JP2003534007A - Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから単離された新たな酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Bifidobacterium bifidumから単離された、トランスガラクトシル化活性を有する新規なβ-ガラクトシダーゼに関し、β-ガラクトシダーゼタンパク質のＣ末端が欠失した結果、加水分解酵素活性よりも高いトランスガラクトシル化活性を有する酵素となっている切り詰め酵素に関する。ラクトースが基質として用いられる場合は、ガラクトオリゴ糖がトランスガラクトシラーゼ活性の生成物である。ガラクトオリゴ糖は、乳業における多数の応用において利用しうる、健康増進性Bifidobacteriumの成長を促進する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、発酵乳製品の改善に関する。特に本発明は、トランスガラクトシル
化活性を有するβ-ガラクトシダーゼに関する。とりわけ、本発明は、Bifidobac
terium bifidumから単離されたβ-ガラクトシダーゼに関し、ここではタンパク
質のＣ末端が欠失しており、生じた切り詰め酵素は加水分解酵素活性よりも高い
トランスガラクトシル化活性を有している。ラクトースが基質として用いられる
場合は、ガラクトオリゴ糖がトランスガラクトシラーゼ活性の生成物である。ガ
ラクトオリゴ糖は、乳業における多数の応用において利用しうる、健康増進性Bi
fidobacteriumの成長を促進する。

【０００２】

【従来の技術】

Bifidobacterium属は、様々な乳製品の発酵のために、乳業において最も一般
的に使用されるタイプの細菌培養菌である。Bifidobacterium含有生成物の摂取
は、更に健康増進効果を有する。この効果は、腸内容物の低いｐＨによって達成
されるのみならず、その腸微生物叢が例えば抗生物質の摂取によって乱された個
体において、腸内微生物叢を再生させるBifidobacteriumの性能によっても達成
される。Bifidobacteriumはさらに、有害でありうる腸内微生物を打ち負かす（o
utcompeting）可能性を有する。

【０００３】 ガラクトオリゴ糖は、Bifidobacteriumの成長を促進することが知られている
。この効果はおそらく、ガラクトオリゴ糖を炭素源として利用するBifidobacter
iumの独自の能力によって達成される。ガラクトオリゴ糖の食事サプリメントは
、更に、多くの長期的疾患保護効果を有すると考えられている。例えば、ガラク
トオリゴ糖摂取は、ラットにおける直腸結腸癌の発生に対する保護性が高いこと
が示されている（Wijnands, et al., 1999）。したがって、食事サプリメント及
び乳製品の改善のための該産業における使用のための、ガラクトオリゴ糖の安価
且つ有効な製造方法を開発することには、多大な興味が寄せられている。

【０００４】 酵素β-ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）は、通常はラクトースを
単糖類Ｄ-グルコース及びＤ-ガラクトースに加水分解する。β-ガラクトシダー
ゼ類の正常な酵素反応においては、前記酵素はラクトースを加水分解し、ガラク
トース単糖を一時的にガラクトース−酵素錯体中に結合させるが、該錯体はガラ
クトースを水のヒドロキシル基に移動させ、結果としてＤ-ガラクトース及びＤ-
グルコースが遊離する。しかしながら、高いラクトース濃度においては、β-ガ
ラクトシダーゼのなかには、トランスガラクトシル化と呼称される行程において
ガラクトースをＤ-ガラクトースまたはＤ-グルコースのヒドロキシル基に移動さ
せることのできるものがあり、これによればガラクトオリゴ糖が産生する。

【０００５】 トランスガラクトシル化を行うことのできる酵素は、細菌及び酵母を含む、広
範な微生物から単離されている。ガラクトオリゴ糖が健康増進性Bifidobacteriu
mの成長を増進することが観察されたため、Bifidobacterium及びこれらのβ-ガ
ラクトシダーゼ酵素類についての研究が活気付いてきた。B. breve及びB. longu
m β-ガラクトシダーゼの２つのＤＮＡ配列が、Genebankに寄託されている（そ
れぞれ受託番号Ｅ５０４０及びＡＪ２４２５９６）。Dumortierら（1994）は、B
. bifidum DSM20215が３つのβ-ガラクトシダーゼ類を含み、これらの酵素の１
つがトランスガラクトシル化特性を有する旨を報告している。しかしながら、こ
の活性を有する酵素、または前記酵素の如何なる配列、またはB. bifidum DSM20
215由来の対応する遺伝子のアイデンティフィケーションは、全く公開されてい
ない。

【０００６】 β-ガラクトシダーゼ類の使用によるガラクトオリゴ糖の製造は、数本の論文
において報告されている。例えば、E. Coli由来のβ-ガラクトシダーゼは、高ラ
クトース濃度（０．５Mまたはおよそ２０％のラクトース；Huber et al. 1976）
にてオリゴ糖を産生することが示されている。多様な好熱微生物が、高温及び高
ラクトース濃度にてオリゴ糖を産生することが示されており、例えばSterigmato
myces elviaeは６０℃にて２０％ラクトースから３９％のオリゴ糖を産生可能で
あり（Onishi & Tanaka, 1995）、Saccharopolyspora rectivirgulaは７０℃に
て１．７５Mラクトース中において４１％のオリゴ糖を合成可能である（Nako et
al., 1994）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】

しかしながら、上述の酵素はいずれも、著しいトランスガラクトシラーゼ活性
を示すためには高温または高ラクトース濃度を、あるいは両方を必要とするとい
う欠点を有する。したがって、当該産業における使用のための、ガラクトオリゴ
糖のより安価且つより有効な製造方法の開発が必要とされている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】

本発明は、Bifidobacterium bifidum由来の新規なβ-ガラクトシダーゼを開示
する。驚くべきことに、該酵素の切り詰めバージョンが高いトランスガラクトシ
ル化活性を有することが示された。切り詰め酵素、または組換え切り詰め酵素を
発現する宿主細胞を適当な条件下でラクトースと共にインキュベートした場合、
ガラクトオリゴ糖が高効率で産生する。乳製品または他の食料品中におけるガラ
クトオリゴ糖の存在は、前記食品中または該食品摂取後の消費者の腸内微生物叢
中、あるいはこれら両方における健康増進性Bifidobacteriumの成長を改善する
という利点を有する。

【０００９】

【発明の実施の形態】

本発明の第一の態様は、単離され、特徴付けされたBifidobacterium bifidum
由来の新規なβ-ガラクトシダーゼ、ＯＬＧＡ５（配列番号１及び配列番号２）
である。E. Coli細胞は、B. bifidum由来のPstＩ消化された染色体ＤＮＡからな
る挿入物を含むプラスミドを用いて形質転換した。β-ガラクトシダーゼ活性を
有するクローンを、発色性β-ガラクトシダーゼ基質を含むプレート上で選択し
た。正のコロニーの１つがおよそ２０kbの挿入物を有するプラスミド、ｐＯＬＧ
Ａ５（配列番号１）を含んでいた。ＤＮＡ配列のシークエンシングにより、ＯＬ
ＧＡ５ β-ガラクトシダーゼ（配列番号２）の演繹的アミノ酸配列は、現在知
られているβ-ガラクトシダーゼ類のおよそ２倍長いことが明らかになり、さら
に既知のβ-ガラクトシダーゼ類との配列相同性の程度が驚くほど低いことが示
される。E. Coliにおける組換えＯＬＧＡ５の発現は、酵素が、ラクトース加水
分解活性に加えて、トランスガラクトシル化活性も示すことを明らかにした。Ｏ
ＬＧＡ５酵素のＣ末端部分は、既知のβ-ガラクトシダーゼとは全く相同性を示
さなかった。引き続きＯＬＧＡ５の様々なＣ末端欠失ミュータントを構成し、生
成した酵素を、加水分解活性及びトランスガラクトシル化活性について調査した
。

【００１０】 本発明の第二の態様は、ＯＬＧＡ５の欠失ミュータント、例えばＯＬＧＡ３４
７である。幾つかのＣ末端欠失ミュータントの中で、５７８アミノ酸Ｃ末端欠失
を有するＯＬＧＡ３４７が、ラクトースと共にインキュベートした場合に、比較
的に低いラクトース濃度においてさえも、産生するオリゴ糖のレベルに最も著し
い増加を示した。該酵素は、実際上全てのガラクトース分子をガラクトース又は
グルコース上に転移させたようである。ＯＬＧＡ５のＣ末端の欠失のゆえに、前
記酵素は、加水分解性ＯＬＧＡ５ β-ガラクトシダーゼからトランスガラクト
シル化ＯＬＧＡ３４７-トランスガラクトシダーゼに変換した。天然のＯＬＧＡ
５酵素を含む、他のトランスガラクトシル化β-ガラクトシダーゼとは異なり、
切り詰めβ-ガラクトシダーゼＯＬＧＡ３４７は、ガラクトースを、試験したラ
クトース濃度全てにおいて高頻度で受容体糖分子上に転移させる。

【００１１】 １つの実施態様において、ＯＬＧＡ５、ＯＬＧＡ３４２、ＯＬＧＡ３４５、Ｏ
ＬＧＡ３４７、ＯＬＧＡ３４４、または他のあらゆるＯＬＧＡ５変異体をコード
する挿入物を有する発現ベクターが使用される。この発現ベクターは、Bifidoba
cterium、Lactococcus、Lactobacillus、Streptococcus、Leuconostoc、Escheri
chia、Bacillus、Streptomyces、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Tor
ula、Torulopsis、及びAspergillusを含む群より選択される宿主細胞に形質転換
可能である。Bifidobacterium属の細胞は、Bifidobacterium breve、Bifidobact
erium longum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium bifidum、及びLac
tococcus lactisからなる群より選択される。その後前記細胞は、ＯＬＧＡ５ま
たはＯＬＧＡ３４７変異体を発現させるような条件下において適当な培地中で培
養され、その後生成する酵素は前記培地より回収される。

【００１２】 本発明の別の実施態様においては、ＯＬＧＡ変異体は、発現ベクターの一部で
あるが、これは上述の宿主細胞のいずれにも形質転換することができる。該細胞
は、その後、ＯＬＧＡ５変異体を発現させるような条件下において適当な培地中
で培養され、その後生成する酵素は前記培地より回収される。該ＯＬＧＡ５変異
体は、いかなるランダムミューテーションまたは従来の分子生物学的技術によっ
て発生するいかなるミューテーションを含んでいても良い。ミューテーションし
た、またはワイルドタイプのＯＬＧＡ５ＤＮＡ分子のいかなる断片も、発現ベク
ターに挿入することができる。前記断片は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に
よって、または配列中に存在するあらゆる制限部位を利用して、あるいは両方の
組み合わせによって、発生させることができる。ＯＬＧＡ５変異体を発生させる
ための処理操作は、当業者には良く知られている。よって、本発明にとっては、
どの方法で変異体を得るかは重要ではない。本願において開示される変異体は、
配列中に存在する制限部位の使用によるサブクローニングによって得られる。

【００１３】 本発明の別の態様は、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、食事サプリメント、
及び共生適合性製品からなる群から選択される製品の製造のための、上述の細胞
タイプの１つ以上の使用に関する。この態様においては、Bifidobacteriumの成
長改善の技術的効果が、工業製品の品質の改善のために使用される。ガラクトオ
リゴ糖の添加により、健康増進性Bifidobacteriumの成長を促進する。したがっ
て、ＯＬＧＡ３４７によって生産されるガラクトオリゴ糖は、オリゴ糖の製造の
ために天然のβ-ガラクトシダーゼ類を使用することに比べて、ずっと安価で且
つ容易に得られる。

【００１４】 本発明の更に別の態様は、オリゴ糖の製造のための、ＯＬＧＡ５、ＯＬＧＡ３
４２、ＯＬＧＡ３４５、ＯＬＧＡ３４７、ＯＬＧＡ３４４、または別のあらゆる
ＯＬＧＡ５変異体の使用、または上述のあらゆる細胞タイプの１つ以上の使用に
関する。該オリゴ糖は、以下に限定されるものではないが、フラクトオリゴ糖、
ガラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、ラクトスクロース、
キシロオリゴ糖を含む。

【００１５】 本発明の１つの実施態様においては、前記オリゴ糖は、例えばラクツロース、
トレハロース、ラムノース、マルトース、スクロース、ラクトース、またはセロ
ビオースなどの二糖基質を含む培地中において、ＯＬＧＡ５変異体を発現する細
胞をインキュベートすることによって製造される。前記インキュベートは、オリ
ゴ糖が産生する条件下でにおいて行われる。前記細胞は、ヨーグルト、チーズ、
発酵乳製品、食事サプリメント、及び共生適合性製品からなる群より選択される
製品の一部であって良い。あるいはまた、前記オリゴ糖を回収し、続いて興味あ
る製品にその製造の前または後に添加することができる。オリゴ糖の添加は、Bi
fidobacterium単独の、または混合培地中におけるBifidobacteriumの、成長を促
進する。

【００１６】 別の実施態様においては、オリゴ糖は、例えばラクツロース、トレハロース、
ラムノース、マルトース、スクロース、ラクトース、またはセロビオースなどの
二糖基質を含む培地中において、ＯＬＧＡ５変異体をインキュベートすることに
よって製造される。前記インキュベートはオリゴ糖が産生する条件下でにおいて
行われる。ＯＬＧＡ５変異体及びラクトースを含む培地は、ヨーグルト、チーズ
、発酵乳製品、食事サプリメント、及び共生適合性製品からなる群より選択され
る製品の一部であって良い。あるいはまた、オリゴ糖を回収し、続いて興味ある
製品にその製造の前または後に添加することができる。オリゴ糖の添加は、Bifi
dobacterium単独の、または混合培地中におけるBifidobacteriumの、成長を促進
する。

【００１７】 （定義） 「β-ガラクトシダーゼまたはその断片」。β-ガラクトシダーゼは、ラクトー
スを単糖類Ｄ-グルコースとＤ-ガラクトースとに加水分解することのできる酵素
として定義される。β-ガラクトシダーゼの断片は、５−９８％、好ましくは４
０−９５％、最も好ましくは５５−７５％のタンパク質を含み、欠失は好ましく
はＣ末端に関する。

【００１８】 「宿主細胞」は、真菌、酵母、及び原核生物からなる群より選択される。前記
微生物は、より好ましくは原核生物であり、最も好ましくはBifidobacterium属
またはE. Coli種の細菌である。

【００１９】 「オリゴ糖」は、少なくとも３つの糖分子からなるオリゴ糖を意味する。オリ
ゴ糖の例は、以下に限定されるものではないが、ガラクトオリゴ糖である。オリ
ゴ糖の糖残基間の結合には、以下に限定されるものではないが、１−４及び１−
６結合が含まれる。

【００２０】 β-ガラクトシダーゼのラクトースとのインキュベートは、０．５−６０％の
ラクトース、好ましくは２−３０％のラクトース、最も好ましくは２−１５％の
ラクトースの存在下において起こる。

【００２１】 β-ガラクトシダーゼのラクトースとのインキュベートの条件は、５乃至７５
℃、好ましくは１５−４５℃、最も好ましくは３７℃の温度でインキュベートを
行うことによって定義される。インキュベートに必要な時間は、１−５０時間、
好ましくは５−４０時間、最も好ましくは１５−２５時間である。

【００２２】 「適合性製品」には、食品、飲料、錠剤、及び粉末などの摂取を企図する製品
が含まれる。

【００２３】

【実施例】

（実施例１） B. bifidumからのトランスガラクトシル化β-ガラクトシダーゼの単離及び特
徴付け。B. bifidum DSM 20215由来のPstＩ消化染色体ＤＮＡを、標準操作を用
いてｐＫＳプラスミド（Stratagene）にライゲートした。ライゲーション混合物
を、LacZ及びβ-ガラクトシダーゼ中においてE. Coli株ＭＴ１０２欠損中に形質
転換した。β-ガラクトシダーゼ産生クローンが、発色性β-ガラクトシダーゼ基
質Ｘ-galを含むプレート上において青色コロニーとして同定された。

【００２４】 青色コロニーの１つは、およそ２０kbの挿入物を有するプラスミド、ｐＯＬＧ
Ａ５を含んでいた。前記挿入物を、さらにサブクローニングし、部分的に配列決
定し、推定されるβ-ガラクトシダーゼ（ＯＬＧＡ５ β-ガラクトシダーゼ）を
コードするオープンリーディングフレームを同定した（図１）。ＢＬＡＳＴ探索
により、ＯＬＧＡ５ β-ガラクトシダーゼは、Streptomyces coelicolorβ-ガ
ラクトシダーゼ（ＡＬ１３３１７１）及びThermoanaerobacterethamolicus（Ｙ
Ｏ８５５７）との相同性が、それぞれ３８％及び３０％の同一性をもって、最も
高度であることを示した。図３には、ＯＬＧＡ５及び関連するアミノ酸配列の「
同一性樹形図」が示される。

【００２５】 ＯＬＧＡ５ β-ガラクトシダーゼのアミノ酸配列の詳細な分析により、該酵
素がそのＮ末端に推定されるシグナル配列を含むこと及び、該オープンリーディ
ングフレームが、現在知られているあらゆるβ-ガラクトシダーゼのおよそ２倍
大きな、１８５ｋＤａのポリペプチドをコードすることが明らかになった。E. C
oli中において製造された組換えＯＬＧＡ５酵素を精製し、Ｎ末端アミノ酸配列
決定により、シグナル配列がE. Coli中における発現の間に開裂したことを確認
した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、ＯＬＧＡ５ポリペプチドの分子量を確認した。

【００２６】 ｐＯＬＧＡ５を含む組換えE. Coli ＭＴ１０２の細胞抽出物を調製し、トラン
スガラクトシル化活性について分析した。図４は、ＯＬＧＡ５が、ラクトース加
水分解活性に加えてトランスガラクトシル化活性を呈したことを示す。

【００２７】 （実施例２） 高度なトランスガラクトシラーゼ活性を有する切り詰めＯＬＧＡ５ β-ガラ
クトシダーゼの構成。他のβ-ガラクトシダーゼに相同のＯＬＧＡ５の領域を、
タンパク質のＮ末端に位置する。Ｃ末端半分は、いかなる既知のβ-ガラクトシ
ダーゼにも相同性を示さなかった。しかしながら、シアリダーゼ様ガラクトース
結合領域が、Ｃ末端部分中に観察された。該ＯＬＧＡ５ β-ガラクトシダーゼ
のこのＣ末端部分の役割を、切り詰め欠失ミュータントの構成によって調査した
。生成する組換えβ-ガラクトシダーゼの加水分解活性及びトランスガラクトシ
ル化活性を分析した。図５は、ＯＬＧＡ５酵素のほぼ３分の一を欠失させて、依
然加水分解活性を維持できることを示す。

【００２８】 トランスガラクトシル化活性を分析したところ、プラスミドｐＯＬＧＡ５、ｐ
ＯＬＧＡ３４２、及びｐＯＬＧＡ３４５を含むE. Coliからの抽出物を用いても
同様の結果が得られた。しかしながら、ｐＯＬＧＡ３４７を有する細胞の抽出物
は、産生したオリゴ糖のレベルが増加し、ガラクトースがほとんど無いことを示
した。図５に示されるように、切り詰めＯＬＧＡ３４７ β-ガラクトシダーゼ
を含む抽出物は、確かにラクトースを加水分解したが、ガラクトースを水中のヒ
ドロキシル基上に移動させる変わりに、前記酵素は実際上全てのガラクトース分
子をガラクトースまたはグルコース上に移動させた（またはグリセリン上に移動
させた；ＴＬＣ上でグルコースよりも僅かに遅く移動するスポットは、ＮＭＲに
よりガラクト-グリセリンと判明した−データ表示無し）。結論として、ＯＬＧ
Ａ３４７は、真の「トランスガラクトシラーゼ」である。

【００２９】 （実施例３） ＯＬＧＡ３４７のトランスガラクトシル化活性の特徴付け。ＯＬＧＡ３４７
β-ガラクトシダーゼのトランスガラクトシル化活性を定量するために２つの方
法を用いた：放射性標識ラクトースを含む反応混合物のＴＬＣ分析、及び未標識
ラクトースの酵素変換後のＨＰＬＣ分析。

【００３０】 放射能を用いる実験を、グルコースのＣ−１位置に¹⁴Ｃ標識を含むラクトース
を用いて行った。前記標識が該二糖のグルコース部分にあるため、グルコースを
含む反応生成物のみが欠失した。図７には、１５％ラクトース及び様々な量のＯ
ＬＧＡ３４７酵素を用いたトランスガラクトシル化実験の結果が示される。ＴＬ
Ｃによる反応混合物の分離後、該プレートをスキャンして放射性スポットをホス
ホイメージャーで計量した。低酵素濃度（抽出物０乃至０．２μl）では、グル
コースレベルとオリゴ糖レベルとがほぼ同一であり、全てのグルコース分子がト
ランスガラクトシル化反応において基質として利用されたことを示している。「
遊離の」加水分解グルコースは、高酵素濃度においてのみ現れた。

【００３１】 未標識ラクトースを用いた実験では、様々な基質及び酵素濃度を試験した。図
８には、酵素反応における基質として１０％、２０％、及び４０％のラクトース
を、様々な濃度のＯＬＧＡ３４７酵素と共に使用した実験が示される。反応混合
物をＨＰＬＣで分析し、ラクトース、グルコース、ガラクトース、及びガラクト
-オリゴ糖の濃度を算出した。図８には、酵素濃度の増加につれてラクトース濃
度は低下し、グルコース濃度は増加するが実際上「遊離の」ガラクトースは全く
生産されないことが示され、これはラクトース中のほぼ全てのガラクトース分子
が別の糖に転移していることを示す。低酵素濃度での反応において測定された炭
水化物濃度の計算により、グルコースとガラクトースとの間の比率がおよそ０．
１であることが示されたが、これは、遊離のガラクトースとグルコースとに加水
分解された全てのラクトース分子について、トランスガラクトシル化において９
つのラクトース分子が使用されたことを意味する。図８に見られるように、トラ
ンスガラクトシル化反応は、１０乃至４０％ラクトースの範囲において、ラクト
ース濃度に依存しない。１０％、２０％または４０％ラクトースを基質として用
いたトランスガラクトシル化反応において産生した、ガラクト-オリゴ糖の最大
収量は、それぞれ３９％、４４％、及び３７％であった（添加したラクトース１
mgあたりに産生したオリゴ糖（mg）。）

【００３２】

【参考文献】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＯＬＧＡ５配列である。Bifidobacterium bifidum由
来のＯＬＧＡ５ β-ガラクトシダーゼのＤＮＡ及びタンパク質配列。シグナル
配列は太字で示され、ＯＬＧＡ３４７において欠失したＯＬＧＡ５遺伝子の一部
はイタリック体で示される。欠失を起こすために使用されたBglII部位には、ハ
イライトがかかっている。

【図２】 図２は、β-ガラクトシダーゼ活性部位領域の比較を示す。E.
Coli由来の触媒Glu461残基（ハイライトがかかっている）の周囲の領域の整列。
該配列は、これらのデータベース受託番号によって同定される。６-ホスホ-β-
ガラクトシダーゼ配列には、（Ｐ）印が付けてある。

【図３】 図３は、図１の直線の近隣連結分析を示すが、ここではSulfol
ubus配列を外群として使用した。ブートストラップ分析（ｎ＝１００）の結果を
、８０より大きな値の接合部について示す。

【図４】 図４は、ＯＬＧＡ５トランスガラクトシラーゼ活性を示す。プ
ラスミド中のＯＬＧＡ５遺伝子を有するE. Coli細胞の全細胞溶解産物を、０．
４Mのラクトースと共に３７℃において２０時間に亘りインキュベートした。５
０μlの全反応体積には、全細胞溶解産物の表示量が含まれていた。反応試料を
、シリカゲルＴＬＣプレート上で分析した。前記プレートに、オルシノール試薬
をスプレーして糖類を画像化した。

【図５】 図５は、ＯＬＧＡ５ β-ガラクトシダーゼのＣ末端欠失を示
す図である。１７５２アミノ酸オープンリーディングフレームは、ＯＬＧＡ５
β-ガラクトシダーゼをコードするが、ここでは開始３２アミノ酸がおそらくシ
グナルペプチド（白四角）を表す。ＯＬＧＡ５の欠失ミュータントを、指示され
た制限部位を使用して構成した。一晩成長させた細菌培養物から調製した溶解産
物を、β-ガラクトシダーゼ活性の測定のために使用し、相対結果をそれぞれの
構成物の右に示した。使用した制限酵素の記号：BglＩＩ（Ｂ）、EcoＲＩ（Ｅ）
、EcoＲＶ（Ｖ）、HindＩＩＩ（Ｈ）、KpnＩ（Ｋ）、NruＩ（Ｎ）、PstＩ（Ｐ）
。

【図６】 図６は、トランスガラクトシラーゼ活性のＴＬＣ分析を示す。
試験した２つの欠失ミュータント、ＯＬＧＡ３４７及びＯＬＧＡ３４５について
の全細胞溶解産物を、指示量で使用し、５０μlの全体積中において０．４Mのラ
クトースと反応させた。反応物を３７℃にて２０時間に亘ってインキュベートし
た。試料を、シリカゲルＴＬＣプレート上で分析した。前記プレートには、オル
シノール試薬をスプレーして糖類を画像化した。

【図７】 図７は、ＯＬＧＡ３４７によって産生されるオリゴ糖を示す。
指示量のＯＬＧＡ３４７全細胞溶解物を、１５％のラクトースと共にμlの全体
積中において、２１時間に亘り３７℃にてインキュベートした。グルコースＣ−
１位において¹⁴Ｃで標識した放射性ラクトースを使用した。試料をＴＬＣプレー
ト上で分離させ、ホスホイメージャーを使用して計量した。Ａ：ラクトース、グ
ルコース、及びガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）スポットからの¹⁴Ｃシグナルの測定
に使用した画像。Ｂ：バックグラウンド（計器レーン）を差し引いた後の¹⁴Ｃ測
定シグナル。

【図８】 図８は、ＯＬＧＡ３４７酵素反応性生物のＨＰＬＣ測定を示す
。１０％、２０％、及び４０％のラクトース中における反応を、指示量のＯＬＧ
Ａ３４７全細胞溶解物を使用して行った。２００μlの全体積を使用し、反応物
を３７℃にて２０時間に亘ってインキュベートした。希釈した試料を、ＨＰＬＣ
分析にかけ、標準曲線を使用して、観察されたピーク領域を濃度（mg/ml）に変
換した。Ａ：１０％ラクトースを用いたＯＬＧＡ３４７反応後に得られた糖（mg
/ml）。Ｂ：２０％ラクトースを用いたＯＬＧＡ３４７反応後に得られた糖（mg/
ml）。Ｃ：４０％ラクトースを用いたＯＬＧＡ３４７反応後に得られた糖（mg/m
l）。Ｄ：１０％反応から得られた結果のプロットである。ガラクトオリゴ糖の
生成量は、グルコースまたはガラクトースとして回収されなかったラクトースの
量として算出される（「ＧＯＳ」）。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１２月１８日（２００２．１２．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ ４Ｂ０６５ 1/20 1/21 1/21 9/10 9/10 9/38 9/38 Ｃ１２Ｐ 19/18 Ｃ１２Ｐ 19/18 Ｃ１２Ｒ 1:01 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B001 AC30 AC31 BC14 EC05 4B018 LB07 LB08 LB10 MD31 MD86 ME02 ME08 ME11 MF12 MF13 4B024 AA05 BA10 BA12 DA05 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD02 LL02 LL05 4B064 AF04 CA02 CA19 CA21 CB07 CB30 CC24 CD09 DA10 4B065 AA01X AA21X AA21Y AB01 AC14 BA02 BB15 CA21 CA29 CA31 CA41 CA42

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
   をコードする、または ｂ）ストリンジェントな条件下でａ）の配列にハイブリダイズする、または ｃ）ａ）もしくはｂ）の配列の変性体である、 ＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 前記配列が、配列番号１に示されるものであるかその断片で
   ある、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 前記配列が、２１２−２１４の位置のＡＴＧから開始して５
   ４６８−５４７０の位置のＴＧＡで終了する、配列番号１由来の配列、またはそ
   のあらゆる断片を含む、請求項２に記載のＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 前記配列が、２１２−２１４の位置のＡＴＧから開始して３
   ７３１−３７３４の位置のＡＴＣＴで終了する、配列番号１由来の配列、または
   そのあらゆる断片を含む、請求項３に記載のＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 前記配列が、３０８−３１０の位置のＧＴＣから開始して５
   ４６８−５４７０の位置のＴＧＡで終了する、配列番号１由来の配列、またはそ
   のあらゆる断片を含む、請求項３に記載のＤＮＡ配列。
6. 【請求項６】 前記配列が、３０８−３１０の位置のＧＴＣから開始して３
   ７３１−３７３４の位置のＡＴＣＴで終了する、配列番号１由来の配列、または
   そのあらゆる断片を含む、請求項３に記載のＤＮＡ配列。
7. 【請求項７】 前記配列が、ヌクレオチド置換、付加、または欠失を含み、
   これにより配列番号２に記載されたアミノ酸配列において６０％未満、好ましく
   は４５％未満、更に好ましくは２５％未満の変化を生じている配列、またはその
   断片を含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。
8. 【請求項８】 前記配列が、ヌクレオチド置換を含み、これにより保存的ア
   ミノ酸置換がもたらされている、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡ
   配列。
9. 【請求項９】 請求項１乃至８のいずれか一項のＤＮＡ配列によってコード
   される酵素。
10. 【請求項１０】 配列番号２に記載のアミノ酸配列、またはその断片を含む
    酵素。
11. 【請求項１１】 配列番号２に定義される配列を有するβ-ガラクトシダー
    ゼ。
12. 【請求項１２】 配列番号２に定義される配列のＭｅｔ（１）乃至Ｇｌｙ（
    １７５２）、またはその断片を有する請求項１０に記載の酵素。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の成熟β-ガラクトシダーゼ。
14. 【請求項１４】 配列番号２に定義される配列のＭｅｔ（１）乃至Ｉｌｅ（
    １１７４）、またはその断片を有する請求項１０に記載の酵素。
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のトランスガラクトシル化酵素。
16. 【請求項１６】 配列番号２に定義される配列のＡｌａ（３３）乃至Ｉｌｅ
    （１１７４）、またはその断片を有する請求項１４に記載の酵素。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の成熟トランスガラクトシル化酵素。
18. 【請求項１８】 下記の特徴： ａ）１００g/Lラクトースの溶液中、３７℃におけるトランスガラクトシル化活
    性のβ-ガラクトシダーゼ活性に対する比が、少なくとも１：１である、 ｂ）１００g/Lラクトースの溶液を用いる、３７℃でのバッチ反応において、少
    なくとも２５％のガラクトオリゴ糖の産生を触媒する、 ｃ）１００g/Lラクトースの溶液を用いる、３７℃でのバッチ反応において、ガ
    ラクト-オリゴ糖の産生を触媒し、ここでガラクト-オリゴ糖の濃度が最高である
    反応時には、ラクトース由来のガラクトースの１５％未満が遊離形態で存在する
    、 の１つ以上を有する請求項１４乃至１７のいずれか一項のトランスガラクトシル
    化酵素。
19. 【請求項１９】 請求項１乃至８のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列を含む
    組換えベクター。
20. 【請求項２０】 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項１９のベク
    ター。
21. 【請求項２１】 請求項１乃至８のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列を含む
    宿主細胞。
22. 【請求項２２】 請求項１９または２０のベクターを含む宿主細胞。
23. 【請求項２３】 前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、または真菌細胞である
    、請求項２１または２２の細胞。
24. 【請求項２４】 前記細胞が、Bifidobacterium、Lactococcus、Lactobacil
    lus、Streptococcus、Leuconostoc、Escherichia、Bacillus、Streptomyces、Sa
    ccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torula、Torulopsis、及びAspergillus
    からなる群より選択される、請求項２３の細胞。
25. 【請求項２５】 前記細胞が、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium l
    ongum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium bifidum、及びLactococcu
    s lactisからなる群より選択される、請求項２４の細胞。
26. 【請求項２６】 ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、食事サプリメント、及
    び共生適合性製品からなる群から選択される製品の製造のための、請求項２１乃
    至２５のいずれか一項に記載の細胞の使用。
27. 【請求項２７】 請求項２１乃至２５のいずれか一項に記載の細胞を含む乳
    製品。
28. 【請求項２８】 請求項１４乃至１８のいずれか一項に記載のトランスガラ
    クトシル化酵素または請求項２１乃至２５のいずれか一項に記載の細胞の、ガラ
    クトオリゴ糖の製造のための使用。
29. 【請求項２９】 請求項１４乃至１８のいずれか一項に記載のトランスガラ
    クトシル化酵素または請求項２１乃至２５のいずれか一項に記載の細胞の、ヨー
    グルト、チーズ、発酵乳製品、食事サプリメント、及び共生適合性製品からなる
    群から選択される製品の一部としてガラクトオリゴ糖を製造するための使用。
30. 【請求項３０】 請求項１４乃至１８のいずれか一項に記載のトランスガラ
    クトシル化酵素または請求項２１乃至２５のいずれか一項に記載の細胞の、ガラ
    クトオリゴ糖を製造してBifidobacteriumの増殖を促進するための使用。
31. 【請求項３１】 請求項１４乃至１８のいずれか一項に記載のトランスガラ
    クトシル化酵素または請求項２１乃至２５のいずれか一項に記載の細胞の、ガラ
    クトオリゴ糖を製造して混合培地発酵におけるBifidobacteriumの増殖を促進す
    るための使用。
32. 【請求項３２】 請求項１４乃至１８のいずれか一項に記載のトランスガラ
    クトシル化酵素の製造方法であって、前記酵素を発現させる条件下で、適当な培
    地中において請求項２１乃至２５のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程、
    及び前記培地から生成した酵素を回収する工程を含む方法。
33. 【請求項３３】 請求項１４乃至１８のいずれか一項に記載の酵素または請
    求項２１乃至２５のいずれか一項に記載の細胞を、ラクトースの溶液と接触させ
    る工程を含む、ガラクト-オリゴ糖の製造方法。