CN110868865A - 具有改进的转半乳糖基活性的糖基化β-半乳糖苷酶组合物 - Google Patents

具有改进的转半乳糖基活性的糖基化β-半乳糖苷酶组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含具有β‑半乳糖苷酶活性的多肽的组合物，特别是液体组合物；制备所述组合物的方法；以及这些组合物用于制备例如乳制品的用途。这些具有β‑半乳糖苷酶活性的多肽是通过如下方式来修饰：通过将该酶在还原糖的存在下孵育来糖化赖氨酸和/或精氨酸残基，任选地结合热处理。由此，提高了转半乳糖基活性。

Description

具有改进的转半乳糖基活性的糖基化β-半乳糖苷酶组合物
序列表
本发明包含序列表，将其通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及包含酶的组合物，特别是液体组合物；制备这些组合物的方法；以及这些组合物用于制备例如乳制品的用途。
发明背景
β-半乳糖苷酶也称为乳糖酶，它是已知可水解β-D-半乳糖苷酶中的末端非还原性β-D-半乳糖残基的酶。更特别地，在正常反应条件下，该酶将其乳糖底物水解成单糖组分D-葡萄糖和D-半乳糖。在某些条件下，某些β-半乳糖苷酶具有在称为转半乳糖基(transgalactosylation)的过程中将半乳糖转移至葡萄糖或半乳糖的羟基基团以形成低聚半乳糖(GOS)的能力。
已经描述了具有高转半乳糖基活性的来自两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)的乳糖酶，全长形式的和特别是从C-末端截短的均有描述(参见例如
Figure BDA0002270891770000011
等人(2001),Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术],57:647-652或EP专利1 283 876)。
在WO 2009/071539中，我们描述了与
Figure BDA0002270891770000012
相比不同的截短片段。WO 2009/071539披露了来自两歧双歧杆菌的胞外乳糖酶的C-末端截短片段，其由于能由乳糖得到大量低聚半乳糖的能力而最初得到分离并请求专利保护，能非常成功地用于水解乳中的乳糖。当在37℃下在水+100g/l乳糖中测试时，如该现有技术所述，该酶高效地制备低聚半乳糖。然而，当在乳中测试时，水解活性与转半乳糖基活性的比率发生明显变化，导致高效水解和极低产量的低聚半乳糖。
WO 2013/182686还描述了与
Figure BDA0002270891770000021
相比的不同截短片段，该截短片段被描述为：当与乳糖一起孵育时，即使在低乳糖水平下(如在乳基产品中)，该截短片段也是GOS的高效生产者。WO 2013/182686还描述了包含稳定剂的组合物。
WO 2015/132349描述了液体乳糖酶组合物，其包含乳糖酶，并且还包含钠、钙或钾-L-乳酸盐或其组合以及任选的糖。
仍然需要开发作为GOS的高效生产者的酶及其工业上重要的配制品。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了配制品，其包含具有β-半乳糖苷酶活性的多肽和至少30wt％的还原糖，优选果糖、半乳糖、葡萄糖或乳糖。
在另一个实施例中，本发明提供了具有β-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽已经通过至少一个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。
在另一个实施例中，本发明提供了修饰具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的方法，该方法包括使该多肽与还原糖，优选果糖、葡萄糖、半乳糖或乳糖接触，接触的时间和温度足以产生通过糖化修饰的多肽。
在另一个实施例中，本发明提供了用于产生低聚半乳糖(GOS)的方法，该方法包括使本发明的配制品或本发明的多肽或已经通过本发明的方法修饰的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与乳糖接触。
在再另一个实施例中，本发明提供了用于产生低聚半乳糖的方法，该方法包括在高温和高初始乳糖浓度的条件下使具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或由其组成的序列的多肽与乳糖接触。
具体实施方式
尽管某些β-半乳糖苷酶或乳糖酶具有主要的水解特性，但是这些酶在例如高乳糖和高温条件下可以被迫具有转移特性。我们出人意料地发现，当进行预孵育时先前水解作用为主的酶可以转化为转移酶，该酶与未加工的酶相比还能够在更低的温度下高效地制备GOS。因此，预孵育出人意料地导致了更稳健的产生GOS的酶，这是由于该酶增强的转移能力(转半乳糖基酶活性)所致。
不希望受理论的束缚，认为这些孵育条件导致β-半乳糖苷酶的糖化，这导致增加的转移特性。随着糖部分的共价附接，β-半乳糖苷酶从水解酶转化为具有转半乳糖基酶活性的转移酶。
β-半乳糖苷酶
来自糖苷水解酶家族2(GH2)的β-半乳糖苷酶是具有外切作用的酶，其水解β-D-半乳糖苷中的末端非还原性β-D-半乳糖残基，例如将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。它们属于酶类别EC 3.2.1.23，官方名称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。此酶的常用名称是乳糖酶，因为乳糖是常见的工业底物。除水解外，此酶类别还能够将半乳糖转移至其他糖类，从而制备低聚半乳糖(GOS)。不同的GH2酶对水解或β-半乳糖苷酶活性和转半乳糖基酶活性具有不同的偏好，并且该偏好可以由其GOS产生能力来表示，例如由转半乳糖基活性与β-半乳糖苷酶活性的比率来表示。
在本上下文中，术语“β-半乳糖苷酶”意指具有将二糖乳糖水解成其成分半乳糖和葡萄糖单体的能力的任何糖苷水解酶。指定为亚类EC 3.2.1.108的酶也称为乳糖酶，其在本发明的上下文中也被认为是β-半乳糖苷酶。在本发明的上下文中，该β-半乳糖苷酶的乳糖水解活性可以被称为其乳糖酶活性或其β-半乳糖苷酶活性。
在本发明的上下文中，具有β-半乳糖苷酶活性的多肽优选属于酶类别3.2.1.23或EC 3.2.1.108，优选3.2.1.23。具有β-半乳糖苷酶活性的多肽优选属于糖苷水解酶家族2(GH2)、更优选属于糖苷水解酶家族GH2_5。
在某些应用中，可以考虑主要具有转半乳糖基活性和主要具有水解活性的多肽的组合。当需要在用具有β-半乳糖苷酶活性的多肽处理(例如在低乳糖水平下)后减少残留的乳糖时，这可能尤其有用。
当考虑在例如乳中的多肽的反应时，碳水化合物最初以乳糖的形式存在，该乳糖是在乳中发现的由半乳糖和葡萄糖构成的二糖。在GOS的形成中，连续的半乳糖分子被添加至乳糖中，然后在延长的孵育后，存在各种碳水化合物(葡萄糖、半乳糖和约30种不同的二糖和多糖)的混合物。
如本文所用的术语“二糖”意指通过称为糖苷键的共价键结合在一起的两个单糖单元，该糖苷键经由脱水反应形成，从而导致一个单糖失去氢原子而另一个单糖失去羟基基团。在一方面，该二糖是纤维二糖、岩藻糖、乳糖、乳果糖、麦芽糖、鼠李糖或蔗糖，最优选乳糖。
如本文所用，术语“转半乳糖基酶”意指能够将半乳糖转移至D-半乳糖(Gal)或D-葡萄糖(Glc)的羟基基团从而产生低聚半乳糖的酶。在一个实施例中，通过该酶对乳糖的反应来鉴定转半乳糖基酶活性，其中在给定时间产生的半乳糖的量少于产生的葡萄糖的量。
更特别地，可以将转半乳糖基酶活性或对于用以水解乳糖或产生GOS的酶的偏好评价为在反应期间的任何给定时间产生的葡萄糖减去半乳糖的量，或者通过直接定量反应期间产生的GOS来评价。可以通过包括本文实例中所示的方法在内的几种方式中的一种来进行此测量。
当评价酶的转半乳糖基活性与β-半乳糖苷酶活性时，β-半乳糖苷酶活性被测量为在反应期间的任何时间点产生的半乳糖浓度。
在本上下文中，多肽的GOS生产被测量为
Figure BDA0002270891770000041
即，转半乳糖基活性与β-半乳糖苷酶活性的比率。
优选地，转半乳糖基活性与β-半乳糖苷酶活性的比率为至少1、至少2.5、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11或至少12，如在高乳糖条件下测量的。
根据本发明有用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽可以是动物、植物或微生物来源的。优选的多肽获得自微生物来源，特别是来自丝状真菌或酵母，或来自细菌。
该多肽可以例如源自以下：蘑菇属(Agaricus)的菌株，例如双孢蘑菇(A.bisporus)；Ascovaginospora；曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉(A.niger)，泡盛曲霉(A.awamori)，臭曲霉(A.foetidus)，日本曲霉(A.japonicus)，米曲霉(A.oryzae)；念珠菌属(Candida)；毛壳菌属(Chaetomium)；Chaetotomastia；网柄菌属(Dictyostelium)，例如盘基网柄菌(D.discoideum)；克鲁维酵母属(Kluveromyces)，例如脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)；毛霉属(Mucor)，例如爪哇毛霉(M.javanicus)、高大毛霉(M.mucedo)、细孢毛霉(M.subtilissimus)；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)；根毛霉属(Rhizomucor)，例如微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)，例如少根根霉(R.arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)、匍枝根霉(R.stolonifer)；核盘霉属(Sclerotinia)，例如白腐核盘霉(S.libertiana)；圆酵母属(Torula)；球拟酵母属(Torulopsis)；毛癣菌属(Trichophyton)，例如红色毛癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，例如W.sclerotiorum；芽孢杆菌属(Bacillus)，例如芽孢杆菌属的种凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、B.novalis、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)；双歧杆菌，例如动物双歧杆菌(B.animalis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、短双歧杆菌(B.breve)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、乳双歧杆菌(B.lactis)、长双歧杆菌(B.longum)；金黄杆菌属(Chryseobacterium)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，例如弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)；梭菌属(Clostridium)，例如产气荚膜梭菌(C.perfringens)；色二孢属(Diplodia)，例如棉色二孢(D.gossypina)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)、迟钝爱德华菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；Miriococcum；Myrothesium；毛霉属；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)；变形菌属(Proteus)，例如普通变形菌(P.vulgaris)；普罗维登斯菌属(Providencia)，例如斯氏普罗维登斯菌(P.stuartii)；密孔菌属(Pycnoporus)，例如朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)、血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)；瘤胃球菌属(Ruminococcus)，例如扭链瘤胃球菌(R.torques)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.Marcescens)；志贺氏杆菌属(Shigella)，例如弗氏志贺菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，例如抗生链霉菌(S.antibioticus)、栗色球孢链霉菌(S.castaneoglobisporus)、紫红链霉菌(S.violeceoruber)；栓菌属(Trametes)；木霉属(Trichoderma)，例如里氏木霉(T.reesei)、维里德木霉(T.viride)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)。
在优选的实施例中，该多肽是来自细菌，例如来自双歧杆菌科，如来自双歧杆菌属，如来自动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌或长双歧杆菌菌株的β-半乳糖苷酶。在更优选的实施例中，该多肽是来自两歧双歧杆菌的β-半乳糖苷酶。
在优选的实施例中，该多肽是来自细菌，例如来自芽孢杆菌科，如来自芽孢杆菌属，如来自芽孢杆菌属的种凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、B.novalis、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌；双歧杆菌，例如动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌菌株的β-半乳糖苷酶。在更优选的实施例中，该多肽是来自环状芽孢杆菌或婴儿芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶。
优选的多肽是具有如下序列的β-半乳糖苷酶，该序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。SEQ ID NO:1的这种片段可以是SEQ ID NO:1的具有β-半乳糖苷酶活性的任何片段。
在优选的实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽包含与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。在更优选的实施例中，该酶包含与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:4至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:5至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:6或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:6至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:7或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:7至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:8或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:8至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:9或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:9至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:10或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:10至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:11或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:11至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:12或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:12至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:13至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:14至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，在本发明方法中使用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有与SEQ ID NO:15或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与SEQ ID NO:15至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
β-半乳糖苷酶可能是胞外的。它们可以在其N-末端包含信号序列，所述信号序列在分泌过程中被切去。
具有β-半乳糖苷酶的多肽可以源自本文提及的任何来源。术语“源自”在本发明的上下文中意指该多肽可以从其天然存在的生物中分离，即该酶的氨基酸序列的身份(identity)与天然的多肽相同。术语“源自”还表示多肽可以在宿主生物中重组产生，其中重组产生的多肽具有与天然多肽相同的身份，或具有修饰的氨基酸序列(例如具有缺失、插入和/或被取代的一个或多个氨基酸)，即重组产生的多肽是天然氨基酸序列的突变体和/或片段。天然的多肽的含义中包括天然的变体。此外，术语“源自”包括通过例如肽合成而合成产生的多肽。术语“源自”还包括已经通过例如糖基化、磷酸化等在体内或体外修饰的酶。对于重组产生的多肽，术语“源自”指多肽的身份而不是重组产生多肽的宿主生物的身份。
可以通过使用任何合适的技术从微生物获得具有β-半乳糖苷酶的多肽。例如，β-半乳糖苷酶多肽制剂可通过发酵合适的微生物和之后通过本领域公知的方法从所得的发酵液或微生物分离乳糖酶制剂而获得。具有β-半乳糖苷酶的多肽还可以通过使用重组DNA技术而获得。这种方法通常包括培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，该载体包含编码所讨论的乳糖酶的DNA序列，并且DNA序列与合适的表达信号可操作地连接，使其能在允许多肽表达的条件下在培养基中表达β-半乳糖苷酶，并从培养物回收多肽。还可以将DNA序列掺入宿主细胞的基因组中。DNA序列可以是基因组、cDNA或合成来源的、或它们的任何组合，并且可以按照本领域已知的方法进行分离或合成。
可以纯化具有β-半乳糖苷酶的多肽。如本文使用的术语“纯化的”包括基本上不含来自生产生物的不溶组分的β-半乳糖苷酶蛋白。术语“纯化的”还包括基本上不含来自获得酶的天然生物的不溶组分的β-半乳糖苷酶蛋白。优选地，还可以从酶的来源生物和培养基的一些可溶组分分离。更优选地，可以通过一种或多种单元操作来进行分离：过滤、沉淀或色谱。
因此，可纯化具有β-半乳糖苷酶活性的多肽，即仅存在少量的其他蛋白质。表述“其他蛋白质”具体涉及其他酶。如本文使用的术语“纯化的”还指代去除其他组分，特别是存在于β-半乳糖苷酶的来源细胞中的其他蛋白质以及最特别是存在于β-半乳糖苷酶的来源细胞中的其他酶。具有β-半乳糖苷酶的多肽可以是“基本上纯的”，即不含来自产生酶的生物(即，例如用于重组产生β-半乳糖苷酶的宿主生物)的其他成分。优选地，β-半乳糖苷酶是至少40％(w/w)纯，更优选至少50％、60％、70％、80％或者甚至至少90％纯的酶蛋白制剂。
术语具有β-半乳糖苷酶活性的多肽包括酶的催化活性必需的任何辅助化合物，如，例如合适的受体或辅因子，其可以或者可以不天然存在于反应系统中。
多肽可以是适合于所述用途的任何形式，如，例如，为干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定化液体或受保护酶的形式。
以合适的量添加多肽，以在所选反应条件下实现理想程度的乳糖水解。可以以在每升乳基底物100与15,000LAU(C)之间，优选在每升乳基底物100-10,000LAU(C)之间的浓度添加多肽。另外优选的浓度包括例如100LAU(C)/L、250LAU(C)/L、500LAU(C)/L、750LAU(C)/L、1000LAU(C)/L、1500LAU(C)/L、2000LAU(C)/L、5000LAU(C)/L、6000LAU(C)/L、7000LAU(C)/L、8000LAU(C)/L、9000LAU(C)/L、10,000LAU(C)/L、11,000LAU(C)/L、12,000LAU(C)/L、13,000LAU(C)/L、14,000LAU(C)/L或15,000LAU(C)/L。
可以通过直接测量从乳糖释放的葡萄糖来测定特定β-半乳糖苷酶的以LAU(C)为单位的活性。技术人员了解如何确定这种活性。可替代地，可以通过使用在本申请的方法和实例中描述的活性测定来测定活性。在此，该活性可以通过将用已知活性的β-半乳糖苷酶运行的标准曲线与由此计算的未知样品的活性进行比较来获得。
特定β-半乳糖苷酶的以LAU(B)为单位的活性可以通过在pH 6.5和30℃下直接测量在缓冲液中从邻硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)释放的邻硝基苯基(ONP)来测定，该缓冲液含有在0.05M MES、1mM MgSO4 7H2O、450mg/L Brij 35中的1.46mg/ml底物。孵育600秒后，通过添加0.2M Na2CO3终止反应，并在孵育126秒后在405nm处测量释放的ONP。技术人员将知道如何执行该测定并确定此类活性。在此，该活性可以通过将用已知活性的乳糖酶运行的标准曲线与由此计算的未知样品的活性进行比较来获得。已知活性的乳糖酶可以是，例如，获得自丹麦的诺维信公司的
Figure BDA0002270891770000111
技术人员了解如何确定不同在pH和温度的乳糖酶活性。优选通过使用本申请的实施例中所述的方法确定不同pH和温度的乳糖酶活性。
在一方面，该多肽是具有从SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的多肽的氨基或羧基末端缺失的一个或多个(若干个)氨基酸的片段，其中该片段具有β-半乳糖苷酶活性。特别优选作为羧基末端截短物的片段。
β-半乳糖苷酶的片段含有至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300个氨基酸残基。
在一方面，β-半乳糖苷酶是如WO 2013/182686中所述。
在一方面，β-半乳糖苷酶是如WO 2015/132349中所述。
在一方面，β-半乳糖苷酶包括SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的多肽和具有β-半乳糖苷酶活性的一个或多个片段，如至少一个、两个、三个、四个或五个片段。
糖化
在实施例中，具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已通过糖化而被修饰。
不希望受理论的束缚，出人意料地发现，β-半乳糖苷酶的糖化将多肽从有更多水解性的酶转化为具有转半乳糖基酶活性的有更多转移性的酶。
如本文所用的“糖化”是指碳水化合物共价附接至蛋白质。碳水化合物附接可以是经由例如该酶的精氨酸、赖氨酸或N-末端的侧链。优选地，该碳水化合物附接是经由精氨酸或赖氨酸的侧链。
糖化有时被称为(非酶促)糖基化。在本发明的上下文中，糖基化和糖化可互换使用，并且糖基化可以是非酶促的。
在实施例中，具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已通过该多肽的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60个残基的糖化而被修饰。
在实施例中，具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已通过该多肽的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。
在实施例中，具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已通过该多肽的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。在一个实施例中，具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已通过该多肽的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。
在优选的实施例中，具有β-半乳糖苷酶活性的多肽通过该多肽的至少1％、优选至少3％、更优选至少5％、甚至更优选至少10％、最优选至少20％的赖氨酸和精氨酸残基的糖化而被修饰。为了避免任何可能的疑问，这意味着该多肽的赖氨酸和精氨酸残基总数的至少1％、优选至少3％、更优选至少5％、甚至更优选至少10％、最优选至少20％通过糖化而被修饰。
在另一个优选的实施例中，具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的胰蛋白酶消化将导致糖化的经胰蛋白酶消化的肽的百分比为至少1％、优选至少3％、更优选至少5％、至少10％或至少20％。
在实施例中，在如下文详述的合适条件下孵育导致赖氨酸和/或精氨酸的一些、基本上所有或甚至所有表面残基的糖化。同样，不希望受理论的束缚，认为一些、基本上所有或甚至所有糖化残基位于具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的C-末端。
孵育导致糖化
在实施例中，本发明提供了修饰具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的方法，该方法包括使该多肽与糖接触，接触的时间和温度足以产生通过糖化修饰的多肽。
在实施例中，使该多肽与5wt％-90wt％糖的溶液在pH 5-10下，在20℃-80℃的温度下接触3-20小时的时间。优选的糖是如下文更详细描述的还原糖，并且特别优选葡萄糖。
合适的条件包括使该多肽与5wt％-90wt％糖(如30wt％-90wt％并且特别是30wt％-70wt％)，例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％糖的溶液接触。
合适的条件包括在5-10范围内的pH(如pH 5-8)，例如pH 5、pH 5.5、pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5、pH 8、pH 8.5、pH 9、pH 9.5或pH 10下使该多肽接触。
合适的条件包括使该多肽接触的时间在3-20小时范围内，如在6-16小时范围内，例如3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、10.5小时、11小时、11.5小时、12小时、12.5小时、13小时、13.5小时、14小时、14.5小时、15小时、15.5小时、16小时、16.5小时、17小时、17.5小时、18小时、18.5小时、19小时、19.5小时或20小时。
合适的条件包括使该多肽在20℃-80℃范围内，如在20℃-50℃范围内，可替代地在40℃-80℃范围内，特别是50℃-70℃，或可替代地在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃的温度下接触。
在优选的实施例中，将具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与还原糖在pH 5-8、优选pH6-7下，在50℃-80℃、优选50℃-70℃的温度下接触3-100小时、优选15-80小时的时间。
技术人员将知道如何根据所添加的酶的量和温度来调节与糖接触的时间。一般而言，如果添加更多的酶，则可以减少接触时间。并且一般而言，如果提高反应温度，则可以减少接触时间。根据与糖接触后酶的储存条件，糖化过程可以在货架上继续进行。因此，如果该酶的货架温度相对较高，则在指定的高温度下与糖的反应时间可以缩短，这是因为在最终消费者使用它之前糖化过程将在酶的运输和储存过程中继续，该最终消费者可以是例如乳制品公司或生产GOS作为成分的公司。
在另一个优选的实施例中，使具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与30wt％-90wt％，优选40wt％-65wt％的还原糖接触。
糖
β-半乳糖苷酶配制品中的糖可以包括单糖、二糖或寡糖。也可以考虑糖的共混物。
优选地，该糖是还原糖。还原糖经由美拉德(Maillard)反应与β-半乳糖苷酶的氨基酸残基反应。
示例性的还原糖包括单糖果糖、半乳糖、葡萄糖、甘油醛、核糖、木糖。优选果糖、半乳糖和/或葡萄糖，并且最特别地是果糖和/或葡萄糖。
其他示例性还原糖包括二糖，如纤维二糖、乳糖和麦芽糖，优选乳糖和/或麦芽糖。示例还有葡萄糖聚合物例如麦芽糖糊精和糖原。
还原糖的存在可以通过许多熟知的测试，包括使用Benedict试剂和/或Tollen试剂来检测。
配制品
根据本发明的实施例的配制品可以包含液体组合物。为了易于使用，优选液体组合物。
在替代的实施例中，该配制品包含固体组合物，例如粉末或颗粒。
在实施例中，根据本发明的配制品或组合物包含具有β-半乳糖苷酶活性的多肽和至少30wt％、31wt％、32wt％、33wt％、34wt％、35wt％、36wt％、37wt％、38wt％、39wt％、40wt％、41wt％、42wt％、43wt％、44wt％、45wt％、46wt％、47wt％、48wt％、49wt％、50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、54wt％、55wt％、56wt％、57wt％、58wt％、59wt％、60wt％、61wt％、62wt％、63wt％、64wt％、65wt％、66wt％、67wt％、68wt％、69wt％、70wt％、71wt％、72wt％、73wt％、74wt％、75wt％、76wt％、77wt％、78wt％、79wt％、80wt％、81wt％、82wt％、83wt％、84wt％、85wt％、86wt％、87wt％、88wt％、89wt％或90wt％的糖。优选地，这样的β-半乳糖苷酶组合物包含200-20,000LAU(C)/g。
在一种合适的配制品中，该组合物包含具有β-半乳糖苷酶活性的酶多肽和至少30wt％、31wt％、32wt％、33wt％、34wt％、35wt％、36wt％、37wt％、38wt％、39wt％、40wt％、41wt％、42wt％、43wt％、44wt％、45wt％、46wt％、47wt％、48wt％、49wt％、50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、54wt％、55wt％、56wt％、57wt％、58wt％、59wt％、60wt％、61wt％、62wt％、63wt％、64wt％、65wt％、66wt％、67wt％、68wt％、69wt％、70wt％、71wt％、72wt％、73wt％、74wt％、75wt％、76wt％、77wt％、78wt％、79wt％或80wt％的葡萄糖。优选地，这样的β-半乳糖苷酶组合物包含200-20,000LAU(C)/g。
一种合适的β-半乳糖苷酶组合物包含200-20,000LAU(C)/g和至少35wt％、36wt％、37wt％、38wt％、39wt％、40wt％、41wt％、42wt％、43wt％、44wt％、45wt％、46wt％、47wt％、48wt％、49wt％、50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、54wt％、55wt％、56wt％、57wt％、58wt％、59wt％、60wt％、61wt％、62wt％、63wt％、64wt％或65wt％的糖，优选在40wt％-80wt％范围内的糖。优选的β-半乳糖苷酶组合物包含200-20,000LAU(C)/g和优选40wt％、60wt％或80wt％葡萄糖。
在一个实施例中，该配制品是液体配制品，其包含200-15,000LAU(C)/g，优选500-10,000LAU(C)/g。
在一个实施例中，该配制品是固体配制品，其包含1,000-20,000LAU(C)/g，优选3,000-15,000LAU(C)/g。
在实施例中，该配制品还包含甘油。
然而，在优选的实施例中，该配制品不含或至少基本上不含多元醇或二醇，如甘油和/或山梨糖醇。多元醇或二醇如甘油的量优选小于40wt％、小于30wt％、小于25wt％、小于20wt％、小于15wt％、小于10wt％、最优选小于5wt％。最优选地，该配制品不含多元醇或二醇，如甘油。
在实施例中，本文的配制品是酶稳定的。特别优选酶稳定的液体酶配制品，并且更特别优选不使用甘油的酶稳定的液体酶配制品。酶稳定性是酶的活性随时间降低的速率的量度。
还优选微生物稳定的配制品，尤其是液体配制品。微生物稳定性是不需要的微生物在组合物中增殖和生长的速率的量度。
在实施例中，该配制品还包含氯化钠或氯化钾，该氯化钠或氯化钾优选在0.01wt％-5wt％、优选0.01wt％-3wt％、更优选0.01wt％-2wt％的范围内。
在实施例中，该配制品还包含防腐剂。食品级防腐剂是优选的，其中苯甲酸酯、山梨酸酯、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯是示例性的。
在可替代的但优选的实施例中，该配制品不含防腐剂，如苯甲酸酯、山梨酸酯、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。
用途
考虑了在原位条件下从已经存在于乳中的乳糖产生低聚半乳糖，以及在高初始乳糖浓度(大于40％-50％乳糖(w/w))的条件下产生低聚半乳糖。
在实施例中，用于产生低聚半乳糖的方法包括在高温和高初始乳糖浓度的条件下使具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与乳糖接触。特别地，该温度可以是例如40℃-80℃，如50℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。此外，初始乳糖浓度可以高于40％(w/w)，如40％-50％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)、55％(w/w)、40％-60％(w/w)，或甚至高于60％(w/w)，如61％(w/w)、62％(w/w)、63％(w/w)、64％(w/w)、65％(w/w)、66％(w/w)、67％(w/w)、68％(w/w)、69％(w/w)、70％(w/w)、71％(w/w)、72％(w/w)、73％(w/w)、74％(w/w)、75％(w/w)或80％(w/w)乳糖。
在一方面，提供了用于产生乳制品的方法，该方法包括用如本文所述的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽处理包含乳糖的乳基底物。通常，在用于施加在乳中具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的原位条件下，初始乳糖浓度为约3％-10％(w/w)乳糖，例如3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(w/w)、最通常约5％(w/w)。
术语“乳”，在本发明的背景中，应理解为对任何哺乳动物如牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶而获得的乳状分泌物。
在本发明的上下文中，“乳基底物”可以是任何生的和/或加工的乳材料。有用的乳基底物包括，但不限于包含乳糖的任何乳或乳样产品的溶液/悬浮液，如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、重构乳粉(reconstituted milk powder)、炼乳、干乳的溶液(solutions ofdried milk)、UHT乳、乳清、乳清渗透液(whey permeate、酸性乳清(acid whey)或乳脂(cream)。
优选地，乳基底物是乳或脱脂乳粉的水溶液。乳粉通常具有36％-52％(w/w)的起始乳糖浓度。
乳基底物可以是比生乳更浓缩的。
在一个实施例中，乳基底物中蛋白质与乳糖的比率为至少0.2，优选至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6或者最优选至少0.7。
可以根据本领域已知的方法对乳基底物进行均质化和巴氏灭菌。
“均质化”在本文使用时表示充分混合以获得可溶的悬浮液或乳液。可以进行均质化而将乳脂分解成更小的尺寸，使其不再与乳分离。这可以通过迫使乳在高压通过小孔而完成。
“巴氏灭菌”在本文使用时表示减少或消除乳基底物中活生物(如微生物)的存在。优选地，通过将特定温度保持特定时间而获得巴氏灭菌。通常通过加热而获得特定的温度。可以选择温度和持续时间，从而杀死或失活某些细菌，如有害的细菌，和/或使乳中的酶失活。然后可以进行快速冷却步骤。在本发明的上下文中，“乳制品”可以是任何食品，其中主要成分之一为乳基成分。优选地，主要成分为乳基成分。更优选地，主要成分是乳基底物，其已经根据本发明的方法用具有β-半乳糖苷酶活性的多肽处理。在本发明的上下文中，“主要成分之一”表示该成分具有占乳制品总干物质的超过20％、优选超过30％或超过40％的干物质，而“主要成分”表示该成分具有占乳制品总干物质的超过50％、优选超过60％或超过70％的干物质。
根据本发明的乳制品可以是，例如，脱脂乳、低脂乳、全脂乳、乳脂、UHT乳、具有延长的货架期的乳、发酵乳产品、乳酪、酸奶、奶油、乳质涂抹料(dairy spread)、酪乳、酸化乳饮料、酸奶油、乳清基饮料、冰激淋、炼乳、乳糖浆(dulce de leche)或调味乳饮料。乳制品可以由本领域已知的任何方法生产。
乳制品可以另外包括非乳成分，例如植物成分，如例如植物油、植物蛋白和/或植物碳水化合物。乳制品还可以进一步包括添加剂如例如酶、调味剂、微生物培养物(如益生培养物)、盐、甜味剂、糖、酸、水果、果汁或本领域已知可作为乳制品成分或添加剂的任何其他成分。
在本发明的一个实施例中，一种或多种乳组分(milk components)和/或乳级分(milk fractions)占乳制品的至少50％(重量/重量)，如至少70％，例如至少80％，优选至少90％。
在本发明的一个实施例中，已根据本发明的方法用具有β-半乳糖苷酶活性的乳糖酶多肽处理的一种或多种乳基底物占乳制品的至少50％(重量/重量)，如至少70％，例如至少80％，优选至少90％。
在本发明的一个实施例中，乳制品是未通过添加预先产生的低聚半乳糖而富集的乳制品。
在本发明的一个实施例中，用酶处理的乳基底物在作为乳制品的成分使用之前未干燥。
在本发明的一个实施例中，该乳制品是冰激凌。在本上下文中，冰激凌可以是任何种类的冰激凌，如全脂冰激凌、低脂冰激凌或基于酸奶或其他发酵乳产品的冰激凌。冰激凌可以通过本领域任何已知方法生产。
在本发明的一个实施例中，乳制品是乳或炼乳。炼乳通常具有10％-20％(w/w)如10％-16％(w/w)的乳糖浓度，并且在一些实施例中具有18％-18.5％(w/w)的乳糖浓度。
在本发明的一个优选的实施例中，该乳制品是UHT乳。在本发明的上下文中，UHT乳是已经进行了灭菌过程的乳，所述灭菌过程意欲杀死所有微生物，包括细菌孢子。UHT(超高温)处理可以是，例如，在130℃热处理30秒，或在145℃热处理一秒。
在本发明的一个优选的实施例中，该乳制品是ESL乳。在本发明的上下文中，ESL乳是由于微滤和/或热处理而具有延长的货架期的乳，并且其能在2℃-5℃在货架上保持新鲜至少15天，优选至少20天。
在本发明的另一个优选的实施例中，该乳制品是发酵乳制品，例如酸奶。
在本发明的上下文中，“发酵乳制品”应理解为任何乳制品，其中任何类型的发酵形成生产过程的一部分。发酵乳制品的实例是产品如酸奶、酪乳、鲜奶油(crème fraiche)、酸奶酪(quark)和鲜奶酪(fromage frais)。发酵乳制品可以由本领域任何已知的方法产生。
在本发明的方法中，“发酵”表示通过微生物的作用而将碳水化合物转化成醇或酸。优选地，本发明的方法中的发酵包括将乳糖转化成乳酸。
在本发明的上下文中，“微生物”可以包括能发酵乳底物的任何细菌或真菌。
用于大多数发酵乳产品的微生物选自通常称为乳酸细菌的细菌组。如本文所使用的，术语“乳酸细菌”指革兰氏阳性、微嗜氧或厌氧细菌，其发酵糖并产生酸，这些酸包括乳酸(作为主要产生的酸)、乙酸和丙酸。工业上最常用的乳酸细菌发现于“乳杆菌目”中，其包括乳球菌属物种(Lactococcus spp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)、假性白隐球菌属物种(Pseudoleuconostoc spp.)、片球菌属物种(Pediococcus spp.)、短杆菌属物种(Brevibacterium spp.)、肠球菌属物种(Enterococcus spp.)和丙酸杆菌属物种(Propionibacterium spp.)。此外，属于厌氧细菌双歧杆菌(即双歧杆菌属物种)的组的产乳酸细菌通常被包括在乳酸细菌组中，该双歧杆菌经常单独或与乳酸细菌组合用作食物培养物。
乳酸细菌通常以冷冻或冻干培养物形式供应给乳业，用于批量起子增殖(bulkstarter propagation)或者所谓的“直投式”(DVS)培养物，意欲直接接种入发酵容器或桶中用于产生发酵乳制品。这种培养物通常称作“起子培养物”或“起子”。
常用的乳酸细菌的起子培养物菌株通常分成嗜常温生物(其最适生长温度约30℃)和嗜热生物(其最适生长温度在约40℃至约45℃的范围内)。属于嗜常温组的典型生物包括乳酸乳球菌(Lactococus lactis)、乳酸乳球菌干酪亚种(Lactococus lactissubsp.cremoris)、肠膜状明串珠菌干酪亚种(Leuconostoc mesenteroidessubsp.cremoris)、肠膜状假明串珠菌干酪亚种(Pseudoleuconostoc mesenteroidessubsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰生物突变株(Lactococus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactococus casei subsp.casei)和副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactococusparacasei subsp.paracasei)。嗜热乳酸细菌菌种包括例如嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
属于双歧杆菌属的厌氧细菌，包括双岐双歧杆菌、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，也常用作乳品起子培养物，并且通常包括在乳酸细菌组中。此外，丙酸杆菌属的菌种可用作乳品起子培养物，特别是在奶酪的生产中。此外，属于双歧杆菌属的生物通常用作食物起子培养物。
另一组微生物起子培养物是真菌培养物，包括酵母培养物和丝状真菌的培养物，其特别用于某些类型的奶酪和饮料的生产中。真菌的实例包括娄地青霉(Penicilliumroqueforti)、白青霉(Penicillium candidum)、白地霉(Geotrichum candidum)、开菲尔圆酵母(Torula kefir)、开菲尔酵母(Saccharomyces kefir)和酿酒酵母。
在本发明的一个实施例中，用于乳基底物发酵的微生物是干酪乳杆菌或嗜热链球菌和德氏乳酸杆菌保加利亚亚种的混合物。
本发明的方法中使用的发酵方法是公知的，并且本领域的技术人员了解如何选择合适的工艺条件，如温度、氧、微生物的量和特征、添加剂(如例如碳水化合物、调味剂、矿物质、酶)和处理时间。明显地，可以选择发酵条件以支持本发明的实现。
作为发酵的结果，乳基底物的pH降低。本发明的发酵乳制品的pH可以是，例如，在3.5-6的范围中，如在3.5-5的范围中，优选在3.8-4.8的范围中。
在优选的实施例中，该发酵乳制品是酸奶。
在一个实施例中，提供了一种使用本文所述的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽或表达这种多肽的细胞来产生寡糖的方法。寡糖包括但不限于低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、乳糖蔗糖、低聚麦芽糖、低聚甘露糖和低聚木糖。特别优选低聚半乳糖(GOS)。
在实施例中，通过使如本文所述的多肽与包含二糖底物(包括例如纤维二糖、乳糖、乳果糖、麦芽糖、鼠李糖、蔗糖和海藻糖)的培养基接触，并在产生寡糖的条件下孵育来产生寡糖。包含如本文所述的多肽的培养基可以是选自由以下组成的组的产品的一部分：奶酪、酸奶和也如上文更特别描述的其他发酵乳产品以及膳食补充剂和益生菌可食用产品。可替代地，可以回收寡糖，然后在制备之前或之后将其添加至目的产品中。
类似地，在实施例中，通过使表达如本文所述的酶多肽的细胞与包含二糖底物(包括例如纤维二糖、乳糖、乳果糖、麦芽糖、鼠李糖、蔗糖和海藻糖)的培养基接触，并在产生寡糖的条件下孵育来产生寡糖。这些细胞可以是选自由以下组成的组的产品的一部分：奶酪、酸奶和也如上文更特别描述的其他发酵乳产品以及膳食补充剂和益生菌可食用产品。可替代地，可以回收寡糖，然后在制备之前或之后将其添加至目的产品中。
在一方面，提供了细胞用于产生选自由以下组成的组的产品的用途：酸奶、奶酪、发酵乳产品、膳食补充剂和益生菌可食用产品。
在一方面，本文所述的多肽可用于制备奶酪产品和用于制备奶酪产品的方法中。奶酪产品可以例如选自由以下组成的组：奶油奶酪、松软奶酪和加工奶酪。通过添加多肽，奶酪可以含有显著增加的低聚半乳糖水平和降低的乳糖水平。在一方面，最终奶酪产品中的乳糖水平可以降低至少约25％，优选至少约50％和更优选至少约75％。该多肽可用于将奶酪产品中的乳糖降低至每份小于约1克，这是大多数乳糖不耐受个体可以耐受的量。
本文提供的奶酪产品是营养增强的奶酪产品，其具有增加的可溶性纤维含量、降低的热焓、优异的感官特性、改进的质地和风味。此外，由于GOS比乳糖或其水解产物吸收得更慢，因此本文所述的多肽可以降低奶酪产品的血糖指数。最后，由于GOS出人意料地为奶油奶酪产品提供了改进的质地从而允许减少稳定剂的使用，或者允许增加水分含量而没有脱水收缩，因此该多肽可以降低奶酪产品、特别是奶油奶酪产品的生产成本。
在另外的方面，提供了如本文披露的转半乳糖基多肽或如本文披露的细胞用于产生低聚半乳糖的用途。在一方面，提供了如本文披露的转半乳糖基多肽或如本文披露的细胞用于产生低聚半乳糖的用途，该低聚半乳糖是选自由以下组成的组的产品的一部分：酸奶、奶酪、发酵乳制品、膳食补充剂和益生菌可食用产品。在一方面，该产品是酸奶、奶酪或发酵乳制品。在一方面，提供了如本文披露的转半乳糖基多肽或如本文披露的细胞用于产生低聚半乳糖以增强双歧杆菌生长的用途。在一方面，提供了如本文披露的转半乳糖基多肽或如本文披露的细胞用于产生低聚半乳糖以增强双歧杆菌在混合培养发酵中的生长的用途。
在一方面，提供了用于产生如本文披露的转半乳糖基多肽的方法，该方法包括在允许所述多肽表达的条件下在合适的培养基中培养如本文披露的细胞，并从该培养物回收得到的多肽。提供了用于产生低聚半乳糖的方法，该方法包括使如本文披露的多肽或如本文披露的细胞与包含乳糖的乳基溶液接触。
用能将乳糖转化为单糖或GOS的多肽处理乳产品具有几个优势。该产品可以由原本表现出诸如肠胃胀气和腹泻的症状的患有乳糖不耐症的人食用。用乳糖酶处理的乳制品的甜度也比类似未经处理的产品高，这是因为与乳糖相比，葡萄糖和半乳糖的感知甜度更高。对于希望最终产品具有高甜度的应用，如酸奶和冰淇淋，这种效果尤其令人感兴趣，并且这允许食用产品中的碳水化合物的净减少。在冰淇淋生产中经常会看到一种称为沙质的现象，其中乳糖分子由于乳糖的溶解度相对较低而结晶。当乳糖转化为单糖或GOS时，冰淇淋的口感比未经处理的产品要好得多。可以消除由于乳糖结晶引起的沙质感的存在，并且可以通过使用全脂乳粉代替脱脂乳粉降低原料成本。酶处理的主要作用是增加甜度。
具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的另一个令人感兴趣的用途是用于婴儿配方食品、较大婴儿配方食品或幼儿配方食品中。婴儿配方食品是针对12个月以下婴幼儿设计和销售的制造食品，通常是从粉末(与水混合)或液体(有或没有额外的水)制备用于瓶喂或杯喂。最常用的婴儿配方食品含有作为蛋白质来源的经纯化的牛奶乳清和酪蛋白、作为脂肪来源的植物油共混物、作为碳水化合物来源的乳糖、维生素-矿物质混合物、以及其他成分。
在许多国家，法律禁止在婴儿配方食品、较大婴儿配方食品或幼儿配方食品中添加或携带甘油，因此，在针对婴儿配方食品、较大婴儿配方食品或幼儿配方食品的应用中，具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的配制品必须不含甘油。
在一个实施例中，具有转半乳糖基活性的多肽可以与其他酶(如蛋白酶(包括凝乳酶-chymosin或rennin)、脂肪酶(如磷脂酶)、淀粉酶和转移酶)一起使用。
优选实施例
1.一种配制品，其包含具有β-半乳糖苷酶活性的多肽和至少30wt％的还原糖，优选果糖、半乳糖、葡萄糖或乳糖。
2.如实施例1所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已经通过至少一个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。
3.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已经通过该多肽的至少1％、优选至少3％、更优选至少5％、甚至更优选至少10％、最优选至少20％的赖氨酸和精氨酸残基的糖化而被修饰。
4.如前述实施例中任一项所述的配制品，其为酶配制品。
5.如前述实施例中任一项所述的配制品，其具有200-20,000LAU(C)/g、优选500-15,000LAU(C)/g的活性。
6.如前述实施例中任一项所述的配制品，其为液体配制品，优选具有200-15,000LAU(C)/g、更优选500-10,000LAU(C)/g的活性。
7.如前述实施例中任一项所述的配制品，其为固体配制品，优选具有1,000-20,000LAU(C)/g、更优选3,000-15,000LAU(C)/g的活性。
8.如前述实施例中任一项所述的配制品，其包含40wt％-65wt％糖。
9.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该糖是葡萄糖。
10.如前述实施例中任一项所述的配制品，其基本上不含甘油。
11.如前述实施例中任一项所述的配制品，其还包含氯化钠或氯化钾，优选在0.01wt％-5wt％，优选0.01wt％-3wt％、更优选0.01wt％-2wt％的范围内。
12.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:6或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:7或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:8或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:9或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:10或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:11或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:12或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与SEQ ID NO:15或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
13.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与SEQ ID NO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
14.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％相同并且具有900-1350个氨基酸，优选1300-1305个氨基酸、更优选1302或1304个氨基酸的长度。
15.一种具有β-半乳糖苷酶活性的多肽，其已经通过至少一个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。
16.如实施例15所述的多肽，其已经通过该多肽的至少1％、优选至少3％、更优选至少5％、甚至更优选至少10％、最优选至少20％的赖氨酸和精氨酸残基的糖化而被修饰。
17.如实施例15-16中任一项所述的多肽，其具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:6或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:7或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:8或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:9或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:10或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:11或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:12或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与SEQ ID NO:15或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
18.如实施例15-17中任一项所述的多肽，其具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与SEQ ID NO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
19.如实施例15-18中任一项所述的多肽，其具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％相同并且具有900-1350个氨基酸，优选1300-1305个氨基酸、更优选1302或1304个氨基酸的长度。
20.一种修饰具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的方法，其包括使该多肽与还原糖，优选果糖、葡萄糖、半乳糖或乳糖接触，接触的时间和温度足以产生通过糖化修饰的多肽。
21.如实施例20所述的方法，其是通过糖化修饰具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的方法。
22.如实施例20-21中任一项所述的方法，其中与未通过糖化修饰的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽相比，该通过糖化修饰的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有改进的转半乳糖基活性。
23.如实施例20-22中任一项所述的方法，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽通过该多肽的至少1％、优选至少3％、更优选至少5％、甚至更优选至少10％、最优选至少20％的赖氨酸和精氨酸残基的糖化而被修饰。
24.如实施例20-23中任一项所述的方法，其包括使该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与30wt％-90wt％的还原糖，优选果糖、葡萄糖或半乳糖在pH5-8下在20℃-80℃的温度下接触3-100小时的时间。
25.如实施例20-24中任一项所述的方法，其包括使该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽在pH 5-8、优选pH 6-7下，在50℃-80℃、优选50℃-70℃的温度下接触3-100小时、优选15-80小时的时间。
26.如实施例20-25中任一项所述的方法，其包括使该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与30wt％-90wt％、优选40wt％、60wt％或80wt％的还原糖，优选葡萄糖接触。
27.如实施例20-25中任一项所述的方法，其包括使该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与30wt％-90wt％、优选40wt％-65wt％的还原糖接触。
28.如实施例20-27中任一项所述的方法，其中该还原糖是果糖、葡萄糖或半乳糖，优选葡萄糖。
29.如实施例20-28中任一项所述的方法，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ IDNO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQID NO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:6或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQID NO:7或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:8或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQID NO:9或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:10或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQID NO:11或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:12或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与SEQ ID NO:15或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
30.如实施例20-29中任一项所述的方法，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQID NO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与SEQ ID NO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
31.如实施例20-30中任一项所述的方法，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％相同并且具有900-1350个氨基酸，优选1300-1305个氨基酸、更优选1302或1304个氨基酸的长度。
32.一种用于产生低聚半乳糖(GOS)的方法，其包括使如实施例1-14中任一项所述的配制品或如实施例15-19中任一项所述的多肽或已通过如权利要求20-31中任一项所述的方法修饰的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与乳糖接触。
33.一种用于产生低聚半乳糖(GOS)的方法，其包括在高温和高初始乳糖浓度的条件下使具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或由其组成的序列的多肽与乳糖接触。
34.如实施例33所述的方法，其中该温度为40℃-80℃，如50℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃，并且其中该初始乳糖浓度为高于40％(w/w)，如40％-50％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)、55％(w/w)、40-60％(w/w)，或甚至高于60％(w/w)，如61％(w/w)、62％(w/w)、63％(w/w)、64％(w/w)、65％(w/w)、66％(w/w)、67％(w/w)、68％(w/w)、69％(w/w)、70％(w/w)、71％(w/w)、72％(w/w)、73％(w/w)、74％(w/w)、75％(w/w)或80％(w/w)乳糖。
实例
材料和方法
活性测定(LAU(C))
原理：
乳糖酶水解乳糖以形成α-D-葡萄糖。在己糖激酶催化的反应中，α-D-葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。伴随着此反应，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。
试剂：
15％(w/v)Brij L23：称量508.0±0.4g的
Figure BDA0002270891770000331
L23(Sigma B4184)放入烧杯中。添加约300mL超纯水并搅拌。将
Figure BDA0002270891770000332
L23定量转移至1L容量瓶中。用超纯水填充至刻度。搅拌至均匀。可储存性：在冰箱中2个月。
显色试剂：(葡萄糖试剂盒(GHK)(0.1M Tris、2.1mM ATP、2.1mM NAD、4mM Mg2+、<0.1％NaN3、4mM Mg2+、>7.5kU/L己糖激酶、>7.5kU/L G-6-P-DH，pH 7.8))：打开葡萄糖(HK)试剂A的小瓶(Thermo Fisher Scientific(产品编号：981304或981779))和葡萄糖(HK)试剂B的小瓶(Thermo Fisher Scientific(产品编号：981304或981779))。将1瓶试剂B倒入1瓶试剂A中。盖上盖子。通过缓慢地且温和地上下旋转小瓶10-15次充分混合。使用在试剂A小瓶中的全部混合物，或将所需量倒入适当的容器中。可储存性：在冰箱中1个月。
溶解缓冲液/稀释缓冲液(0.01M柠檬酸一水合物、0.0225％(w/v)
Figure BDA0002270891770000333
L23、1mMMgSO4,7H2O，pH 4.5)：称量21.0±0.1g柠檬酸一水合物(Cas号5949-29-1)并将其定量转移至10L容量瓶中。称量2.46±0.01g的MgSO4,7H2O(Cas号10034-99-8)并定量转移至容量瓶中。添加约9L的脱矿质水并搅拌直至完全溶解。将15mL的15％(w/v)Brij L23添加至容量瓶中并搅拌。添加约35mL的4M NaOH(Cas号1310-73-2)并搅拌。根据情况使用例如4M NaOH或例如HCl将pH调节至4.50±0.05。用脱矿质水填充至刻度并搅拌。可储存性：在室温下13天。
底物(31.6％w/w乳糖一水合物、0.01M柠檬酸一水合物、0.0225(w/v)Brij L23、1mM MgSO4,7H2O)：称量7.9±0.2g乳糖一水合物(Cas号10039-26-6)，直接放入烧杯中。溶解至总体积为25.0±0.1g的溶解缓冲液。加热并搅拌直至完全溶解，而底物不沸腾。可储存性：在室温下6小时。
标准品：使用具有鉴定的LAU(C)/g的酶标准品(可从丹麦的诺维信公司(Novozymes A/S)获得)作为标准品，在溶解缓冲液中稀释至0.197-0.7880LAU(C)/mL的范围内。
程序：
1.将50uL的底物在50℃下孵育540秒。减去空白(50uL的溶解缓冲液)。
2.添加25uL在溶解缓冲液中的样品。
3.将反应孵育1800秒，然后添加160uL显色试剂。
4.300秒后，测量在340nm处的吸光度。
酶活性的计算：
从标准曲线读取稀释样品的酶活性。以LAU(C)/g为单位的样品活性的计算如下式所述：
Figure BDA0002270891770000341
S＝从标准曲线的读取，以LAU(C)/mL为单位
V＝使用的容量瓶的体积，以mL为单位
F＝第二次稀释的稀释度
W＝样品的重量，以g为单位
在酸奶中的应用
将含有1.5％脂肪的商业均质化乳在90℃下巴氏灭菌20min。将200ml的该乳转移至婴儿奶瓶中并调至43℃。将该乳用冷冻的益生菌酸奶培养物例如丹麦的Chr.Hansen(F-DVS ABY-3)使用0.02％的接种水平进行接种。同时，将酶添加至该乳中。在43℃下发酵乳样品，直至在约五小时内pH达到4.55。然后搅拌酸奶，冷却至25℃并置于8℃保存。在添加培养物和酶后2小时、在最终pH(pH 4.55)时和在8℃下储存20-24小时(第1天)后收集样品。通过添加硫酸终止生物活性。添加高氯酸沉淀蛋白，然后添加含有MQW的标准品。使用配备有与电化学检测仪(ED)连接的Carbopac20的Dionnex ICS-3000系统来测量乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品相比较，鉴定并定量峰。鉴定并定量DP2糖(特别是乳糖)和DP3+形式的GOS的含量。Vivinal GOS(弗里斯兰坎皮纳公司(Friesland Campina))是用于GOS定量的有用标准品。
在酸奶中的应用
将含有1.5％脂肪的商业均质化乳在90℃下巴氏灭菌20min。将200ml的该乳转移至婴儿奶瓶中并调至43℃。将该乳用冷冻的益生菌酸奶培养物例如丹麦的Chr.Hansen(F-DVS ABY-3)使用0.02％的接种水平进行接种。同时将酶添加至该乳中。在43℃下发酵乳样品，直至在约五小时内pH达到4.55。然后搅拌酸奶，冷却至25℃并置于8℃保存。在添加培养物和酶后2小时、在最终pH(pH 4.55)时和在8℃下储存1、2、3和7天后收集样品。通过添加硫酸终止生物活性。添加高氯酸沉淀蛋白，然后添加含有MQW的标准品。使用配备有与电化学检测仪(ED)连接的Carbopac20的DionnexICS-3000系统来测量乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品相比较，鉴定并定量峰。鉴定并定量DP2糖(特别是乳糖)和DP3+形式的GOS的含量。Vivinal GOS(弗里斯兰坎皮纳公司(Friesland Campina))是用于GOS定量的有用标准品。
在1.5％乳中应用
将包含1.5％脂肪的商业均质化乳转移至管(10ml)中，并在水浴中分别加热至40℃、50℃和55℃。然后将酶添加至乳样品中。在添加酶后2小时和4小时收集样品。通过添加硫酸终止生物活性。添加高氯酸沉淀蛋白，然后添加含有MQW的标准品。使用配备有与电化学检测仪(ED)连接的Carbopac20的Dionnex ICS-3000系统来测量乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品相比较，鉴定并定量峰。鉴定并定量DP2糖(特别是乳糖)和DP3+形式的GOS的含量。Vivinal GOS(弗里斯兰坎皮纳公司(Friesland Campina))是用于GOS定量的有用标准品。
在脱脂乳溶液中的应用
通过在91ml离子水中混合9g脱脂乳粉(Kerry)来制备具有约5％乳糖的100ml 9％脱脂乳溶液。将10ml溶液转移至包含磁力搅棒的试管中并置于37℃的水浴中。15min后添加酶。每隔固定时间取乳样品，直至4小时，并且通过在热混合器中加热至99℃持续10min而使酶失活。将样品适当稀释并通过0.20um过滤器过滤。使用配备有Dionex PA1柱和PulsedAmperiometrisk Detektor(PAD)的Dionex BioLC测量乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品相比较，鉴定并定量峰。鉴定并定量DP2糖(特别是乳糖)和DP3+形式的GOS的含量。Vivinal GOS(弗里斯兰坎皮纳公司(Friesland Campina))是用于GOS定量的有用标准品。
在1.5％乳中应用-高温
将包含1.5％脂肪的商业均质化乳转移至管(10ml)中，并调至63℃。将酶添加至乳样品中。在添加酶后15分钟、30分钟、2小时和4小时在63℃下收集样品。通过添加硫酸终止生物活性，并在HPLC分析前通过添加高氯酸沉淀蛋白。使用配备有与电化学检测仪(ED)连接的Carbopac20的Dionnex ICS-3000系统来测量乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品相比较，鉴定并定量峰。鉴定并定量DP2糖(特别是乳糖)和DP3+形式的GOS的含量。Vivinal GOS(弗里斯兰坎皮纳公司(Friesland Campina))是用于GOS定量的有用标准品。
在乳清渗透溶液中的应用
通过分别在85ml或70ml离子水中混合15g或30g经喷雾干燥的乳清渗透粉末(Variolac，阿拉公司(Arla))来制备主要包含乳糖和离子的100ml 15％或30％(w/w)乳清渗透液。将溶液倒入含有磁力搅棒的烧瓶中，并置于37℃水浴中。15min后添加酶。每隔固定时间取乳样品，直至5.5小时，并且通过在热混合器中加热至99℃持续10min而使酶失活。将样品适当稀释并通过0.20um过滤器过滤。使用配备有Dionex PA1柱和PulsedAmperiometrisk Detektor(PAD)的Dionex BioLC测量乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品相比较，鉴定并定量峰。鉴定并定量DP2糖(特别是乳糖)和DP3+形式的GOS的含量。Vivinal GOS(弗里斯兰坎皮纳公司(Friesland Campina))是用于GOS定量的有用标准品。
实例1
多肽的产生
具有如SEQ ID NO:1所示序列的两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶(BBB)在地衣芽孢杆菌中表达
实例2
糖化
BBB-un_1：根据实例1，未处理的两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶(BBB-un_1)在地衣芽孢杆菌中表达，使用超滤(截断值10kDa)浓缩，并且最后用50％(w/w)甘油配制。此样品的活性为7210LAU(C)/g。
向100ml Distec容器中，添加100克含有pH 6.5的20mM琥珀酸缓冲液的66％(w/w)糖(葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)或乳糖(Lac))溶液，并预热至60℃保持15min。然后添加10ml不含甘油的BBB-un_1，并在60℃下伴随混合下孵育16hr。将溶液冷却至室温，并在5℃下针对5mMpH 6.5的琥珀酸缓冲液透析(截断值12kDa)16hr，然后使用截断值10kDa的Amicon池浓缩至约5ml，最后添加相同体积的甘油以得到50％甘油浓度(v/v)。从此程序产生的三个样品称为BBB-Glc、BBB-Gal和BBB-Lac，指出用于孵育的糖。
得到了来自胰蛋白酶消化物的过滤器辅助样品制备(FASP)MS数据，并且糖化肽被鉴定为Lys和Arg+1己糖，导致1个错过的裂解位点。对于未处理、乳糖处理、葡萄糖处理和半乳糖处理，糖化的经胰蛋白酶消化的肽％分别估算为0.66％、31％、36％和27％。因此，由胰蛋白酶消化物制备的肽的质谱法证实了BBB-Glc、BBB-Gal和BBB-Lac的赖氨酸和精氨酸残基的糖化，但这些糖化在BBB-un_1中不存在。
25℃下的GOS生产
为了评价在25℃下产生的GOS，将50ul 1280LAU(C)/g酶(BBB-un_1、BBB-Glc、BBB-Gal或BBB-Lac)与950ul预热的66.5％乳糖*H2O(w/w)、20mM琥珀酸(pH 6.5)在Eppendorf管中混合，从而得到最终浓度为60％的乳糖。然后将该混合物在25℃下以1000rpm孵育22hr，并放在冰上。然后通过用49ml 0.04M NaOH、1mM EDTA稀释1ml GOS产物来使酶失活，并在室温下孵育5min。然后用Milli Q水制备另外的40倍稀释物(即总共2000倍稀释物)，并施加至带有脉冲安培检测法的PA1柱(高效阴离子交换色谱)(HPAEC-PAD)。
65℃下的GOS生产
为了评价在65℃下产生的GOS，将50ul 192LAU(C)/g酶(BBB-un_1、BBB-Glc、BBB-Gal或BBB-Lac)与950ul预热的66.5％乳糖*H2O(w/w)、20mM琥珀酸(pH 6.5)在Eppendorf管中混合，从而得到最终浓度为60％的乳糖。然后将该混合物在65℃下以1000rpm孵育22hr，并放在冰上。然后通过用49ml 0.04M NaOH、1mM EDTA稀释1ml GOS产物来使酶失活，并在室温下孵育5min。然后用Milli Q水制备另外的40倍稀释物(即总共2000倍稀释物)，并施加至带有脉冲安培检测法的PA1柱(高效阴离子交换色谱)(HPAEC-PAD)。
表1.
Figure BDA0002270891770000381
Figure BDA0002270891770000391
如表1所见，与在相同的过程条件下孵育时具有7-10倍更高(Glc-Gal)/Gal比率的糖化BBB形式(BBB-Glc、BBB-Gal和BBB-Lac)相比，未处理的两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶(BBB-un_1)在25℃下具有较低转半乳糖基活性，(Glc-Gal)/Gal比率为0.79。在65℃下，未处理的与糖化的BBB之间的差异不太明显，并且观察到(Glc-Gal)/Gal比率仅增加了1.2-1.3倍。然而，出人意料的是，在升高的温度下，65℃与25℃相比，所有酶BBB-un_1、BBB-Glc、BBB-Gal和BBB-Lac的(Glc-Gal)/Gal比率均明显增加，尤其是BBB-un的(Glc-Gal)/Gal比率增加了13倍。
实例3
样品：
BBB-un_2：根据实例1，未处理的两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶(BBB-un_2)在地衣芽孢杆菌中表达，并使用超滤(截断值10kDa)浓缩，最后用40％(w/w)、60％(w/w)或80％(w/w)葡萄糖配制，其中酶浓度分别为7575LAU(C)/g、9200LAU(C)/g和4600LAU(C)/g。
酶样品的糖化：
将用葡萄糖配制的酶溶液在50℃、55℃和60℃三种不同温度下孵育16h和40h，参见表2。
25℃下的GOS生产
为了评价在25℃下产生的GOS，将表2中所示的50μl酶样品与950μl预热的66.5％乳糖*H2O(w/w)、20mM琥珀酸(pH 6.5)在Eppendorf管中混合，从而得到最终浓度为60％的乳糖。然后将该混合物在25℃下以1000rpm孵育22hr，并放在冰上。然后通过用49ml 0.04MNaOH、1mM EDTA稀释1ml GOS产物来使酶失活，并在室温下孵育5min。然后用Milli Q水制备另外的40倍稀释物(即总共2000倍稀释物)，并施加至PA1柱(其为高效阴离子交换色谱，HPAEC)并用脉冲安培检测法(PAD)检测碳水化合物。
结果与讨论
表2
Figure BDA0002270891770000401
Figure BDA0002270891770000411
表2显示，当温度从50℃升高到60℃时，(Glc-Gal)/Gal比率增加，并且(Glc-Gal)/Gal比率高于未进行热处理的对照。延长的孵育时间也会增加(Glc-Gal)/Gal比率，即与16h后获得的值相比，40h后获得的值较高。对于用40％、60％和80％葡萄糖配制的酶，温度和时间的影响是相同的。
实例4
酶样品的糖化
根据实例1，未处理的两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶(BBB-un)在地衣芽孢杆菌中表达，并使用超滤(截断值10kDa)浓缩，并用表中所示的水平的葡萄糖通过在55℃下孵育44h来配制，然后在4℃下储存。
5℃下在乳中的GOS生产
将一毫升半脱脂乳放入2ml Eppendorf管中，加热至90℃保持5min，并在冰浴中冷却至少30min。然后添加10μl稀释的酶样品，并在5℃下孵育24h。添加5μl HAc终止反应，加热至90℃保持5min，并以20,000g离心5min。然后将50μl上清液添加至5ml Eppendorf管中的500μl Milli Q水+10μl Carrez I溶液中并混合，然后添加10μl Carrez II溶液并混合。然后添加4.43ml milli Q水，并在室温下以20,000g离心5min。然后将1ml上清液添加至4ml水中，并通过0.20μm过滤器过滤至HPLC小瓶中，并施加至PA1HPAEC柱，并用PAD检测碳水化合物。
42℃下在乳中的GOS生产
将一毫升半脱脂乳放入2ml Eppendorf管中，加热至90℃保持5min，并在冰浴中冷却至少30min。然后添加10μl稀释的酶样品，并在42℃下孵育6h。添加5μl HAc终止反应，加热至90℃保持5min，并以20,000g离心5min。然后将50μl上清液添加至5ml Eppendorf管中的500μl Milli Q水+10μl Carrez I溶液中并混合，然后添加10μl Carrez II溶液并混合。然后添加4.43ml milli Q水，并在室温下以20,000g离心5min。然后将1ml上清液添加至4ml水中，并通过0.20μm过滤器过滤至HPLC小瓶中，并施加至PA1HPAEC柱，并用PAD检测碳水化合物。
42℃下在35％重构的脱脂乳粉中的GOS生产
将1ml 35％(w/w)重构的脱脂乳粉放入2ml eppendorf管中，加热至90℃保持5min，并在冰浴中冷却至少30min。然后添加10μl稀释的酶样品，并在42℃下孵育6h。添加5μl HAc终止反应，加热至90℃保持5min，并以20,000g离心5min。然后将50μl上清液添加至5ml Eppendorf管中的500μl Milli Q水+10μl Carrez I溶液中并混合，然后添加10μlCarrez II溶液并混合。然后添加4.43ml milli Q水，并在室温下以20,000g离心5min。然后将0.35ml上清液添加至4.65ml水中，并通过0.20μm过滤器过滤至HPLC小瓶中，并施加至PA1柱(其为高效阴离子交换色谱，HPAEC)，并用脉冲安培检测法(PAD)检测碳水化合物。
结果与讨论
表3来自5℃下在乳中的GOS生产数据
Figure BDA0002270891770000421
表4来自42℃下在乳中的GOS生产数据
Figure BDA0002270891770000422
Figure BDA0002270891770000431
表5来自42℃下在35％(w/w)重构的脱脂乳粉中的GOS生产数据
Figure BDA0002270891770000432
表3、表4和表5显示，与40％葡萄糖对照(无热处理)相比，当在55℃下孵育44h时，40％和60％葡萄糖配制品的(Glc-Gal)/Gal比率均增加。这些结果表明，GOS可以在5℃(乳的常见储存温度)下原位(在乳中)产生，也可以在42℃(可用于酸奶应用)下产生，因为42℃是常见的发酵温度。可以在35％(w/w)重构的脱脂乳粉中获得甚至更高的(Glc-Gal)/Gal比率(表5)，即增加干物质含量和乳糖浓度，从而增加转移酶功效。
实例5
酶样品的糖基化
具有如SEQ ID NO:1所示序列的未处理的两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶(BBB)在地衣芽孢杆菌中表达，并使用超滤(截断值10kDa)浓缩至23000LAU(B)/g，用60％(w/w)葡萄糖(3克葡萄糖+2克BBB-un)或60％(w/w)甘油(3克甘油+2克BBB-un)配制并在50℃下孵育66h，或者用水以相同的稀释度(即3克水+2克BBB-un)进行未配制稀释并在50℃下孵育30min。
25℃下的GOS生产
为了评价在25℃下产生的GOS，将50ul 770LAU(B)/g酶与950ul预热的66.5％乳糖*H2O(w/w)、20mM琥珀酸(pH 6.5)在Eppendorf管中混合，从而得到最终浓度为60％的乳糖。然后将该混合物在25℃下以1000rpm孵育22hr，并放在冰上。然后通过用9ml 0.04MNaOH稀释1ml GOS产物并在室温下孵育5min来使酶失活。然后用Milli Q水制备另外的200倍稀释物(即总共2000倍稀释物)，并施加至带有脉冲安培检测法的PA1柱(高效阴离子交换色谱)(HPAEC-PAD)。
表6
Figure BDA0002270891770000441
在60％葡萄糖中在50℃下孵育66h，以确保两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶(BBB)的糖化。包括在60％甘油(不是还原糖)中孵育作为对照。包括不含配制剂的样品(在水中处理的BBB)作为另一个对照。由于未添加稳定剂(例如葡萄糖或甘油)时酶的不稳定性，酶在50℃下将不会稳定持续66h，因此“在水中处理的BBB”样品仅在50℃下孵育0.5h。
表6显示，只有通过将两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶(BBB)与葡萄糖一起孵育，而不与在甘油中配制的对照或不含配制剂(水)的对照一起孵育，才获得高(Glc-Gal)/Gal比率(5.5)。因此，这些结果显示，并不是像这样对酶样品的加热使酶转化以得到高(Glc-Gal)/Gal比率。在能够使酶糖化的条件下与葡萄糖一起孵育方可确保从低到高(Glc-Gal)/Gal比率的转变。
实例6
样品：
BBB-1：具有如SEQ ID NO:1所示序列的两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶已在地衣芽孢杆菌中表达并经柱纯化，随后最终用60％葡萄糖配制(BBB-1-G)，并如表6中所示在50℃下孵育66h，然后在-20℃下储存。对照样品(BBB-1-C)未用葡萄糖配制，并且仅在-20℃下储存。
乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶(
Figure BDA0002270891770000451
纯)已在乳酸克鲁维酵母中表达，并使用UF(截断值为10kDa)浓缩，最终用60％葡萄糖以与BBB-1-G相同的酶蛋白浓度([ep])配制，并如表6所示在50℃下孵育66h，然后在-20℃下储存。对照样品未用葡萄糖配制，仅在-20℃下储存，并且具有与BBB-1-C相同的酶蛋白浓度([ep])。
具有SEQ ID NO:14的氨基酸28-1737所示序列的环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶已在枯草芽孢杆菌中表达并经柱纯化，随后最终用60％葡萄糖以与BBB-1-G相同的酶蛋白浓度([ep])配制，并如表6所示在50℃下孵育66h，然后在-20℃下储存。对照样品未用葡萄糖配制，仅在-20℃下储存，并且具有与BBB-1-C相同的酶蛋白浓度([ep])。
BBB-2：具有如SEQ ID NO:1所示序列的两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶已在地衣芽孢杆菌中表达，并使用UF(截断值为10kDa)浓缩，最终用50％甘油配制，并如表6中所示在40℃下孵育4周(672h)，然后在-20℃下储存。不将对照样品在40℃下孵育，而是仅在-20℃下储存4周。
BBB-3：具有如SEQ ID NO:1所示序列的两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶已在地衣芽孢杆菌中表达，并使用UF(截断值为10kDa)浓缩，最终用40％葡萄糖配制，并如表6中所示在40℃下孵育4周(672h)，然后在-20℃下储存。不将对照样品在40℃下孵育，而是仅在-20℃下储存4周。
常规乳中的GOS生产
在5℃下24h(结果显示在表6中)。
将两毫升半脱脂乳(阿拉公司，在丹麦当地一家超市中购买，每100g含有4.7g乳糖和3.5g蛋白质)转移到5ml Eppendorf管中(对每个剂量(包括对照)进行两次测定)。然后添加20μl酶稀释物(参见表6)并混合，然后在5℃下孵育24h。孵育后，将10μl浓乙酸添加至每个样品中，并将溶液加热至90℃保持5min。失活后，将样品在室温下以14,000rpm离心5min。将1ml上清液转移至另一个管中，并保持冷冻直至通过HPLC分析。
(Glc-Gal)/Gal比率的测定
如下进行使用PA1柱的带有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)，以定量测定半乳糖(Gal)和葡萄糖(Glc)。
将50μl样品与500μl Milli Q水+10μl Carrez I溶液在5ml Eppendorf管中混合，然后与10μl Carrez II溶液混合。然后添加4.43ml milli Q水，并在室温下以14,000rpm离心5min。将1ml上清液与4ml Milli-Q水混合，并通过0.2μm过滤器过滤到HPLC小瓶中，并施加在PA1柱上。分别使用Glc和Gal的已知标准品进行Glc和Gal的定量测定。
表6
Figure BDA0002270891770000461
Figure BDA0002270891770000471
当两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶和环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶(均为GH2_5)与60％葡萄糖在50℃下孵育66h时，观察到(Glc-Gal)/Gal比率明显增加，其中(Glc-Gal)/Gal比率分别为3.39和4.09。而对于乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶(GH2_6)，观察到(Glc-Gal)/Gal比率的增加较小。这表明，与对于GH2的亚家族6(GH2_6)相比，对于糖基水解酶家族2的亚家族5(GH2_5)，糖化对酶分子从具有水解活性转变为具有转移酶活性的影响更为明显。
所有对照样品BBB-1-C，乳酸克鲁维酵母和环状芽孢杆菌的(Glc-Gal)/Gal比率接近于零。当与实施例5的对照的小而正的值相比时，正如预期的那样，乳中仅有约5％的乳糖，而表5中的对照在60％乳糖下孵育(高乳糖浓度有利于转移酶活性)。
如表6所见，在延长的孵育时间下也可以获得在较低葡萄糖浓度和较低温度下的糖化，其中相对于具有零值的对照，BBB-3在40％葡萄糖中在40℃下孵育672h导致0.75的(Glc-Gal)/Gal比率。制作了另外的对照：将两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶在40％甘油中在40℃下孵育672h，这对(Glc-Gal)/Gal比率没有可检测的影响，因为与对照一样获得零值。此另外的实验证实糖化而不是热处理本身负责将酶从水解酶转变为转移性更高的酶。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
Tams, Jeppe Wegener
<120> β-半乳糖苷酶组合物
<130> 14434-WO-PCT
<160> 15
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Val Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Ser Thr Thr Gln Met Ser Ser Thr
1 5 10 15
Pro Glu Val Val Tyr Ser Ser Ala Val Asp Ser Lys Gln Asn Arg Thr
20 25 30
Ser Asp Phe Asp Ala Asn Trp Lys Phe Met Leu Ser Asp Ser Val Gln
35 40 45
Ala Gln Asp Pro Ala Phe Asp Asp Ser Ala Trp Gln Gln Val Asp Leu
50 55 60
Pro His Asp Tyr Ser Ile Thr Gln Lys Tyr Ser Gln Ser Asn Glu Ala
65 70 75 80
Glu Ser Ala Tyr Leu Pro Gly Gly Thr Gly Trp Tyr Arg Lys Ser Phe
85 90 95
Thr Ile Asp Arg Asp Leu Ala Gly Lys Arg Ile Ala Ile Asn Phe Asp
100 105 110
Gly Val Tyr Met Asn Ala Thr Val Trp Phe Asn Gly Val Lys Leu Gly
115 120 125
Thr His Pro Tyr Gly Tyr Ser Pro Phe Ser Phe Asp Leu Thr Gly Asn
130 135 140
Ala Lys Phe Gly Gly Glu Asn Thr Ile Val Val Lys Val Glu Asn Arg
145 150 155 160
Leu Pro Ser Ser Arg Trp Tyr Ser Gly Ser Gly Ile Tyr Arg Asp Val
165 170 175
Thr Leu Thr Val Thr Asp Gly Val His Val Gly Asn Asn Gly Val Ala
180 185 190
Ile Lys Thr Pro Ser Leu Ala Thr Gln Asn Gly Gly Asn Val Thr Met
195 200 205
Asn Leu Thr Thr Lys Val Ala Asn Asp Thr Lys Ala Ala Ala Asn Ile
210 215 220
Thr Leu Lys Gln Thr Val Phe Pro Lys Gly Gly Lys Thr Asp Ala Ala
225 230 235 240
Ile Gly Thr Val Thr Thr Ala Ser Lys Ser Ile Ala Ala Gly Ala Ser
245 250 255
Ala Asp Val Thr Ser Thr Ile Thr Ala Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ser
260 265 270
Ile Lys Asn Pro Asn Leu Tyr Thr Val Arg Thr Glu Val Leu Asn Gly
275 280 285
Gly Lys Val Leu Asp Thr Tyr Asp Thr Glu Tyr Gly Phe Arg Trp Thr
290 295 300
Gly Phe Asp Ala Thr Ser Gly Phe Ser Leu Asn Gly Glu Lys Val Lys
305 310 315 320
Leu Lys Gly Val Ser Met His His Asp Gln Gly Ser Leu Gly Ala Val
325 330 335
Ala Asn Arg Arg Ala Ile Glu Arg Gln Val Glu Ile Leu Gln Lys Met
340 345 350
Gly Val Asn Ser Ile Arg Thr Thr His Asn Pro Ala Ala Lys Ala Leu
355 360 365
Ile Asp Val Cys Asn Glu Lys Gly Val Leu Val Val Glu Glu Val Phe
370 375 380
Asp Met Trp Asn Arg Ser Lys Asn Gly Asn Thr Glu Asp Tyr Gly Lys
385 390 395 400
Trp Phe Gly Gln Ala Ile Ala Gly Asp Asn Ala Val Leu Gly Gly Asp
405 410 415
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435 440 445
Met Glu Gly Ile Ser Gly Ser Val Ser Gly Phe Pro Ala Thr Ser Ala
450 455 460
Lys Leu Val Ala Trp Thr Lys Ala Ala Asp Ser Thr Arg Pro Met Thr
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485 490 495
Gly Asp Asn Leu Thr Ala Asn Gly Gly Val Val Gly Thr Asn Tyr Ser
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515 520 525
Ile Tyr Gly Ser Glu Thr Ala Ser Ala Ile Asn Ser Arg Gly Ile Tyr
530 535 540
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Tyr Asp Asn Ser Ala Val Gly Trp Gly Ala Val Ala Ser Ser Ala Trp
565 570 575
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595 600 605
Gly Ala Val Gly Ser Trp Pro Ser Pro Lys Asn Ser Tyr Phe Gly Ile
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
Ala Ala Gly Tyr Thr Tyr Gln Val Tyr Glu Gly Ala Asp Lys Asp Ser
705 710 715 720
Thr Ala His Lys Asn Met Tyr Leu Thr Trp Asn Val Pro Trp Ala Glu
725 730 735
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740 745 750
Glu Gly Ser Thr Glu Gly Asn Ala Ser Val Thr Thr Thr Gly Lys Ala
755 760 765
Ala Lys Leu Lys Ala Asp Ala Asp Arg Lys Thr Ile Thr Ala Asp Gly
770 775 780
Lys Asp Leu Ser Tyr Ile Glu Val Asp Val Thr Asp Ala Asn Gly His
785 790 795 800
Ile Val Pro Asp Ala Ala Asn Arg Val Thr Phe Asp Val Lys Gly Ala
805 810 815
Gly Lys Leu Val Gly Val Asp Asn Gly Ser Ser Pro Asp His Asp Ser
820 825 830
Tyr Gln Ala Asp Asn Arg Lys Ala Phe Ser Gly Lys Val Leu Ala Ile
835 840 845
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850 855 860
Asp Gly Leu Gln Ser Ser Thr Val Lys Ile Ala Thr Thr Ala Val Pro
865 870 875 880
Gly Thr Ser Thr Glu Lys Thr Val Arg Ser Phe Tyr Tyr Ser Arg Asn
885 890 895
Tyr Tyr Val Lys Thr Gly Asn Lys Pro Ile Leu Pro Ser Asp Val Glu
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Val Arg Tyr Ser Asp Gly Thr Ser Asp Arg Gln Asn Val Thr Trp Asp
915 920 925
Ala Val Ser Asp Asp Gln Ile Ala Lys Ala Gly Ser Phe Ser Val Ala
930 935 940
Gly Thr Val Ala Gly Gln Lys Ile Ser Val Arg Val Thr Met Ile Asp
945 950 955 960
Glu Ile Gly Ala Leu Leu Asn Tyr Ser Ala Ser Thr Pro Val Gly Thr
965 970 975
Pro Ala Val Leu Pro Gly Ser Arg Pro Ala Val Leu Pro Asp Gly Thr
980 985 990
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Gly Gly Ala Asn Pro Ser Ala Trp Thr Asn Trp Ala Tyr Ser Lys
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<210> 2
<211> 1931
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
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1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Val Glu Asp Ala
20 25 30
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Thr Thr Thr Pro Ser Gly Val Val Cys Ala Gly Leu Thr Glu Ile
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Glu Leu Lys Thr Ala Thr Ser Lys Phe Val Thr Asn Thr Ser Ala
1235 1240 1245
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Val Lys Ala Glu Gly Glu Gly Asn Ala Ser Val Thr Val Leu Pro
1280 1285 1290
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<211> 1341
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 3
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 人工序列
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Ala Lys Phe Gly Gly Glu Asn Thr Ile Val Val Lys Val Glu Asn Arg
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1295
<210> 12
<211> 1720
<212> PRT
<213> 两歧双歧杆菌
<400> 12
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1 5 10 15
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Leu Arg Val Asp Thr His Arg Leu Lys Ala Ser Gly Phe Gln Ile
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<210> 13
<211> 1396
<212> PRT
<213> 环状芽孢杆菌
<400> 13
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Leu Leu Ile Glu Glu Ala Phe Asp Cys Trp Ser Gln Ser Lys Lys Thr
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515 520 525
Arg Thr Ala Glu Asp Ala Trp Lys Ser Asp Arg Asp Leu Lys His Phe
530 535 540
Ala Gly Gln Phe Ile Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Ile Gly Glu Pro Thr
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565 570 575
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725 730 735
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740 745 750
Ala Ser Val Glu Arg Tyr Lys Asp Asn Lys Arg Lys Ala Phe Ser Gly
755 760 765
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770 775 780
Leu His Ala Ser Ala Glu Gly Leu Ser Ser Gly Asn Val Thr Ile Phe
785 790 795 800
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835 840 845
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1190 1195 1200
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1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Glu Asp Leu Gly Thr Ser Ser Pro Ala Tyr Phe Arg Ile Gln Tyr
1235 1240 1245
Lys Ser Gly Asp Glu Trp Lys Asp Val Ser Gly Leu Lys Thr Asn
1250 1255 1260
Pro Ser Asn Thr Val Leu Arg Gln Ala Asn Val Tyr Thr Phe Asp
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1280 1285 1290
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<210> 14
<211> 1737
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属的种
<400> 14
Met Lys Lys Ala Ile Ser Cys Val Phe Leu Ile Ser Ala Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ser Phe Gln Val Pro Val Gln Gly Gln Ala Met Ser Lys Thr Thr
20 25 30
Ser Ala Ala Gly Asn Ser Val Ser Tyr Asp Gly Glu Arg Arg Val Asn
35 40 45
Phe Asn Glu Asn Trp Arg Phe Gln Arg Glu Thr Asn Gly Ser Ile Ala
50 55 60
Gly Ala Gln Asn Pro Gly Phe Asp Asp Ser Ser Trp Arg Lys Leu Asn
65 70 75 80
Leu Pro His Asp Trp Ser Ile Glu Leu Asp Phe Asn Lys Asn Ser Leu
85 90 95
Ala Thr His Glu Gly Gly Tyr Leu Asp Gly Gly Ile Gly Trp Tyr Arg
100 105 110
Lys Thr Phe Thr Ile Pro Glu Ser Met Lys Gly Lys Arg Ile Ser Leu
115 120 125
Asp Phe Asp Gly Val Tyr Met Asn Ser Thr Thr Tyr Leu Asn Gly Glu
130 135 140
Val Leu Gly Thr Tyr Pro Phe Gly Tyr Asn Ala Phe Ser Tyr Asp Ile
145 150 155 160
Ser Asp Lys Leu Tyr Lys Asp Gly Arg Ala Asn Val Leu Val Val Lys
165 170 175
Val Asn Asn Thr Gln Pro Ser Ser Arg Trp Tyr Ser Gly Ser Gly Ile
180 185 190
Tyr Arg Asn Val Tyr Leu Thr Val Thr Asp Pro Ile His Val Ala Arg
195 200 205
Tyr Gly Thr Phe Val Thr Thr Pro Asn Leu Glu Lys Ser Ile Lys Glu
210 215 220
Asp Arg Ala Asp Val Asn Ile Lys Thr Lys Ile Ser Asn Asp Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ala Lys Gln Val Lys Ile Lys Ser Thr Ile Tyr Asp Gly Ala Gly
245 250 255
Asn Thr Val Gln Thr Val Glu Thr Glu Glu Lys Thr Ala Ala Ala Gly
260 265 270
Thr Val Thr Pro Phe Glu Gln Asn Thr Val Ile Lys Gln Pro Lys Leu
275 280 285
Trp Ser Ile Asp Lys Pro Tyr Arg Tyr Asn Leu Val Thr Glu Val Ile
290 295 300
Val Gly Gly Gln Thr Val Asp Thr Tyr Glu Thr Lys Phe Gly Val Arg
305 310 315 320
Tyr Phe Lys Phe Asp Glu Asn Glu Gly Phe Ser Leu Asn Gly Glu Tyr
325 330 335
Met Lys Leu His Gly Val Ser Met His His Asp Leu Gly Ala Leu Gly
340 345 350
Ala Ala Thr Asn Ala Arg Gly Val Glu Arg Gln Met Gln Ile Met Lys
355 360 365
Asp Met Gly Val Asn Ala Ile Arg Val Thr His Asn Pro Ala Ser Pro
370 375 380
Glu Leu Leu Glu Ala Ala Asn Lys Leu Gly Leu Phe Ile Ile Glu Glu
385 390 395 400
Ala Phe Asp Ser Trp Ala Gln Ser Lys Lys Pro Tyr Asp Tyr Gly Arg
405 410 415
Phe Phe Asn Ala Trp Ala Glu His Asp Ile Lys Glu Met Val Asp Arg
420 425 430
Gly Lys Asn Glu Pro Ala Ile Ile Met Trp Ser Ile Gly Asn Glu Ile
435 440 445
Tyr Asp Thr Thr Asn Ala Ala Gly Val Glu Thr Ala Arg Asn Leu Val
450 455 460
Gly Trp Val Lys Glu Ile Asp Thr Thr Arg Pro Thr Thr Ile Gly Glu
465 470 475 480
Asp Lys Thr Arg Gly Asp Lys Val Asn Val Thr Pro Ile Asn Ser Tyr
485 490 495
Ile Lys Glu Ile Phe Asn Ile Val Asp Val Val Gly Leu Asn Tyr Ser
500 505 510
Glu Asn Asn Tyr Asp Gly Tyr His Lys Gln Asn Pro Ser Trp Lys Leu
515 520 525
Tyr Gly Ser Glu Thr Ser Ser Ala Thr Arg Ser Arg Gly Val Tyr Thr
530 535 540
His Pro Tyr Gln Tyr Asn Gln Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Leu Gln Gln
545 550 555 560
Ser Ser Tyr Asp Asn Asp Tyr Val Gly Trp Gly Arg Thr Ala Glu Asp
565 570 575
Ala Trp Lys Tyr Asp Arg Asp Leu Lys His Ile Ala Gly Gln Phe Ile
580 585 590
Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Ile Gly Glu Pro Thr Pro Tyr Tyr Asn Ser
595 600 605
Tyr Pro Ala Lys Ser Ser Tyr Phe Gly Ala Val Asp Thr Ala Gly Phe
610 615 620
Pro Lys Asp Ile Phe Tyr Tyr Tyr Gln Ser Gln Trp Lys Lys Glu Pro
625 630 635 640
Met Val His Leu Leu Pro His Trp Asn Trp Lys Glu Gly Glu Lys Val
645 650 655
Arg Val Leu Ala Tyr Thr Asn Ala Ser Lys Val Glu Leu Val Leu Asn
660 665 670
Gly Glu Ser Leu Gly Glu Lys Asn Tyr Asp Asn Lys Gln Thr Ser Trp
675 680 685
Gly Ala Pro Tyr Lys Glu Thr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Glu Trp
690 695 700
Ala Val Pro Phe Lys Pro Gly Lys Leu Glu Ala Val Ala Lys Asp Glu
705 710 715 720
Asn Gly Lys Val Ile Ala Arg Asp Gln Val Val Thr Ala Gly Glu Pro
725 730 735
Ala Ser Val Arg Leu Thr Ala Asp Arg Lys Val Val Lys Ala Asp Gly
740 745 750
Thr Asp Leu Ser Phe Ile Thr Ala Asp Ile Val Asp Ser Lys Gly Ile
755 760 765
Val Val Pro Asp Ala Asp His Leu Ile Thr Phe Asn Val Thr Gly Gln
770 775 780
Gly Glu Leu Ala Gly Val Asp Asn Gly Asn Ala Ser Ser Val Glu Arg
785 790 795 800
Tyr Lys Asp Asn Lys Arg Lys Ala Phe Ser Gly Lys Ala Leu Ala Ile
805 810 815
Val Gln Ser Ser Lys Leu Ser Gly Lys Ile Thr Val His Ala Ser Val
820 825 830
Ala Gly Leu Ser Ser Asp Ser Thr Ser Val Phe Thr Val Thr Pro Ala
835 840 845
Asp His Asp Lys Lys Ile Val Ala Gly Ile Asp Asp Val Asn Leu Thr
850 855 860
Val Asp Val Asn Glu Ala Pro Lys Leu Pro Ser Glu Ile Lys Val Tyr
865 870 875 880
Tyr Ser Asp Glu Ser Ala Ala Ala Lys Asn Val Thr Trp Asp Glu Val
885 890 895
Asp Pro Lys Gln Tyr Ser Thr Val Gly Glu Phe Thr Val Glu Gly Ser
900 905 910
Val Glu Gly Thr Ser Leu Lys Ala Lys Ala Phe Val Ile Val Lys Gly
915 920 925
Ile Val Ala Val Lys Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Lys Val Gly Val Gln
930 935 940
Pro Val Leu Pro Glu Lys Ala Thr Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Thr Thr
945 950 955 960
Lys Gly Ala Thr Val Thr Trp Asp Glu Ile Pro Glu Asp Lys Leu Ala
965 970 975
Lys Glu Gly Arg Phe Thr Val Glu Gly Ser Val Glu Gly Thr Asp Leu
980 985 990
Lys Ala Asn Val Tyr Val Arg Val Thr Asn Glu Val Lys Ser Val Asn
995 1000 1005
Ile Met Leu Gln Glu Gln Gly Ser Ala Tyr Pro Lys Leu Glu Ala
1010 1015 1020
Thr Phe Thr Asn Pro Ala Asp Asn Leu Gln His Leu Asn Asp Gly
1025 1030 1035
Ile Lys Ser Tyr Thr Asn Asn Pro Val Asn Arg Trp Thr Asn Trp
1040 1045 1050
Thr Arg Thr Pro Arg Asp Ala Gly Asp Ser Ile Thr Val Asn Phe
1055 1060 1065
Gly Lys Lys His Val Ile Asn Asn Leu Asp Leu Phe Val Phe Thr
1070 1075 1080
Asp Ser Gly Thr Val Val Pro Glu Lys Ala Glu Val Gln Tyr Trp
1085 1090 1095
Asp Gly Thr Ala Trp Lys Asp Val Glu Asn Leu Thr Gln Pro Ser
1100 1105 1110
Pro Tyr Val Val Glu Lys Asn Glu Leu Thr Phe Asp Ala Val Ala
1115 1120 1125
Thr Glu Lys Leu Lys Phe His Leu Thr Pro Ser Val Lys Gly Lys
1130 1135 1140
Phe Leu Ala Leu Thr Glu Ala Glu Val Tyr Ala Asp Gln Ile Val
1145 1150 1155
Met Gly Glu Thr Ala Lys Leu Gln Ser Ile Thr Val Asn Gly Lys
1160 1165 1170
Ala Leu Glu Gly Phe Asp His Ala Lys Lys Asn Tyr Glu Leu Val
1175 1180 1185
Leu Pro Tyr Gly Ser Glu Leu Pro Lys Ile Glu Ala Ala Ala Ala
1190 1195 1200
Asp Asn Ala Thr Val Thr Ile Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Pro Gly
1205 1210 1215
Thr Ala Lys Leu Phe Val Thr Ser Glu Asp Gly Lys Val Thr Thr
1220 1225 1230
Glu Tyr Ser Ile Gly Val Ser Thr Glu Glu Pro Lys Leu Val Ser
1235 1240 1245
Ala Glu Leu Ser Ala Asp Lys Thr Asn Val Met Glu Asp Asp Ile
1250 1255 1260
Ile Asp Leu Lys Val Ile Gly Leu Phe Glu Ser Lys Glu Lys Ile
1265 1270 1275
Asp Val Thr Asp Ser Gln Pro Thr Tyr Glu Phe Asp Gln Gln Ile
1280 1285 1290
Ile Lys Ile Glu Gly Asn Lys Leu Tyr Ala Leu Glu Thr Gly Asn
1295 1300 1305
Val Lys Val Lys Val Thr Val Thr Tyr Lys Gly Val Ser Val Thr
1310 1315 1320
Thr Pro Ala Leu Glu Phe Thr Ile Ala Lys Asn Pro Ala Pro Lys
1325 1330 1335
Tyr Ile Thr Ser Leu Glu Pro Val Thr Val Val Val Lys Lys Gly
1340 1345 1350
Glu Ala Pro Glu Leu Pro Ala Thr Val Val Ala His Tyr Asn Arg
1355 1360 1365
Gly Ile Pro Arg Asp Val Lys Val Lys Trp Glu Arg Ile Asn Pro
1370 1375 1380
Ser Lys Tyr Gln Gln Leu Gly Glu Phe Thr Val Ser Gly Met Val
1385 1390 1395
Glu Gly Thr Asp Ile Lys Ala Gln Ala Lys Val Ile Val Lys Gly
1400 1405 1410
Ala Val Ala Val Glu Asp Ile Arg Met Ala Val Leu Leu Lys Gln
1415 1420 1425
Met Pro Gln Leu Pro Gly Lys Val Thr Val Tyr Tyr Ser Asp Gly
1430 1435 1440
Ala Glu Glu Gln Arg Ala Val Lys Trp Glu Glu Ile Pro Gln Glu
1445 1450 1455
Glu Leu Glu Asn Val Gly Glu Phe Lys Val Lys Gly Asp Val Asn
1460 1465 1470
Gly Val Lys Leu Lys Ala Thr Ala Thr Ile Arg Val Thr Asp Glu
1475 1480 1485
Val Gly Gly Glu Gln Asn Ile Ser Arg Ala Lys Asn Gly Tyr Glu
1490 1495 1500
Tyr Pro Lys Ala Glu Ala Ser Phe Thr Asn Asn Gly Pro Gly Ser
1505 1510 1515
Ser Asp Arg Ile Glu Ala Ile Asn Asp Asp Val Ile Ser Tyr Glu
1520 1525 1530
Ala Asn Pro His Asn Arg Trp Thr Asn Trp Gln Pro Val Pro Arg
1535 1540 1545
Ala Gly Asp Trp Val Ser Ile Thr Phe Gly Asp Tyr Glu Pro Thr
1550 1555 1560
Glu Tyr Asp Val Asp Ser Met Glu Ile His Trp Phe Ala Asp His
1565 1570 1575
Gly Thr Ser Tyr Pro Glu Arg Phe Gln Ile Glu Tyr Lys Ser Gly
1580 1585 1590
Asp Ser Trp Lys Glu Val Thr Ser Leu Lys Ser Asp Pro Ala Ser
1595 1600 1605
Pro Ala Leu Gly Lys Ala Asn Val Tyr Ser Phe Asp Arg Val Lys
1610 1615 1620
Thr Ser Ala Ile Arg Val Lys Met Thr Ala Gln Ala Gly Lys Ser
1625 1630 1635
Leu Ala Ile Thr Glu Leu Lys Val Phe Ser Lys Trp Pro Lys Ala
1640 1645 1650
Gly Thr Glu Pro Glu Val Thr Asp Ile Lys Val Gly Gly Lys Ser
1655 1660 1665
Ile Leu Glu Asp Phe Glu Gln Lys Gly Asp His Tyr Glu Val Thr
1670 1675 1680
Ile Asp Ala Gly Asp Ala Asn Val Met Pro Lys Ile Asn Val Lys
1685 1690 1695
Ala Lys Asp Gln Thr Ser Ile Thr Ile Val Pro Ala Val Thr Ser
1700 1705 1710
Pro Ser Thr Ala Lys Val Ile Ala Lys Ser Glu Asp Gly Lys Lys
1715 1720 1725
Val Lys Val Tyr Ser Ile His Tyr Lys
1730 1735
<210> 15
<211> 1025
<212> PRT
<213> 乳酸克鲁维酵母
<400> 15
Met Ser Cys Leu Ile Pro Glu Asn Leu Arg Asn Pro Lys Lys Val His
1 5 10 15
Glu Asn Arg Leu Pro Thr Arg Ala Tyr Tyr Tyr Asp Gln Asp Ile Phe
20 25 30
Glu Ser Leu Asn Gly Pro Trp Ala Phe Ala Leu Phe Asp Ala Pro Leu
35 40 45
Asp Ala Pro Asp Ala Lys Asn Leu Asp Trp Glu Thr Ala Lys Lys Trp
50 55 60
Ser Thr Ile Ser Val Pro Ser His Trp Glu Leu Gln Glu Asp Trp Lys
65 70 75 80
Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Thr Asn Val Gln Tyr Pro Ile Pro Ile Asp
85 90 95
Ile Pro Asn Pro Pro Thr Val Asn Pro Thr Gly Val Tyr Ala Arg Thr
100 105 110
Phe Glu Leu Asp Ser Lys Ser Ile Glu Ser Phe Glu His Arg Leu Arg
115 120 125
Phe Glu Gly Val Asp Asn Cys Tyr Glu Leu Tyr Val Asn Gly Gln Tyr
130 135 140
Val Gly Phe Asn Lys Gly Ser Arg Asn Gly Ala Glu Phe Asp Ile Gln
145 150 155 160
Lys Tyr Val Ser Glu Gly Glu Asn Leu Val Val Val Lys Val Phe Lys
165 170 175
Trp Ser Asp Ser Thr Tyr Ile Glu Asp Gln Asp Gln Trp Trp Leu Ser
180 185 190
Gly Ile Tyr Arg Asp Val Ser Leu Leu Lys Leu Pro Lys Lys Ala His
195 200 205
Ile Glu Asp Val Arg Val Thr Thr Thr Phe Val Asp Ser Gln Tyr Gln
210 215 220
Asp Ala Glu Leu Ser Val Lys Val Asp Val Gln Gly Ser Ser Tyr Asp
225 230 235 240
His Ile Asn Phe Thr Leu Tyr Glu Pro Glu Asp Gly Ser Lys Val Tyr
245 250 255
Asp Ala Ser Ser Leu Leu Asn Glu Glu Asn Gly Asn Thr Thr Phe Ser
260 265 270
Thr Lys Glu Phe Ile Ser Phe Ser Thr Lys Lys Asn Glu Glu Thr Ala
275 280 285
Phe Lys Ile Asn Val Lys Ala Pro Glu His Trp Thr Ala Glu Asn Pro
290 295 300
Thr Leu Tyr Lys Tyr Gln Leu Asp Leu Ile Gly Ser Asp Gly Ser Val
305 310 315 320
Ile Gln Ser Ile Lys His His Val Gly Phe Arg Gln Val Glu Leu Lys
325 330 335
Asp Gly Asn Ile Thr Val Asn Gly Lys Asp Ile Leu Phe Arg Gly Val
340 345 350
Asn Arg His Asp His His Pro Arg Phe Gly Arg Ala Val Pro Leu Asp
355 360 365
Phe Val Val Arg Asp Leu Ile Leu Met Lys Lys Phe Asn Ile Asn Ala
370 375 380
Val Arg Asn Ser His Tyr Pro Asn His Pro Lys Val Tyr Asp Leu Phe
385 390 395 400
Asp Lys Leu Gly Phe Trp Val Ile Asp Glu Ala Asp Leu Glu Thr His
405 410 415
Gly Val Gln Glu Pro Phe Asn Arg His Thr Asn Leu Glu Ala Glu Tyr
420 425 430
Pro Asp Thr Lys Asn Lys Leu Tyr Asp Val Asn Ala His Tyr Leu Ser
435 440 445
Asp Asn Pro Glu Tyr Glu Val Ala Tyr Leu Asp Arg Ala Ser Gln Leu
450 455 460
Val Leu Arg Asp Val Asn His Pro Ser Ile Ile Ile Trp Ser Leu Gly
465 470 475 480
Asn Glu Ala Cys Tyr Gly Arg Asn His Lys Ala Met Tyr Lys Leu Ile
485 490 495
Lys Gln Leu Asp Pro Thr Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Asp Leu Asn
500 505 510
Ala Leu Ser Ala Asp Ile Phe Ser Phe Met Tyr Pro Thr Phe Glu Ile
515 520 525
Met Glu Arg Trp Arg Lys Asn His Thr Asp Glu Asn Gly Lys Phe Glu
530 535 540
Lys Pro Leu Ile Leu Cys Glu Tyr Gly His Ala Met Gly Asn Gly Pro
545 550 555 560
Gly Ser Leu Lys Glu Tyr Gln Glu Leu Phe Tyr Lys Glu Lys Phe Tyr
565 570 575
Gln Gly Gly Phe Ile Trp Glu Trp Ala Asn His Gly Ile Glu Phe Glu
580 585 590
Asp Val Ser Thr Ala Asp Gly Lys Leu His Lys Ala Tyr Ala Tyr Gly
595 600 605
Gly Asp Phe Lys Glu Glu Val His Asp Gly Val Phe Ile Met Asp Gly
610 615 620
Leu Cys Asn Ser Glu His Asn Pro Thr Pro Gly Leu Val Glu Tyr Lys
625 630 635 640
Lys Val Ile Glu Pro Val His Ile Lys Ile Ala His Gly Ser Val Thr
645 650 655
Ile Thr Asn Lys His Asp Phe Ile Thr Thr Asp His Leu Leu Phe Ile
660 665 670
Asp Lys Asp Thr Gly Lys Thr Ile Asp Val Pro Ser Leu Lys Pro Glu
675 680 685
Glu Ser Val Thr Ile Pro Ser Asp Thr Thr Tyr Val Val Ala Val Leu
690 695 700
Lys Asp Asp Ala Gly Val Leu Lys Ala Gly His Glu Ile Ala Trp Gly
705 710 715 720
Gln Ala Glu Leu Pro Leu Lys Val Pro Asp Phe Val Thr Glu Thr Ala
725 730 735
Glu Lys Ala Ala Lys Ile Asn Asp Gly Lys Arg Tyr Val Ser Val Glu
740 745 750
Ser Ser Gly Leu His Phe Ile Leu Asp Lys Leu Leu Gly Lys Ile Glu
755 760 765
Ser Leu Lys Val Lys Gly Lys Glu Ile Ser Ser Lys Phe Glu Gly Ser
770 775 780
Ser Ile Thr Phe Trp Arg Pro Pro Thr Asn Asn Asp Glu Pro Arg Asp
785 790 795 800
Phe Lys Asn Trp Lys Lys Tyr Asn Ile Asp Leu Met Lys Gln Asn Ile
805 810 815
His Gly Val Ser Val Glu Lys Gly Ser Asn Gly Ser Leu Ala Val Val
820 825 830
Thr Val Asn Ser Arg Ile Ser Pro Val Val Phe Tyr Tyr Gly Phe Glu
835 840 845
Thr Val Gln Lys Tyr Thr Ile Phe Ala Asn Lys Ile Asn Leu Asn Thr
850 855 860
Ser Met Lys Leu Thr Gly Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Phe Pro Arg Val
865 870 875 880
Gly Tyr Glu Phe Trp Leu Gly Asp Ser Tyr Glu Ser Phe Glu Trp Leu
885 890 895
Gly Arg Gly Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Glu Ser Gln Arg
900 905 910
Phe Gly Leu Tyr Asp Ser Lys Asp Val Glu Glu Phe Val Tyr Asp Tyr
915 920 925
Pro Gln Glu Asn Gly Asn His Thr Asp Thr His Phe Leu Asn Ile Lys
930 935 940
Phe Glu Gly Ala Gly Lys Leu Ser Ile Phe Gln Lys Glu Lys Pro Phe
945 950 955 960
Asn Phe Lys Ile Ser Asp Glu Tyr Gly Val Asp Glu Ala Ala His Ala
965 970 975
Cys Asp Val Lys Arg Tyr Gly Arg His Tyr Leu Arg Leu Asp His Ala
980 985 990
Ile His Gly Val Gly Ser Glu Ala Cys Gly Pro Ala Val Leu Asp Gln
995 1000 1005
Tyr Arg Leu Lys Ala Gln Asp Phe Asn Phe Glu Phe Asp Leu Ala
1010 1015 1020
Phe Glu
1025

Claims (15)

1.一种配制品，其包含具有β-半乳糖苷酶活性的多肽和至少30wt％的还原糖，优选果糖、半乳糖、葡萄糖或乳糖；其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已经通过至少一个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。
2.如权利要求1所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已经通过该多肽的至少1％、优选至少3％、更优选至少5％的赖氨酸和精氨酸残基的糖化而被修饰。
3.如权利要求1或2中任一项所述的配制品，其具有200-20,000LAU(C)/g的活性。
4.如权利要求1-3中任一项所述的配制品，其为液体配制品，并且优选具有200-15,000LAU(C)/g、更优选500-10,000LAU(C)/g的活性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的配制品，其包含40wt％-65wt％糖，其中该糖优选为葡萄糖。
6.如权利要求1-5中任一项所述的配制品，其基本上不含甘油，并且还任选地包含氯化钠或氯化钾，该氯化钠或氯化钾优选在0.01wt％-5wt％、优选0.01wt％-3wt％、更优选0.01wt％-2wt％的范围内。
7.如权利要求1-6中任一项所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQID NO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:6或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQID NO:7或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:8或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQID NO:9或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:10或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQID NO:11或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:12或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与SEQ ID NO:15或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
8.如权利要求1-7中任一项所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQID NO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与SEQ ID NO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
9.如权利要求1-8中任一项所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％相同并且具有900-1350个氨基酸，优选1300-1305个氨基酸、更优选1302或1304个氨基酸的长度。
10.一种通过糖化修饰具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的方法，该方法包括使该多肽与30wt％-90wt％还原糖，优选果糖、葡萄糖、半乳糖或乳糖接触，接触的时间和温度足以产生通过糖化修饰的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其中与未通过糖化修饰的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽相比，该通过糖化修饰的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有改进的转半乳糖基活性。
12.如权利要求10-11中任一项所述的方法，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽是通过该多肽的至少1％、优选至少3％、更优选至少5％的赖氨酸和精氨酸残基的糖化而被修饰。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，该方法包括使该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽在pH 5-8、优选pH 6-7下，在50℃-80℃、优选50℃-70℃的温度下接触3-100小时、优选15-80小时的时间。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:6或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:7或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:8或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:9或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:10或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:11或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:12或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQ ID NO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与SEQ ID NO:15或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
15.一种用于产生低聚半乳糖(GOS)的方法，其包括使如权利要求1-9中任一项所述的配制品或已通过如权利要求10-14中任一项所述的方法修饰的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与乳糖接触。
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