CN108699549B

CN108699549B - β-半乳糖苷酶

Info

Publication number: CN108699549B
Application number: CN201680076645.0A
Authority: CN
Inventors: 星由纪子; 冈田正通; 堀井晃夫; 北条真之
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2036-12-27
Also published as: JP7122114B2; JPWO2017115826A1; US11859222B2; AU2016382107A1; US20230193233A1; US20190119662A1; US11512299B2; CN108699549A; US20240084278A1; EP3399032A1; AU2016382107B2; EP3399032A4; WO2017115826A1; CA3009043A1

Abstract

本发明的课题在于提供一种在低聚糖的制造中有用的β‑半乳糖苷酶。本发明公开了一种β‑半乳糖苷酶，含有序列号1～4中的任一种氨基酸序列或与该氨基酸序列80％以上相同的氨基酸序列。

Description

β-半乳糖苷酶

技术领域

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶。本发明的β-半乳糖苷酶用于制造例如作为肠内双歧杆菌增殖因子已知的低聚半乳糖。本申请主张基于2015年12月29日提出申请的日本专利申请第2015-257705号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照而被引入。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是将β-D-半乳糖苷键水解而使D-半乳糖游离的酶，通常广泛存在于微生物和动植物中。β-半乳糖苷酶的别名也被称为乳糖酶，作为用于由在制造乳糖不耐受症用的低乳糖牛奶、奶酪时副产生的乳清制造乳清糖浆的酶、或者作为乳糖不耐受症患者用的医药、补充剂的有效成分使用。另外，β-半乳糖苷酶还具有通过β键转移半乳糖残基的能力，已知有利用该能力制造低聚半乳糖(具有半乳糖残基的低聚糖)的方法。作为生产在这些用途中使用的β-半乳糖苷酶的微生物，已知有米曲霉(Aspergillusoryzae)、独特掷孢酵母(Sporobolomyces singularis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、艾尔维梗孢酵母(Sterigmatomyces elviae)等(例如，参照专利文献1～3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平3-216185号公报

专利文献2：日本特公平6-2057号公报

专利文献3：日本特开平7-236480号公报

发明内容

从耐热性、pH稳定性等观点考虑，已知的β-半乳糖苷酶大多不适于产业上的利用。因此，本发明的课题在于提供在产业上的利用、特别是低聚糖的制造中有用的β-半乳糖苷酶及其用途。

为了解决上述课题，本发明人以广泛种类的微生物为对象实施了筛选。其结果，成功地发现产生最适温度高且耐热性优异并且糖转移活性也优异的β-半乳糖苷酶的隐球菌属微生物(野生株)。通过将该菌株所产生的β-半乳糖苷酶进行纯化并对其特征进行详细调查，结果作为进一步优越的特性，判明在酸性pH区域具有稳定性；以乳糖为底物发挥作用时，有效地生成作为肠内双歧杆菌增殖因子的有用性特别高的直链低聚糖等。另一方面，由于该β-半乳糖苷酶为被外分泌的酶，因此，从其生产的方面考虑也是有利的。如此，经过潜心研究，结果成功地取得作为低聚糖制造用酶的利用价值极高的β-半乳糖苷酶(为了方便，称为“野生株酶”)。另外，还成功地确定了野生株酶的基因序列。另一方面，为了提高β-半乳糖苷酶的生产率等，反复进行了上述微生物(野生株)的基于UV处理的突变和随后的筛选，结果成功地作出了有用的突变株。在对得到的突变株的特性进行研究的过程中，从两种突变株发现合计3种β-半乳糖苷酶(突变株酶)。经过进一步研究，成功地确定了这些突变株酶的氨基酸序列。这些酶均为野生株酶的片段(一部分)，并非天然存在的。更具体而言，是野生株酶的N末端氨基酸序列的一部分缺失的突变型的酶，与野生株酶相比，稳定性(pH、温度)提高。

以下的发明是基于上述的成果而完成的。

[1]一种β-半乳糖苷酶，含有序列号1～4中的任一种氨基酸序列或与该氨基酸序列80％以上相同的氨基酸序列。

[2]根据[1]所述的β-半乳糖苷酶，其中，氨基酸序列为与序列号1～4中的任一种氨基酸序列85％以上相同的氨基酸序列。

[3]根据[1]所述的β-半乳糖苷酶，其中，氨基酸序列为与序列号1～4中的任一种氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的β-半乳糖苷酶，由长度不超过序列号1的序列长度的氨基酸序列构成。

[5]一种β-半乳糖苷酶，具有下述的酶化学性质：

(1)作用：具有乳糖分解活性和半乳糖基转移活性，且向β-1,4键的转移活性比向β-1,6键、β-1,3键或β-1,2键的转移活性优越，

(2)最适温度：70℃，

(3)不含糖链时的分子量：约104kDa、约64kDa或约61kDa(利用SDS-PAGE测得)。

[6]根据[5]所述的β-半乳糖苷酶，进一步具有下述的酶化学性质：

(4)最适pH：4～5，

(5)pH稳定性：在pH2～8的范围内稳定(40℃、30分钟)，

(6)温度稳定性：在30℃～60℃的范围内稳定(pH6.0、30分钟)。

[7]根据[5]所述的β-半乳糖苷酶，进一步具有下述的酶化学性质：

(4)最适pH：4～5，

(5)pH稳定性：在pH2～9的范围内稳定(40℃、30分钟)，

(6)温度稳定性：在30℃～65℃的范围内稳定(pH6.0、30分钟)。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的β-半乳糖苷酶，来自土生隐球菌。

[9]根据[8]所述的β-半乳糖苷酶，其中，土生隐球菌为MM13-F2171株(保藏号：NITE BP-02177)或APC-6431株(保藏号：NITE BP-02178)。

[10]一种酶剂，以[1]～[9]中任一项所述的β-半乳糖苷酶作为有效成分。

[11]一种β-半乳糖苷酶基因，由选自以下(a)～(c)中的任一种DNA构成：

(a)编码序列号1～4中的任一种氨基酸序列的DNA，

(b)由序列号5～8、16中的任一种碱基序列构成的DNA，

(c)具有与序列号5～8、16中的任一种碱基序列等价的碱基序列，且编码具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质的DNA。

[12]一种重组DNA，含有[11]所述的β-半乳糖苷酶基因。

[13]一种微生物，保有[12]所述的重组DNA。

[14]一种β-半乳糖苷酶的制造法，包括以下的步骤(1)和(2)：

(1)培养土生隐球菌的步骤，

(2)从培养后的培养液和/或菌体回收β-半乳糖苷酶的步骤。

[15]根据[14]所述的制造法，其中，土生隐球菌为MM13-F2171株或其突变株。

[16]一种β-半乳糖苷酶的制造法，包括以下的步骤(i)和(ii)：

(i)在产生上述基因编码的蛋白质的条件下培养[13]所述的微生物的步骤，

(ii)回收所产生的上述蛋白质的步骤。

[17]一种低聚糖的制造方法，包括使[1]～[9]中任一项所述的β-半乳糖苷酶作用于具有β-1,3键、β-1,4键和β-1,6键中的至少一个的二糖、低聚糖或多糖的步骤。

[18]一种低聚糖的制造方法，包括使[1]～[9]中任一项所述的β-半乳糖苷酶作用于乳糖的步骤。

[19]根据[17]或[18]所述的制造方法，其中，上述步骤的反应温度为30℃～75℃。

[20]一种低聚糖，是通过[17]～[19]中任一项所述的制造方法而得到的。

[21]根据[20]所述的低聚糖，其中，含有的三糖低聚糖的65％以上为直链低聚糖。

[22]一种[1]～[9]中任一项所述的β-半乳糖苷酶的应用，用于制造低聚糖。

附图说明

图1是来自土生隐球菌(Cryptococcus terrestris)MM13-F2171株的野生株酶(β-半乳糖苷酶)的分子量的测定结果(SDS-PAGE)。M：分子量标记，泳道1：无处理，泳道2：O-糖苷酶/神经氨酸苷酶处理，泳道3：PNGase F处理，泳道4：O-糖苷酶/神经氨酸苷酶/PNGase F处理。应予说明，对于糖链处理中使用的酶的分子量，O-糖苷酶为147kDa，神经氨酸苷酶为43kDa，PNGase F为36kDa。

图2是纯化酶的最适pH。

图3是纯化酶的pH稳定性。

图4是纯化酶的最适温度。

图5是纯化酶的温度稳定性。

图6是纯化酶(野生株酶)的低聚糖生成能力。

图7是纯化酶(野生株酶)的低聚糖生成能力。以乳糖为底物，使来自MM13-F2171株的纯化酶(野生株酶)反应。将低聚半乳糖(GOS)生成量约为50％时的GOS的聚合度与已知的β-半乳糖苷酶进行比较(上段)。另外，将三糖中的直链低聚糖和支链低聚糖的比率与已知的β-半乳糖苷酶进行比较(下段)。

图8是来自土生隐球菌M2株的突变株酶、来自土生隐球菌M6株的突变株酶的分子量的测定结果(SDS-PAGE)。泳道1～4为来自M2株的突变株酶的结果。M：分子量标记，泳道1：无处理，泳道2：O-糖苷酶/神经氨酸苷酶处理，泳道3：PNGase F处理，泳道4：O-糖苷酶/神经氨酸苷酶/PNGase F处理。泳道5～8为来自M6株的突变株酶的结果。泳道5：无处理，泳道6：O-糖苷酶/神经氨酸苷酶处理，泳道7：PNGase F处理，泳道8：O-糖苷酶/神经氨酸苷酶/PNGase F处理。

图9是纯化酶(突变株酶3)的低聚糖生成能力。

图10是纯化酶(突变株酶)的低聚糖生成能力。以乳糖为底物，使来自土生隐球菌M2株的纯化酶(突变株酶1)、来自土生隐球菌M6株的纯化酶(突变株酶3)反应。将低聚半乳糖(GOS)生成量约为50％时的GOS的聚合度与已知的β-半乳糖苷酶进行比较(上段)。另外，将三糖中的直链低聚糖和支链低聚糖的比率与已知的β-半乳糖苷酶进行比较(下段)。

图11是纯化酶(突变株酶1)的最适pH。

图12是纯化酶(突变株酶3)的最适pH。

图13是纯化酶(突变株酶1)的pH稳定性。

图14是纯化酶(突变株酶3)的pH稳定性。

图15是纯化酶(突变株酶1)的最适温度。

图16是纯化酶(突变株酶3)的最适温度。

图17是纯化酶(突变株酶1)的温度稳定性。

图18是纯化酶(突变株酶3)的温度稳定性。

具体实施方式

1.术语

本说明书中术语“分离”可与“纯化”交换使用。术语“分离”是为了与天然的状态，即在自然界中存在的状态的物质进行区别而使用的。通过分离这样的人为操作，成为与天然的状态不同的状态，即“分离的状态”。经分离的物质与天然物本身明显且决定性地不同。

经分离的酶的纯度没有特别限定。但是，如果预定应用于要求纯度高的用途，则优选经分离的酶的纯度高。

β-半乳糖苷酶通常显示乳糖分解活性(作用于β-1,4键而分解乳糖的活性)和半乳糖基转移活性(将半乳糖转移的活性)。因此，本发明中的“β-半乳糖苷酶活性”包含这两个活性。乳糖分解活性可以通过实施例所示的活性测定法(乳糖法)进行测定。另外，半乳糖基转移活性可以通过实施例所示的低聚糖生成能力的聚合度的测定法进行评价。

2.β-半乳糖苷酶及其生产菌

本发明的第1方面提供β-半乳糖苷酶及其生产菌。如上所述，本发明人等从隐球菌属微生物(野生株)成功地取得了有用性高的β-半乳糖苷酶(为了方便说明，称为“野生株酶”)，并且确认了其基因序列。另一方面，鉴定了突变株所产生的3种β-半乳糖苷酶(突变株酶1、2、3)，并确定了其氨基酸序列。这3种β-半乳糖苷酶是由野生株酶的基因序列推定的全长氨基酸序列(序列号1)的一部分。具体而言，是全长氨基酸序列(序列号1)的N末端侧130氨基酸残基缺失的酶(为了方便说明，称为“突变株酶1”)；全长氨基酸序列(序列号1)的N末端侧136氨基酸残基缺失的酶(为了方便说明，称为“突变株酶2”)；全长氨基酸序列(序列号1)的N末端侧141氨基酸残基缺失的酶(为了方便说明，称为“突变株酶3”)。基于这些成果和见解，本发明的β-半乳糖苷酶(以下，也称为“本酶”)具备下述特征：含有序列号1～4中的任一种氨基酸序列或与该氨基酸序列等价的氨基酸序列。序列号2的氨基酸序列相当于突变株酶1的氨基酸序列，序列号3的氨基酸序列相当于突变株酶2的氨基酸序列，序列号4的氨基酸序列相当于突变株酶3的氨基酸序列。

此处的“等价的氨基酸序列”是指与作为基准的序列(序列号1～4中的任一种氨基酸序列)一部分不同，但该不同不会对蛋白质的功能(此处是β-半乳糖苷酶活性)造成实质性影响的氨基酸序列。因此，具有由等价的氨基酸序列构成的多肽链的酶显示β-半乳糖苷酶活性。活性的程度只要能够发挥作为β-半乳糖苷酶的功能就没有特别限定。但是，优选与具有由作为基准的序列构成的多肽链的酶同等程度或者比其高。优选等价的氨基酸序列由长度不超过序列号1的序列的长度的氨基酸序列构成。

“氨基酸序列的一部分不同”典型而言是指因构成氨基酸序列的1～几个(上限例如为3个、5个、7个、10个)氨基酸的缺失、取代、或者1～几个(上限例如为3个、5个、7个、10个)氨基酸的附加、插入或它们的组合而导致氨基酸序列发生突变(变化)。此处的氨基酸序列的不同只要可保持β-半乳糖苷酶就被允许(活性可以稍微变动)。只要满足该条件，则氨基酸序列不同的位置没有特别限定，另外，可以在多个位置产生不同。此处的“多个”例如为相当于小于全部氨基酸的约20％的数量，优选为相当于小于约15％的数量，进一步优选为相当于小于约10％的数量，更进一步优选为相当于小于约5％的数量，最优选为相当于小于约1％的数量。即等价蛋白质与作为基准的序列具有例如约80％以上、优选约85％以上、进一步优选约90％以上、进一步优选约95％以上、更进一步优选约97％以上、最优选约99％以上的相同性。应予说明，氨基酸序列的不同可以在多个位置产生。

优选通过在对β-半乳糖苷酶不必需的氨基酸残基中发生保守性氨基酸取代而得到等价的氨基酸序列。此处的“保守性氨基酸取代”是指将某个氨基酸残基取代成具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而被分为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)之类的几个家族。保守性氨基酸取代优选为相同家族内的氨基酸残基间的取代。

然而，两个氨基酸序列或两个核酸序列(以下，作为含有它们的术语，使用“两个序列”)的相同性(％)例如可以通过以下的步骤来确定。首先，以能够进行最佳的比较的方式将两个序列进行排列(例如，可以在第一序列导入空位(gap)而使其与第二序列的比对最佳化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列的对应的位置的分子相同时，可以说该位置的分子相同。两个序列的相同性是指该两个序列共通的相同位置的数量的函数(即，相同性(％)＝相同位置的数量/位置的总数×100)，优选将比对的最佳化所需的空位的数量和尺寸也纳入考虑。

两个序列的比较和相同性的确定可以利用数学算法来实现。作为可利用于序列比较的数学算法的具体例，有在Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68中记载的、在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中进行了改变的算法，但并不限定于该方法。这样的算法已被编入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中记载的NBLAST程序和XBLAST程序(版本2.0)。为了得到等价的核苷酸序列，例如只要在NBLAST程序中使score＝100、wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索即可。为了得到等价的氨基酸序列，例如只要在XBLAST程序中使score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索即可。为了得到用于比较的空位比对，可以利用Altschul等(1997)Amino Acids Research 25(17)：3389-3402中记载的Gapped BLAST。利用BLAST和GappedBLAST时，可以采用对应的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。详细而言，请参照http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。作为可利用于序列比较的其它数学算法的例子，有Myers和Miller(1988)Comput Appl Biosci.4：11-17中记载的算法。将这样的算法例如已被编入可GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier，法国)或ISREC服务器中利用的ALIGN程序。氨基酸序列的比较利用ALIGN程序时，例如可以使用PAM120残基质量表，使空位长罚分＝12，空位罚分＝4。

可以使用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，使空位权重＝12、10、8、6或4，空位长权重＝2、3或4来确定两个氨基酸序列的相同性。另外，可以使用GCG软件包(可在http：//www.gcg.com中利用)的GAP程序，使空位权重＝50，空位长权重＝3来确定两个核酸序列的相同度。

本酶可以为更大的蛋白质(例如融合蛋白质)的一部分。作为在融合蛋白质中附加的序列，例如可举出多重组氨酸残基这样的对纯化有用的序列、确保重组生产时的稳定性的附加序列等。

具有上述氨基酸序列的本酶可以通过基因工程学方法而容易地制备。例如可以通过用编码本酶的DNA转化适当的宿主细胞(例如大肠杆菌)，回收转化体内表达的蛋白质而制备。回收的蛋白质可以根据目的适当地纯化。如果如此得到本酶重组蛋白质，则可以进行各种修饰。例如，如果将编码本酶的DNA和其它适当的DNA插入相同的载体并使用该载体进行重组蛋白质的生产，则能够得到由连接有任意的肽或蛋白质的重组蛋白质构成的本酶。另外，可以实施糖链和/或脂质的附加、产生N末端或C末端的加工这样的修饰。通过如上所述的修饰，可以简化重组蛋白质的提取、纯化，或者附加生物学功能等。

然而，本发明人等也成功地确定了成功取得的β-半乳糖苷酶的酶化学特性(参照后述的实施例)。因此，也可以用以下的酶化学性质(1)～(3)来表征本酶。

(1)作用

本酶具有乳糖分解活性和半乳糖基转移活性，向β-1,4键的转移活性比向β-1,6键、β-1,3键或β-1,2键的转移活性优越。即，本酶向β-1,4键的转移活性优异。因此，利用本酶，能够有效地得到转移的糖以β-1,4键键合的生成物。例如，如果使本酶作用于乳糖(底物)，则得到富含直链低聚糖的三糖低聚糖。直链低聚糖为构成单糖以β-1,4糖苷键连接的结构的低聚糖，与支链低聚糖(具有β-1,6糖苷键、β-1,2糖苷键等)形成对照。对于在后述的实施例所示的反应条件(低聚糖生成能力的研究1栏)下，以乳糖为底物使本酶发挥作用时得到的三糖低聚糖，65％以上、优选70％以上、进一步优选72％以上、进一步优选为73％以上、更进一步优选为75％以上为直链低聚糖(O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡萄糖)。应予说明，本酶所生成的直链低聚糖为低聚半乳糖。一般而言，低聚半乳糖由Gal-(Gal)n-Glc(n为0～5左右)表示(Gal：半乳糖残基，Glc：葡萄糖残基)。键合样式除β-1,4、β-1,6、β-1,3、β-1,2以外，还有α-1,3、α-1,6等。但是，本发明中，乳糖不属于低聚半乳糖。因此，本说明书中“低聚半乳糖(GOS)”是指除乳糖以外的聚合度为二糖以上的低聚半乳糖。

本酶的糖转移活性优异。如果在后述的实施例所示的反应条件(低聚糖生成能力的研究栏)下，以乳糖为底物使本酶发挥作用，则虽然根据反应温度条件而发生变动，但低聚半乳糖占反应后的全部糖中的45％以上(在最适温度附近反应时为50％以上)。

(2)最适温度

本酶的最适温度为70℃。如此最适温度高作为用于制造低聚糖的酶是有利的。在低聚糖的制造中利用本酶时，可以将处理温度(反应温度)设定得较高。通过提高处理温度，底物的溶解度增大，能够进行高浓度投料。其结果，可期待单位反应液量的低聚半乳糖的生成量(收量)的增加。另外，也可实现浓缩成本的降低。此外，也能够降低污染的风险。应予说明，最适温度可以通过使用乙酸缓冲液(pH6.0)并以乳糖为底物的测定法进行评价。

(3)分子量

属于本酶的野生株酶、突变株酶1～3均含有糖链，如果在除去N型糖链和O型糖链后用SDS-PAGE测定分子量，则为104kDa(野生株酶)、64kDa(突变株酶1)、61kDa(突变株酶2)、61kDa(突变株酶3)。基于该事实，本酶的一个方式中，不含糖链时的分子量(利用SDS-PAGE测得)为104kDa。在另一方式中，该分子量为64kDa。在又一方式中，该分子量为61kDa。应予说明，不进行糖链的除去处理时的分子量(利用SDS-PAGE测得)为120kDa(野生株酶)、71kDa(突变株酶1)、66kDa突变株酶2)、66kDa(突变株酶3)。

可以用以下的酶化学性质(4)～(6)进一步表征本酶。

(4)最适pH

最适pH为4～5。最适pH例如可以基于在pH2～3的pH区域在0.1M甘氨酸缓冲液、在pH3～6的pH区域在0.1M柠檬酸缓冲液、在pH5～6的pH区域在0.1M乙酸缓冲液、在pH7～8的pH区域在0.1M磷酸缓冲液、在pH9～10的pH区域在0.1M碳酸钠缓冲液中测得的结果来判断。

(5)pH稳定性

一个方式的酶在pH2～8的pH区域显示稳定的活性，另一方式的酶在pH2～9的pH区域显示稳定的活性。即，如果供于处理的酶溶液的pH在该范围内，则在40℃、30分钟的处理后，显示最大活性的80％以上的活性。pH稳定性例如可以基于在pH2～3的pH区域在0.1M甘氨酸缓冲液、在pH3～6的pH区域在0.1M柠檬酸缓冲液、在pH5～6的pH区域在0.1M乙酸缓冲液、在pH7～8的pH区域在0.1M磷酸缓冲液、在pH9～10的pH区域在0.1M碳酸钠缓冲液中测得的结果来判断。

(6)温度稳定性

一个方式的酶即便在乙酸缓冲液(pH6.0)中、在30℃～60℃的条件下处理30分钟，仍维持80％以上的活性。另一方式的酶即便在乙酸缓冲液(pH6.0)中、在30℃～65℃的条件下处理30分钟，仍维持80％以上的活性。

本酶优选为来自土生隐球菌(Cryptococcus terrestris)的β-半乳糖苷酶。此处的“来自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶”是指被分类为土生隐球菌的微生物(可以为野生株也可以为突变株)生产的β-半乳糖苷酶、或者利用土生隐球菌(可以为野生株也可以为突变株)的β-半乳糖苷酶基因并通过基因工程学方法得到的β-半乳糖苷酶。因此，利用导入有由土生隐球菌取得的β-半乳糖苷酶基因(或者改变该基因而得到的基因)的宿主微生物生产的重组体也属于“来自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶”。

为了方便说明，将成为本酶来源的土生隐球菌称为本酶的生产菌。

如后述的实施例所示，本发明人等成功地从土生隐球菌MM13-F2171株及其突变株(M2株、M6株)分离·纯化了具备上述性质的β-半乳糖苷酶。应予说明，土生隐球菌MM13-F2171株和M2株如下保藏在规定的保藏机构，可容易地获得。

＜土生隐球菌MM13-F2171株＞

保藏机构：独立行政法人制品评价技术基础机构，专利微生物保藏中心(〒292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)

识别表示：土生隐球菌MM13-F2171

保藏日：2015年12月10日

保藏号：NITE BP-02177

＜土生隐球菌M2株＞

识别表示：土生隐球菌APC-6431

保藏日：2015年12月10日

保藏号：NITE BP-02178

3.编码β-半乳糖苷酶的基因、重组DNA、转化体

本发明的第2方面涉及编码本酶的基因。在一个方式中本发明的基因含有编码序列号1～4中的任一种氨基酸序列的DNA。该方式的具体例为由序列号5的碱基序列构成的cDNA(编码序列号1的氨基酸序列)、由序列号6的碱基序列构成的cDNA(编码序列号2的氨基酸序列)、由序列号7的碱基序列构成的cDNA(编码序列号3的氨基酸序列)和由序列号8的碱基序列构成的cDNA(编码序列号4的氨基酸序列)。进一步的具体例为由序列号16的碱基序列构成的基因组DNA。该基因组DNA与序列号5的cDNA对应。

编码本酶的基因典型而言被利用于本酶的制备。根据使用了编码本酶的基因的基因工程学制备法，能够得到更均质状态的本酶。另外，该方法在制备大量本酶时也可以说是适当的方法。应予说明，编码本酶的基因的用途并不限于本酶的制备。例如，也可以利用该基因作为以阐明本酶的作用机制等为目的的实验用的工具、或者用于设计或制作本酶的突变体(改变体)的工具。

本说明书中“编码本酶的基因”是指使其表达时可得到本酶的核酸，自然包括具有与本酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸，还包括在这样的核酸中附加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。另外，也考虑密码子的简并。

本发明的基因可以通过参考本说明书或附加的序列表所公开的序列信息，利用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法、化学合成、PCR法(例如重叠PCR)或它们的组合而制备成分离的状态。

一般而言，对编码某种蛋白质的DNA的一部分实施改变时，有时改变后的DNA所编码的蛋白质具有与改变前的DNA所编码的蛋白质同等的功能。即有时DNA序列的改变不对所编码的蛋白质的功能实质上造成影响，所编码的蛋白质的功能在改变前后得以维持。因此，本发明作为其它方式提供具有与作为基准的碱基序列(序列号5～8、16中的任一种序列)等价的碱基序列且编码具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质的DNA(以下，也称为“等价DNA”)。此处的“等价的碱基序列”是指与作为基准的碱基序列所示的核酸一部分不同，但其所编码的蛋白质的功能(此处是β-半乳糖苷酶活性)不会因该不同而受到实质性的影响的碱基序列。

等价DNA的具体例是在严格条件下对与作为基准的碱基序列互补的碱基序列进行杂交的DNA。此处的“严格条件”是指形成所谓的特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。这样的严格条件是本领域技术人员公知的，例如可以参照Molecular Cloning(ThirdEdition,Cold Spring Harbor L aboratory Press,New York)、Current protocols inmolecular biology(edited b y Frederick M.Ausubel et al.,1987)进行设定。作为严格条件，例如可以举出使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约50℃进行温育，然后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃进行清洗的条件。作为进一步优选的严格条件，例如可以举出作为杂交液使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15MNaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。

作为等价DNA的其它具体例，可举出由相对于作为基准的碱基序列包含1个或多个(优选为1～几个)碱基的取代、缺失、插入、附加或者倒位的碱基序列构成且编码具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以发生在多个部位。此处的“多个”也根据该DNA所编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类而不同，例如为2～40个碱基，优选为2～20个碱基，更优选为2～10个碱基。等价核酸相对于作为基准的碱基序列，具有例如60％以上、优选为70％以上、更优选为80％以上、更进一步优选为85％以上、进一步优选为约90％以上、进一步更优选为95％以上、最优选为99％以上的相同性。如上所述的等价DNA例如可以通过利用限制性内切酶处理、利用核酸外切酶、DNA连接酶等的处理、基于定位突变导入法(Molecular Cloning,Third Edition,Chapter 13,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York)、随机突变导入法(Molecular Cloning,ThirdEdition,Chapter 13,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)的突变导入等，以包含碱基的取代、缺失、插入、附加和/或倒位的方式对具有作为基准的碱基序列的DNA进行改变而得到。另外，也可以通过紫外线照射等其它方法得到等价DNA。作为等价DNA的又一个例子，可举出由于SNP(单核苷酸多态性)所代表的多态性而确认到如上所述的碱基的不同的DNA。

本发明的其它方式涉及具有与本发明的编码本酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的又一方式提供相对于本发明的编码本酶的基因的碱基序列或与其互补的碱基序列具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％相同的碱基序列的核酸。

本发明的又一方面涉及含有本发明的基因(编码本酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA例如以载体的形态提供。本说明书中术语“载体”是指能够将插入该载体的核酸输送至细胞等靶内的核酸性分子。

可以根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，并且考虑宿主细胞的种类来选择适当的载体。作为以大肠杆菌为宿主的载体，可例示M13噬菌体或其改变体、λ噬菌体或其改变体、pBR322或其改变体(pB325、pAT153、pUC8等)等，作为以酵母为宿主的载体，可例示pYepSec1、pMFa、pYES2等，作为以昆虫细胞为宿主的载体，可例示pAc、pVL等，作为以哺乳类细胞为宿主的载体，可例示pCDM8、pMT2PC等。

本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”是指能够将插入其中的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内且能够在该细胞内表达的载体。表达载体通常含有对插入的核酸的表达所需要的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用含有选择标记的表达载体。使用该表达载体时，可以利用选择标记来确认有无导入表达载体(及其程度)。

DNA向载体的插入、选择标记基因的插入(在需要的情况下)、启动子的插入(在需要的情况下)等可以使用标准的重组DNA技术(例如，可以参照Molecular Cloning,ThirdEdition,1.84,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York，使用限制性内切酶和DNA连接酶的众所周知的方法)进行。

本发明进一步涉及导入有本发明的重组DNA(含有本发明的基因)宿主细胞(转化体)。在本发明的转化体中，本发明的重组DNA作为外源性分子存在。本发明的转化体优选通过使用上述本发明的载体的转染或转化而制备。转染、转化可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter,H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161-7165(1984))、脂质转染(Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,7413-7417(1984))、显微注射(Graessmann,M.&Graessmann,A.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73,366-370(1976))、Hanahan的方法(Hanahan,D.,J.Mol.Biol.166,557-580(1983))、乙酸锂法(Schiestl,R.H.et al.,Curr.Genet.16,339-346(1989))、原生质体-聚乙二醇法(Yelton,M.M.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.81,1470-1474(1984))等来实施。

宿主细胞只要表达本酶就没有特别限定，例如可以从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)等芽孢杆菌(Bacillus)属细菌，乳球菌(Lactococcus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、双歧杆菌(Bifidobacterium)等乳酸菌，埃希杆菌(Escherichia)、链霉菌(Streptomyces)等其它细菌，酵母菌(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、假丝酵母(Candida)、圆酵母(Torula)、球拟酵母(Torulopsis)、毕赤酵母(Pichia)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)等酵母，米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉菌(Aspergillus)属，青霉(Penicillium)属，木霉(Trichoderma)属，镰刀菌(Fusarium)属等丝状菌(真菌)等中选择。

4.β-半乳糖苷酶的制造方法

本发明的第2方面提供β-半乳糖苷酶的制造方法。在本发明的制造方法的一个方式中，进行培养土生隐球菌的步骤(步骤(1))和从培养后的培养液和/或菌体回收β-半乳糖苷酶的步骤(步骤(2))。作为土生隐球菌，优选使用MM13-F2171株或其突变株(例如，土生隐球菌APC-6431(M2株)、该株的进一步的突变株)。培养条件、培养法只要可生产本酶就没有特别限定。即，可以将可产生本酶作为条件而适当地设定适于使用的微生物的培养的方法、培养条件。作为培养法，液体培养、固体培养中的任一种均可，优选利用液体培养。以液体培养为例，对其培养条件进行说明。

作为培养基，只要为使用的微生物可生长的培养基就没有特别限定。例如，可以使用添加有葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源，进一步添加有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵，或者使用添加有蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦糠、肉提取物等氮源，进一步添加有钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进使用的转化体的整张，可以在培养基中添加维生素、氨基酸等。培养基的pH例如调整为约3～8，优选调整为约4～7左右，培养温度通常为约20～40℃，优选为约25～35℃左右，在需氧条件下培养1～10天、优选3～6天左右。作为培养法，例如可利用振荡培养法、利用发酵罐的需氧深层培养法。

在以上的条件下培养后，从培养液或菌体回收目标酶(步骤(2))。从培养液回收时，例如通过对培养上清液进行过滤、离心处理等而除去不溶物后，适当地组合利用超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种层析等进行分离、纯化，从而能够得到本酶。另一方面，从菌体内回收时，例如通过加压处理、超声波处理等将菌体破碎后，与上述同样地进行分离、纯化，从而可以得到目标蛋白质。应予说明，也可以通过过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、纯化)。

在本发明的其它方式中，使用上述的转化体制造β-半乳糖苷酶。在该方式的制造法中，首先，在产生由导入其中的基因所编码的蛋白质的条件下培养上述的转化体(步骤(i))。关于各种载体宿主体系，转化体的培养条件是公知的，只要是本领域技术人员就能够容易地设定适当的培养条件。接着培养步骤，将产生的蛋白质(即，β-半乳糖苷酶)回收(步骤(ii))。对于回收及其后的纯化，只要与上述方式的情况同样地进行即可。

β-半乳糖苷酶的纯化度没有特别限定。最终的形态可以为液态，也可以为固态(包括粉体状)。

也可以将如上所述得到的纯化酶通过例如冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等制成粉末而提供。此时，可以预先将纯化酶溶解于乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、GOOD的缓冲液。优选使用乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应予说明，此处，作为GOOD的缓冲液，可举出PIPES、MES或MOPS。

5.酶剂

本酶例如可以以酶剂的形态提供。本酶剂除含有有效成分(即本酶)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为有效成分的本酶的纯化度没有特别限制。即，可以为粗酶，也可以为纯化酶。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、麦芽糊精、白糖、食盐等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、枸橼酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

6.β-半乳糖苷酶的用途

本发明的进一步的方面提供本酶或本酶剂的用途。用途的例子为低聚半乳糖的制造、低乳糖牛奶的制造、或者用于乳糖不耐受症患者的医药、补充剂的制造。低聚半乳糖例如作为肠内双歧杆菌增殖因子利用。本酶或本酶剂在低聚半乳糖的制造中特别有用。利用本酶或本酶剂，可以以乳糖为原料，制作富含直链低聚糖的(即，与支链低聚糖相比，直链低聚糖的比例多)低聚半乳糖。在制造低聚半乳糖时，例如，在预先加热溶解的30％～65％乳糖液(pH 5.0)1L中加入75U～5000U的本酶，在30℃～75℃反应15小时～50小时，生成低聚半乳糖。本酶由于最适温度高，因此，能够将处理温度(反应温度)设定得较高(例如40℃～75℃，优选为50℃～75℃，进一步优选为60℃～75℃，进一步优选为65℃～75℃)。通过提高处理温度，底物的溶解度增加，能够进行高浓度投料。使用本酶或本酶剂制造低聚糖时的原料(底物)优选乳糖，但并不限于次。可以采用具有β-1,3键、β-1,4键和β-1,6键中的至少一个的二糖、低聚糖或多糖作为原料。

实施例

1.β-半乳糖苷酶的取得

为了取得适于制造低聚半乳糖的β-半乳糖苷酶，以广泛种类的微生物作为对象进行筛选。其结果判明在基于独立行政法人制品评价技术基础机构的“关于亚洲地域的生物遗传资源的保全和可持续利用的共同事业”中在2013年10月于缅甸的Heho机场附近采取的土壤试样中含有的土生隐球菌是有希望的产生菌。因此，尝试了从该菌株(土生隐球菌MM13-F2171株)纯化β-半乳糖苷酶。应予说明，土生隐球菌MM13-F2171株以土生隐球菌MM13-F2171的名称在2015年12月10日被保藏在独立行政法人制品评价技术基础机构的专利微生物保藏中心，被赋予保藏号NITE BP-02177。

(1)乳糖分解活性的测定方法

量取含有12％乳糖的0.1M乙酸缓冲液(pH 6.0)5.0mL，在40℃预热10分钟。添加样品1mL，在40℃放置10分钟后，加入1.5M氢氧化钠1.0mL，进一步在40℃放置5分钟使反应停止。将该溶液在冰水槽中冷却后，添加1.5M盐酸1.0mL进行中和。使用糖原稳定法(和光纯药工业，葡萄糖试剂盒，Glucose CII-Test Wako)对该反应液100μl测定反应液中的葡萄糖量。将每1分钟生成相当于1μmol的葡萄糖的酶量设为1U。

(2)纯化操作和结果

将土生隐球菌MM13-F2171株在液体培养基(2.0％乳糖、2.0％酵母提取物、0.1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、pH5.0)中在30℃进行4天振荡培养(200转/分钟)。培养后，通过离心分离回收约3L的上清液，使用超滤膜(AIP-1013D，膜内径0.8mm(旭化成化学株式会社))进行浓缩·脱盐处理。在脱盐处理时，使用20mM乙酸缓冲液pH6.0。

将该浓缩液供于已用20mM乙酸缓冲液pH6.0平衡化的阴离子交换柱HiTrap DEAEFF(GE Healthcare Bioscience)。以含有1M NaCl的20mM乙酸缓冲液pH6.0的梯度来洗脱吸附成分，确认了酶活性。

收集确认有酶活性的级分，用含有1.8M硫酸铵的20mM乙酸缓冲液pH6.0进行透析。

将得到的酶活性级分供于已用含有1.8M硫酸铵的20mM乙酸缓冲液pH6.0平衡化的疏水柱HiTrap Phenyl HP(GE Healthcare Bioscience)。以20mM乙酸缓冲液pH6.0的梯度来洗脱吸附成分，确认了酶活性。收集确认有酶活性的级分，用含有0.2M NaCl的20mM乙酸缓冲液pH6.0进行透析。

将得到的酶活性级分供于已用含有0.2M的NaCl的20mM乙酸缓冲液pH6.0平衡化的凝胶过滤柱HiLoad Superdex 200prep grade(GE Healthcare Bioscience)，回收显示酶活性的级分。通过使用HiLoad Superdex 200prep grade的凝胶过滤法进行测定，结果分子量为约266kDa。如果与SDS-PAGE的结果(下述)一并考察，则认为形成了二聚体。

接下来，用SDS-PAGE测定野生株酶的分子量。首先，对野生株酶进行改性处理(在改性缓冲液中，沸腾水浴，10分钟)后，供于O型糖链除去处理(O-糖苷酶和神经氨酸苷酶的同时处理)(O-Glycosidase&Neuraminidase Bundle，New England Biolabs公司))和/或N型糖链除去处理(利用PNGase F(New England Biolabs公司)的处理)。处理条件依照酶附带的操作规程。处理后，用SDS-PAGE测定分子量。将SDS-PAGE的结果示于图1。无处理时(泳道1)的分子量为120kDa，除去了O型糖链时(泳道2)的分子量为106kDa，除去了N型糖链时(泳道3)的分子量为104kDa，除去了O型糖链和N型糖链时(泳道4)的分子量为104kDa。

2.纯化酶的内部氨基酸序列

对纯化酶的氨基酸序列进行解析，结果判明了含有以下的序列。

GVQYVDYNSPT(序列号9)

FLFGWATAAQQ(序列号10)

QAYQIGIFAEPIYNT(序列号11)

PSIWDWAS(序列号12)

EEPPFAYVPE(序列号13)

3.基因序列的确定

尝试对编码土生隐球菌MM13-F2171株所产生的β-半乳糖苷酶的基因序列进行鉴定。将土生隐球菌MM13-F2171株在液体培养基(2.0％乳糖、2.0％酵母提取物、0.1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、pH5.0)中在30℃进行24小时振荡培养(200转/分钟)。培养后，进行集菌。依照RNeasy Mini Kit(QIAGEN)的从酵母提取RNA(利用机械的菌体破碎)的操作规程来制备总RNA。使用SMARTer RACE 5’/3’kit(TaKaRa)由得到的总RNA合成cDNA，实施5’和3’RACE PCR。5’RACE用GSP引物使用GATTACGCCAAGCTTgcaaagatcccgatctggtacgcctg(序列号14)，3’RACE用GSP引物使用GATTACGCCAAGCTTttcctgtttggctgggcgaccgcc(序列号15)。对得到的RACE PCR产物的碱基序列进行解析，确认了全长cDNA序列(序列号5)。应予说明，将由全长cDNA序列编码的推定氨基酸序列示于序列号1。

进一步进行研究，结果成功地确定了编码土生隐球菌MM13-F2171株所产生的β-半乳糖苷酶的基因组DNA序列(序列号16)。

4.纯化酶的性质的研究

(1)最适pH和pH稳定性

将乳糖分解活性作为指标，对纯化酶的最适pH和pH稳定性进行了研究。在最适pH研究中，在pH2～3的pH区域使用0.1M甘氨酸缓冲液，在pH3～6的pH区域使用0.1M柠檬酸缓冲液，在pH5～6的pH区域使用0.1M乙酸缓冲液，在pH7～8的pH区域使用0.1M磷酸缓冲液，在pH9～10的pH区域使用0.1M碳酸钠缓冲液。将测定结果示于图2。纯化酶的最适pH为4～5。

在各pH的缓冲液(使用上述缓冲液)中，在40℃加热30分钟后，测定残留活性，由此对pH稳定性进行了研究。将结果示于图3。纯化酶在pH2～8的pH区域显示稳定的活性。

(2)最适温度和温度稳定性

为了研究最适温度，使用乙酸缓冲液(pH6.0)，测定在各温度的乳糖分解活性。将结果示于图4。最适温度为70℃。为了研究温度稳定性，在乙酸缓冲液(pH6.0)中，在各温度加热30分钟后，测定乳糖分解活性。将结果示于图5。在30℃～60℃是稳定的，活性保持在80％以上。

5.低聚糖生成能力的研究1

(1)方法

对纯化酶的低聚糖生成能力进行了研究。在预热至反应温度的53％乳糖溶液中，每1g乳糖添加1U的野生株酶，在各温度反应24小时。用HPLC进行分析(以下的条件)，调查反应后的溶液中所含的糖的组成。应予说明，可以由糖组成的测定结果来评价转移活性。

对纯化酶(野生株酶)中的低聚半乳糖(GOS)生成量成为约50％时的GOS的聚合度和三糖的支化度进行了调查。依据上述的条件实施，采用在纯化酶(土生隐球菌)中GOS生成量成为约50％的条件，在65℃反应24小时。为了比较，还测定了已知的β-半乳糖苷酶产生菌罗伦隐球酵母(日本特公平6-2057号公报)和独特掷孢酵母(日本特开平3-216185号公报)的低聚糖生成能力。以在来自罗伦隐球酵母出自的酶和来自独特掷孢酵母的酶中GOS生成量也成为约50％的方式进行反应。

＜聚合度的测定＞

使用柱：MCI^TMGEL CK04S(三菱化学)

洗脱液：H₂O

流速：0.4ml/分钟

检测器：RI

柱温：80℃

＜支化度的测定＞

使用柱：Shodex(注册商标)Asahipak NH2P-40 3E(昭和电工株式会社)

洗脱液：MeCN：H₂O＝75：25(vol：vol)

流速：0.35ml/分钟

检测器：RI

柱温：25℃

(2)结果

由测定结果算出每个反应温度的低聚半乳糖(GOS)在反应液中所含的糖(全糖)中所占的比例(％)和GOS中的聚合度的比率(％)(图6)。可知纯化酶(野生株酶)的GOS生成能力优异。另外，在高温条件下显示高的转移活性，可以说对低聚糖的制造有用。

由测定结果算出GOS中的聚合度的比率(％)。将使用纯化酶(野生株酶)时的聚合度的结果(代表性的结果)示于图7上段。可知野生株酶(土生隐球菌)的GOS生成能力优异，特别是有效地生成三糖以上的低聚糖。

由测定结果算出生成的三糖中的直链低聚糖和支链低聚糖的比例(％)，用各酶比较支链的比率(支化度)。将使用纯化酶(野生株酶)时的支化度的结果示于图7下段。可知野生株酶(土生隐球菌)主要生成直链低聚糖。即，表明具有β-1,4糖苷键特异性转移活性，特别是难以以形成β-1,6糖苷键的方式进行糖转移。

6.突变株产生的β-半乳糖苷酶的取得、氨基酸序列的鉴定、分子量的测定

通过利用UV处理的突变，由土生隐球菌MM13-F2171株得到两种突变株(M2株和M6株)。将这些突变株所产生的β-半乳糖苷酶通过与上述1.(2)同样的步骤进行纯化。M2株和M6株均具有突变株酶1～3的产生能力，但M2株的突变株酶1的产生能力特别高，M6株的突变株酶2和突变株酶3的产生能力特别高。应予说明，土生隐球菌M2株以土生隐球菌APC-6431的名称在2015年12月10日被保藏在独立行政法人制品评价技术基础机构的专利微生物保藏中心，被赋予保藏号NITE BP-02178。

确定得到的纯化酶，即来自突变株M2的酶(突变株酶1)、来自突变株M6的两种酶(突变株酶2、突变株酶3)的氨基酸序列。首先，使用蛋白质测序仪(PPSQ-31A，岛津制作所)确定突变株酶1～3的N末端氨基酸序列。接下来，从野生株酶的cDNA序列(序列号5)中找出与各突变株酶的N末端氨基酸序列对应的碱基序列，确定编码各突变株酶的cDNA序列。突变株酶1的氨基酸序列(序列号2)相当于由野生株酶的cDNA序列(序列号5)推定的全长氨基酸序列(序列号1)的N末端侧130氨基酸残基缺失的氨基酸序列。同样地，突变株酶2的氨基酸序列(序列号3)相当于全长氨基酸序列(序列号1)的N末端侧136氨基酸残基缺失的氨基酸序列，突变株酶3的氨基酸序列(序列号4)相当于全长氨基酸序列(序列号1)的N末端侧141氨基酸残基缺失的氨基酸序列。

接下来，用SDS-PAGE测定各突变株酶的分子量。糖链处理的操作·条件依据上述1.(2)。将SDS-PAGE的结果示于图8。无处理时、除去了N型糖链时、除去了O型糖链时、除去了O型糖链和N型糖链时的各突变株酶的分子量如下。应予说明，由SDS-PAGE的结果能够确认M2株除产生突变株酶1以外，还产生了突变株酶2和突变株酶3。

＜无处理时＞

突变株酶1(泳道1、5)：71kDa

突变株酶2(泳道1、5)：66kDa

突变株酶3(泳道1、5)：66kDa

＜除去了O型糖链时＞

突变株酶1(泳道2、6)：65kDa

突变株酶2(泳道2、6)：63kDa

突变株酶3(泳道2、6)：62kDa

＜除去了N型糖链时＞

突变株酶1(泳道3、7)：64kDa

突变株酶2(泳道3、7)：61kDa

突变株酶3(泳道3、7)：61kDa

＜除去了O型糖链和N型糖链时＞

突变株酶1(泳道4、8)：64kDa

突变株酶2(泳道4、8)：61kDa

突变株酶3(泳道4、8)：61kDa

7.低聚糖生成能力的研究2

(1)方法

在乳糖溶液中添加来自M2株的纯化酶(突变株酶1)或来自M6株的纯化酶(突变株酶3)进行反应，对反应后的溶液中所含的糖的聚合度和支化度进行分析。反应条件、聚合度和支化度的测定依据上述5.。

(2)结果

由测定结果算出每个反应温度的GOS在反应液中所含的糖(全糖)中所占的比例(％)和GOS中的聚合度的比率(％)(图9)。可知纯化酶(突变株酶)的GOS生成能力优异。另外，在高温条件下显示高的转移活性，可以说对低聚糖的制造有用。另外，可知野生株酶和突变株酶的GOS生成能力没有差别。

由测定结果算出GOS中的聚合度的比率(％)。将使用来自M2株的纯化酶(突变株酶1)、来自M6株的纯化酶(突变株酶3)时的结果(代表性的结果)示于图10上段。可知突变株酶的GOS生成能力优异，特别是有效地生成三糖以上的低聚糖。另外，可知野生株酶和突变株酶的GOS生成能力没有差别。

由测定结果算出生成的三糖中的直链低聚糖和支链低聚糖的比例(％)，用各酶比较支链的比率(支化度)(图10下段)。可知突变株酶(土生隐球菌)主要生成直链低聚糖。即，表明具有β-1,4糖苷键特异性转移活性，特别是难以以形成β-1,6糖苷键的方式进行糖转移。另外，确认了野生株酶和各突变株酶显示同等的GOS生成能力，在作为β-半乳糖苷酶的特性方面，这些酶之间没有实质性的差异。突变株酶2是与突变株酶1相比N末端侧短6个氨基酸残基且与突变株酶3相比N末端侧长5个氨基酸残基的酶。由上述结果表明N末端区域的氨基酸序列对酶的特性不造成影响，因此，推测突变株酶2也具有与突变株酶1、3同等的特性。

8.突变株酶1和突变株酶3的性质的研究

使用纯化酶(参照上述6.)，确认突变株酶1和突变株酶3的性质。实验方法与野生株酶的情况(参照上述4.)同样。

(1)最适pH和pH稳定性

将关于最适pH的测定结果示于图11(突变株酶1)和图12(突变株酶3)。突变株酶1和突变株酶3的最适pH均为4～5。另一方面，将关于pH稳定性的测定结果示于图13(突变株酶1)和图14(突变株酶3)。突变株酶1和突变株酶3均在pH2～9的pH区域显示稳定的活性。

(2)最适温度和温度稳定性

将关于最适温度的测定结果示于图15(突变株酶1)和图16(突变株酶3)。突变株酶1和突变株酶3的最适温度均为70℃。另一方面，将关于温度稳定性的测定结果示于图17(突变株酶1)和图18(突变株酶3)。突变株酶1和突变株酶3均在30℃～65℃稳定，活性保持在80％以上。

产业上的可利用性

本发明提供特别是在低聚糖的制造中有用的β-半乳糖苷酶。本发明的β-半乳糖苷酶例如在制造直链低聚糖的含有率高的低聚半乳糖的目的中有用。

本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限制。在不脱离权利要求书的记载、本领域技术人员能够容易地想到的范围内的各种变形方式也包含在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报和专利公报等的内容通过援引而引用其全部的内容。

序列表

<110> 天野酶制品株式会社

<120> 新型β-半乳糖苷酶

<130> AE15009P

<150> JP P2015-257705

<151> 2015-12-29

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 696

<212> PRT

<213> 土生隐球菌

<400> 1

Met Ile Pro Ala Ser Ala Leu Leu Ala Ala Val Pro Leu Leu Ala Gln

1 5 10 15

Gln Val Ser Ala Gly Ile Leu Arg Arg Gln Asn Ala Ala Gly Ser Asp

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<212> PRT

<213> 土生隐球菌

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<212> PRT

<213> 土生隐球菌

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<212> PRT

<213> 土生隐球菌

<400> 4

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<210> 5

<211> 2091

<212> DNA

<213> 土生隐球菌

<400> 5

atgatcccgg caagtgcact ccttgccgcc gtacccctcc ttgcccaaca ggtgagcgcc 60

ggcatactgc gaagacagaa tgctgcgggt tcggattcgg cagcgcctga ctcgatcgcg 120

gatgcgtcca ccggtgtcgt ctcgtcgatc gccacggaag ccgtctcttc gggagcgaca 180

ggccttgtcg cgtccgtcgc catgtcattc gcctcgtcga tggcgactcc aacggccaca 240

gtgacgggcc taagctccga gacgggagcg ccttccaaca ccccaatggc cagtgcctct 300

ggtagtgtcc ctacaaccac ctctgccgtc gggtctggcg acttcgactg ggtccagaca 360

gacggcctgc ccacgatcac gaccactttg gctactacga accaggacgc aatcactccg 420

acggcgacgg gccccgtcgg cggacagggc acccctgctg tcaacttcac cgactactct 480

tcatcgtcgc tcgagcagtt ttggaacgac tgggtgggag aggtggagga gccgccgttc 540

gcctacgtcc cggaaccgcc taacccgtac ccgttaccga acgccccgcc tccaatctac 600

cccgagtact acaccaagcg tcccaaggac attctccccg actacaagtt ccccaaagac 660

ttcctgtttg gctgggcgac cgccgcgcag cagtgggagg gggccgtcaa ggcggatggg 720

aaggggccgt ccatctggga ctgggccagc cggttcccgg ggttcattgc ggacaacacg 780

acttccgacg tcggagactt gggatactat ttatacaaag aggacctcgc taggatcgct 840

gcattgggcg caaacgttta ctctttcagc atgttctgga cacggatctt tcccttcggc 900

aaggccgact cgcctgtcaa tcaagcgggc atcgacttct accacgactt gatcgattat 960

tcttggagcc tgggcatcga gcccgtcgtg acattgttcc attgggatac gccgctcgcc 1020

ctccagcttg agtacggagg tttcgccagc gagcgaatca ttgatgacta cgtcaactat 1080

gcggaaaccg tgttcaaggc gtacaacggt agtgtgcaca aatgggtcac attcaacgag 1140

cctgtggtgt tctgcagcca gatggcagcg cccgtgaaca ctactctacc gccgaacctc 1200

aactcgacaa tctaccccta tacctgcagc tatcacctcg tgctagccca cgccaagacg 1260

gtcaagcggt tcagggagtt gaacattcag ggccagatcg ctttcaagtc ggacaatttt 1320

gtcggtatcc cgtggcgtga ggggaaccaa gaggacatag atgcggtcga gcgccatcag 1380

gcgtaccaga tcgggatctt tgctgagccg atctacaaca ccggagactg gcccgatatc 1440

gtgaagaatg atctctcccc cgacatcctt cctcgattca cggatgacga gatcgcgatg 1500

atcaagtgca ctgccgactt cttccccatc gatggctaca gggacggtta tgtccaggct 1560

gtaccggggg gtgtcgaagc ttgcgtcgcg aacatcagca acccgctttg gcctgcttgc 1620

aaccaagtca acttctatga ttccacaccc gccggatggg cgatcggcac gttcggcaac 1680

tggccgacga caccctggct ccagaacacc tggcagtttg tgcgcccctt cctcgctgat 1740

ctggcaaagc ggtaccccac cgaaggcggc atctaccttt cggaatttgg cttctccgag 1800

ccgttcgaaa atgataaaac cttcatttac cagatcaccc aggacagcgg acggacggcg 1860

tacttcaaca gttacctcgg cgaagtgttg aaaggtatcg ttgaagatgg cattcctatc 1920

aagggcgtgt tcggctggag tatggtcgac aactttgaat ggaactctgg cttgtctact 1980

cgcttcggcg tccaatacgt tgattacaac agcccgacgc gtcaacgaac gttcaagcgg 2040

tccgctctgg agatgagcga gttctggaat gctcatcgat gttccgccta a 2091

<210> 6

<211> 1701

<212> DNA

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<400> 6

gctactacga accaggacgc aatcactccg acggcgacgg gccccgtcgg cggacagggc 60

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cagtgggagg gggccgtcaa ggcggatggg aaggggccgt ccatctggga ctgggccagc 360

cggttcccgg ggttcattgc ggacaacacg acttccgacg tcggagactt gggatactat 420

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tatcacctcg tgctagccca cgccaagacg gtcaagcggt tcagggagtt gaacattcag 900

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gaggacatag atgcggtcga gcgccatcag gcgtaccaga tcgggatctt tgctgagccg 1020

atctacaaca ccggagactg gcccgatatc gtgaagaatg atctctcccc cgacatcctt 1080

cctcgattca cggatgacga gatcgcgatg atcaagtgca ctgccgactt cttccccatc 1140

gatggctaca gggacggtta tgtccaggct gtaccggggg gtgtcgaagc ttgcgtcgcg 1200

aacatcagca acccgctttg gcctgcttgc aaccaagtca acttctatga ttccacaccc 1260

gccggatggg cgatcggcac gttcggcaac tggccgacga caccctggct ccagaacacc 1320

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cagatcaccc aggacagcgg acggacggcg tacttcaaca gttacctcgg cgaagtgttg 1500

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<210> 7

<211> 1683

<212> DNA

<213> 土生隐球菌

<400> 7

gcaatcactc cgacggcgac gggccccgtc ggcggacagg gcacccctgc tgtcaacttc 60

accgactact cttcatcgtc gctcgagcag ttttggaacg actgggtggg agaggtggag 120

gagccgccgt tcgcctacgt cccggaaccg cctaacccgt acccgttacc gaacgccccg 180

cctccaatct accccgagta ctacaccaag cgtcccaagg acattctccc cgactacaag 240

ttccccaaag acttcctgtt tggctgggcg accgccgcgc agcagtggga gggggccgtc 300

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gctaggatcg ctgcattggg cgcaaacgtt tactctttca gcatgttctg gacacggatc 480

tttcccttcg gcaaggccga ctcgcctgtc aatcaagcgg gcatcgactt ctaccacgac 540

ttgatcgatt attcttggag cctgggcatc gagcccgtcg tgacattgtt ccattgggat 600

acgccgctcg ccctccagct tgagtacgga ggtttcgcca gcgagcgaat cattgatgac 660

tacgtcaact atgcggaaac cgtgttcaag gcgtacaacg gtagtgtgca caaatgggtc 720

acattcaacg agcctgtggt gttctgcagc cagatggcag cgcccgtgaa cactactcta 780

ccgccgaacc tcaactcgac aatctacccc tatacctgca gctatcacct cgtgctagcc 840

cacgccaaga cggtcaagcg gttcagggag ttgaacattc agggccagat cgctttcaag 900

tcggacaatt ttgtcggtat cccgtggcgt gaggggaacc aagaggacat agatgcggtc 960

gagcgccatc aggcgtacca gatcgggatc tttgctgagc cgatctacaa caccggagac 1020

tggcccgata tcgtgaagaa tgatctctcc cccgacatcc ttcctcgatt cacggatgac 1080

gagatcgcga tgatcaagtg cactgccgac ttcttcccca tcgatggcta cagggacggt 1140

tatgtccagg ctgtaccggg gggtgtcgaa gcttgcgtcg cgaacatcag caacccgctt 1200

tggcctgctt gcaaccaagt caacttctat gattccacac ccgccggatg ggcgatcggc 1260

acgttcggca actggccgac gacaccctgg ctccagaaca cctggcagtt tgtgcgcccc 1320

ttcctcgctg atctggcaaa gcggtacccc accgaaggcg gcatctacct ttcggaattt 1380

ggcttctccg agccgttcga aaatgataaa accttcattt accagatcac ccaggacagc 1440

ggacggacgg cgtacttcaa cagttacctc ggcgaagtgt tgaaaggtat cgttgaagat 1500

ggcattccta tcaagggcgt gttcggctgg agtatggtcg acaactttga atggaactct 1560

ggcttgtcta ctcgcttcgg cgtccaatac gttgattaca acagcccgac gcgtcaacga 1620

acgttcaagc ggtccgctct ggagatgagc gagttctgga atgctcatcg atgttccgcc 1680

taa 1683

<210> 8

<211> 1668

<212> DNA

<213> 土生隐球菌

<400> 8

gcgacgggcc ccgtcggcgg acagggcacc cctgctgtca acttcaccga ctactcttca 60

tcgtcgctcg agcagttttg gaacgactgg gtgggagagg tggaggagcc gccgttcgcc 120

tacgtcccgg aaccgcctaa cccgtacccg ttaccgaacg ccccgcctcc aatctacccc 180

gagtactaca ccaagcgtcc caaggacatt ctccccgact acaagttccc caaagacttc 240

ctgtttggct gggcgaccgc cgcgcagcag tgggaggggg ccgtcaaggc ggatgggaag 300

gggccgtcca tctgggactg ggccagccgg ttcccggggt tcattgcgga caacacgact 360

tccgacgtcg gagacttggg atactattta tacaaagagg acctcgctag gatcgctgca 420

ttgggcgcaa acgtttactc tttcagcatg ttctggacac ggatctttcc cttcggcaag 480

gccgactcgc ctgtcaatca agcgggcatc gacttctacc acgacttgat cgattattct 540

tggagcctgg gcatcgagcc cgtcgtgaca ttgttccatt gggatacgcc gctcgccctc 600

cagcttgagt acggaggttt cgccagcgag cgaatcattg atgactacgt caactatgcg 660

gaaaccgtgt tcaaggcgta caacggtagt gtgcacaaat gggtcacatt caacgagcct 720

gtggtgttct gcagccagat ggcagcgccc gtgaacacta ctctaccgcc gaacctcaac 780

tcgacaatct acccctatac ctgcagctat cacctcgtgc tagcccacgc caagacggtc 840

aagcggttca gggagttgaa cattcagggc cagatcgctt tcaagtcgga caattttgtc 900

ggtatcccgt ggcgtgaggg gaaccaagag gacatagatg cggtcgagcg ccatcaggcg 960

taccagatcg ggatctttgc tgagccgatc tacaacaccg gagactggcc cgatatcgtg 1020

aagaatgatc tctcccccga catccttcct cgattcacgg atgacgagat cgcgatgatc 1080

aagtgcactg ccgacttctt ccccatcgat ggctacaggg acggttatgt ccaggctgta 1140

ccggggggtg tcgaagcttg cgtcgcgaac atcagcaacc cgctttggcc tgcttgcaac 1200

caagtcaact tctatgattc cacacccgcc ggatgggcga tcggcacgtt cggcaactgg 1260

ccgacgacac cctggctcca gaacacctgg cagtttgtgc gccccttcct cgctgatctg 1320

gcaaagcggt accccaccga aggcggcatc tacctttcgg aatttggctt ctccgagccg 1380

ttcgaaaatg ataaaacctt catttaccag atcacccagg acagcggacg gacggcgtac 1440

ttcaacagtt acctcggcga agtgttgaaa ggtatcgttg aagatggcat tcctatcaag 1500

ggcgtgttcg gctggagtat ggtcgacaac tttgaatgga actctggctt gtctactcgc 1560

ttcggcgtcc aatacgttga ttacaacagc ccgacgcgtc aacgaacgtt caagcggtcc 1620

gctctggaga tgagcgagtt ctggaatgct catcgatgtt ccgcctaa 1668

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 土生隐球菌

<400> 9

Gly Val Gln Tyr Val Asp Tyr Asn Ser Pro Thr

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 土生隐球菌

<400> 10

Phe Leu Phe Gly Trp Ala Thr Ala Ala Gln Gln

1 5 10

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 土生隐球菌

<400> 11

Gln Ala Tyr Gln Ile Gly Ile Phe Ala Glu Pro Ile Tyr Asn Thr

1 5 10 15

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 土生隐球菌

<400> 12

Pro Ser Ile Trp Asp Trp Ala Ser

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 土生隐球菌

<400> 13

Glu Glu Pro Pro Phe Ala Tyr Val Pro Glu

1 5 10

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'RACE GSP引物

<400> 14

gattacgcca agcttgcaaa gatcccgatc tggtacgcct g 41

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3'RACE GSP引物

<400> 15

gattacgcca agcttttcct gtttggctgg gcgaccgcc 39

<210> 16

<211> 2942

<212> DNA

<213> 土生隐球菌

<400> 16

atgatcccgg caagtgcact ccttgccgcc gtacccctcc ttgcccaaca ggtgagcgcc 60

ggcatactgc gaagacagaa tgctgcgggt tcggattcgg cagcgcctga ctcgatcgcg 120

gatgcgtcca ccggtgtcgt ctcgtcgatc gccacggaag ccgtctcttc gggagcgaca 180

ggccttgtcg cgtccgtcgc catgtcattc gcctcgtcga tggcgactcc aacggccaca 240

gtgacgggcc taagctccga gacgggagcg ccttccaaca ccccaatggc cagtgcctct 300

ggtagtgtcc ctacaaccac ctctgccgtc gggtctggcg acttcgactg ggtccagaca 360

gacggcctgc ccacgatcac gaccactttg gctactacga accaggacgc aatcactccg 420

acggcgacgg gccccgtcgg cggacagggc acccctgctg tcaacttcac cgactactct 480

tcatcgtcgc tcgagcagtt ttggaacgac tgggtaagtt aggccacggc tccatctgct 540

gacgagggtc caggagagct gacgcacagg tgggagaggt ggaggagccg ccgttcgcct 600

acgtcccgga accgcctaac ccgtacccgt taccgaacgc cccgcctcca atctaccccg 660

agtactacac caagcgtccc aaggacattc tccccgacta caagttcccc aaagacttcc 720

tgtttggctg ggcgaccgcc gcgcagcagt gggagggggc cgtcaaggcg gatgggaagg 780

ggccgtccat ctgggactgg gccagccggt tcccggggtt cattgcggac aacacgactt 840

ccggtgagct gagaatgacc acctttcagt acgagagctc acttcagacg tcggagactt 900

gggatactat ttatacaaag agggttagcc ggggccgtat gagccagtgc tggatgctga 960

gtgcagacct cgctaggatc gctgcattgg gcgcaaacgt ttactctttc agcatgttct 1020

ggacacggat ctttcccttc ggcaaggccg actcgcctgt caatcaagcg ggcatcgact 1080

tctaccacga cttgatcgat tattcttgga gcctgggcat cgagcccgtc gtgtaagcct 1140

gtacaggggc ccatcttgaa ccccgctcat tacaggacat tgttccattg ggatacgccg 1200

ctcgccctcc agcttgagta cggaggtttc gccagcgagc gaatcattga tgactacgtc 1260

aactatgcgg tgagcagtac ggtcccttga gcacagcttg ggctgactcg taaggaaacc 1320

gtgttcaagg cgtacaacgg tagtgtgcac aaatgggtca cattcaacga gcctgtggtg 1380

ttctgcagcc aggtgagcaa ccaaagcgca tgttgagctg atcgaccaga tggcagcgcc 1440

cgtgaacgta agatgagcaa cgagccagac cagtgtcaat gctgaccatg accgtagact 1500

actctaccgc cgaacctcaa ctcgacaatc tacccctata cctgcagcta tcacctcgtg 1560

ctagcccacg ccaagacggt caagcggttc agggagttga acattcgtga gctgatcggt 1620

accgcgtttc tggctgaaga cacgctgact gtcacagagg gccagatcgc tttcaagtcg 1680

gacaattttg tgtgagcatc gctgttgtgg ggagtcgtgc gtgctgaacc tttagcggta 1740

tcccgtggcg tgaggggaac caagaggaca tagatgcggt cgagcgccat caggtgaagt 1800

ctcgccagac cgcggaggct ccgaggctga ccggacaggc gtaccagatc gggatctttg 1860

ctgagccgat ctacaacacc ggagtgaggc ttccctccct cttccgcacg gtacacttgt 1920

ggcttatcga caggactggc ccgatatcgt gaagaatgat ctctcccccg acatccttcc 1980

tcgattcacg gatgacgaga tcgcgatgat caagtgcact gccgacttct tccccatcga 2040

tgtgagcctc caaacccacc cgtcgggaga cgggtcccga gtactacgcc taacgcacag 2100

ggctacaggg acggttatgt ccaggctgta ccggggggtg tcgaagcttg cgtcgcgaac 2160

atcagcaacc cgctttggcc tgcttgcaac caagtcaagt gagactcgtc cagaccccgc 2220

ctgtattgcg agcgccggca ctgacatgca gcttctgtac ggcccacagc accccgtcgc 2280

cgccgctgag ctgatgcata gatgattcca cacccgccgg atgggcgatc ggcacgttcg 2340

gcaactggcc gacgacaccc tggctccaga acacctggca gtttgtgcgc cccttcctcg 2400

ctgatctggc aaagcggtac cccaccgaag gcggcatcta cctttcggaa tttggcttct 2460

ccgagccgtt cgaaaatgag tacgcctatc aactggctgc tgcaaggcat ggcgtactga 2520

gactcagtaa aaccttcatt taccagatca cccaggacag cggacggacg gcgtacttca 2580

acagttacct cggcgaagtg ttgaaaggta tcgttgaaga tggcattcct atcaagggcg 2640

tgttcggctg gagtatggtc gacaactttg aatggaactc tggcttgtct agtacgtcca 2700

cacggccgtg gatccttcga cgcccggtct gacccgtagc tcgcttcggc gtccaatacg 2760

ttgattacaa caggtgagct gtcgtttttg ttttagggat cgcgatgctg atgcaaacag 2820

cccgacgcgt caacgaacgg tacgccgttc atgacctccc cctcgtccct gctgacgtcc 2880

agttcaagcg gtccgctctg gagatgagcg agttctggaa tgctcatcga tgttccgcct 2940

aa 2942

Claims

1.一种β-半乳糖苷酶，由序列号1、2、4中的任一种氨基酸序列构成。

2.一种酶剂，以权利要求1所述的β-半乳糖苷酶作为有效成分。

3.一种β-半乳糖苷酶基因，由以下（a）的DNA构成：

（a）编码序列号1、2、4中的任一种氨基酸序列的DNA。

4.根据权利要求3所述的β-半乳糖苷酶基因，其中，所述（a）的DNA为以下（b）的DNA：

（b）由序列号5、6、8中的任一种碱基序列构成的DNA，

5.一种重组DNA，含有权利要求3或4所述的β-半乳糖苷酶基因。

6.一种微生物，具有权利要求5所述的重组DNA。

7.一种β-半乳糖苷酶的制造法，包括以下的步骤（i）和（ii）：

（i）在产生所述基因编码的蛋白质的条件下培养权利要求6所述的微生物的步骤，

（ii）回收所产生的所述蛋白质的步骤。

8.一种低聚糖的制造方法，包括使权利要求1所述的β-半乳糖苷酶作用于具有β-1,3键、β-1,4键和β-1,6键中的至少一个的二糖、低聚糖或多糖的步骤。

9.一种低聚糖的制造方法，包括使权利要求1所述的β-半乳糖苷酶作用于乳糖的步骤。

10.根据权利要求8或9所述的制造方法，其中，所述步骤的反应温度为30℃~75℃。

11.一种权利要求1的β-半乳糖苷酶的应用，用于制造低聚糖。