JPH03216185A - ビフイドバクテリウム菌増殖促進剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，ビフイドバクテリウム菌（以下ビフイズス菌
という。）の増殖促進剤の製造方法に関するものである
。

（従来の技術） ビフイズス菌は，人間の腸内に生育する有用菌であり．
腸管内にビフイズス菌叢が形成されると，これが乳酸．
酢酸および蟻酸を産生じ，腸管内のｐＨを低下させ，有
害菌の腸管内定着を防止することが知られている。この
ように有用なビフイズス菌の増殖を促進する活性をもつ
化合物は，粉乳．ドリンク剤の他，各種の食品に添加し
て利用されている。

従来，このビフイズス菌の増殖促進剤（以下ビフイズス
因子という。）については多くの研究がなされており，
ラクチュロース，フラクトオリゴ糖，一般式：Ｇａｊｌ
！−　（Ｇａｐ）Ｉ，−Ｇｆｌｃ　（式中，Ｇａ１はガ
ラクトース残基，Ｇ１ｃはグルコース残基，ｎは１〜４
の整数を表す。）で示されるガラクトオリゴ糖，人参エ
キス，Ｎ−アセチルラクトサミン等のビフイズス因子が
報告されている。

乳糖を原料とする酵素あるいは微生物によるガラクトオ
リゴ糖の製造法としては，アスペルギルス・オリゼ（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の生産するβー
ガラクトシダーゼを用いる方法（特公昭５８−２０２６
６号公報参照），バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ８１）
．　）の細菌を乳糖を含む培地で培養し，培養濾液より
ビフイズス因子を分離・採取する方法（特開昭５　６−
１　１　５　７　９　６号公報参照），クリブトコツカ
ス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の酵母を乳糖を含む
培地で培養し，培養濾液よりガラクトオリゴ糖を分離・
採取する方法（特開昭６　０−２　５　１　８　９　６
号公報８照），サツ力口マイセス・フラギリス（Ｓａｃ
−ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）のラクタ
ーゼを用いてガラクトオリゴ糖を生成させる方法〔アグ
リ力ルチュラル・アンド・フード・ケミス｝　ＩＪ　−
　（Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，）　　５．　　
１　３　０　（１９５７）］　，　スポロボロミセス・
シンギュラリス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｉ
ｎｇｕＩａｒｉｓ）を乳糖含有培地で培養することによ
り，培地中にガラクトオリゴ糖を生成させる方法〔カナ
ディアン・ジャーナル・オブ・ケミス｝　！Ｊ　−　（
Ｃａｎ．Ｊ，　ｏｆ　Ｃｈｅｍ．）４　２．　　１　３
　４　１　（１９６４）］　，ペニシリウム０クリソゲ
ナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ
ｍ）を乳糖含有培地で培養することにより．培地中にガ
ラクトオリゴ糖を生成させる方法〔テトラヘドロン（Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）　９　，　　１　２　５　（１
９６０）］　，乳酸菌より得たβ−ガラクトシダーゼを
用いてガラクトオリゴ糖を生成させる方法〔ジャーナル
・オブ・デイリー・サイエンス（Ｊ，　ｏｆ　Ｄａｉｒ
ｙ　Ｓｃｉ．）　　６　４，１　８　５　（１９８１）
］　．バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）のβ−ガラクトシダーゼを用いて
ガラクトオリゴ糖を生成させる方法〔アグリ力ルチュラ
ル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ，　　
Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．）　　４　　８，　　３　　Ｑ
　　５　　３　　（１９８４）コ　，リボマイセス（Ｌ
ｉｐｏｍｙｃｅｓ）属の静止菌体で乳糖を処理すること
によりガラクトオリゴ糖を生成させる方法（特開昭６　
３−１　８　５　３　７　３号公報参照）等が知られて
いる。

（発明が解決しようとする課題） 上記の乳糖を原料とするビフイズス因子製造法は，乳糖
を含有する培地で菌体を培養し，培養濾液にガラクトオ
リゴ糖を生成せしめ，これを採取する方法と，菌体から
抽出した酵素または酵母の静止菌体を乳糖に作用させる
方法の２つに大別される。

これら２つの方法のうち，培養濾液中にガラクトオリゴ
糖を生成せしめる方法では，菌体の増殖が伴うため，菌
体由来の分泌物も培養濾液中に蓄積し，目的とするガラ
クトオリゴ糖を分離・精製する際に問題となるばかりで
なく，培地に加えた菌体の生育に必要な窒素源やビタミ
ン類，微量元素等から目的とするガラクトオリゴ糖を分
離・精製する必要がある。また，得られるガラクト才リ
ゴ糖糖液の濃度が低く，糖液の腐敗を防ぐには濃縮する
必要がある。

一方，菌体から抽出した酵素または酵母の静止菌体を用
いる方法は，原料乳糖を水に溶解させた溶液状態で酵素
または静止菌体を作用させ，ガラクトオリゴ糖を合成す
るものである。しかし，この方法では，乳糖の水に対す
る溶解度が低く，乳糖濃度４０％（Ｗ／Ｖｏｌ）が溶液
状態で反応を行う限界であり，したがって，得られる糖
液の濃度も満足いくものでなく，さらに高濃度の糖液を
得るためには濃縮する必要があった。また，乳糖を溶解
する際には，一旦昇温し，溶解後，反応温度まで下げる
操作が必要である等製造工程が繁雑であるという問題も
あった。

本発明は，ビフイズス因子を簡便な工程でかつ高濃度に
得るための製造方法を提供することを目的とするもので
ある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは，このような課題を解決するために鋭意検
討した結果，乳糖を原料としてビフイズス菌増殖促進剤
を製造するに際し，乳糖を水に完全に溶解することなく
，スラリー状でも酵素または酵母の静止菌体と作用させ
ることにより，反応が進行することを見出し，さらにこ
のような反応によりビフイズス菌増殖促進剤のシロップ
が得られることを見出し，本発明をなすに至った。

すなわち，本発明は，乳糖資化能を有する酵母菌体また
はオリゴ糖合成能を有する酵素をスラリー状乳糖に作用
させることを特徴とするビフイズス菌増殖促進剤の製造
方法を要旨とするものである。

以下，本発明を詳細に説明する。

本発明に用いられる酵母は，乳糖資化能を有する酵母で
あり，そのようなものには．例えば，ロドトルラ属，ス
ボロボロミセス属，クリプトコツカス属，リポマイセス
属およびブレラ属に属する酵母がある。そのような具体
例としては、ロドトルラ・ラクトーザ（Ｒｈｏｄｏｔｏ
ｒｕｌａ　ｌａｃｔｏｓａ）　Ｉ　Ｆ　０１４２３，Ｉ
ＦＯ１４２４，　　クリプトコツカス・ローレンテイ　
（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）　
　Ｉ　ＦＯ０３７２，■ＦＯＯ３８４，ＩＦＯＯ９３０
．ＩＦＯ１３７６，ＩＦ０１４８７．スボロボロミセス
０シンギュラリス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓ
ｉｎｇｕｌａｒｉｓ）ＡＴＣＣ２　４　１　９　３，　
　リポマイセス・リポーファ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｌ
ｉｐｏｆｅｒ）　Ｉ　ＦＯ　０　６　７　３．　　Ｉ　
ＦＯ１２８８，　　ブレラ・アルバ（Ｂｕｌｌｅｒａ　
ａｌｂａ）　　Ｉ　Ｆ０１１９２およびリポマイセス（
Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）　Ｎ　ＫＤ−１４（微工研菌寄第
８９４８号）株等が挙げられる。

これらの菌体を得るだめの条件としては．何ら限定され
るものではなく，乳糖を含む培地で培養することにより
．乳糖を原料とするビフイズス因子の合成活性の高い静
止菌体を得ることができる（特開昭６　３−１　８　５
　３　７　３号公報参照）。また，炭素源としてグルコ
ース，ソルビトース，マルトース，シヨ糖．廃糖蜜等を
用い，菌体を十分増殖させた後に乳糖を添加し，さらに
培養を続け，β一ガラクトシダーゼが十分誘導された後
に菌体を遠心，濾過等の通常用いられる方法によって回
収することもできる。培養に用いる窒素源としては，例
えば，ペブトン，カゼイン，コーンステイーブリカー，
肉エキス，酵母エキス等の有機窒素源や，硫安，塩化ア
ンモニウム，尿素等の無機窒素源を用いることができる
。

培養の方法としては，通常用いられる液体培地，固体培
地で，静置培養，通気攪拌培養，振盪培養のいずれの方
法でもよい。培養液から遠心，濾過等の通常の方法によ
り回収した菌体は，何ら処理を施すことなく，菌体のま
ま反応の触媒として用いることができる。

また，本発明に用いることができる酵素は，ガラクトオ
リゴ糖合成能を有していればよく，そのようなものの例
としては，β−ガラクトシダーゼ等があげられ，その由
来は特に限定されるものではない。具体的には，アスベ
ルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　ｏｒｙ
ｚａｅ）由来のβ−ガ゛ラクトシダーゼ（例えば，米国
シグマ社製）等が挙げられる。

本発明のビフイズス因子は，上記のよう１ごして得られ
る酵母菌体または酵素で乳糖を処理することにより得ら
れる。その処理法において，乳糖は完全に溶解させ溶液
状態にする必要はなく，ただ加えるだけで不溶の乳糖が
存在している状態，すなわちスラリー状態のまま攪拌す
るだけでよい。

このときの乳糖の濃度は３０〜９０％（Ｗ／Ｖｏｌ）が
適当であり，４０〜８０％（Ｗ／Ｖｏｌ）が好ましく，
５０〜７０％（Ｗ／Ｖｏｌ）が特に好ましい。３０％（
Ｗ／Ｖｏｌ）より低いと，得られる糖液の濃度が低くな
り好ましくなく，９０％（Ｗｔ／Ｖｏｌ）より高いと，
攪拌が困難となることと，反応速度が遅くなるため好ま
しくない。

このときの乳糖の状態は，濃度と温度に依存し，例えば
，濃度３０％（Ｗ／Ｖｏｌ），温度４０℃ではスラリー
状態であるが．それより高い温度では溶液状態となる。

また濃度４０％（Ｗ／Ｖｏｌ）で温度５０’ｊ：以下，
　Ｉ１度５　０　％（Ｗ／Ｖｏｌ）　テ温度６０℃以下
あるいは濃度６０％（Ｗ／Ｖｏｌ）で温度７０℃以下の
条件においても原料乳糖はスラリー状態となる。

反応温度は４０〜７０℃が適当であり，５０〜６０℃が
好ましい。４０℃より低いと，反応速度が遅く好ましく
なく，また，７０℃より高いと，反応の触媒として用い
る酵素または菌体中の酵素活性が失活し，反応が進まな
くなる。

反応に用いる菌体又は酵素の添加量は，反応温度．反応
時間及び乳糖濃度に依存するところが大きいが，例えば
，乳糖濃度６０％（Ｗ／Ｖｏｌ），反応温度５５℃，反
応時間４８時間の条件下では，菌体の添加量は，湿菌体
として０．１〜２０％（Ｗ／Ｖｏｌ）が適当であり，１
〜１０％（Ｗ／Ｖｏｌ）が好ましい。

また，同条件下での酵素の添加量は．０．０１〜１０ユ
ニット／ｍＩｔが好まし＜，０．０５〜１ユニット／ｍ
βがより好まし＜，０．１〜０．５ユニット／ｍｌｌが
最も好ましい。なお，ここでいう１ユニットとは．ｐＨ
４．５．３０℃の条件下で１分間に１μｍｏｂのラクト
ースを加水分解する酵素量と定義されるものである。反
応温度がこれより高くなると菌体又は酵素の添加量は上
記より少なくてもよく，反応温度が低くいと添加量を多
くすればよい。

また反応時間は，反応温度，菌体又は酵素量により一定
ではないが，２００時間以下が適当であり，１〜１００
時間が好ましい。

そのときのｐＨは，使用する酵母菌体または酵素が安定
で，しかも目的とするビフイズス因子が最も多く合成さ
れるようなｐＨであり，具体的には３〜９，好ましくは
４〜７である。また，必要に応じてリン酸．酢酸．クエ
ン酸等の緩衝液を使用することもできる。

このような条件で反応を行うと，目的とするビフイズス
因子であるオリゴ糖が生成してくる。そして，生成して
くるオリゴ糖の水に対する溶解度が乳糖より大きいため
，反応系内の糖分は反応の進行とともに溶解する。反応
終了後，菌体は必要に応じて濾過，遠心分離．デカンテ
ーション等により除去，酵素は加熱失活させることによ
り，オリゴ糖を含む高濃度の糖液を得ることができる。

通常，この糖液をイオン交換樹脂に通液して脱塩を行い
，さらにオリゴ糖のみを精製するためには，活性炭吸着
，ゲル濾過等を用いれば達成できる。

（実施例） 次に，本発明を実施例により具体的に説明する。

参考例１ 下記組成の培地を３０ｊ２容ジャーファーメンターに入
れ．殺菌した。

乳糖　　　　　４００ｇ 硫安　　　　　４０ｇ ＫＨ２ＰＯａｌＯｇ Ｎａ．ＨＰＯ．−１２Ｈ２０　　　１　０　ｇＭ　ｇ　
Ｓ　０　４・７Ｈ２０　　　１０ｇ酵母エキス　　　　
　　　　　２０ｇ 水道水　　　　　　　　　　　２０Ｉｌ次に，同組成の
培地で３０℃で２４時間前培養したりポマイセス（Ｌｉ
ｐｏｍｙｃｅｓ）ＮＫＤ　−　１　４　（微工研菌寄第
８９４８号）ＩＩｌを接種し，ｐＨ６．５＋３０℃，通
気量２　０　ｊ！　／ｍｉｎ　，インペラ一回転数４　
０　Ｏ　ｒ．ｐ，ｍ，で１８時間培養を行った。培養終
了後，α−ラバル社製の遠心機ＬＡＰＸ２０２型で遠心
分離を行って湿菌体２．　８　ｋｇを得た。

参考例２ ５００ｒｎｌ容三角フラスコに，下記組成の培地を１０
０ｒｎｌ入れたものを１０本オートクレープした。

乳糖　　　　５ｇ ポリペブトン　　　　　０．５ｇ 酵母エキス　　　　　　０．　３　ｇ 水　　　　　　　　　　　１　０　０ｄｐＨ５．６ 次に，この培地にクリプトコツカス・ローレンテイ　（
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）　　
Ｉ　Ｆ　０　０　３　７　２株を一白金耳接種し，３０
℃で２日間ロータリーシェーカーで培養を行った。培養
終了後，遠心分離により菌体を回収し．７．５ｇの湿菌
体を得た。

参考例３ 参考例２に記載した培地にスポロボロミセス・シンギュ
ラリス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｉｎｇｕｌ
ａｒｉｓ）　ＡＴＣＣ２４１９３株を一白金耳接種し，
２８℃で３日間ロータリーシェーカーで培養を行った。

培養終了後，遠心分離して３．２ｇの湿菌体を得た。

参考例４ 参考例２に記載した培地にリボマイセス・リボーファ−
（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｐｏｆｅｒ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ
　Ｏ　６　７　３株を一白金耳接種し，３０℃で２日間
ロータリーシェーカーで培養を行った。培養終了後，遠
心分離して３．５ｇの湿菌体を得た。

実施例１ ５　０　０ｍｌ容三角フラスコに乳糖６０ｇ．参考例１
で得られたリボマイセｘ　（　Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）　
Ｎ　Ｋ　Ｄ　−１４（微工研菌寄第８９４８号）株の湿
菌体４．５ｇを加え．さらに水道水を加えてｉ　ｏ　Ｏ
−［乳糖濃度は６０％（Ｗ／Ｖｏｌ）となる。〕とした
。この反応液を，原料乳糖がスラリー状のまま５５℃に
保温しｌ）Ｈ６．０でロータリーシェーカー内で２日間
反応を行った。反応液中の乳糖は，反応の進行とともに
溶解し，２日後にはすべて溶解した。反応後の液を遠心
分離し，菌体を除いた後．上澄み液をウォーターズ社製
の高速液体クロマトグラフイー用力ラムマイクロボンダ
パック／　Ｎ　Ｈ　２（移動相アセトニ｝ＩＪル／水＝
７／３）で才リゴ糖，単糖及び乳糖を分析した。

分析結果を表１に示す。

実施例２ 参考例２で得られたクリプトコツカス・ローレンテイ　
（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）　
　Ｉ　Ｆ　０　０　３　７２株の湿菌体４．５ｇを用い
る以外は，実施例１と同様に反応を行い，すべて溶解し
たシロップを得，分析した。

分析結果を表１に示す。

実施例３ 参考例３で得られたスポロボロミセス・シンギュラリス
（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｉｎｇｕｌａｒｉ
ｓ）　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ２４１９３株の湿菌体４．５ｇを
用い，ｐＨが４．０である以外は，実施例１と同様に反
応を行い，すべて溶解したシロップを得，分析した。

分析結果を表１に示す。

実施例４ 参考例４で得られたりポマイセス・リボーファ−　（Ｌ
ｉｐｏｍｙｃｅｓ　Ｉｉｐｏｆｅｒ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ　０
　６　７　３株の湿菌体４．５ｇを用いる以外は，実施
例１と同様に反応を行い，すべて溶解したシロップを得
，分析を行った。

分析結果を表１に示す。

実施例５ 乳糖６００ｇに約４　０　０ｍｆの水道水とＩＭ一酢酸
緩衝液５ｍｊ！を加え．ｐＨ５．０に調整した後，アス
ペルギルスｅオリゼ（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙ
ｚａｅ）由来のβ−ガラクトシダーゼ（米国シグマ社製
）４９．５■（２００ユニットに相当）および水を加え
てＩＩ！〔乳糖濃度は６　０　％　（Ｗ／Ｖｏｌ）　ト
ナ６。〕とし，原料乳糖がスラリー状態のままで５５℃
で４時間反応させた。反応液中の乳糖は，反応の進行と
ともに溶解し，４時間後にはすべて溶解した。

この後，反応液を加熱し，酵素を失活させた後，実施例
１と同様に分析を行った。

分析結果を表１に示す。

ここで得られたオリゴ糖を，活性炭力ラムクロマトグラ
フィーにより単離した後，”Ｃ−ＮＭＲで分析した結果
，これらのオリゴ糖は，ビフィズス因子である０−β一
Ｄ〜ガラクトビラノシルー（１→４）旧β−Ｄ−ガラク
トビラノシルー（１→４）一〇−グルコースであること
が？１ｕされた。

表１より，スラリー状乳糖を原料として反応が進むこと
が明らかになり，ビフィズス菌増殖促進剤であるオリゴ
糖の高濃度シロップが得られた。

（発明の効果） 本発明によれば，ビフィズス菌増殖促進剤の製造に際し
．原料である乳糖を一旦昇温しで溶解する必要がなく，
ただ反応系内に乳糖を加えるだけで反応を行うことがで
きるため，工程および設備を簡略，軽減することができ
る。さらに，高濃度での反応が可能となるため，濃縮す
る必要がなく，そのまま精製を行うことにより，シロッ
プ状の製品を得ることができる。また，高濃度であるこ
とから，雑菌等による汚染の心配もなく，ビフイズス菌
増殖促進剤をより簡便に製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）乳糖資化能を有する酵母菌体またはオリゴ糖合成
   能を有する酵素をスラリー状乳糖に作用させることを特
   徴とするビフイドバクテリウム菌増殖促進剤の製造方法
   。