JPH1118763A - β−ガラクトシダーゼの改質方法 - Google Patents
β−ガラクトシダーゼの改質方法Info
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- JPH1118763A JPH1118763A JP9192043A JP19204397A JPH1118763A JP H1118763 A JPH1118763 A JP H1118763A JP 9192043 A JP9192043 A JP 9192043A JP 19204397 A JP19204397 A JP 19204397A JP H1118763 A JPH1118763 A JP H1118763A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラク
トシダーゼを用いてガラクトオリゴ糖を製造する方法に
おいて、β−ガラクトシダーゼＩの混在に由来する問題
点を改善すること。 【解決手段】 バチルス・サーキュランス由来のβ−ガ
ラクトシダーゼを、好ましくは４０〜６０℃の温度範囲
で加熱処理するβ−ガラクトシダーゼのガラクトオリゴ
糖の生成能を高めるための改質方法およびこの改質方法
により得られたβ−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させ
るガラクトオリゴ糖の製造方法。
トシダーゼを用いてガラクトオリゴ糖を製造する方法に
おいて、β−ガラクトシダーゼＩの混在に由来する問題
点を改善すること。 【解決手段】 バチルス・サーキュランス由来のβ−ガ
ラクトシダーゼを、好ましくは４０〜６０℃の温度範囲
で加熱処理するβ−ガラクトシダーゼのガラクトオリゴ
糖の生成能を高めるための改質方法およびこの改質方法
により得られたβ−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させ
るガラクトオリゴ糖の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、β−ガラクトシダ
ーゼの改質方法に関し、更に詳細にはバチルス・サーキ
ュランス由来β−ガラクトシダーゼ中に含まれるβ−ガ
ラクトシダーゼＩのガラクトオリゴ糖の生成能を高める
ための改質方法およびこの改質されたβ−ガラクトシダ
ーゼによるガラクトオリゴ糖の製造方法に関するもので
ある。
ーゼの改質方法に関し、更に詳細にはバチルス・サーキ
ュランス由来β−ガラクトシダーゼ中に含まれるβ−ガ
ラクトシダーゼＩのガラクトオリゴ糖の生成能を高める
ための改質方法およびこの改質されたβ−ガラクトシダ
ーゼによるガラクトオリゴ糖の製造方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】β−ガラクトシダーゼ（β−galactosid
ase）は、β−Ｄ−ガラクシド結合の加水分解とともに
ガラクトシル基転移反応を触媒する酵素として知られて
おり、近年、乳糖からのガラクトオリゴ糖の製造に有用
であることが数多く報告されている。
ase）は、β−Ｄ−ガラクシド結合の加水分解とともに
ガラクトシル基転移反応を触媒する酵素として知られて
おり、近年、乳糖からのガラクトオリゴ糖の製造に有用
であることが数多く報告されている。
【０００３】β−ガラクトシダーゼは、微生物、動物、
植物に広く分布しているが、ガラクトオリゴ糖の製造に
は糖転移率の高い微生物起源の酵素が選択される。この
ような微生物由来のβ−ガラクトシダーゼとしては、例
えば、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulan
s）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryza
e）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptoco
ccus thermophilus）、クリプトコッカス・ローレンテ
ィー（Cryptococcus laurentii）のほか、ブレラ・シン
ギュラリス（Bullera singularis）、リポマイセス（Ly
pomyces）属酵母、ステリグマトマイセス（Sterigmatom
yces）属酵母などが知られている。
植物に広く分布しているが、ガラクトオリゴ糖の製造に
は糖転移率の高い微生物起源の酵素が選択される。この
ような微生物由来のβ−ガラクトシダーゼとしては、例
えば、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulan
s）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryza
e）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptoco
ccus thermophilus）、クリプトコッカス・ローレンテ
ィー（Cryptococcus laurentii）のほか、ブレラ・シン
ギュラリス（Bullera singularis）、リポマイセス（Ly
pomyces）属酵母、ステリグマトマイセス（Sterigmatom
yces）属酵母などが知られている。
【０００４】これらのうち、バチルス・サーキュランス
は、２種のβ−ガラクトシダーゼ（β−ガラクトシダー
ゼＩ、β−ガラクトシダーゼＩＩ）を生産することが知
られており、その酵素学的性質も報告されている（Agri
c.Biol.Chem., 48 (12), 3053-3061 (1984)）。 この２
種のβ−ガラクトシダーゼはオリゴ糖の生成能において
大きく相違し、β−ガラクトシダーゼＩはガラクトオリ
ゴ糖の生成能が低く、β−ガラクトシダーゼＩＩは、ガ
ラクトオリゴ糖の生成能が高いことが確認されている。
は、２種のβ−ガラクトシダーゼ（β−ガラクトシダー
ゼＩ、β−ガラクトシダーゼＩＩ）を生産することが知
られており、その酵素学的性質も報告されている（Agri
c.Biol.Chem., 48 (12), 3053-3061 (1984)）。 この２
種のβ−ガラクトシダーゼはオリゴ糖の生成能において
大きく相違し、β−ガラクトシダーゼＩはガラクトオリ
ゴ糖の生成能が低く、β−ガラクトシダーゼＩＩは、ガ
ラクトオリゴ糖の生成能が高いことが確認されている。
【０００５】このため、市販のバチルス・サーキュラン
ス由来のβ−ガラクトシダーゼ製剤より、ガラクトオリ
ゴ糖の製造に有利なβ−ガラクトシダーゼＩＩを分離す
る方法が提案されている（特開昭６２−１１８８８６
号）。 しかしながら、この方法はカラムを用いた分離
方法であり、カラムに充填した樹脂（ハイドロキシアパ
タイト）量あたりに処理できる酵素蛋白質の量が少な
い、カラム分離に時間がかかる、経費が極めて高い等の
点で工業的実施には実用的ではなかった。
ス由来のβ−ガラクトシダーゼ製剤より、ガラクトオリ
ゴ糖の製造に有利なβ−ガラクトシダーゼＩＩを分離す
る方法が提案されている（特開昭６２−１１８８８６
号）。 しかしながら、この方法はカラムを用いた分離
方法であり、カラムに充填した樹脂（ハイドロキシアパ
タイト）量あたりに処理できる酵素蛋白質の量が少な
い、カラム分離に時間がかかる、経費が極めて高い等の
点で工業的実施には実用的ではなかった。
【０００６】また、両タイプの酵素を含むバチルス・サ
ーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼで、乳糖濃度
３０重量％以上の高濃度下で転移反応を起こさせると、
ガラクトオリゴ糖を収率よく製造することができること
が報告されている（特公平３−５４５５９号）。 しか
しながら、この方法で示された高濃度乳糖での反応で
は、β−ガラクトシダーゼＩＩに比べてＩの方がガラク
トオリゴ糖の生成率が低いことが認められる。また、高
乳糖濃度での反応は乳糖の結晶が析出しない高温で反応
しなければならないことから、耐熱性の低いβ−ガラク
トシダーゼＩは反応中に失活が起こり、反応が遅延する
難点があった。
ーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼで、乳糖濃度
３０重量％以上の高濃度下で転移反応を起こさせると、
ガラクトオリゴ糖を収率よく製造することができること
が報告されている（特公平３−５４５５９号）。 しか
しながら、この方法で示された高濃度乳糖での反応で
は、β−ガラクトシダーゼＩＩに比べてＩの方がガラク
トオリゴ糖の生成率が低いことが認められる。また、高
乳糖濃度での反応は乳糖の結晶が析出しない高温で反応
しなければならないことから、耐熱性の低いβ−ガラク
トシダーゼＩは反応中に失活が起こり、反応が遅延する
難点があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このように、バチルス
・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼを用いて
ガラクトオリゴ糖の効率的な製造を行う技術開発が行わ
れているものの、いまだ工業的実施においてβ−ガラク
トシダーゼＩの混在に由来する問題点を改善するという
点で満足のゆく技術は提案されておらず、さらに効率の
良いガラクトオリゴ糖の製造方法が望まれていた。
・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼを用いて
ガラクトオリゴ糖の効率的な製造を行う技術開発が行わ
れているものの、いまだ工業的実施においてβ−ガラク
トシダーゼＩの混在に由来する問題点を改善するという
点で満足のゆく技術は提案されておらず、さらに効率の
良いガラクトオリゴ糖の製造方法が望まれていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記現状
に鑑み、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクト
シダーゼについて研究を重ねたところ、ガラクトオリゴ
糖の生成能が低いβ−ガラクトシダーゼＩを加熱処理す
ることにより、ガラクトオリゴ糖の生成能が高まり、β
−ガラクトシダーゼＩＩに類似した酵素に改質されると
いうという極めて特異的な現象を見い出した。また、こ
れはβ−ガラクトシダーゼの粗酵素から分離したβ−ガ
ラクトシダーゼＩに対してだけでなく、分離前のβ−ガ
ラクトシダーゼの粗酵素に対して加熱処理を行っても同
様の効果が得られることを見い出し本発明を完成した。
に鑑み、バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクト
シダーゼについて研究を重ねたところ、ガラクトオリゴ
糖の生成能が低いβ−ガラクトシダーゼＩを加熱処理す
ることにより、ガラクトオリゴ糖の生成能が高まり、β
−ガラクトシダーゼＩＩに類似した酵素に改質されると
いうという極めて特異的な現象を見い出した。また、こ
れはβ−ガラクトシダーゼの粗酵素から分離したβ−ガ
ラクトシダーゼＩに対してだけでなく、分離前のβ−ガ
ラクトシダーゼの粗酵素に対して加熱処理を行っても同
様の効果が得られることを見い出し本発明を完成した。
【０００９】即ち、本発明の第１の発明は、バチルス・
サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼを加熱処理
することを特徴とするガラクトオリゴ糖の生成能を高め
るためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法である。ま
た、本発明の第２の発明は、上記改質方法においてバチ
ルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼがβ
−ガラクトシダーゼＩであるガラクトオリゴ糖の生成能
を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法であ
る。更に本発明の第３の発明は、上記両改質方法におい
て加熱処理を４０〜６０℃で行うガラクトオリゴ糖の生
成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法で
ある。更にまた、本発明の第４の発明は、上記各改質方
法により得られたβ−ガラクトシダーゼを乳糖に作用さ
せるガラクトオリゴ糖の製造方法である。
サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼを加熱処理
することを特徴とするガラクトオリゴ糖の生成能を高め
るためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法である。ま
た、本発明の第２の発明は、上記改質方法においてバチ
ルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼがβ
−ガラクトシダーゼＩであるガラクトオリゴ糖の生成能
を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法であ
る。更に本発明の第３の発明は、上記両改質方法におい
て加熱処理を４０〜６０℃で行うガラクトオリゴ糖の生
成能を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法で
ある。更にまた、本発明の第４の発明は、上記各改質方
法により得られたβ−ガラクトシダーゼを乳糖に作用さ
せるガラクトオリゴ糖の製造方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の改質方法の対象となるβ
−ガラクトシダーゼは、バチルス・サーキュランス由来
のものである。 バチルス・サーキュランスに属する微
生物の産生するβ−ガラクトシダーゼであれば、いずれ
も利用することができるが、好ましいものの例として
は、バチルス・サーキュランス（ＡＴＣＣ−３１３８
２）の培養により得られたβ−ガラクトシダーゼ等を挙
げることができる。
−ガラクトシダーゼは、バチルス・サーキュランス由来
のものである。 バチルス・サーキュランスに属する微
生物の産生するβ−ガラクトシダーゼであれば、いずれ
も利用することができるが、好ましいものの例として
は、バチルス・サーキュランス（ＡＴＣＣ−３１３８
２）の培養により得られたβ−ガラクトシダーゼ等を挙
げることができる。
【００１１】上記のβ−ガラクトシダーゼは、乳糖に作
用させた場合のガラクトオリゴ糖の生成能が低いβ−ガ
ラクトシダーゼＩおよび乳糖に作用させた場合のガラク
トオリゴ糖の生成能が高いβ−ガラクトシダーゼＩＩを
含有するものであるが、本発明の改質方法は、β−ガラ
クトシダーゼの粗酵素からβ−ガラクトシダーゼＩのみ
を分離した後に実施しても、また両酵素を分離せずβ−
ガラクトシダーゼＩＩを含有する状態で実施しても良
い。
用させた場合のガラクトオリゴ糖の生成能が低いβ−ガ
ラクトシダーゼＩおよび乳糖に作用させた場合のガラク
トオリゴ糖の生成能が高いβ−ガラクトシダーゼＩＩを
含有するものであるが、本発明の改質方法は、β−ガラ
クトシダーゼの粗酵素からβ−ガラクトシダーゼＩのみ
を分離した後に実施しても、また両酵素を分離せずβ−
ガラクトシダーゼＩＩを含有する状態で実施しても良
い。
【００１２】また、バチルス・サーキュランス由来のβ
−ガラクトシダーゼとして、市販の酵素製剤を用いるこ
ともできるが、このものが賦形剤として糖を含有してい
る場合は糖含量ができるだけ少ないものか、あるいは糖
を除いて用いることが望ましい。 糖が存在すると本発
明の改質が十分に行われない場合がある。 なお、市販
されている酵素製剤の例としては、ビオラクタＮ５（大
和化成（株）製）などが挙げられる。
−ガラクトシダーゼとして、市販の酵素製剤を用いるこ
ともできるが、このものが賦形剤として糖を含有してい
る場合は糖含量ができるだけ少ないものか、あるいは糖
を除いて用いることが望ましい。 糖が存在すると本発
明の改質が十分に行われない場合がある。 なお、市販
されている酵素製剤の例としては、ビオラクタＮ５（大
和化成（株）製）などが挙げられる。
【００１３】本発明のβ−ガラクトシダーゼの改質方法
を実施するには、上記のβ−ガラクトシダーゼ（Ｉまた
はＩとＩＩの混合）を単に加熱処理すれば良い。 加熱
は、４０℃以上の温度で、適宜時間、酵素が失活しない
範囲で行えば良く、例えば、４０〜６０℃程度の温度で
１０分〜１６時間程度、望ましくは、４５〜５５℃程度
の温度で１時間〜１６時間程度行うのがよい。 なお、
４０℃未満の加熱では十分な改質が行われず、また、６
０℃を越える加熱では酵素が失活してしまう場合があ
る。 これらの加熱条件はタンクなどでのバッチ式加熱
での条件であって、例えばプレートヒーターなど連続的
に加熱可能な装置を用いれば高温で短時間の加熱も実施
可能となる。 以上の加熱処理により、β−ガラクトシ
ダーゼ中のβ−ガラクトシダーゼＩがβ−ガラクトシダ
ーゼＩＩに類似した特徴を有する酵素に改質され、ガラ
クトオリゴ糖の生成能が高められる。
を実施するには、上記のβ−ガラクトシダーゼ（Ｉまた
はＩとＩＩの混合）を単に加熱処理すれば良い。 加熱
は、４０℃以上の温度で、適宜時間、酵素が失活しない
範囲で行えば良く、例えば、４０〜６０℃程度の温度で
１０分〜１６時間程度、望ましくは、４５〜５５℃程度
の温度で１時間〜１６時間程度行うのがよい。 なお、
４０℃未満の加熱では十分な改質が行われず、また、６
０℃を越える加熱では酵素が失活してしまう場合があ
る。 これらの加熱条件はタンクなどでのバッチ式加熱
での条件であって、例えばプレートヒーターなど連続的
に加熱可能な装置を用いれば高温で短時間の加熱も実施
可能となる。 以上の加熱処理により、β−ガラクトシ
ダーゼ中のβ−ガラクトシダーゼＩがβ−ガラクトシダ
ーゼＩＩに類似した特徴を有する酵素に改質され、ガラ
クトオリゴ糖の生成能が高められる。
【００１４】上記方法により改質されたβ−ガラクトシ
ダーゼを用いてガラクトオリゴ糖を製造するには、この
β−ガラクトシダーゼを単に乳糖に作用させれば良い。
このガラクトオリゴ糖の製造方法は、改質されたβ−ガ
ラクトシダーゼを用いることを除いては、通常の酵素作
用条件で実施することができ、例えば、ｐＨ５.０〜８.
０程度、温度２０〜７０℃程度の条件で実施すれば良
い。 また、改質されたβ−ガラクトシダーゼの添加量
も特に限定されないが、通常約１〜２０ＬＵ（乳糖力
価）／ｇ基質程度から選択されるのが良い。
ダーゼを用いてガラクトオリゴ糖を製造するには、この
β−ガラクトシダーゼを単に乳糖に作用させれば良い。
このガラクトオリゴ糖の製造方法は、改質されたβ−ガ
ラクトシダーゼを用いることを除いては、通常の酵素作
用条件で実施することができ、例えば、ｐＨ５.０〜８.
０程度、温度２０〜７０℃程度の条件で実施すれば良
い。 また、改質されたβ−ガラクトシダーゼの添加量
も特に限定されないが、通常約１〜２０ＬＵ（乳糖力
価）／ｇ基質程度から選択されるのが良い。
【００１５】本発明方法により改質されたβ−ガラクト
シダーゼは、β−ガラクトシダーゼＩのガラクトオリゴ
糖の生成能が高められており、ガラクトオリゴ糖の製造
におけるβ−ガラクトシダーゼＩの不都合が解消されて
いるため、基質として用いられる乳糖の濃度は特に限定
されず、任意の基質濃度でガラクトオリゴ糖の製造を行
うことができる。 また、ガラクトオリゴ糖生成反応は
乳糖のみの溶液においてだけでなく、牛乳や脱脂粉乳溶
液など乳糖を含有する溶液においても高いガラクトオリ
ゴ糖生成率が達成できる。
シダーゼは、β−ガラクトシダーゼＩのガラクトオリゴ
糖の生成能が高められており、ガラクトオリゴ糖の製造
におけるβ−ガラクトシダーゼＩの不都合が解消されて
いるため、基質として用いられる乳糖の濃度は特に限定
されず、任意の基質濃度でガラクトオリゴ糖の製造を行
うことができる。 また、ガラクトオリゴ糖生成反応は
乳糖のみの溶液においてだけでなく、牛乳や脱脂粉乳溶
液など乳糖を含有する溶液においても高いガラクトオリ
ゴ糖生成率が達成できる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例および試験例を挙げ、本発明を
更に詳しく説明する。 なお、本明細書中においては、
β−ガラクトシダーゼの活性を以下の方法により評価し
た。また、試験例および実施例のβ−ガラクトシダーゼ
Ｉとβ−ガラクトシダーゼＩＩは、従来技術であるハイ
ドロキシアパタイトを用いて分離精製をしたものを用い
た。
更に詳しく説明する。 なお、本明細書中においては、
β−ガラクトシダーゼの活性を以下の方法により評価し
た。また、試験例および実施例のβ−ガラクトシダーゼ
Ｉとβ−ガラクトシダーゼＩＩは、従来技術であるハイ
ドロキシアパタイトを用いて分離精製をしたものを用い
た。
【００１７】［ β−ガラクトシダーゼの活性評価法 ］ （１） ＯＮＰＧ法（ＯＮＰＧ力価：ＬＳＵ） 酵素溶液１ｍｌを試験管に量りとり、４０ｍＭのＯＮＰ
Ｇ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド；ｏ−Nitrophenyl−β−D-galactopyranoside）溶液
を１ｍｌ加え、ｐＨ６.０、４０℃で１０分間反応させ
る。 ２％炭酸ナトリウム溶液を５ｍｌ加えて反応を停
止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定する。この方法で１
分間に１μｍｏｌのＯＮＰ（ｏ−ニトロフェノール；o-
Nitrophenol）を遊離する酵素量を１ＬＳＵとした。
Ｇ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド；ｏ−Nitrophenyl−β−D-galactopyranoside）溶液
を１ｍｌ加え、ｐＨ６.０、４０℃で１０分間反応させ
る。 ２％炭酸ナトリウム溶液を５ｍｌ加えて反応を停
止させ、４２０ｎｍの吸光度を測定する。この方法で１
分間に１μｍｏｌのＯＮＰ（ｏ−ニトロフェノール；o-
Nitrophenol）を遊離する酵素量を１ＬＳＵとした。
【００１８】（２） 乳糖分解力法（乳糖力価：ＬＵ） １２％乳糖溶液５ｍｌを試験管に量りとり、酵素溶液を
１ｍｌ加えてｐＨ６.０、４０℃で１０分間反応させ
る。 反応を中止したのち生成したグルコース量をグル
コースオキシダーゼ法で測定する。 この方法で１分間
に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１ＬＵと
した。
１ｍｌ加えてｐＨ６.０、４０℃で１０分間反応させ
る。 反応を中止したのち生成したグルコース量をグル
コースオキシダーゼ法で測定する。 この方法で１分間
に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１ＬＵと
した。
【００１９】（３）活性比（ＬＳＵ／ＬＵ） β−ガラクトシダーゼＩとβ−ガラクトシダーゼＩＩ
は、ＯＮＰＧと乳糖に対する分解力が異なることから、
これらの活性比（ＬＳＵ／ＬＵ）を両酵素の指標とし
た。
は、ＯＮＰＧと乳糖に対する分解力が異なることから、
これらの活性比（ＬＳＵ／ＬＵ）を両酵素の指標とし
た。
【００２０】試 験 例 １ ビオラクタＮ５より調製したβ−ガラクトシダーゼＩを
試験管に分注し、密栓したのち各温度条件下で加熱保持
した。 所定の時間保持した酵素をＯＮＰＧ法と乳糖分
解法にて活性を測定し、活性比（ＬＳＵ／ＬＵ）を算出
した。 なお、残存活性％は非加熱の各酵素活性に対す
る割合で算出した。 この結果を表１に示す。
試験管に分注し、密栓したのち各温度条件下で加熱保持
した。 所定の時間保持した酵素をＯＮＰＧ法と乳糖分
解法にて活性を測定し、活性比（ＬＳＵ／ＬＵ）を算出
した。 なお、残存活性％は非加熱の各酵素活性に対す
る割合で算出した。 この結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】試 験 例 ２ ビオラクタＮ５に含まれる賦形剤の糖をセファデックス
（Sephadex） G−１０（ファルマシア製）で除いた酵素
を調製し、試験例１と同様に各温度条件下で加熱保持し
た。 所定の時間保持した酵素をＯＮＰＧ法と乳糖分解
法にて活性を測定し、活性比（ＬＳＵ／ＬＵ）を算出し
た。 なお、残存活性％は非加熱の各酵素活性に対する
割合で算出した。 この結果を表２に示す。
（Sephadex） G−１０（ファルマシア製）で除いた酵素
を調製し、試験例１と同様に各温度条件下で加熱保持し
た。 所定の時間保持した酵素をＯＮＰＧ法と乳糖分解
法にて活性を測定し、活性比（ＬＳＵ／ＬＵ）を算出し
た。 なお、残存活性％は非加熱の各酵素活性に対する
割合で算出した。 この結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
【００２４】試 験 例 ３ β−ガラクトシダーゼＩを３０℃から５５℃の各温度で
６０分加熱して改質させた。 改質後のβ−ガラクトシ
ダーゼＩを乳糖濃度１０％の基質に４０℃で作用させ、
三糖以上のオリゴ糖の含有量を経時的にＨＰＬＣ（高速
液体クロマトグラフィー）で測定した。 なお、酵素添
加量は５.０ＬＵ／ｇ乳糖とした。 また、コントロール
として非加熱のβ−ガラクトシダーゼＩおよびＩＩにつ
いても測定した。 この結果を図１に示す。
６０分加熱して改質させた。 改質後のβ−ガラクトシ
ダーゼＩを乳糖濃度１０％の基質に４０℃で作用させ、
三糖以上のオリゴ糖の含有量を経時的にＨＰＬＣ（高速
液体クロマトグラフィー）で測定した。 なお、酵素添
加量は５.０ＬＵ／ｇ乳糖とした。 また、コントロール
として非加熱のβ−ガラクトシダーゼＩおよびＩＩにつ
いても測定した。 この結果を図１に示す。
【００２５】試 験 例 ４ ５５℃で１時間加熱して改質させたβ−ガラクトシダー
ゼ（Ｉ,ＩＩ混合）を、３０または５０重量％の乳糖濃
度の基質にそれぞれ５０および６０℃で作用させ、三糖
以上のオリゴ糖の含有量を経時的に測定した。 なお、
酵素添加量はそれぞれ６.０または８.０ＬＵ／ｇ乳糖と
した。 また、コントロールとして非加熱のものについ
ても測定した。 この結果を図２に示す。
ゼ（Ｉ,ＩＩ混合）を、３０または５０重量％の乳糖濃
度の基質にそれぞれ５０および６０℃で作用させ、三糖
以上のオリゴ糖の含有量を経時的に測定した。 なお、
酵素添加量はそれぞれ６.０または８.０ＬＵ／ｇ乳糖と
した。 また、コントロールとして非加熱のものについ
ても測定した。 この結果を図２に示す。
【００２６】この結果、基質濃度に関係なく改質β−ガ
ラクトシダーゼ（Ｉ,ＩＩ混合）がオリゴ糖製造に有効
であることが明らかになった。
ラクトシダーゼ（Ｉ,ＩＩ混合）がオリゴ糖製造に有効
であることが明らかになった。
【００２７】実 施 例 １ β−ガラクトシダーゼＩの加熱処理とガラクトオリゴ糖
の製造：ビオラクタＮ５（５５００ＬＵ／ｇ）を５０ｇ
秤量して１Ｌの０.０２Mリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）に
溶解し、限外濾過モジュール（ＳＩＰ−１０１３、旭化
成製）を用い、酵素の濃縮と賦形剤の糖を除いた。 得
られた３７０ｍｌをハイドロキシアパタイト（ＢＩＯ−
ＧＥＬ ＨＴ, ＢＩＯ−ＲＡＤ製）を充填した２Ｌのカ
ラムに通し、０.０２Mのリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）の
４Ｌを流したのち、同緩衝液の濃度をステップワイズで
上昇させ、０.１５Mを１０Ｌ流してβ−ガラクトシダー
ゼＩＩを溶出させた。
の製造：ビオラクタＮ５（５５００ＬＵ／ｇ）を５０ｇ
秤量して１Ｌの０.０２Mリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）に
溶解し、限外濾過モジュール（ＳＩＰ−１０１３、旭化
成製）を用い、酵素の濃縮と賦形剤の糖を除いた。 得
られた３７０ｍｌをハイドロキシアパタイト（ＢＩＯ−
ＧＥＬ ＨＴ, ＢＩＯ−ＲＡＤ製）を充填した２Ｌのカ
ラムに通し、０.０２Mのリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）の
４Ｌを流したのち、同緩衝液の濃度をステップワイズで
上昇させ、０.１５Mを１０Ｌ流してβ−ガラクトシダー
ゼＩＩを溶出させた。
【００２８】次いで、０.２０Ｍの同緩衝液を１０Ｌ流
したのち０.２５Mの緩衝液１５Ｌでβ−ガラクトシダー
ゼＩを回収し、限外濾過装置を用いて濃縮して１２５,
０００ＬＵの酵素液を調製した。 このβ−ガラクトシ
ダーゼＩ溶液（６０ｍｌ）をビーカーにとり、攪拌しな
がら５５℃で１時間加熱した。 加熱処理した酵素液の
活性を測定したところ１１１,０００ＬＵでＬＳＵ／Ｌ
Ｕは０.６であった。
したのち０.２５Mの緩衝液１５Ｌでβ−ガラクトシダー
ゼＩを回収し、限外濾過装置を用いて濃縮して１２５,
０００ＬＵの酵素液を調製した。 このβ−ガラクトシ
ダーゼＩ溶液（６０ｍｌ）をビーカーにとり、攪拌しな
がら５５℃で１時間加熱した。 加熱処理した酵素液の
活性を測定したところ１１１,０００ＬＵでＬＳＵ／Ｌ
Ｕは０.６であった。
【００２９】２５ｋｇの食品用乳糖を２５Ｌの水に加え
て加熱溶解し、次いで反応タンクのジャケットに水を流
して６０℃まで冷却した。 ６Ｎ−NａＯＨを加えてｐＨ
を６.０に調製したのち、１００,０００ＬＵの上記β−
ガラクトシダーゼＩを加え、６０℃で１０時間反応させ
た。 反応後、三糖以上のガラクトオリゴ糖３９.９％、
二糖４１.５％、グルコース１８.０％、ガラクトース
０.６％の糖組成の溶液を得た。
て加熱溶解し、次いで反応タンクのジャケットに水を流
して６０℃まで冷却した。 ６Ｎ−NａＯＨを加えてｐＨ
を６.０に調製したのち、１００,０００ＬＵの上記β−
ガラクトシダーゼＩを加え、６０℃で１０時間反応させ
た。 反応後、三糖以上のガラクトオリゴ糖３９.９％、
二糖４１.５％、グルコース１８.０％、ガラクトース
０.６％の糖組成の溶液を得た。
【００３０】実 施 例 ２ β−ガラクトシダーゼＩ＋ＩＩの加熱処理とガラクトオ
リゴ糖の製造：ビオラクタＮ５（５５００ ＬＵ／ｇ）
を２５ｇ秤量して５００ｍｌの０.０２Mリン酸緩衝液
（ｐＨ６.０）に溶解し、攪拌しながら５５℃で１時間
加熱した。加熱処理した酵素液（１３２,０００ ＬＵ、
ＬＳＵ／ＬＵ：０.６）を限外濾過装置で濃縮した。
リゴ糖の製造：ビオラクタＮ５（５５００ ＬＵ／ｇ）
を２５ｇ秤量して５００ｍｌの０.０２Mリン酸緩衝液
（ｐＨ６.０）に溶解し、攪拌しながら５５℃で１時間
加熱した。加熱処理した酵素液（１３２,０００ ＬＵ、
ＬＳＵ／ＬＵ：０.６）を限外濾過装置で濃縮した。
【００３１】２５ｋｇの食品用乳糖を２５Ｌの水に加え
て加熱溶解し、次いで反応タンクのジャケットに水を流
して６０℃まで冷却した。 ６Ｎ−NａＯＨを加えてｐＨ
を６.０に調製したのち、１００,０００ＬＵの上記酵素
液を加えて６０℃で１２時間反応させ、三糖以上のガラ
クトオリゴ糖４０.０％、二糖４０.９％、グルコース１
８.５％、ガラクトース０.６％の糖組成の溶液を得た。
て加熱溶解し、次いで反応タンクのジャケットに水を流
して６０℃まで冷却した。 ６Ｎ−NａＯＨを加えてｐＨ
を６.０に調製したのち、１００,０００ＬＵの上記酵素
液を加えて６０℃で１２時間反応させ、三糖以上のガラ
クトオリゴ糖４０.０％、二糖４０.９％、グルコース１
８.５％、ガラクトース０.６％の糖組成の溶液を得た。
【００３２】
【発明の効果】本発明の改質方法によれば、加熱という
極めて簡易な方法により、バチルス・サーキュランス由
来のβ−ガラクトシダーゼのうち、ガラクトオリゴ糖の
生成能が低いβ−ガラクトシダーゼＩを、ガラクトオリ
ゴ糖の生成能が高いβ−ガラクトシダーゼＩＩに類似し
た特徴に改質させることができ、これによりガラクトオ
リゴ糖の生成能を高めることができる。
極めて簡易な方法により、バチルス・サーキュランス由
来のβ−ガラクトシダーゼのうち、ガラクトオリゴ糖の
生成能が低いβ−ガラクトシダーゼＩを、ガラクトオリ
ゴ糖の生成能が高いβ−ガラクトシダーゼＩＩに類似し
た特徴に改質させることができ、これによりガラクトオ
リゴ糖の生成能を高めることができる。
【００３３】また、本発明改質方法では、分離されたβ
−ガラクトシダーゼＩ単独のみならず、分離前のβ−ガ
ラクトシダーゼを利用することができるため、分離工程
を設けることなくガラクトオリゴ糖の製造に非常に有利
なβ−ガラクトシダーゼを得ることができる。
−ガラクトシダーゼＩ単独のみならず、分離前のβ−ガ
ラクトシダーゼを利用することができるため、分離工程
を設けることなくガラクトオリゴ糖の製造に非常に有利
なβ−ガラクトシダーゼを得ることができる。
【００３４】さらに、本発明の改質方法により得られた
β−ガラクトシダーゼは、基質濃度にかかわらず優れた
ガラクトオリゴ糖の生成能を有するものであり、ガラク
トオリゴ糖の製造に極めて有効なものである。
β−ガラクトシダーゼは、基質濃度にかかわらず優れた
ガラクトオリゴ糖の生成能を有するものであり、ガラク
トオリゴ糖の製造に極めて有効なものである。
【図１】β−ガラクトシダーゼＩの改質条件と反応での
オリゴ糖の含有率の経時的変化の関係を示す図面。
オリゴ糖の含有率の経時的変化の関係を示す図面。
【図２】高い基質濃度における加熱または非加熱β−ガ
ラクトシダーゼを用いた場合のオリゴ糖生成率の比較を
示す図面。 以 上
ラクトシダーゼを用いた場合のオリゴ糖生成率の比較を
示す図面。 以 上
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:09） (72)発明者 有福 美香 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 溝渕 尚宏 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内
Claims (4)
- 【請求項１】 バチルス・サーキュランス由来のβ−ガ
ラクトシダーゼを加熱処理することを特徴とするガラク
トオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシダー
ゼの改質方法。 - 【請求項２】 該バチルス・サーキュランス由来のβ−
ガラクトシダーゼがβ−ガラクトシダーゼＩであること
を特徴とする請求項１記載のガラクトオリゴ糖の生成能
を高めるためのβ−ガラクトシダーゼの改質方法。 - 【請求項３】 該加熱処理を４０〜６０℃の温度範囲で
行うことを特徴とする請求項１または請求項２記載のガ
ラクトオリゴ糖の生成能を高めるためのβ−ガラクトシ
ダーゼの改質方法。 - 【請求項４】 請求項１ないし請求項３記載の改質方法
により得られたβ−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させ
ることを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19204397A JP3831075B2 (ja) | 1997-07-03 | 1997-07-03 | β−ガラクトシダーゼの改質方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19204397A JP3831075B2 (ja) | 1997-07-03 | 1997-07-03 | β−ガラクトシダーゼの改質方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1118763A true JPH1118763A (ja) | 1999-01-26 |
| JP3831075B2 JP3831075B2 (ja) | 2006-10-11 |
Family
ID=16284667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19204397A Expired - Lifetime JP3831075B2 (ja) | 1997-07-03 | 1997-07-03 | β−ガラクトシダーゼの改質方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3831075B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001245690A (ja) * | 2000-03-03 | 2001-09-11 | Yakult Honsha Co Ltd | グリコシドまたはオリゴ糖の製造方法 |
| WO2010140435A1 (ja) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | 天野エンザイム株式会社 | バチルス・サーキュランス由来のβ-ガラクトシダーゼ |
| WO2015046408A1 (ja) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型β－ガラクトシダーゼ |
| US9974318B2 (en) | 2009-06-05 | 2018-05-22 | Amano Enzyme Inc. | Method for producing a low-lactose milk, medicine, supplement, or galacto-oligosaccharide |
| WO2018210820A1 (en) * | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Novozymes A/S | Glycosylated beta-galactosidase compositions having improved transgalactosylating activity |
-
1997
- 1997-07-03 JP JP19204397A patent/JP3831075B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001245690A (ja) * | 2000-03-03 | 2001-09-11 | Yakult Honsha Co Ltd | グリコシドまたはオリゴ糖の製造方法 |
| WO2010140435A1 (ja) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | 天野エンザイム株式会社 | バチルス・サーキュランス由来のβ-ガラクトシダーゼ |
| AU2010255150B2 (en) * | 2009-06-05 | 2014-02-27 | Amano Enzyme Inc. | Beta-galactosidase derived from Bacillus circulans |
| JP5643756B2 (ja) * | 2009-06-05 | 2014-12-17 | 天野エンザイム株式会社 | バチルス・サーキュランス由来のβ−ガラクトシダーゼ |
| US9974318B2 (en) | 2009-06-05 | 2018-05-22 | Amano Enzyme Inc. | Method for producing a low-lactose milk, medicine, supplement, or galacto-oligosaccharide |
| US9516888B2 (en) | 2009-06-05 | 2016-12-13 | Amano Enzyme Inc. | Beta-galactosidase derived from bacillus circulans |
| JPWO2015046408A1 (ja) * | 2013-09-30 | 2017-03-09 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型β−ガラクトシダーゼ |
| WO2015046408A1 (ja) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型β－ガラクトシダーゼ |
| WO2018210820A1 (en) * | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Novozymes A/S | Glycosylated beta-galactosidase compositions having improved transgalactosylating activity |
| WO2018210821A1 (en) * | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Novozymes A/S | Milk products comprising high amounts of galactooligosaccharides (gos) and their production |
| CN110621163A (zh) * | 2017-05-15 | 2019-12-27 | 诺维信公司 | 包含高含量低聚半乳糖(gos)的乳产品及其生产 |
| CN110868865A (zh) * | 2017-05-15 | 2020-03-06 | 诺维信公司 | 具有改进的转半乳糖基活性的糖基化β-半乳糖苷酶组合物 |
| US11304425B2 (en) | 2017-05-15 | 2022-04-19 | Novozymes A/S | Glycosylated beta-galactosidase compositions having improved transgalactosylating activity |
| US11896024B2 (en) | 2017-05-15 | 2024-02-13 | Novozymes A/S | Method of glycation of a polypeptide |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3831075B2 (ja) | 2006-10-11 |
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