酵素は、例えば表３に示すアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。酵素は、例えば表３に示すアミノ酸配列を含み得る。あるいは、酵素のアミノ酸配列は、表３に示すアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。酵素は、例えば表３に示すアミノ酸配列を有し得る。
（表３）
表３ 有用なアミノ酸配列（ＡＡＳ）

本発明の一部の実施形態では、酵素は、例えば表４に示すアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。酵素は、例えば表４に示すアミノ酸配列を含み得る。あるいは、酵素のアミノ酸配列は、表４に示すアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。酵素は、例えば表４に示すアミノ酸配列を有し得る。
（表４）
表４ 有用なアミノ酸配列（ＡＡＳ）

本発明の一部の実施形態では、酵素は１またはそれ以上のグリコシル化されたアミノ酸を含み得る。あるいはまたは加えて、酵素は１またはそれ以上のリン酸化されたアミノ酸を含み得る。あるいは、酵素のアミノ酸のいずれもグリコシル化またはリン酸化されていない。

本発明の一部の好ましい実施形態では、酵素は少なくとも２つのサブユニットを含み、各々のサブユニットは上記で定義された酵素から成る。

酵素は、好ましくは混合物と接触し、それによりガラクトシル受容体およびガラクトシル供与体の両方と接触する。

本発明の一部の実施形態では、混合物は酵素を含む。酵素は、例えば単独酵素分子としてまたは酵素分子の可溶性凝集体として、溶解形態で混合物中に存在し得る。

本発明の他の実施形態では、酵素は混合物から離れているが、酵素を混合物と接触させることにより、酵素はガラクトシル受容体およびガラクトシル供与体と接触する。例えば、固定相固体上に固定化された酵素を使用し得る。有用な固定相固体の例は、例えばフィルタ、酵素含有粒子の充填層または同様の構造体である。

あるいは、固定相固体は、例えば、混合物の一部を形成する、自由流動微粒子固相、例えば有機または無機ビーズであり得る。

固定化技術および適切な固相型を含む酵素の工業的使用に関する詳細は、あらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ（２００５）に見出すことができる。

酵素は、好ましくは許容される収量のガラクトオリゴ糖を得るのに十分な活性で使用される。最適活性は工程の特定の実施に依存し、当業者によって容易に決定され得る。

ガラクトシル供与体の高い代謝回転数およびガラクトオリゴ糖の高い収率が必要である場合は、酵素を比較的高い活性で使用することが好ましいと考えられる。例えば、酵素の活性は、ガラクトシル供与体の代謝回転数が少なくとも０．０２モル／（Ｌ×時）、好ましくは少なくとも０．２モル／（Ｌ×時）、なお一層好ましくは少なくとも２モル／（Ｌ×時）となる活性であり得る。

酵素反応は段階ｃ）の間に起こる。ガラクトシル受容体およびガラクトシル供与体が酵素と接触したほぼ直後であり得る、混合物が最適な状態に暴露されるとすぐに、トランスガラクトシル化が通常開始され、本発明の一部の実施形態では、段階ｂ）とｃ）は同時に起こる。

酵素は、ガラクトシル供与体の脱離基を放出し、ガラクトシル供与体のガラクトシル基をガラクトシル受容体に転移することができる。例えば、ガラクトシル供与体がラクトースである場合は、グルコースが放出され、ガラクトシル基が受容体に転移される。酵素は、酵素反応の間触媒として働く。

本発明の一部の好ましい実施形態では、酵素は、既にガラクトシル化されたガラクトシル受容体にガラクトシル基をさらに転移し、それにより２、３またはなお一層多くのガラクトシル基を含むガラクトシル受容体を生成する。

混合物のｐＨは、好ましくは酵素の最適ｐＨに近い。本発明の一部の実施形態では、段階ｃ）の間の混合物のｐＨはｐＨ３〜９の範囲内である。例えば、段階ｃ）の間の混合物のｐＨは、ｐＨ４〜８の範囲内、例えばｐＨ５〜７．５の範囲内であり得る。

ｐＨと同様に、混合物の温度も、好ましくは使用される酵素の最適温度に調整される。本発明の一部の実施形態では、段階ｃ）の間の温度は１０〜８０℃の範囲内である。段階ｃ）の間の温度は、２０〜７０℃の範囲内、好ましくは２５〜６０℃の範囲内、なお一層好ましくは３０〜５０℃の範囲内であり得る。

本発明に関連して、「酵素の最適ｐＨ」という用語は、酵素が最も高いトランスガラクトシル化活性を有するｐＨに関する。同じように、「酵素の最適温度」という用語は、酵素が最も高いトランスガラクトシル化活性を有する温度に関する。

発明人は、本発明の方法が、驚くべきことに、比較的低濃度のガラクトシル供与体を使用した場合でも高い収量のガラクトオリゴ糖を提供することを発見した。比較的低濃度のガラクトシル供与体は、加えて、供与体の自己ガラクトシル化、すなわち１番目のガラクトシル供与体のガラクトシル基が、ガラクトシル受容体ではなく２番目のガラクトシル供与体に転移することの程度を低減する。

本発明の一部の好ましい実施形態では、段階ｃ）は、混合物へのさらなるガラクトシル供与体の添加を含む。これは、比較的低濃度のガラクトシル供与体を使用する場合に特に好ましい。さらなるガラクトシル供与体を添加することにより、混合物中のガラクトシル供与体が枯渇することが回避され、酵素反応の間ガラクトシル供与体の濃度が制御され得る。

さらなるガラクトシル供与体の添加は、ガラクトシル供与体の個別の添加、例えば酵素反応の間に少なくとも１回の添加を含み得る。あるいはまたは加えて、さらなるガラクトシル供与体の添加は、酵素反応の間の連続的な添加であり得る。さらなるガラクトシル供与体は、好ましくは段階ａ）で使用されるのと同じ型である。

本発明の一部の好ましい実施形態では、段階ｃ）の間の混合物のガラクトシル供与体の濃度は、０．０１〜１モル／Ｌの範囲内、好ましくは０．０１〜０．５モル／Ｌの範囲内、好ましくは０．０３〜０．３モル／Ｌの範囲内の濃度に維持される。

例えば、段階ｃ）の間の混合物のガラクトシル供与体の濃度は、０．０２〜０．１モル／Ｌの範囲内の濃度に維持され得る。

段階ｃ）は、さらなるガラクトシル受容体の添加をさらに含み得る。これは、段階ｃ）の間の混合物のガラクトシル受容体の濃度を制御することを可能にし、例えば、所望する場合はガラクトシル受容体の濃度を実質的に一定に保持することを可能にする。

２または３個の転移されたガラクトシル基を含む、有意の量のガラクトオリゴ糖を生産するために、工程は、ガラクトシル受容体よりも多くのガラクトシル供与体を消費すべきである。それにより、ガラクトシル受容体のより多くが２または３回ガラクトシル化される。したがって、本発明の一部の好ましい実施形態では、消費されるガラクトシル供与体と消費されるガラクトシル受容体のモル比は、少なくとも１：１、好ましくは少なくとも５：１、なお一層好ましくは少なくとも１０：１である。

しばしば、組成物のガラクトオリゴ糖を富化および／または精製し、ガラクトシル受容体、ガラクトシル供与体および放出される脱離基の濃度を低減する必要がある。

したがって、本発明の一部の好ましい実施形態では、本発明の方法は、
ｄ）段階ｃ）の組成物のガラクトオリゴ糖を富化すること
の段階をさらに含む。

本発明に関連して、「ガラクトオリゴ糖を富化する」という用語は、乾燥重量ベースで組成物のガラクトオリゴ糖の相対量を増大させることに関する。これは、典型的には組成物のその他の固体の一部、例えば低分子量糖類および場合により酵素も、必要に応じて除去することによって行われる。

段階ｄ）の富化は、例えばクロマトグラフィ分離および／またはナノろ過を含み得る。そのような工程に関する詳細は、あらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）に記載されている。

本発明の一部の実施形態では、富化は、最大でも２００ｇ／モルのモル重量を有する分子の少なくとも５０％（乾燥重量ベースで重量／重量）が段階ｃ）の組成物から除去されることを含む。例えば、富化は、最大でも２００ｇ／モルのモル重量を有する分子の少なくとも８０％（乾燥重量ベースで重量／重量）が段階ｃ）の組成物から除去されることを含み得る。

本発明の他の実施形態では、富化は、最大でも３５０ｇ／モルのモル重量を有する分子の少なくとも５０％（乾燥重量ベースで重量／重量）が段階ｃ）の組成物から除去されることを含む。例えば、富化は、最大でも３５０ｇ／モルのモル重量を有する分子の少なくとも８０％（乾燥重量ベースで重量／重量）が段階ｃ）の組成物から除去されることを含み得る。

富化の代わりにまたは富化に加えて、段階ｄ）は、組成物中のガラクトオリゴ糖の濃度を増大させる１またはそれ以上の工程を含むことが好ましいと考えられる。有用な濃縮段階の例は、例えば逆浸透、蒸発および／または噴霧乾燥である。

本発明の方法によって提供されるガラクトオリゴ糖含有組成物は、例えば乾燥粉末の形態またはシロップの形態であり得る。

乾燥粉末の生産は、典型的には濃縮、蒸発および／または噴霧乾燥などの１またはそれ以上の工程段階を必要とする。したがって、本発明の一部の好ましい実施形態では、段階ｄ）は、粉末形態の組成物を得るために液体形態の組成物を濃縮する、蒸発させるおよび／または噴霧乾燥することをさらに含む。粉末組成物を得るために段階ｄ）の液体組成物を噴霧乾燥することは特に好ましい。段階ｄ）は、例えば、富化段階、次いで濃縮段階、例えばナノろ過、逆浸透または蒸発、次いで噴霧乾燥段階を含み得る。あるいは、段階ｄ）は、濃縮段階、次いで富化段階、次いで噴霧乾燥段階を含み得る。富化の前に組成物のガラクトオリゴ糖を濃縮することは、その後の富化工程をよりコスト効率的にし得る。

効率的な噴霧乾燥は、１またはそれ以上の補助剤、例えばマルトデキストリン、乳タンパク質、カゼイン塩、濃縮ホエータンパク質および／または脱脂粉乳の添加を必要とし得る。

本発明の工程は、例えばバッチ工程として実施され得る。本発明の工程は、選択的にフェドバッチ工程として実施され得る。本発明の工程は、選択的に連続工程として実施され得る。

本発明の工程は、酵素および／または未使用のガラクトシル受容体を混合物にもどす再循環をさらに含み得る。再循環は、例えば段階ｄ）の一部を形成し得る。例えば、段階ｄ）は、ガラクトオリゴ糖含有組成物からガラクトシル受容体および／または酵素を分離し、ガラクトシル受容体および／または酵素を段階ａ）またはｃ）に再循環させることを含み得る。バッチ工程またはフェドバッチ工程の場合は、ガラクトシル受容体および／または酵素を次のバッチの混合物に再循環させ得る。

連続工程の場合は、ガラクトシル受容体を段階ａ）または段階ｃ）に対応する工程ラインの部分にもどして再循環させ得る。酵素は、段階ｂ）または段階ｃ）に対応する工程ラインの部分にもどして再循環させ得る。

段階ａ）およびｂ）に関連する詳細および特徴は、生産工程の実際上の開始に関連する必要はないが、少なくとも工程の間のどこかで生じるべきであることが留意されねばならない。しかし、本発明の一部の実施形態では、ガラクトシル供与体の濃度は、段階ｃ）の全期間中、段階ａ）で述べる範囲内に保持される。

本発明の方法がバッチまたはフェドバッチ工程として実施される場合、段階ａ）は、好ましくは合成が開始するときの混合物の組成物に関する。方法が連続工程である場合は、段階ａ）は、好ましくは定常状態操作下での合成の間の混合物の組成物に関する。

ガラクトシル化されたガラクトシル供与体は、ガラクトシル化されたガラクトシル受容体から分離することが難しい、望ましくない不純物とみなされ得るので、ガラクトシル化されたガラクトシル供与体のレベルはできるだけ低く保持されることが望ましいと考えられ得る。本発明の一部の好ましい実施形態では、段階ａ）の混合物は最大でも０．５モル／Ｌのガラクトシル化されたガラクトシル供与体を含む。ガラクトシル化されたガラクトシル供与体は、例えば最大でも０．１モル／Ｌのガラクトシル化されたガラクトシル供与体を含み得る。なお一層好ましくは、ガラクトシル化されたガラクトシル供与体は、最大でも０．０１モル／Ｌのガラクトシル化されたガラクトシル供与体を含み、好ましくはガラクトシル化されたガラクトシル供与体を実質的に含まない。

さらに、本発明の一態様は、ガラクトオリゴ糖を含有する組成物であって、本明細書で定義される方法によって得られる組成物に関する。

本発明のさらなる態様は、ガラクトオリゴ糖含有組成物、例えば上述した組成物であり、前記ガラクトオリゴ糖含有組成物は、
−一般式Ｇａｌ−Ｘを有する第一ガラクトオリゴ糖、
−例えば一般式Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘなどの、化学量論式（Ｇａｌ）２Ｘを有する第二ガラクトオリゴ糖、
−例えば一般式Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘなどの、化学量論式（Ｇａｌ）３Ｘを有する第三ガラクトオリゴ糖
［式中、Ｘはグリコシル基であり、ラクトシルまたはグルコシルではない］
を含有する。

本明細書で述べるガラクトオリゴ糖含有組成物は、例えば食品成分であり得る。

上述したように、「Ｘ」または「−Ｘ」は、好ましくは本明細書で言及するガラクトシル受容体の１つのグリコシル基である。

本発明の一部の実施形態では、「Ｘ」または「−Ｘ」は、グルコースではない単糖のグリコシル基である。本発明の他の実施形態では、「−Ｘ」は、ラクトースではない二糖のグリコシル基である。

本発明の一部の好ましい実施形態では、「Ｘ」または「−Ｘ」はフコシル基である。本発明の他の好ましい実施形態では、「Ｘ」または「−Ｘ」はガラクトシル基である。

本発明の一部の好ましい実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、
−ガラクトオリゴ糖Ｇａｌ−Ｘ、（Ｇａｌ）２Ｘおよび（Ｇａｌ）３Ｘの総量と、
−ガラクトオリゴ糖Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｇａｌ２Ｇｌｃ、Ｇａｌ３Ｇｌｃの総量
との間で少なくとも５：９５のモル比を有する。例えば、上記モル比は、少なくとも１：４、好ましくは少なくとも１：１、なお一層好ましくは少なくとも２：１であり得る。上記モル比は少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１、なお一層好ましくは少なくとも２０：１であることがさらに好ましいと考えられる。

本発明の他の好ましい実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、
−ガラクトオリゴ糖Ｇａｌ−Ｘ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＸおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘの総量と、
−ガラクトオリゴ糖Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃの総量
との間で少なくとも５：９５のモル比を有する。例えば、上記モル比は、少なくとも１：４、好ましくは少なくとも１：１、なお一層好ましくは少なくとも２：１であり得る。上記モル比は、少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１、なお一層好ましくは少なくとも２０：１であることがさらに好ましいと考えられる。

さらには、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、式Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃのいずれのガラクトオリゴ糖も含まないことが可能である。

本発明の一部の実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、第一ガラクトオリゴ糖、第二ガラクトオリゴ糖および第三ガラクトオリゴ糖の間で５０〜９９：１〜４５：０．５〜２５の範囲内のモル比を有する。

本発明の他の実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、第一ガラクトオリゴ糖、第二ガラクトオリゴ糖および第三ガラクトオリゴ糖の間で２０〜４５：２０〜４５：２０〜４５の範囲内のモル比を有する。

本発明のさらなる実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、第一ガラクトオリゴ糖、第二ガラクトオリゴ糖および第三ガラクトオリゴ糖の間で０．５〜２５：１〜４５：５０〜９８の範囲内のモル比を有する。

本発明の一部の好ましい実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、ガラクトオリゴ糖含有組成物の総重量の少なくとも１０重量％の、第一ガラクトオリゴ糖、第二ガラクトオリゴ糖および第三ガラクトオリゴ糖の総量を含有する。例えば、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、ガラクトオリゴ糖含有組成物の総重量の少なくとも２０重量％、好ましくは少なくとも３０重量％、なお一層好ましくはガラクトオリゴ糖含有組成物の総重量の少なくとも４０重量％の、第一ガラクトオリゴ糖、第二ガラクトオリゴ糖および第三ガラクトオリゴ糖の総量を含有し得る。

なお一層高いレベルの第一、第二および第三ガラクトオリゴ糖が好ましいと考えられる。したがって、本発明の一部の好ましい実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、ガラクトオリゴ糖含有組成物の総重量の少なくとも５０重量％の、第一ガラクトオリゴ糖、第二ガラクトオリゴ糖および第三ガラクトオリゴ糖の総量を含有する。例えば、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、ガラクトオリゴ糖含有組成物の総重量の少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、なお一層好ましくはガラクトオリゴ糖含有組成物の総重量の少なくとも８０重量％の、第一ガラクトオリゴ糖、第二ガラクトオリゴ糖および第三ガラクトオリゴ糖の総量を含有し得る。

さらに、本発明の一態様は、本明細書で述べるガラクトオリゴ糖含有組成物を含む食品に関する。

本発明の一部の実施形態では、食品は、乳児用調製粉乳および臨床栄養のための製品などの機能性食品である。

本発明の他の実施形態では、食品は、例えばパンまたは同様の製品などの焼いた生地を含む、焼いた製品である。

本発明のさらなる実施形態では、食品は乳製品、例えば牛乳などの生鮮乳製品またはヨーグルトなどの発酵乳製品である。

本発明のなおさらなる実施形態では、食品はペットフード製品である。

本発明の態様の１つに関連して述べる実施形態および特徴は、同時に本発明のその他の態様にも適用されることが留意されるべきである。

本発明を、ここで、以下の非限定的な実施例においてさらに詳細に説明する。

酵素の調製
発酵培地７５０ｍＬの作業容量に、１２時間増殖させたＯＤ６００が３．０の、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを添加したＬｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地の種培養物２ｍＬを接種した。発酵は、２％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、２％（ｗ／ｖ）ダイズペプトン、１％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＥＣ培地で実施した。ＯＬＧＡ３４７ β−ガラクトシダーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を先に述べられているように（Ｊφｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５５５，３４８ Ｂ２号、実施例１および２）調製した。発酵槽はＡｐｐｌｉｋｏｎからであり、総容量２Ｌのガラス製凹面底容器を有し、２つのＲｕｓｈｔｏｎ羽根車を備えていた。発酵の間、ｐＨは、２Ｍ ＮａＯＨおよび２Ｍ Ｈ３ＰＯ４の適切な添加によってｐＨ６．５に維持し、温度は３７℃に制御した。１〜２Ｌ／分の速度で空気を通気させることによって酸素を供給し、撹拌速度を高めることによってｐＯ２を３０％に維持した。増殖の後にオフラインでＯＤ６００を読み取った。約１０時間の増殖後ＯＤ６００値２９．７で遠心分離によって培養物を採取した。培養上清６５０ｍＬを−２０℃で保存した。細胞ペレットをスクロース緩衝液２００ｍＬ（３０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、４０％スクロース、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートすることにより、ペリプラズムタンパク質を浸透圧ショックによって細胞ペレットから単離した。遠心分離後、上清を廃棄し、ペレットを冷水２００ｍＬに再懸濁した。飽和ＭｇＣｌ２溶液８３μＬを添加し、ペリプラズムタンパク質を含む上清を遠心分離段階によって収集した。ペリプラズム画分を、０．２μＭ Ｍｉｌｌｉｐａｋ ４０フィルタを通してろ過滅菌し、−２０℃で保存した。

ペリプラズム画分２００ｍＬおよび培養上清６５０ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ活性を、プロトコール（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１），ｐｐ．１７．４８−１７．５１）に従い、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＰＮＧ）を基質として使用して測定した。活性の大部分はペリプラズム画分中で認められた（９８％に相当する５２５単位）。

β−ガラクトシダーゼ酵素のＴ値の決定
β−ガラクトシダーゼ酵素のＴ値を、以下に示すアッセイおよび式に従って決定する。
アッセイ：
試験するβ−ガラクトシダーゼ酵素、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１ｍＭクエン酸マグネシウム、１ｍＭクエン酸カルシウム、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）から成り、６．５のｐＨを有する酵素溶液３．３ｍＬを調製する。酵素溶液は、本アッセイ条件下で添加されたラクトースの３３％（ｗ／ｗ）を１時間で使用するのに十分な量のβ−ガラクトシダーゼ酵素を含むべきである。酵素溶液の温度は３７℃でなければならない。

Ｔ０の時点で、ラクトース一水和物８２．５ｍｇ（生化学用、Ｍｅｒｃｋ Ｇｅｒｍａｎｙ）を酵素溶液に添加して混合し、その後混合物を３７℃で４時間インキュベートする。Ｔ０の正確に１時間後、試料１００μＬを収集し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１：５に希釈して、１０分間８５℃に加熱することによって不活性化する。不活性化した混合物を、特性付けまで−２０℃に保持する。

特性付け：
生産されたガラクトースの量（モル）および使用されたラクトースの量（モル）の測定は、任意の適切な分析技術を用いて実施し得る。例えば、希釈した混合物を、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８２）およびＳｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）によって述べられている方法に従い、ＨＰＬＣによって分析し得る。他の有用な分析技術は、Ｅｌ Ｒａｚｚｉ（２００２）に記載されている。

適切な分析技術の別の例は、ＩＳＯ ５７６５−２：２００２（ＩＤＦ ７９−２：２００２）「粉乳、ドライアイス混合物およびプロセスチーズ−ラクトース含量の測定−第２部：ラクトースのガラクトース部分を利用する酵素的方法」である。

Ｔ値の計算：
アッセイの希釈混合物の特性付けから得られたデータを使用して、以下の式に従ってＴ値を計算する：
Ｔ値＝生産されたガラクトースの量（モル）／使用されたラクトースの量（モル）

例−ＯＬＧＡ３４７酵素のＴ値：
上記アッセイを、実施例１のＯＬＧＡ３４７酵素を用いて実施した。

アッセイから得られた希釈混合物を、変換された（すなわち使用された）ラクトースおよび生成されたガラクトースに関して分析ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ装置はＷａｔｅｒｓからであり、示差屈折計（ＲＩ検出器）およびＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｃカラム（３００×７．８ｍｍ、１２５−００５５）を備えた。糖類の溶出は、０．０５ｇ／Ｌ酢酸カルシウム、流速０．３ｍＬ／分および注入量２０μＬを用いて均一濃度で実施した。

得られたデータを自動化ソフトウエアによって適切に基線補正し、ピークを個別に同定して積分した。ラクトース一水和物（生化学用、Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄ−（＋）−グルコース一水和物（生化学用、Ｍｅｒｃｋ Ｅｕｒｏｌａｂ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＤ−（＋）−ガラクトース（≧９９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｔａｌｙ）の外標準を使用することによって定量化を実施した。

各々の時点Ｔに対するラクトースの変換およびガラクトースの形成を定量化したデータから計算した。Ｔ＝１時間の時点で、収集した試料１００μＬ中のラクトースの２９％が変換されており、これはラクトース２．３μｍｏｌに対応する。Ｔ＝１の時点で、ガラクトース０．５μｍｏｌが収集した１００μＬ試料中で形成されていた。Ｔ値は、したがって、０．５μｍｏｌ／２．３μｍｏｌ＝０．２と計算することができる。

アッセイから得られた希釈混合物を、変換された（すなわち使用された）ラクトースおよび生成されたガラクトースに関して酵素的方法ＩＳＯ ５７６５−２によっても分析した。Ｒ−ＢｉｏｐｈａｒｍからのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍラクトース／Ｄ−ガラクトース試験キット（カタログ番号１０ １７６ ３０３ ０３５）を使用し、プロトコールに従って試験を実施した。酵素的方法は、ＯＬＧＡ３４７酵素のＴ値が０．２であることを確認した。

例−従来のラクターゼ酵素のＴ値：
上記アッセイを、市販の従来のラクターゼ酵素Ｌａｃｔｏｚｙｍ Ｐｕｒｅ ２６００Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて実施した。アッセイから得られた希釈混合物を、ＯＬＧＡ３４７酵素に関して述べたように分析した。三糖および四糖は検出可能な量で存在せず、等しい量のグルコースおよびガラクトースが認められた。対応するＴ値は１である。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からの市販のβ−ガラクトシダーゼ（製品番号：Ｇ６００８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびニホンコウジカビ（アスペルギルス・オリザエ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）からの市販のβ−ガラクトシダーゼ（製品番号：Ｇ５１６０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＴ値も決定し、どちらの酵素も約１のＴ値を有する。

供与体分子の逐次添加によるＬ−フコシル含有ヘテロガラクトオリゴ糖の合成
Ｌ−（−）−フコース７００ｍｇ（９９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｌｏｖａｋｉａ）およびラクトース一水和物２０ｍｇ（生化学用、Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を緩衝液５ｍＬ（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．５）に溶解し、３７℃の温度に維持した。実施例１におけるように調製した、ＯＬＧＡ３４７酵素２ｍＬを添加した。この時点をＴ＝０と定義する。６時間の期間中、ラクトース一水和物２０ｍｇを３０分間隔で添加した。試料１００μＬをＴ＝０、１、２、３、４、５および７時間の時点で取得した。試料の取得および特性付けは実施例２におけるように実施した。質量分析を、１００〜１０００ａｍｕのＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＡＰＩ−ＥＳ ＬＣ／ＭＳＤ Ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ走査質量を用いて実施した（ガス温度：３５０℃、乾燥ガス流速：１３．０Ｌ／分、噴霧圧：６０ｐｓｉｇ）。検出されるイオンは、分析物と溶液からのナトリウムカチオンとの間の錯体形成によって生じ、Ｍ（Ｎａ＋）＝Ｍ＋２３Ｄａの検出質量をもたらす。

Ｔ＝０時間およびＴ＝７時間からのＨＰＬＣクロマトグラムをそれぞれ図１ａおよび図１ｂに示す。ピークをＭＳによって同定し（データは示していない）、図に表示している。説明：１＝ラクトース、２＝グルコース、３＝ガラクトース、４＝Ｌ−フコース、５＝スクロース、６＝Ｇａｌ−Ｆｕｃ二糖、７＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＦｕｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ三糖、８＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＦｕｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ四糖。図において、グルコースおよびガラクトースの濃度が上昇し、グルコースはガラクトースより約４倍豊富であることが認められる。これは、ガラクトースがガラクトオリゴ糖の形成のための供与体分子として使用されており、残存するグルコースは溶液中に放出されるという仮説と一致する。ラクトースの濃度は、ラクトースの連続的な添加のために上昇する。このピークはまた、酵素反応において形成されるアロラクトースおよびＧａｌ−Ｇａｌ二糖を含む。さらに、Ｇａｌ−Ｆｕｃ二糖、Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ三糖ならびにＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ四糖が形成される。

ラクトース、グルコースおよびガラクトースに関して時間の関数としての計算されたピーク面積のプロットを図２に示す。説明：菱形＝ラクトース、十字＝グルコース、三角＝ガラクトース。ラクトース、アロラクトースおよびＧａｌ−Ｇａｌ二糖の濃度が上昇することならびに酵素反応の間にグルコースが溶液中に放出されると共にグルコースの濃度が直接的に上昇することが認められる。ガラクトースの濃度はグルコースに比べて低く、濃度は緩やかにしか上昇しない。これは、ラクトースの切断から提供されるほとんどすべてのガラクトースがガラクトオリゴ糖を形成するために使用されたことを指示する。さらに、Ｌ−フコースはガラクトオリゴ糖を形成する酵素反応において受容体分子として使用されるので、Ｌ−フコースの濃度は実験の経過中低下する（データは示していない）。

図３は、酵素反応からの生成物に関する時間の関数としての計算されたピーク面積のプロットを示す。説明：星印＝Ｇａｌ−Ｆｕｃ二糖、丸印＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ三糖、中空の四角＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ四糖。Ｇａｌ−Ｆｕｃ二糖および三糖と四糖の両方が形成される。三糖はＧａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃの形態であり、四糖はＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃの形態である。

Ｇａｌ−Ｆｕｃ二糖の濃度は直線的に上昇し、Ｔ＝６時間からＴ＝７時間まではプラトーに達する傾向を示す。Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ三糖の濃度は直線的に上昇し、Ｔ＝４時間から指数的上昇の傾向を示す。Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ四糖の濃度は直線的に上昇する。

Ｌ−フコース含有ガラクトオリゴ糖の量（総炭水化物のｗ／ｗ）は、Ｔ＝７時間のＨＰＬＣおよびＭＳデータに基づき以下のように推定される：Ｇａｌ−Ｆｕｃ＝８％、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ＝３％、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ＝１％。全体で、Ｌ−フコース含有ガラクトオリゴ糖はＴ＝７時間の反応時間後に１２％を構成する。クロマトグラフィによる遊離Ｌ−フコースの除去後、計算されたＬ−フコース含有ガラクトオリゴ糖の量は２８％である。

Ｄ−フコシル含有ヘテロガラクトオリゴ糖の合成
Ｄ−（＋）−フコース１１０ｍｇ（≧９８％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｌｏｖａｋｉａ）およびラクトース一水和物５５ｍｇ（生化学用、Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を緩衝液１ｍＬ（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．５）に溶解した。実施例１におけるように調製した、ＯＬＧＡ３４７酵素１００μＬを添加した。この時点をＴ＝０と定義する。試料１００μＬをＴ＝０、２、４、６および２２時間の時点で取得した。試料の取得およびＨＰＬＣ特性付けは実施例２におけるように実施した。ＭＳ特性付けは実施例３におけるように実施した。

図４は、酵素反応からの生成物に関する時間の関数としての計算されたピーク面積のプロットを示す。説明：星印＝Ｇａｌ−Ｆｕｃ二糖、丸印＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ三糖、中空の四角＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ四糖。Ｇａｌ−Ｆｕｃ二糖および三糖と四糖の両方が形成される。三糖はＧａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃの形態であり、四糖はＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃの形態である。

Ｇａｌ−Ｆｕｃ二糖の濃度はＴ＝０からＴ＝６時間まで最大の上昇を示す。Ｔ＝６からＴ＝２２時間までは上昇の割合がより低い。Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ三糖の濃度は、Ｔ＝０からＴ＝６時間まで２番目に大きい上昇を示す。Ｔ＝６からＴ＝２２時間までは濃度がＴ＝４時間のレベルに低下する。Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ四糖の濃度はＴ＝０からＴ＝６時間まで上昇する。Ｔ＝６からＴ＝２２時間までは濃度がＴ＝４時間のレベルに低下する。

Ｄ−フコース含有ガラクトオリゴ糖の量（総炭水化物のｗ／ｗ）は、Ｔ＝２２時間からのＨＰＬＣおよびＭＳデータに基づいて推定される。Ｇａｌ−Ｆｕｃ＝２０％、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ＝６％およびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ＝１％。全体で、Ｄ−フコース含有ガラクトオリゴ糖はＴ＝２２時間の反応時間後に２７％を構成する。クロマトグラフィによる遊離Ｄ−フコースの除去後、計算されたＤ−フコース含有ガラクトオリゴ糖の量は５５％である。

Ｎ−アセチルガラクトサミン含有ヘテロガラクトオリゴ糖の合成
実験は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）１１０ｍｇ（９８％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を受容体分子として用いて、実施例４におけるように実施した。試料１００μＬをＴ＝０、４および２３時間の時点で取得した。試料の取得およびＨＰＬＣ特性付けは実施例２におけるように実施した。ＭＳ特性付けは実施例３におけるように実施した。

図５は、酵素反応からの生成物に関する時間の関数としての計算されたピーク面積のプロットを示す。説明：星印＝Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ二糖、丸印＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ三糖、中空の四角＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ四糖。Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ二糖および三糖と四糖の両方が形成される。三糖はＧａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃの形態であり、四糖はＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃの形態である。

Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ二糖の濃度は、Ｔ＝０からＴ＝２３時間まで直線的に上昇し、Ｔ＝２３時間に最も豊富なガラクトオリゴ糖である。Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ三糖の濃度は、Ｔ＝０からＴ＝４時間まで最大の上昇を示す。Ｔ＝４からＴ＝２３時間までは濃度の上昇の割合がより低く、Ｔ＝２３時間でほぼＧａｌ−ＧａｌＮＡｃレベルに達する。Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ四糖の濃度はＴ＝０からＴ＝２３時間まで上昇し、最大の上昇はＴ＝０からＴ＝４時間までである。Ｎ−アセチルガラクトサミン含有ガラクトオリゴ糖の量（総炭水化物のｗ／ｗ）は、Ｔ＝２３時間からのＨＰＬＣおよびＭＳデータに基づいて推定される。Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ＝８％、Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ＝５％およびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ＝２％。全体で、ＧａｌＮＡｃ含有ガラクトオリゴ糖はＴ＝２３時間の反応時間後に１５％を構成する。クロマトグラフィによる遊離ＧａｌＮＡｃの除去後、計算されたＮ−アセチルガラクトサミン含有ガラクトオリゴ糖の量は４０％である。

キシロシル含有ヘテロガラクトオリゴ糖の合成
実験は、Ｄ−（＋）−キシロース１１０ｍｇ（≧９９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を受容体分子として用いて、実施例４におけるように実施した。試料１００μＬをＴ＝０、５および２３時間の時点で取得した。試料の取得およびＨＰＬＣ特性付けは実施例２におけるように実施した。ＭＳ特性付けは実施例３におけるように実施した。

図６は、酵素反応からの生成物に関する時間の関数としての計算されたピーク面積のプロットを示す。説明：星印＝Ｇａｌ−Ｘｙｌ二糖、丸印＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ三糖、中空の四角＝Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ四糖。Ｇａｌ−Ｘｙｌ二糖および三糖と四糖の両方が形成される。三糖はＧａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌの形態であり、四糖はＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌの形態である。

Ｇａｌ−Ｘｙｌ二糖の濃度はＴ＝０からＴ＝５時間まで最大の上昇を示す。Ｔ＝５からＴ＝２３時間までは濃度がＴ＝４時間のレベルに低下する。Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ三糖の濃度は、Ｔ＝０からＴ＝５時間まで２番目に大きい上昇を示す。Ｔ＝５からＴ＝２３時間までは濃度がＴ＝４時間のレベルに低下する。Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ四糖の濃度はＴ＝０からＴ＝５時間まで上昇する。Ｔ＝５からＴ＝２３時間までは、濃度は観察可能なレベルで変化しない。

キシロシル含有ガラクトオリゴ糖の量（総炭水化物のｗ／ｗ）は、Ｔ＝２３時間からのＨＰＬＣおよびＭＳデータに基づいて推定される。Ｇａｌ−Ｘｙｌ＝１５％、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ＝３％、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ＝０．５％。全体で、キシロシル含有ガラクトオリゴ糖はＴ＝２３時間の反応時間後に１８．５％を構成する。クロマトグラフィによる遊離キシロースの除去後、計算されたキシロシル含有ガラクトオリゴ糖の量は４１％である。

Claims (14)

1. 下記の一般式で表される１またはそれ以上のガラクトオリゴ糖を含有する組成物を生産する方法であって、
   Ｇａｌ（Ｇａｌ）_ｉＸ
   （ここで、Ｇａｌはガラクトシル基を表し、Ｘはマンノシル、フコシル、Ｎ−アセチルガラクトサミニル、Ｎ−アセチルグルコサミニル、フルクトシル、タガトシルおよびマルトシルから選択されるガラクトシル受容体を表し、ｉは負でない整数である）
   ａ）−脱離基に結合したガラクトシル基を含み、最大でも３５０ｇ／モルのモル重量を有するガラクトシル供与体、
   −ガラクトシル供与体とは異なり、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、フルクトース、タガトースおよびマルトースから選択されるガラクトシル受容体
   を含む混合物であって、ガラクトシル受容体とガラクトシル供与体のモル比が１：５〜２０：１であり、少なくとも０．０５モル／Ｌのガラクトシル受容体および０．７モル／Ｌ以下のガラクトシル供与体を含む混合物を提供する段階、
   ｂ）β−ガラクトシダーゼ活性を有し、最大でも０．６のＴ値を有する酵素を提供して、前記酵素を前記混合物と接触させる段階であって、前記Ｔ値は以下の式により決められる、酵素を混合物と接触させる段階、
   Ｔ値＝生産されたガラクトースの量（モル）／使用されたラクトースの量（モル）
   （ここで、生産されたガラクトースの量（モル）ならびに使用されたラクトースの量（モル）は、ラクトース一水和物８２．５ｍｇを、当該ラクトースの３３％（ｗ／ｗ）を６．５のｐＨおよび３７℃の温度で１時間、使用するのに十分な酵素を含む酵素溶液３．３ｍＬと混合するアッセイにより決定される）、および
   ｃ）酵素にガラクトシル供与体の脱離基を放出させ、ガラクトシル供与体のガラクトシル基をガラクトシル受容体に転移させることでガラクトオリゴ糖を形成し、それによりガラクトオリゴ糖を含有する組成物を得る段階
   を含む方法。
2. 前記酵素のＴ値が０．５以下である、請求項１に記載の方法。
3. ガラクトシル供与体の脱離基がグリコシル基である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記段階ａ）の混合物に含まれるガラクトシル供与体が０．４モル／Ｌ以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記ガラクトシル供与体が、ラクトースまたはラクチトールである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ガラクトシル受容体が、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、およびＮ−アセチルグルコサミンから選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. ガラクトシル受容体が、マンノース、フコース、およびＮ−アセチルグルコサミンから選択される、請求項６に記載の方法。
8. 酵素が、
   −配列番号：２のＭｅｔ（１）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   −配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
   を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 酵素が、配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 酵素が、配列番号：２のＶａｌ（３３）からＩｌｅ（１１７４）までのアミノ酸配列からなる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 段階ｃ）がさらなるガラクトシル供与体の添加を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 段階ｃ）の間、混合物のガラクトシル供与体の濃度が０．０１〜１モル／Ｌの範囲内の濃度に維持される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. ｄ）段階ｃ）の組成物のガラクトオリゴ糖を富化する段階
    をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 富化がクロマトグラフィ分離および／またはナノろ過を含む、請求項９に記載の方法。

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