BR112019024134B1 - Produtos de leite que compreendem altas quantidades de galactooligossacarídeos (gos) e sua produção - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a produtos de leite que compreendem uma alta quantidade de galacto-oligossacarídeos (gos) produzidos in situ e a métodos para produzir os mesmos. o substrato de leite que tem um teor de lactose de pelo menos 20% em peso de lactose é tratado com uma enzima que tem atividade de transgalactose. a atividade de transgalactose da dita enzima pode ter sido aumenta por meio de glicação de resíduos de lisina e/ou arginina por incubação da dita enzima com altas concentrações de glicose a temperaturas elevadas.
Description
[0001] A presente invenção compreende uma listagem de sequências que está incorporada ao presente documento a título de referência. CAMPO DA TÉCNICA A presente invenção refere-se a produtos de leite que compreendem uma alta quantidade de galacto-oligossacarídeos (GOS) produzidos in situ e a métodos para produzir os mesmos.
[0002] Galacto-oligossacarídeos (GOS) podem ser produzidos a partir de lactose através da reação de transgalactosilação enzimática de beta-galactosidase. Foi mostrado que GOS podem promover o crescimento de bifidobactérias, micróbios saudáveis, no intestino grosso de seres humano. Portanto, é benéfico e desejável produzir produtos de leite que compreendam altas quantidades de GOS.
[0003] Relatou-se que a produção de GOS a partir de lactose aumenta com a concentração de lactose.
[0004] GOS podem ser produzidos ex-situ a partir de soluções de lactose e adicionados a produtos lácteos como um ingrediente. Isso adicionará calorias ao produto lácteo e, além disso, a adição de GOS deve estar rotulada no produto final. Isso contraria a tendência geral de "rótulo limpo", isto é, a preferência de muitos consumidores por produtos "naturais" que compreendem apenas ingredientes que são considerados naturais, sem ou com poucos aditivos.
[0005] Portanto, é preferencial produzir GOS in-situ, isto é, produzir os GOS no produto de leite a partir da lactose já presente no leite. A produção de GOS in situ em altos níveis tem sido difícil.
[0006] No documento no EP 0458358 A1, o leite desnatado é concentrado até um teor total de sólidos de 20 a 50% em peso. Incubando- se o leite concentrado com beta-galactosidase a uma temperatura de 20 a 50 °C seguido por secagem por aspersão, especula-se que leite em pó desnatado contendo uma quantidade total de cerca de 5 a 15% em peso de GOS (presumidamente DP2+) possa ser obtido. Assumindo-se um teor total de carboidratos livres no leite desnatado concentrado (lactose e derivados) de cerca de 50% da matéria seca, isso corresponde a uma quantidade relativa de 10 a 30% de GOS DP2+ em p/p dos carboidratos livres totais. A produção de leite em pó desnatado que compreende uma quantidade total de 10,5% de GOS DP2+ em p/p é exemplificada.
[0007] Chen et al. (2002), "Optimization of the enzymic process for manufacturing low-lactose milk containing oligosaccharides", Process Biochemistry 38, 801 a 808, compararam o uso de beta galactosidase para transformar a lactose no leite em GOS diretamente com a aplicação de técnicas de ultrafiltração para separar a lactose das proteínas do leite e, então, transformar a lactose no permeado em GOS. Ao usar leite concentrado contendo 16,7% de lactose, pode-se obter um produto de leite por meio de incubação a 47 °C por 1,4 h, sendo que 22,8% em p/p da lactose foi convertido em GOS DP3+. Ao passo que, removendo-se proteínas do leite por ultrafiltração e, assim, aumentando-se a concentração de lactose no permeado para 25,3% por evaporação, pode-se obter um permeado por meio de incubação a 50 °C por 3,5 h, sendo que até 31,1% em p/p da lactose foi convertido em GOS DP3+.
[0008] O documento no WO 2015/086746 revela uma conversão eficaz de lactose de baixa concentração (no máximo 15% em p/v) em GOS por tratamento de meios à base de leite que compreendem, por exemplo, leite desnatado, creme e lactose com uma beta-galactosidase truncada de Bifidobacteriurn bifidum que consiste em 887 aminoácidos. Também é revelado um substrato à base de leite que compreende GOS após o tratamento enzimático em uma quantidade total de 0,1 a 10% (em p/v). Os exemplos mostram a produção de GOS a partir de meios à base de leite aos quais a lactose foi adicionada. A incubação ocorreu a 45 °C ou menos, e uma quantidade total de até 3,7% (em p/v) de GOS DP3+ foi produzida.
[0009] É um objetivo da presente invenção produzir GOS in situ em altos níveis nos produtos de leite a partir da lactose já presente no leite e fornecer produtos de leite que têm uma alta concentração de GOS produzidos in situ.
[0010] A presente invenção fornece um produto de leite que compreende uma quantidade total de pelo menos 11% em peso de galacto- oligossacarídeos (GOS) DP3+ produzidos in situ, e sendo que os GOS DP3+ produzidos in situ constituem pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais.
[0011] A invenção fornece, ainda, um método para produzir um produto de leite que compreende: (a) fornecer um substrato de leite que compreende pelo menos 20% em peso de lactose, (b) colocar o substrato de leite em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose por pelo menos 45 minutos, (c) inativar completa ou parcialmente a enzima e (d) obter, assim, um produto de leite em que pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de galacto-oligossacarídeos (GOS) DP3+ produzidos in situ.
[0012] Em uma modalidade preferencial, pelo menos 50% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de GOS DP2+ produzidos in situ.
[0013] Produtos de leite que compreendem galacto- oligossacarídeos (GOS) são altamente desejáveis. Os GOS podem ser dissacarídeos (DP2) (exceto lactose, que é, por definição, não GOS), trissacarídeos (DP3), tetrassacarídeos (DP4), pentassacarídeos (DP5) ou oligossacarídeos mais longos. DP é abreviatura de grau de polimerização.
[0014] No contexto da presente invenção, o termo “GOS DPx+" significa a soma de moléculas de GOS que têm DPx ou DP superior. Por exemplo, o termo "DP3+" significa a soma de moléculas de GOS que têm DP3, DP4, DP5, DP6, etc.
[0015] GOS DP3+ são, assim, GOS que têm um grau de polimerização de pelo menos 3. Ou seja, GOS DP3+ são trissacarídeos, tetrassacarídeos, pentassacarídeos e oligossacarídeos mais longos. GOS DP3+ são, por definição, fibras e podem ser reivindicados como tal.
[0016] A indústria de laticínios tem interesse em reivindicar o teor de GOS em seus produtos lácteos, bem como o teor de fibras.
[0017] O alto teor de GOS produzidos in situ ou fibras produzidas in situ (GOS DP3+) é de interesse particular.
[0018] Esta invenção fornece um produto de leite que compreende uma quantidade total de pelo menos 11% em peso de galacto- oligossacarídeos (GOS) DP3+ produzidos in situ, e sendo que os GOS DP3+ produzidos in situ constituem pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais.
[0019] Os carboidratos livres são os carboidratos que não são covalentemente ligados às proteínas.
[0020] Em produtos de leite em que os carboidratos não foram manipulados, por exemplo, por tratamento enzimático, a vasta maioria dos carboidratos livres é lactose.
[0021] Os GOS produzidos in situ nos produtos de leite da invenção foram produzidos no substrato de leite a partir da lactose presente no mesmo. Se um produto de leite for enriquecido por adição de GOS pré- produzidos, tais GOS não são produzidos in situ.
[0022] De preferência, o produto de leite é obtido a partir do leite que não teve a composição amplamente modificada por adição e/ou retirada de constituintes do leite, exceto pelo ajuste de teor de gordura e/ou água. Obviamente, nesse contexto, uma enzima que tem atividade de transgalactose que foi adicionada com o propósito de converter a lactose no produto de leite em GOS não é considerada um constituinte do leite.
[0023] Em uma modalidade, o produto de leite é obtido a partir do leite que teve a composição modifica apenas pelo ajuste do teor de gordura e/ou água e pela adição de enzima transgalactosante.
[0024] O ajuste de teor de gordura e/ou água pode ter sido realizado por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por centrifugação, evaporação, condensação, ultrafiltração, nanofiltração, liofilização, secagem por aspersão, reconstituição por adição de água, etc.
[0025] Em algumas modalidades, por exemplo, o teor de proteína ou o teor de lactose também pode ter sido ligeiramente ajustado, por exemplo, pela empresa de laticínios, por exemplo, para obter um produto de leite que tenha uma composição “padrão” bem definida.
[0026] De preferência, o produto de leite é produzido a partir de leite, sem alterar a razão entre proteína de soro do leite e caseína. De preferência, a razão entre proteína de soro do leite e caseína é mesma que no leite.
[0027] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite não compreende lactose adicionada. Em uma outra modalidade preferencial, o teor de lactose no substrato de leite a partir do qual o produto de leite foi produzido foi apenas ligeiramente ajustado, por exemplo, pela adição/remoção de no máximo 20%, de preferência, no máximo 10% da lactose originalmente presente.
[0028] Em uma modalidade preferencial, nenhuma proteína do leite foi adicionada ou removida do produto de leite. Em uma outra modalidade preferencial, o teor de proteína do leite no produto de leite foi apenas ligeiramente ajustado, por exemplo, pela adição/remoção de no máximo 20%, de preferência, no máximo 10% da proteína do leite originalmente presente. Isso significa que o teor total da proteína do leite é basicamente o mesmo que no leite bruto, exceto pelas alterações relativas provocadas pela remoção ou adição de gordura ou água.
[0029] Em uma modalidade preferencial, no máximo 20%, de preferência, no máximo 10%, proteína do leite foi adicionado ou removido do produto de leite em comparação com a proteína do leite originalmente presente.
[0030] Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite compreende uma quantidade total de pelo menos 10% em peso de proteína do leite, tal como pelo menos 15% em peso ou pelo menos 20% em peso da proteína do leite.
[0031] Como um exemplo, o leite em pó desnatado é normalmente produzido a partir de leite bruto com nenhum ou apenas ligeiro ajuste do teor de lactose e proteína do leite. Tipicamente, o leite em pó desnatado compreende cerca de 50% em peso de lactose e cerca de 35% em peso de proteína do leite. Assim, uma solução de leite desnatado a 60% tipicamente compreende cerca de 30% em peso de lactose e cerca de 21% em peso de proteína do leite. Se GOS forem produzidos em tal solução de leite em pó desnatado a partir da lactose presente no mesmo, tais GOS são GOS produzidos in situ no contexto da presente invenção. Se a solução de leite em pó desnatado que compreende os GOS produzidos in situ for seca por aspersão, o leite em pó obtido será um produto de leite que compreende GOS produzidos in situ de acordo com a invenção.
[0032] Ao passo que, se GOS forem pré-produzidos e adicionados como um ingrediente ao leite em pó desnatado ou a uma solução de leite em pó desnatado, tais GOS não são produzidos in situ no contexto da presente invenção.
[0033] Um produto de leite de acordo com a invenção poderia também ser, por exemplo, leite concentrado, tal como leite condensado, que compreende GOS produzidos in situ. Ou o leite concentrado seco por aspersão que compreende GOS produzidos in situ.
[0034] O produto de leite de acordo com a invenção pode ser diluído (se o produto de leite for um produto líquido, tal como leite em pó reconstituído ou leite concentrado) ou solubilizado (se o produto de leite for um leite em pó) para produzir uma bebida láctea que tem um alto nível relativo de GOS produzidos in situ. Ou o produto de leite de acordo com a invenção pode ser usado como um ingrediente na produção de, por exemplo, uma barra de proteína, uma fórmula para bebês ou um iogurte que tem um alto nível relativo de GOS produzidos in situ.
[0035] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, leite concentrado, tal como leite condensado, ou leite em pó, tal como leite em pó desnatado. Em uma modalidade mais preferencial, o produto de leite é leite em pó desnatado ou leite em pó desnatado reconstituído.
[0036] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite compreende pelo menos 40% em peso, de preferência, pelo menos 45% em peso, pelo menos 50% em peso, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso de matéria seca. Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado, que compreende pelo menos 40% em peso, de preferência, pelo menos 45% em peso, pelo menos 50% em peso, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso de matéria seca. Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite é leite em pó desnatado reconstituído que compreende pelo menos 40% em peso, de preferência, pelo menos 45% em peso, pelo menos 50% em peso, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso de matéria seca.
[0037] Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite é leite em pó, de preferência, leite em pó desnatado.
[0038] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite compreende 40 a 100% em peso, de preferência, 45 a 100% em peso, 50 a 100% em peso, 55 a 100% em peso, 57 a 100% em peso ou 60 a 100% em peso de matéria seca. Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite compreende 50 a 70% em peso de matéria seca, de preferência, 55 a 65% em peso de matéria seca, tal como cerca de 60% em peso de matéria seca.
[0039] No produto de leite da invenção, os GOS DP3+ produzidos in situ constituem pelo menos 35% em peso do carboidrato livre total. Em uma modalidade preferencial, pelo menos 40% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de GOS DP3+ produzidos in situ.
[0040] Em uma outra modalidade preferencial, 35 a 70% em peso, de preferência, 40 a 70% em peso, com mais preferência, 40 a 60 ou 40 a 50% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de GOS DP3+ produzidos in situ.
[0041] A % em peso de GOS DP3+ dos carboidratos livres totais pode ser determinada pelo método dos Exemplos do presente pedido.
[0042] Em uma modalidade preferencial, pelo menos 50% em peso, de preferência, pelo menos 55% em peso ou pelo menos 60% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de GOS DP2+ produzidos in situ.
[0043] Em uma outra modalidade preferencial, 50 a 80% em peso, de preferência, 55 a 80% em peso ou 60 a 80% em peso, com mais preferência, 50 a 70 ou 60 a 70% em peso dos carboidratos livres totais trata- se de GOS DP2+ produzidos in situ.
[0044] A % em peso de GOS DP2+ dos carboidratos livres totais pode ser determinada pelo método dos Exemplos do presente pedido.
[0045] O produto de leite da invenção compreende uma quantidade total de pelo menos 11% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. Em uma modalidade preferencial, o produto de leite compreende uma quantidade total de pelo menos 12% em peso, de preferência, pelo menos 13% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ.
[0046] Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite compreende 11 a 25% em peso, de preferência, 12 a 25% em peso ou 13 a 25% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite compreende 11 a 15% em peso, 12 a 15% em peso ou 13 a 15% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ.
[0047] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite compreende uma quantidade total de pelo menos 12% em peso, de preferência, pelo menos 15% em peso ou pelo menos 18% em peso de GOS DP2+ produzidos in situ.
[0048] Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite compreende 12 a 35% em peso, de preferência, 15 a 35% em peso ou 18 a 35% em peso de GOS DP2+ produzidos in situ. Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite compreende 12 a 20% em peso, 15 a 20% em peso ou 18 a 20% em peso de GOS DP2+ produzidos in situ.
[0049] Em uma modalidade preferencial, no máximo 30% em peso, de preferência, no máximo 20% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite trata-se de lactose. Em uma outra modalidade preferencial, 0 a 30% em peso, de preferência, 0 a 20% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite trata-se de lactose.
[0050] Em uma outra modalidade, no máximo 15% em peso ou no máximo 12% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite trata-se de lactose. Em uma outra modalidade, 0 a 15% em peso ou 0 a 12% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite trata-se de lactose.
[0051] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado, que compreende uma quantidade total de pelo menos 11% em peso, de preferência, pelo menos 12% em peso ou pelo menos 13% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado, que compreende uma quantidade total de 11 a 20% em peso, de preferência, 12 a 20% em peso ou 13 a 20% em peso, com mais preferência, 11 a 15% em peso, 12 a 15% em peso ou 13 a 15% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. Tal produto de leite compreende, de preferência, uma quantidade total de no máximo 10% em peso, de preferência, no máximo 5% em peso de lactose.
[0052] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite é leite em pó, tal como leite em pó desnatado, que compreende uma quantidade total de pelo menos 11% em peso, de preferência, pelo menos 12% em peso ou pelo menos 13% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite é leite em pó, tal como leite em pó desnatado, que compreende uma quantidade total de 11 a 40% em peso, de preferência, 12 a 40% em peso ou 13 a 40% em peso, com mais preferência, 11 a 30% em peso, 12 a 30% em peso ou 13 a 30% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite é leite em pó, tal como leite em pó desnatado, que compreende uma quantidade total de pelo menos 15% em peso, de preferência, pelo menos 18% em peso ou pelo menos 20% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite é leite em pó, tal como leite em pó desnatado, que compreende uma quantidade total de 15 a 40% em peso, de preferência, 18 a 40% em peso ou 20 a 40% em peso, com mais preferência, 15 a 30% em peso, 18 a 30% em peso ou 20 a 30% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. Tal produto de leite compreende, de preferência, uma quantidade total de no máximo 15% em peso, de preferência, no máximo 10% em peso de lactose.
[0053] O produto de leite pode ter sido submetido a tratamentos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, pasteurização, tratamento ESL ou tratamento UHT.
[0054] A invenção fornece, ainda, um método para produzir um produto de leite que compreende: (e) fornecer um substrato de leite que compreende pelo menos 20% em peso de lactose, (f) colocar o substrato de leite em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose por pelo menos 45 minutos, (g) inativar completa ou parcialmente a enzima e (h) obter, assim, um produto de leite em que pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de galacto-oligossacarídeos (GOS) DP3+ produzidos in situ.
[0055] Em um método da presente invenção, um produto de leite é produzido a partir de um substrato de leite colocando-se o substrato de leite que compreende lactose em contato com uma enzima transgalactosante que converte a lactose no substrato de leite em GOS.
[0056] O substrato de leite a ser usado no método é à base de leite. O termo "leite", no contexto da presente invenção, deve ser compreendido como a secreção láctea obtida ordenhando-se qualquer mamífero, tal como vacas, ovelhas, cabras, búfalos ou camelos.
[0057] De preferência, o substrato de leite é obtido a partir do leite que não teve a composição amplamente modificada pela adição e/ou remoção de constituintes do leite, exceto pelo ajuste do teor de gordura e/ou água.
[0058] Em uma modalidade, o substrato de leite é obtido a partir do leite que teve a composição modificada apenas pelo ajuste do teor de gordura e/ou água.
[0059] O ajuste de teor de gordura e/ou água pode ter sido realizado por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por centrifugação, evaporação, condensação, ultrafiltração, nanofiltração, liofilização, secagem por aspersão, reconstituição por adição de água, etc.
[0060] Em algumas modalidades, por exemplo, o teor de proteína ou o teor de lactose também pode ser sido ligeiramente ajustado, por exemplo, pela empresa de laticínios, por exemplo, para obter um substrato de leite que tenha uma composição “padrão” bem definida.
[0061] O substrato de leite pode ter sido submetido a tratamentos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, pasteurização, tratamento ESL ou tratamento UHT.
[0062] De preferência, o substrato de leite é produzido a partir de leite, sem alterar a razão entre proteína de soro do leite e caseína. De preferência, a razão entre proteína de soro do leite e caseína é mesma que no leite.
[0063] Em uma modalidade preferencial, o substrato de leite não compreende lactose adicionada. Em uma outra modalidade preferencial, o teor de lactose foi apenas ligeiramente ajustado, por exemplo, pela adição/remoção de no máximo 20%, de preferência, no máximo 10% da lactose originalmente presente.
[0064] Em uma modalidade preferencial, no máximo 20%, de preferência, no máximo 10% de lactose foi adicionado ou removido do substrato de leite em comparação com a lactose originalmente presente.
[0065] Em uma modalidade preferencial, nenhuma proteína do leite foi adicionada ou removida do substrato de leite. Em uma outra modalidade preferencial, o teor de proteína do leite no substrato de leite foi apenas ligeiramente ajustado, por exemplo, pela adição/remoção de no máximo 20%, de preferência, no máximo 10% da proteína do leite originalmente presente. Isso significa que o teor total da proteína do leite é basicamente o mesmo que no leite bruto, exceto pelas alterações relativas provocadas pela remoção ou adição de gordura ou água.
[0066] Em uma modalidade preferencial, no máximo 20%, de preferência, no máximo 10% de proteína do leite foi adicionado ou removido do substrato de leite em comparação com a proteína do leite originalmente presente.
[0067] De preferência, o substrato de é mais concentrado que o leite.
[0068] Em uma modalidade preferencial, o substrato de leite compreende uma quantidade total de pelo menos 10% em peso de proteína do leite, tal como pelo menos 15% em peso ou pelo menos 20% em peso de proteína do leite.
[0069] Em uma modalidade preferencial, o substrato de leite é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado. Em uma modalidade mais preferencial, o substrato de leite é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído.
[0070] Em uma modalidade preferencial, o substrato de leite compreende pelo menos 40% em peso, de preferência, pelo menos 45% em peso, pelo menos 50% em peso, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso de matéria seca. Em uma outra modalidade preferencial, o substrato de leite é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado, que compreende pelo menos 40% em peso, de preferência, pelo menos 45% em peso, pelo menos 50% em peso, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso de matéria seca. Em uma outra modalidade preferencial, o substrato de leite é leite em pó desnatado reconstituído que compreende pelo menos 40% em peso, de preferência, pelo menos 45% em peso, pelo menos 50% em peso, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso de matéria seca.
[0071] O substrato de leite compreende pelo menos 20% em peso de lactose. Em uma modalidade preferencial, o substrato de leite compreende pelo menos 25% em peso, de preferência, pelo menos 27% em peso ou pelo menos 30% em peso de lactose.
[0072] O substrato de leite é colocado em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose por pelo menos 45 minutos. Em uma modalidade preferencial, o substrato de leite é colocado em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose por pelo menos 1 hora, de preferência, pelo menos 1,5 hora, pelo menos 3 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 9 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 15 horas, pelo menos 20 horas ou pelo menos 24 horas.
[0073] Em uma modalidade, o substrato de leite é colocado em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose a uma temperatura de 2 a 8 °C, de preferência, 3 a 7 °C, por 12 horas a 5 dias, de preferência, 24 horas a 3 dias.
[0074] Em uma outra modalidade, o substrato de leite é colocado em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose a uma temperatura de pelo menos 40 °C, de preferência, pelo menos 50 °C, pelo menos 55 °C, ou pelo menos 60 °C, por exemplo, a uma temperatura de 40 a 65 °C, 50 a 65 °C, 55 a 65 °C ou 60 a 65 °C, por 45 minutos a 48 horas, de preferência, 2 a 36 horas, com mais preferência, 20 a 30 horas.
[0075] Em ainda uma outra modalidade, o substrato de leite é colocado em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose a uma temperatura de 60 a 67 °C, por 45 minutos a 10 horas, de preferência, 2 a 5 horas.
[0076] De preferência, a enzima que tem atividade de transgalactose é adicionada a uma concentração de 1 a 1.000 LAU(C) por g de lactose, de preferência, 5 a 500 LAU(C) por g de lactose, com mais preferência, 8 a 150 LAU(C) por g de lactose.
[0077] A atividade em LAU(C) de uma beta-galactosidase específica pode ser determinada por medição direta da glicose liberada da lactose. O versado na técnica saberá como determinar tal atividade. Alternativamente, a atividade pode ser determinada com o uso do ensaio de atividade descrito nos métodos e exemplos do presente pedido. No presente documento, a atividade é obtida comparando-se uma curva padrão executada com uma beta-galactosidase de atividade conhecida e a atividade da amostra desconhecida calculada a partir disso.
[0078] Quando o substrato de leite tiver sido colocado com contato por tempo suficiente com a enzima transgalactosante para assegurar formação suficiente de GOS, a enzima é completa ou parcialmente inativada.
[0079] A enzima pode ser inativada por qualquer método conhecido na técnica que resulte na redução da atividade enzimática, por exemplo, por tratamento térmico, pH ou protease. Deve-se compreender que a inativação pode ser temporária. A inativação pode ocorrer devido a uma etapa inerente no processo de produção do produto de leite, tal como pasteurização, tratamento ESL, tratamento UHT ou secagem por aspersão.
[0080] Em uma modalidade preferencial, a enzima é completa ou parcialmente inativada por tratamento térmico.
[0081] Após o contato do substrato de leite com a enzima transgalactosante, o produto de leite obtido pode ser adicionalmente processado por métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, centrifugação, homogeneização, pasteurização, tratamento ESL, tratamento UHT ou secagem, tal como secagem por aspersão ou liofilização.
[0082] No produto de leite obtido por meio do método da invenção, pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais devem ser GOS DP3+ produzidos in situ obtidos como um resultado do contato do substrato de leite com a enzima transgalactosante.
[0083] Em uma modalidade preferencial, pelo menos 40% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de GOS DP3+ produzidos in situ.
[0084] Em uma outra modalidade preferencial, 35 a 70% em peso, de preferência, 40 a 70% em peso, com mais preferência, 40 a 60 ou 40 a 50% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de GOS DP3+ produzidos in situ.
[0085] Em uma modalidade preferencial, pelo menos 50% em peso, de preferência, pelo menos 55% em peso ou pelo menos 60% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de GOS DP2+ produzidos in situ.
[0086] Em uma outra modalidade preferencial, 50 a 80% em peso, de preferência, 55 a 80% em peso ou 60 a 80% em peso, com mais preferência, 50 a 70 ou 60 a 70% em peso dos carboidratos livres totais trata- se de GOS DP2+ produzidos in situ.
[0087] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite produzido por meio do método da invenção compreende uma quantidade total de pelo menos 11% em peso, de preferência, pelo menos 12% em peso ou pelo menos 13% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ.
[0088] Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite obtido por meio do método da invenção compreende 11 a 20% em peso, de preferência, 12 a 20% em peso ou 13 a 20% em peso, com mais preferência, 11 a 15% em peso, 12 a 15% em peso ou 13 a 15% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ.
[0089] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite obtido por meio do método da invenção compreende uma quantidade total de pelo menos 12% em peso, de preferência, pelo menos 15% em peso ou pelo menos 18% em peso de GOS DP2+ produzidos in situ.
[0090] Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite obtido por meio do método da invenção compreende 12 a 25% em peso, de preferência, 15 a 25% em peso ou 18 a 25% em peso, com mais preferência, 12 a 20% em peso, 15 a 20% em peso ou 18 a 20% em peso de GOS DP2+ produzidos in situ.
[0091] Em uma modalidade preferencial, no máximo 30% em peso, de preferência, no máximo 20% em peso, tal como no máximo 15% em peso ou no máximo 12% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite obtido por meio do método da invenção trata-se de lactose. Em uma outra modalidade preferencial, 0 a 30% em peso, de preferência, 0 a 20% em peso, tal como 0 a 15% em peso ou 0 a 12% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite trata-se de lactose.
[0092] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite obtido por meio do método da invenção é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado, que compreende uma quantidade total de pelo menos 11% em peso, de preferência, pelo menos 12% em peso ou pelo menos 13% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. Em uma outra modalidade preferencial, o produto de leite obtido por meio do método da invenção é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado, que compreende uma quantidade total de 11 a 20% em peso, de preferência, 12 a 20% em peso ou 13 a 20% em peso, com mais preferência, 11 a 15% em peso, 12 a 15% em peso ou 13 a 15% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. Tal produto de leite compreende, de preferência, uma quantidade total de no máximo 10% em peso, de preferência, no máximo 5% em peso de lactose.
[0093] Em uma modalidade, o método da invenção compreende, ainda, uma etapa (e): (i) secar, de preferência, secar por aspersão, o produto de leite da etapa (d) para obter um leite em pó, tal como um leite em pó desnatado.
[0094] O produto de leite da etapa (d) ou o leite em pó da etapa (e) pode ser usado na produção de, por exemplo, uma barra de proteína, uma bebida láctea, uma fórmula para bebês ou um iogurte.
[0095] Em uma modalidade, o método da invenção é um método para produzir um produto de leite fermentado que compreende: (j) fornecer um substrato de leite que compreende pelo menos 20% (em p/v) de lactose, (k) colocar o substrato de leite em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose por pelo menos 45 minutos, (l) fermentar o substrato de leite, de preferência, incubando-se com uma cultura bacteriana, antes, durante e/ou após a etapa (b), (m) inativar a enzima antes ou após a etapa (c) e (n) obter, assim, um produto de leite fermentado em que pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de galacto- oligossacarídeos (GOS) DP3+ produzidos in situ.
[0096] Em uma modalidade preferencial, o produto de leite fermentado é iogurte. Em uma outra modalidade preferencial, a etapa (b) e a etapa (c) ocorrem a uma temperatura de 37 a 45 °C, de preferência, 40 a 45 °C, com mais preferência, cerca de 42 a 43 °C.
[0097] No método da invenção, o substrato de leite é colocado em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose.
[0098] Beta-galactosidases da família glicosídeo hidrolase 2 (GH2) são enzimas exoatuantes que hidrolisam resíduos terminais de beta- D-galactose não redutores em beta-D-galactosídeos, por exemplo, a lactose é hidrolisada em galactose e glicose. As mesmas pertencem à classe enzimática EC 3.2.1.23 com o nome oficial beta-D-galactosídeo galacto- hidrolase. Um nome comum usado para essa enzima é lactase, visto que lactose é o substrato industrial comum. Além de hidrolisar, essa classe enzimática também tem capacidade para transferir galactose para outros açúcares e, assim, produzir galacto-oligossacarídeos (GOS). As enzimas GH2 diferentes têm várias preferências para atividade hidrolítica ou betagalactosidase e atividade transgalactosilase, e a preferência pode ser expressa em termos de sua capacidade de produção de GOS, tal como pela razão entre a atividade de transgalactose e de hidrólise.
[0099] No presente contexto, o termo "beta-galactosidase" significa qualquer glicosídeo hidrolase que tenha a capacidade para hidrolisar a lactose dissacarídica em seus monômeros constituintes de galactose e glicose. Enzimas atribuídas à subclasse EC 3.2.1.108, também chamadas de lactases, também são consideradas uma beta-galactosidase no contexto da presente invenção. No contexto da invenção, a atividade de hidrolisação de lactose da beta-galactosidase pode ser denominada sua atividade lactase ou sua atividade beta-galactosidase.
[0100] No contexto da presente invenção, a enzima que tem atividade de transgalactose pertence, de preferência, à classe enzimática EC 3.2.1.23 ou EC 3.2.1.108, de preferência, 3.2.1.23. A enzima que tem atividade de transgalactose pertence, de preferência, à família glicosídeo hidrolase 2 (GH2), com mais preferência, à família glicosídeo hidrolase GH2_5.
[0101] Em certas aplicações, combinações de polipeptídeos que têm atividade predominantemente de transgalactose e atividade predominantemente de hidrólise podem ser contempladas. Isso pode ser especialmente útil quando há o desejo de reduzir lactose residual após o tratamento com o polipeptídeo que tem atividade beta-galactosidase, por exemplo, em baixos níveis de lactose.
[0102] Ao considerar a reação da enzima, por exemplo, no leite, os carboidratos estão inicialmente presentes na forma de lactose, um dissacarídeo composto por galactose e glicose que é encontrado no leite. Na formação de GOS, moléculas sucessivas de galactose são adicionadas à lactose e, então, após incubação prolongada, uma mistura dos vários carboidratos está presente (glicose, galactose e ~30 di e polissacarídeos diferentes).
[0103] O termo "dissacarídeo", conforme usado, significa duas unidades de monossacarídeo unidas por uma ligação covalente conhecida como uma ligação glicosídica formada por meio de uma reação de desidratação, resultando na perda de um átomo de hidrogênio de um monossacarídeo e um grupo hidroxila do outro.
[0104] Conforme usado no presente documento, os termos "enzima que tem atividade de transgalactose", "enzima transgalactosante" e "transgalactosilase" são usados intercambiavelmente de modo a significar uma enzima que tem capacidade para transferir galactose para os grupos hidroxila de D-galactose (Gal) ou D-glicose (Glc), pelo que os galacto- oligossacarídeos são produzidos. Em uma modalidade, a atividade transgalactosilase é identificada por reação da enzima na lactose na qual a quantidade de galactose gerada é inferior à quantidade de glicose gerada em um dado momento.
[0105] Mais particularmente, a atividade transgalactosilase (ou preferência por uma enzima para hidrolisar lactose ou produzir GOS) pode ser avaliada como a quantidade de glicose menos galactose gerada em qualquer dado momento durante a reação ou por quantificação direta de GOS gerados durante a reação. Essa medição pode ser realizada por meio de uma dentre diversas formas, incluindo os métodos mostrados nos Exemplos no presente documento.
[0106] Ao avaliar a atividade de transgalactose versus atividade de hidrólise de uma enzima, a atividade de hidrólise pode ser medida como a concentração de galactose ([Gal]) gerada em qualquer ponto no tempo durante a reação.
[0107] A atividade de transgalactose, isto é, a transferência de uma porção química de galactose para uma molécula diferente de água, pode ser medida como ([Glc] - [Gal]) gerada em qualquer dado momento.
[0108] Assim, a razão entre a atividade de transgalactose e de hidrólise no contexto da presente invenção é determinada como ([Glc] - [Gal])/[Gal].
[0109] De preferência, uma enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção é uma beta-galactosidase que tem uma razão entre atividade de transgalactose e de hidrólise de pelo menos 1, de preferência, pelo menos 2, pelo menos 3 ou pelo menos 4, quando medida em uma solução a 60% de leite em pó desnatado após 24 horas a 50 °C com o uso de uma concentração de enzimas de 13 LAU(C) por g de lactose.
[0110] Qualquer enzima que tenha uma atividade de transgalactose suficientemente alta pode ser usada no método da invenção. A origem da enzima não é importante para um resultado bem-sucedido.
[0111] A enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção pode ser de origem animal, vegetal ou microbiana. Enzimas preferenciais são obtidas a partir de fontes microbianas, em particular, a partir de um fungo ou levedura filamentoso ou a partir de uma bactéria.
[0112] A enzima pode, por exemplo, ser derivada de uma cepa de Agaricus, por exemplo, A. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, por exemplo, D. discoideum; Kluveromyces, por exemplo, K. fragilis, K. lactis; Mucor, por exemplo, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por exemplo, N. crassa; Rhizomucor, por exemplo, R. pusillus; Rhizopus, por exemplo, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, por exemplo, S. libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, por exemplo, T. rubrum; Whetzelinia, por exemplo, W. sclerotiorum; Bacillus, por exemplo, B. sp. B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. subtilis, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, por exemplo, B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum; Chryseobacterium; Citrobacter, por exemplo, C. freundii; Clostridium, por exemplo, C. perfringens; Diplodia, por exemplo, D. gossypina; Enterobacter, por exemplo, E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por exemplo, E. herbicola; Escherichia, por exemplo, E. coli; Klebsiella, por exemplo, K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neurospora, por exemplo, N. crassa; Proteus, por exemplo, P. vulgaris; Providencia, por exemplo, P. stuartii; Pycnoporus, por exemplo, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus, por exemplo, R. torques; Salmonella, por exemplo, S. typhimurium; Serratia, por exemplo, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por exemplo, S. flexneri; Streptomyces, por exemplo, S. antibioticus, S. castaneoglobisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, por exemplo, T. reesei, T. viride; Yersinia, por exemplo, Y. enterocolitica.
[0113] Em uma modalidade preferencial, a enzima é uma beta-galactosidase proveniente de uma bactéria, por exemplo, da família Bifidobacteriaceae, tal como do gênero Bifidobacterium, tal como de uma cepa de B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis ou B. longum. Em uma modalidade mais preferencial, a enzima é uma beta-galactosidase de Bifidobacterium bifidum.
[0114] Em uma modalidade preferencial, a enzima é uma beta-galactosidase proveniente de uma bactéria, por exemplo, da família Bacillaceae, tal como do gênero Bacillus, tal como de uma cepa de B. sp., B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. subtilis, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, por exemplo, B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum. Em uma modalidade mais preferencial, a enzima é uma beta-galactosidase de Bacillus circulans ou Bacillus infantis.
[0115] Uma enzima preferencial é uma beta-galactosidase que tem uma sequência que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica aos aminoácidos 1 a 1.304 da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. Tal fragmento da SEQ ID NO: 1 pode ser qualquer fragmento de SEQ ID NO: 1 que tenha atividade de transgalactose.
[0116] Em uma modalidade preferencial, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% idêntica aos aminoácidos 1 a 1.304 da SEQ ID NO: 1 e tem um comprimento de 900 a 1.350 aminoácidos, de preferência, 1.300 a 1.305 aminoácidos, com mais preferência, 1.302 ou 1.304 aminoácidos.
[0117] Em uma modalidade preferencial, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica aos aminoácidos 28 a 1.931 da SEQ ID NO: 2, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. Em uma modalidade mais preferencial, a enzima compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica aos aminoácidos 28 a 1.931 da SEQ ID NO: 2.
[0118] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica aos aminoácidos 28 a 1.331 da SEQ ID NO: 3, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica aos aminoácidos 28 a 1.331 da SEQ ID NO: 3.
[0119] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 4, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 4.
[0120] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 5, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 5.
[0121] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 6, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 6.
[0122] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 7, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 7.
[0123] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 8, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 8.
[0124] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 9, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 9.
[0125] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 10, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 10.
[0126] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 11, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 11.
[0127] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 12, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 12.
[0128] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 13, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 13.
[0129] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 14, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 14.
[0130] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose a ser usada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 15, ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. De preferência, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15.
[0131] Para os propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada como o resultado de “identidade mais longa” com o uso do algoritmo de Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), de preferência, versão 6.6.0 ou posterior. Os parâmetros usados são uma penalidade de abertura de lacunas de 10, uma penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). A fim de que o programa de Needle relate a identidade mais longa, a opção -nobrief precisa ser especificada na linha de comando. A saída de Needle identificada como "identidade mais longa” é calculada da seguinte forma:
[0132] (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento).
[0133] A enzima que tem atividade de transgalactose pode ser extracelular. A mesma pode ter uma sequência sinal em sua terminação N, que é clivada durante a secreção.
[0134] A enzima que tem atividade de transgalactose pode ser derivada de qualquer uma das fontes mencionadas no presente documento. O termo "derivado" significa, nesse contexto, que a enzima pode ter sido isolada a partir de um organismo no qual está nativamente presente, isto é, a identidade da sequência de aminoácidos da enzima é idêntica à de um polipeptídeo nativo. O termo "derivado" também significa que a enzima pode ter sido produzida de modo recombinante em um organismo hospedeiro, sendo que a enzima recombinantemente produzida tem uma identidade idêntica à de uma enzima nativa ou tem uma sequência de aminoácidos modificada, por exemplo, que tem um ou mais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácidos nativa. Dentro do significado de uma enzima nativa estão incluídas variantes naturais. Além disso, o termo "derivado" inclui enzimas produzidas sinteticamente, por exemplo, por síntese peptídica. O termo "derivado" também abrande enzimas que foram modificadas, por exemplo, por glicosilação, fosforilação etc., in vivo ou in vitro. Em relação às enzimas recombinantemente produzidas, o termo "derivado de" se refere à identidade da enzima e não à identidade do organismo hospedeiro no qual a mesma é recombinantemente produzida.
[0135] A enzima que tem atividade de transgalactose pode ser obtida a partir de um micro-organismo com o uso de qualquer técnica adequada. Por exemplo, uma preparação de enzima pode ser obtida por fermentação de um micro-organismo adequado e isolamento subsequente de uma preparação de lactase proveniente do caldo fermentado ou microorganismo resultante por métodos conhecidos na técnica. A enzima que tem atividade de transgalactose também pode ser obtida com o uso de técnicas de DNA recombinante. Tal método normalmente compreende o cultivo de uma célula hospedeira transformada com um vetor de DNA recombinante que compreende uma sequência de DNA que codifica a lactase em questão, e sendo que a sequência de DNA é operacionalmente ligada a um sinal de expressão adequado de modo que tenha capacidade para expressar a enzima em um meio de cultura sob condições que permitem a expressão da enzima e recuperar a enzima da cultura. A sequência de DNA também pode ser incorporada no genoma da célula hospedeira. A sequência de DNA pode ser de origem genômica, cDNA ou sintética, ou quaisquer combinações dessas, e pode ser isolada ou sintetizada de acordo com os métodos conhecidos na técnica.
[0136] A enzima que tem atividade de transgalactose pode ser purificada. O termo "purificado", conforme usado no presente documento, abrange proteína da enzima beta-galactosidase essencialmente livre de componentes insolúveis do organismo de produção. O termo "purificado" também abrange proteína da enzima beta-galactosidase essencialmente livre de componentes insolúveis do organismo nativo a partir do qual é obtida. De preferência, a mesma também é separada de alguns dos componentes solúveis do organismo e meio de cultura a partir dos quais é derivada. Com mais preferência, a mesma é separada por uma ou mais dentre as operações unitárias: filtração, precipitação ou cromatografia.
[0137] Consequentemente, a enzima que tem atividade de transgalactose pode ser purificada, em que, visualmente, apenas quantidades menores de outras proteínas estão presentes. A expressão "outras proteínas" refere-se, em particular, a outras enzimas. O termo "purificado", conforme usado no presente documento, também se refere à remoção de outros componentes, particularmente outras proteínas e, com máxima particularidade, outras enzimas presentes na célula de origem da beta-galactosidase. A enzima que tem atividade de transgalactose pode ser "substancialmente pura", isto é, livre de outros componentes do organismo no qual é produzida, isto é, por exemplo, um organismo hospedeiro para a beta-galactosidase recombinantemente produzida. De preferência, a enzima que tem atividade de transgalactose é uma preparação da proteína enzimática pelo menos 40% (em p/p) pura, com mais preferência, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou mesmo pelo menos 90% pura.
[0138] O termo enzima que tem atividade de transgalactose inclui quaisquer compostos auxiliares que possam ser necessários para a atividade catalítica da enzima, tais como, por exemplo, um aceitante ou cofator adequado, que podem ou não estar naturalmente presentes no sistema de reação.
[0139] A enzima pode estar em qualquer forma adequada para uso em questão, tal como, por exemplo, sob a forma de um pó ou granulado seco, um granulado sem poeira, um líquido, um líquido estabilizado ou uma enzima protegida.
[0140] Apesar das propriedades hidrolíticas dominantes de certas enzimas beta-galactosidase ou lactase, essas enzimas podem ser convertidas para ter propriedades de transferência superiores, por exemplo, submetendo-se as enzimas a uma pré-incubação. A pré-incubação, assim, resulta em uma enzima produtora de GOS mais robusta devido a suas capacidades de transferência superiores (atividade transgalactosilase).
[0141] Sem o desejo de se vincular à teoria, acredita-se que essas condições de incubação resultem na glicação da beta-galactosidase, que resulta no aumento das propriedades de transferência. Com a fixação covalente da porção química de açúcar, a beta-galactosidase é convertida de uma enzima hidrolisante para uma enzima de transferência que tem atividade transgalactosilase.
[0142] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose foi modificada por glicação.
[0143] "Glicação", conforme usado no presente documento, se refere à fixação covalente de um carboidrato a uma proteína. A fixação de carboidrato pode ocorrer por meio de uma cadeia lateral de, por exemplo, arginina, lisina ou terminal N da enzima. De preferência, a fixação de carboidrato ocorre por meio de uma cadeia lateral de arginina ou lisina.
[0144] A glicação é, algumas vezes, denominada glicosilação (não enzimática). No contexto da presente invenção, a glicosilação e glicação são usadas intercambiavelmente, e a glicosilação pode ser não enzimática.
[0145] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose foi modificada por glicação de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 resíduos da enzima.
[0146] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose foi modificada por glicação de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 resíduos de lisina e/ou arginina da enzima.
[0147] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose foi modificada por glicação de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% dos resíduos de lisina e/ou arginina da enzima. Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose foi modificada por glicação de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 resíduos de lisina e/ou arginina da enzima.
[0148] Em uma modalidade, a incubação sob condições adequadas, conforme detalhado abaixo, resulta na glicação de alguns, substancialmente todos ou até mesmo todos os resíduos superficiais de lisina e/ou arginina. Novamente sem o desejo de se vincular à teoria, acredita-se que alguns, substancialmente todos ou até mesmo todos os resíduos glicados estejam localizados na extremidade C-terminal da enzima que tem atividade de transgalactose.
[0149] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de transgalactose foi colocada em contato com uma solução de 5 a 90% em peso de açúcar a pH 5 a 10 por um tempo de 3 a 20 horas a uma temperatura de 20 a 80 °C. Açúcares preferenciais são açúcares redutores, e de modo particularmente preferencial trata-se de glicose.
[0150] Em uma modalidade preferencial, a enzima que tem atividade de transgalactose foi incubada com 40 a 70% em peso, de preferência, 50 a 70% em peso ou 55 a 65% em peso de glicose por 40 a 100 horas, de preferência, 50 a 90 ou 60 a 80 horas, a 40 a 60 °C, de preferência, 50 a 60 °C.
[0151] Açúcares redutores exemplificativos incluem os monossacarídeos frutose, galactose, glicose, gliceraldeído, ribose, xilose. Frutose, galactose e/ou glicose são preferenciais e, com a máxima particularidade, frutose e/ou glicose.
[0152] Outros açúcares redutores exemplificativos incluem dissacarídeos, tais como celobiose, lactose e maltose, de preferência, lactose e/ou maltose. Polímeros de glicose também são exemplificativos, por exemplo, maltodextrina e glicogênio.
[0153] A presença de um açúcar redutor pode ser detectada por muitos testes bem conhecidos, incluindo o uso de reagente de Benedict e/ou reagente de Tollen. MODALIDADES PREFERENCIAIS 1. Um método para produzir a produto de leite que compreende: (a) fornecer um substrato de leite que compreende pelo menos 20% em peso de lactose, (b) colocar o substrato de leite em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose por pelo menos 45 minutos, (c) inativar completa ou parcialmente a enzima e (d) obter, assim, um produto de leite em que pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de galacto- oligossacarídeos (GOS) DP3+ produzidos in situ. 2. O método, de acordo com a modalidade 1, sendo que os carboidratos livres são os carboidratos que não são covalentemente ligados às proteínas. 3. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que os GOS DP3+ são GOS que têm um grau de polimerização de pelo menos 3. 4. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que o substrato de leite é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado. 5. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que o substrato de leite é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído. 6. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que o substrato de leite é obtido a partir do leite que não teve a composição amplamente modificada por adição e/ou remoção de constituintes do leite, exceto pelo ajuste do teor de gordura e/ou água. 7. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que, no substrato de leite, a razão entre proteína de soro do leite e caseína é a mesma que no leite. 8. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que o substrato de leite foi produzido a partir do leite, sem alterar a razão entre proteína de soro do leite e caseína. 9. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que o substrato de leite não compreende lactose adicionada. 10. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que no máximo 20%, de preferência, no máximo 10% da proteína do leite foi adicionado ou removido do substrato de leite em comparação com a proteína do leite originalmente presente. 11. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que o substrato de leite compreende pelo menos 40% em peso, de preferência, pelo menos 45% em peso, pelo menos 50% em peso, ou pelo menos 55% em peso, com mais preferência, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso de matéria seca. 12. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que o substrato de leite compreende pelo menos 25% em peso, de preferência, pelo menos 27% em peso ou pelo menos 30% em peso de lactose. 13. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que pelo menos 40% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite trata-se de GOS DP3+ produzidos in situ. 14. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que pelo menos 50% em peso, de preferência, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite trata-se de GOS DP2+ produzidos in situ. 15. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que, na etapa (b), pelo menos 35% em peso, de preferência, pelo menos 40% em peso da lactose é convertido em GOS DP3+. 16. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que, na etapa (b), pelo menos 50% em peso, de preferência, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso da lactose é convertido em GOS DP2+. 17. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que no máximo 30% em peso, de preferência, no máximo 20% em peso, tal como no máximo 15% em peso ou no máximo 12% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite trata-se de lactose. 18. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que o produto de leite é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado, que compreende uma quantidade total de no máximo 10% em peso, de preferência, no máximo 5% em peso de lactose. 19. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que o substrato de leite é colocado em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose por pelo menos 1 hora, de preferência, pelo menos 1,5 hora, pelo menos 3 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 9 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 15 horas, pelo menos 20 horas ou pelo menos 24 horas. 20. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que o substrato de leite é colocado em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose a uma temperatura de 2 a 8 °C, de preferência, 3 a 7 °C, por 12 horas a 5 dias, de preferência, 24 horas a 3 dias. 21. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 18, sendo que o substrato de leite é colocado em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose a uma temperatura de pelo menos 40 °C, de preferência, pelo menos 50 °C, pelo menos 55 °C ou pelo menos 60 °C, por 45 minutos a 48 horas, de preferência, 2 a 36 horas, com mais preferência, 20 a 30 horas. 22. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 18, sendo que o substrato de leite é colocado em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose a uma temperatura de 60 a 67 °C, por 45 minutos a 10 horas, de preferência, 2 a 5 horas. 23. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose é adicionada a uma concentração de 1 a 1.000 LAU(C) por g de lactose, de preferência, 5 a 500 LAU(C) por g de lactose. 24. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica aos aminoácidos 1 a 1.304 da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica aos aminoácidos 28 a 1.931 da SEQ ID NO: 2 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica aos aminoácidos 28 a 1.331 da SEQ ID NO: 3 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 4 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 5 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 6 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 7 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 8 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 9 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 10 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 11 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 12 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 13 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 14 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose; ou pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. 25. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% idêntica aos aminoácidos 1 a 1.304 da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma que tenha atividade de transgalactose. 26. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% idêntica aos aminoácidos 1 a 1.304 da SEQ ID NO: 1 e tem um comprimento de 900 a 1.350 aminoácidos, de preferência, 1.300 a 1.305 aminoácidos, com mais preferência, 1.302 ou 1.304 aminoácidos. 27. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose foi modificada por glicação de pelo menos um resíduo de lisina e/ou arginina. 28. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose foi colocada em contato com um açúcar redutor, de preferência, frutose, glicose, galactose ou lactose, por um tempo e a uma temperatura suficiente para produzir um polipeptídeo modificado por glicação. 29. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose que foi modificada por glicação tem atividade de transgalactose melhorada em comparação com uma enzima que não foi modificada por glicação. 30. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose foi modificada por glicação colocando-se em contato com 30 a 90% em peso de um açúcar redutor, de preferência, frutose, glicose ou galactose, a pH 5 a 8 por um tempo de 3 a 20 horas a uma temperatura de 20 a 80 °C. 31. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose foi incubada com 40 a 70% em peso, de preferência, 50 a 70% em peso ou 55 a 65% em peso de glicose por 40 a 100 horas, de preferência, 50 a 90 ou 60 a 80 horas, a 40 a 60 °C, de preferência, 50 a 60 °C. 32. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose foi modificada por glicação colocando-se em contato com pelo menos 40% em peso, de preferência, pelo menos 60% em peso ou pelo menos 80% em peso de um açúcar redutor, de preferência, glicose. 33. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose é uma beta-galactosidase que tem uma razão entre atividade de transgalactose e de hidrólise de pelo menos 1, de preferência, pelo menos 2, pelo menos 3 ou pelo menos 4, quando medida em uma solução a 60% de leite em pó desnatado após 24 horas a 50 °C com o uso de uma concentração de enzimas de 13 LAU(C) por g de lactose. 34. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose é uma beta-galactosidase pertencente à classe enzimática EC 3.2.1.23 ou 3.2.1.108, de preferência, 3.2.1.23. 35. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que a enzima que tem atividade de transgalactose é uma beta-galactosidase GH2, de preferência, uma beta-galactosidase GH2_5. 36. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que, na etapa (c), a enzima é completa ou parcialmente inativada por tratamento térmico. 37. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que, na etapa (c), a enzima é completa ou parcialmente inativada por pasteurização, tratamento ESL, tratamento UHT ou secagem por aspersão. 38. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que compreende, ainda: (e) secar, de preferência, secar por aspersão, o produto de leite da etapa (d) para obter um leite em pó, tal como um leite em pó desnatado. 39. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que compreende, ainda: (e) opcionalmente, secar, de preferência, secar por aspersão, o produto de leite da etapa (d) para obter um pó, tal como um leite em pó desnatado e (f) usar o produto de leite da etapa (d) ou o leite em pó da etapa (e) na produção de uma barra de proteína. 40. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que compreende, ainda: (e) opcionalmente, secar, de preferência, secar por aspersão, o produto de leite da etapa (d) para obter um pó, tal como um leite em pó desnatado e (f) usar o produto de leite da etapa (d) ou o leite em pó da etapa (e) na produção de uma bebida láctea. 41. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que compreende, ainda: (e) opcionalmente, secar, de preferência, secar por aspersão, o produto de leite da etapa (d) para obter um pó, tal como um leite em pó desnatado e (f) usar o produto de leite da etapa (d) ou o leite em pó da etapa (e) na produção de uma fórmula para bebês. 42. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, sendo que compreende, ainda: (e) opcionalmente, secar, de preferência, secar por aspersão, o produto de leite da etapa (d) para obter um pó, tal como um leite em pó desnatado e (f) usar o produto de leite da etapa (d) ou o leite em pó da etapa (e) na produção de iogurte. 43. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 37, sendo que é um método para produzir um produto de leite fermentado que compreende: (a) fornecer um substrato de leite que compreende pelo menos 20% (em p/v) de lactose, (b) colocar o substrato de leite em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose por pelo menos 45 minutos, (c) fermentar o substrato de leite, de preferência, incubando-se com uma cultura bacteriana, antes, durante e/ou após a etapa (b), (d) inativar a enzima antes ou após a etapa (c) e (e) obter, assim, um produto de leite fermentado em que pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de galacto- oligossacarídeos (GOS) DP3+ produzidos in situ. 44. O método, de acordo com a modalidade 43, sendo que o produto de leite fermentado é iogurte. 45. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 43 ou 44, sendo que a etapa (b) e a etapa (c) ocorrem a uma temperatura de 40 a 45 °C. 46. Um produto de leite obtenível por meio do método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores. 47. Um produto de leite que compreende uma quantidade total de pelo menos 11% em peso de galacto-oligossacarídeos (GOS) DP3+ produzidos in situ, e sendo que os GOS DP3+ produzidos in situ constituem pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais. 48. O produto de leite, de acordo com a modalidade 47, sendo que os carboidratos livres são os carboidratos que não são covalentemente ligados às proteínas. 49. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 ou 48, sendo que os GOS DP3+ são GOS que têm um grau de polimerização de pelo menos 3. 50. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 49, sendo que é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, leite concentrado, tal como leite condensado, ou leite em pó, tal como leite em pó desnatado. 51. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 50, sendo que compreende pelo menos 40% em peso, de preferência, pelo menos 45% em peso, pelo menos 50% em peso, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso de matéria seca. 52. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 51, sendo que é obtido a partir do leite que não teve a composição amplamente modificada por adição e/ou remoção de constituintes do leite, exceto pelo ajuste do teor de gordura e/ou água. 53. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 52, sendo que a razão entre proteína de soro do leite e caseína é a mesma que no leite. 54. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 53, sendo que é produzido a partir do leite, sem alterar a razão entre proteína de soro do leite e caseína. 55. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 54, sendo que não compreende lactose adicionada. 56. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 55, sendo que compreende uma quantidade total de pelo menos 10% em peso de proteína do leite, tal como pelo menos 15% em peso ou pelo menos 20% em peso de proteína do leite. 57. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 56, sendo que é leite em pó desnatado ou leite em pó desnatado reconstituído. 58. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 57, sendo que pelo menos 40% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de GOS DP3+ produzidos in situ. 59. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 58, sendo que pelo menos 50% em peso, de preferência, pelo menos 55% em peso ou pelo menos 60% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de GOS DP2+ produzidos in situ. 60. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 59, sendo que compreende uma quantidade total de pelo menos 12% em peso, de preferência, pelo menos 13% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. 61. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 60, sendo que compreende uma quantidade total de pelo menos 12% em peso, de preferência, pelo menos 15% em peso ou pelo menos 18% em peso de GOS DP2+ produzidos in situ. 62. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 61, sendo que no máximo 30% em peso, de preferência, no máximo 20% em peso, tal como no máximo 15% em peso ou no máximo 12% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite trata-se de lactose. 63. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 62, sendo que é leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado, que compreende uma quantidade total de pelo menos 11% em peso, de preferência, pelo menos 12% em peso ou pelo menos 13% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. 64. O produto de leite, de acordo com a modalidade 63, sendo que compreende uma quantidade total de no máximo 10% em peso, de preferência, no máximo 5% em peso de lactose. 65. O produto de leite, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 62, sendo que é leite em pó, tal como leite em pó desnatado, que compreende uma quantidade total de pelo menos 11% em peso, de preferência, pelo menos 12% em peso ou pelo menos 13% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. 66. O leite em pó, de acordo com a modalidade 65, sendo que compreende uma quantidade total de pelo menos 15% em peso, de preferência, pelo menos 18% em peso ou pelo menos 20% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ. 67. O leite em pó, de acordo com qualquer uma das modalidades 65 ou 66, sendo que compreende uma quantidade total de no máximo 15% em peso, de preferência, no máximo 10% em peso de lactose.
[0154] A lactase hidrolisa a lactose para formar α-D-glicose. A α-D-glicose é fosforilada por ATP, em uma reação catalisada por hexoquinase. A glicose-6-fosfato formada é oxidada em 6-fosfogluconato por glicose-6-fosfato desidrogenase. De modo concomitante com essa reação, uma quantidade equimolar de NAD+ é reduzida a NADH com um aumento resultante na absorvância a 340 nm.
[0155] 15% (em p/v) de Brij L23: Pesar 508,0 ± 0,4 g de Brij® L23 (Sigma B4184) em um béquer. Adicionar aproximadamente 300 ml de água ultrapura e agitar. Transferir o Brij® L23 quantitativamente para um frasco volumétrico de 1 l. Encher até a marca com água ultrapura. Agitar até fica homogêneo. Armazenabilidade: 2 meses em refrigerador.
[0156] Reagente de cor: (kit de reagente de glicose (GHK) (Tris 0,1 M, ATP 2,1 mM, NAD 2,1 mM, Mg2+ 4 mM, NaN3 a <0,1%, Mg2+ 4 mM, >7,5 kU/l de hexoquinase, >7,5 kU/l de G-6-P-DH, pH 7,8)): Abrir uma ampola de reagente de glicose A (HK), Thermo Fisher Scientific (número de artigo: 981304 ou 981779) e um ampola de reagente de glicose B (HK), Thermo Fisher Scientific (número de artigo: 981304 ou 981779). Verter 1 ampola de reagente B em 1 ampola de reagente A. Colocar a tampa. Misturar bem, virando-se a ampola para cima e para baixo lenta e suavemente 10 a 15 vezes. Usar toda a mistura na ampola de reagente A, ou verter a quantidade necessária em um recipiente adequado. Armazenabilidade: 1 mês no refrigerador.
[0157] Tampão de dissolução/tampão de diluição (mono- hidrato de ácido cítrico 0,01 M, 0,0225% (em p/v) de Brij® L23, MgSO4 1 mM, 7H2O, pH 4,5): Pesar 21,0 ± 0,1 g de mono-hidrato de ácido cítrico (número Cas 5949-29-1) e transferir quantitativamente para um frasco volumétrico de 10 l. Pesar 2,46 ± 0,01 g de MgSO4, 7H2O (número Cas 10034-99-8) e transferir quantitativamente para o frasco volumétrico. Adicionar aproximadamente 9 l de água desmineralizada e agitar até que a dissolução esteja completa. Adicionar 15 ml de Brij L23 a 15% (em p/v) ao frasco volumétrico e agitar. Adicionar aproximadamente 35 ml de NaOH 4 M (número Cas 1310-73-2) e agitar. Ajustar o pH para 4,50 ± 0,05 com o uso, por exemplo, de NaOH 4 M ou, por exemplo, HCl conforme for adequado. Encher até a marca com água desmineralizada e agitar. Armazenabilidade: 13 dias à temperatura ambiente.
[0158] Substrato (31,6% em p/p de mono-hidrato de lactose, mono-hidrato cítrico 0,01 M, 0,0225 (em p/v) de Brij L23, MgSO4 1 mM, 7H2O): Pesar 7,9 ± 0,2 g de mono-hidrato de lactose (número Cas 1003926-6) diretamente em um béquer. Dissolver até um volume total de 25,0 ± 0,1 g de tampão de dissolução. Aquecer e agitar até que a dissolução esteja completa, sem ebulição do substrato. Armazenabilidade: 6 horas à temperatura ambiente.
[0159] Padrão: Padrão enzimático com LAU(C)/g identificado (disponível junto à Novozymes A/S, Dinamarca) é usado como padrão, diluído em tampão de dissolução na faixa de 0,197 a 0,7880 LAU(C)/ml. Procedimento: 1. 50 ul de substrato são incubados por 540 segundos a 50 °C. O bloco bruto (50 ul de tampão de dissolução) é subtraído. 2. Amostra de 25 ul em tampão de dissolução é adicionada. 3. A reação é incubada por 1.800 segundos seguido pela adição de 160 ul de reagente de cor. 4. Após 300 segundos, a absorvância é medida a 340 nm. Cálculo de Atividade Enzimática:
[0160] A atividade enzimática da amostra diluída é lida a partir da curva padrão. Cálculo da atividade de uma amostra em LAU(C)/g é conforme indicado na fórmula: 5. = Leitura a partir da curva padrão em LAU(C)/ml V = Volume do frasco de medição usado em ml F = Fator de diluição para segunda diluição W = Peso da amostra em g
[0161] β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum que tem a sequência mostrada como SEQ ID NO: 1 foi expressa em Bacillus licheniformis e concentrada com o uso de UF (corte de 10 kDa) e finalmente formulada com glicose a 60% (em p/p) e incubada por 69,5 h a 55 °C e, então, armazenada a -20 °C. A concentração dessa amostra é de 5.300 LAU(C)/g.
[0162] Dois ml leite semidesnatado (Arla, comprado em um supermercado dinamarquês local, 4,7 g de lactose e 3,5 g de proteína por 100 g) foram transferidos para um tubo Eppendorf de 5 ml (determinações duplas para cada dose, incluindo controle). Então, 20 μl de diluição de enzima foram adicionados (LAU(C)/l final pode ser observado na Tabela 1) e misturados seguido por uma incubação a 5 °C por 24 h. Após a incubação, 10 μl de ácido acético concentrado foram adicionados a cada amostra, e as soluções foram aquecidas a 90 °C por 5 min. Após a inativação, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 5 min à temperatura ambiente. Um ml de sobrenadante foi transferido para um outro tubo e mantido congelado até ser analisado por HPLC.
[0163] Dois ml leite semidesnatado (Arla, comprado em um supermercado dinamarquês local, 4,7 g de lactose e 3,5 g de proteína por 100 g) foram transferidos para um tubo Eppendorf de 2 ml (determinações duplas para cada dose, incluindo controle). Então, 20 μl de diluição de enzima foram adicionados (LAU(C)/l final pode ser observado na Tabela 3) e misturados seguido por uma incubação a 60 °C por 3 h. Após a incubação, 10 μl de ácido acético concentrado foram adicionados a c ada amostra, e as soluções foram aquecidas a 90 °C por 5 min. Após a inativação, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 5 min à temperatura ambiente. Um ml de sobrenadante foi transferido para um outro tubo e mantido congelado até ser analisado por HPLC.
[0164] 12 g de leite em pó desnatado (contendo 50% de lactose e 35% de proteína) e 8 ml de solução de amostra (LAU(C)/kg final de SMP a 60% pode ser observado na Tabela 2) foram adicionados a um tubo de 50 ml tube e misturados e incubados por 22,5 h a 5 °C. Então, 20 ml de HAc a 3% foram adicionados e misturados com uma espátula até uma solução homogênea e, então, colocados em um rotador à temperatura ambiente por 10 min. Então, uma centrifugação a 7.850 rpm por 10 min foi realizada, e 200 μl de sobrenadante foram transferidos para um tubo Eppendorf de 2 ml contendo 1 ml água e aquecidos a 90 °C por 5 min e centrifugados a 14.000 rpm por 5 min à temperatura ambiente, e o sobrenadante foi mantido congelado até o uso para os dois testes analíticos de HPLC.
[0165] 12 g de leite em pó desnatado (contendo 50% de lactose e 35% de proteína) e 8 ml de solução de amostra (LAU(C)/kg final de SMP a 60% pode ser observado na Tabela 4) foram adicionados a um tubo de 50 ml tube e misturados e incubados por 24 h a 50, 55 ou 60 °C ou por 3 h a 65 °C. Então, 20 ml de HAc a 3% foram adicionados e misturados com uma espátula até uma solução homogênea e, então, colocados em um rotador à temperatura ambiente por 10 min. Então, uma centrifugação a 7.850 rpm por 10 min foi realizada, e 200 μl de sobrenadante foram transferidos para um tubo Eppendorf de 2 ml contendo 1 ml água e aquecidos a 90 °C por 5 min e centrifugados a 14.000 rpm por 5 min à temperatura ambiente, e o sobrenadante foi mantido congelado até o uso para os dois testes analíticos de HPLC.
[0166] Cromatografia de troca aniônica de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) com o uso de uma coluna PA1 para determinação quantitativa de galactose (Gal), glicose (Glc), lactose (Lac) e GOS DP2 é realizada da seguinte forma.
[0167] 50 μl de amostra são misturados juntos com 500 μl de água Milli Q + 10 μl solução Carrez I em um tubo Eppendorf de 5 ml e, então, misturados com 10 μl de solução Carrez II. Então, 4,43 ml de água milli Q são adicionados e centrifugados a 14.000 rpm por 5 min à temperatura ambiente. Um ml sobrenadante é misturado com 4 ml de água Milli-Q e transferido para tubos de filtro spin-x e centrifugado por 5 min a 6.000 rpm e aplicado em uma coluna PA1. A determinação quantitativa de Lac, b-1-6-Gal- Gal, b-1-6-Gal-Glc, b-1-3-Gal-Gal, b-1-4-Gal-Gal e b-1-3-Gal-Glc (+ b-1-2- Gal-Glc) foi realizada de modo que uma razão entre dissacarídeos GOS (DP2G) e lactose pudesse ser determinada.
[0168] Essa razão DP2G/(Lac+DP2G) é, então, usada para calcular a quantidade de DP2G no pico DP2 determinado pelo método ICS- 5000 RI do sistema de HPLC Dionex (consultar abaixo), e os GOS totais podem, então, ser calculados pela soma de DP3+ e DP2G.
[0169] De modo semelhante, a razão Lac/(Lac+DP2G) (= 1 menos DP2G/(Lac+DP2G)) pode ser usada para calcular a quantidade de lactose no pico DP2 determinado abaixo.
[0170] ICS-5000 RI do sistema de HPLC Dionex (Coluna de exclusão iônica Aminex-HPX-87H) é usado para determinação quantitativa de Gal, Glc, DP2, DP3, DP4 e DP5+. A amostra não diluída é transferida para tubos de filtro spin-x e centrifugada por 5 min a 6.000 rpm e aplicada a uma coluna Aminex-HPX-87H. Uma amostra de controle sem adição de enzima foi incubada sob as mesmas condições que as amostras tratadas com enzima e usada para calcular a contribuição de Gal, Glc e DP3, DP4 e DP5+ a partir do tratamento enzimático.
[0171] Os números mostrados nas tabelas se baseiam na determinação quantitativa de Gal, Glc, DP3, DP4 e DP5+ menos a determinação quantitativa de Gal, Glc, DP3, DP4 e DP5+ estimada na amostra de controle (sem enzima).
[0172] DP3+ quantitativo é determinado como DP3 + DP4 + DP5+.
[0173] Lactose quantitativa (Lac) = DP2 multiplicado pela razão Lac/(Lac+DP2G) determinada acima.
[0174] DP2G quantitativo = DP2 multiplicado pela razão DP2G/(Lac+DP2G) determinada acima.
[0175] Finalmente, GOS quantitativos = DP2G mais DP3+. Resultados Tabela 1. Produção de GOS em leite regular a 5 °C por 24 h
Tabela 2. Produção de GOS em SMP a 60% a 5 °C por 22,5 h
[0176] Para reivindicar fibras em um produto lácteo, um alto DP3+ (DP3+ é DP3 e DP superior que é fibra por definição,) é solicitado. Se o substrato de partida for leite regular, consultar na Tabela 1, um máximo de 28,0% de DP3+ pode ser obtido, ao passo que tendo SMP a 60%, um máximo de 38,7% pode ser obtido, consultar a Tabela 2. O rendimento de DP3+ mais alto obtido pela aplicação de SMP a 60% possibilita, além da reivindicação de fibra, também menores calorias do produto de leite final, visto que DP3+ tem 2 kcal/g, enquanto Glc, Gal e DP2G têm 4 kcal/g, conforme descrito pela regulamentação da UE: ANEXO XIV, Regulamento 1169/2011 sobre informações de alimento para consumidores. Tabela 3. Produção de GOS em leite regular a 60 °C por 3 h Tabela 4. Produção de GOS em SMP a 60% a 50, 55 e 60 °C por 24 h e 65 °C por 3 h
[0177] A Tabela 3 mostra GOS produzidos em leite regular a 60 °C por 3 h com aumento de dose enzimática (LAU(C)/kg, coluna 1). Na dose enzimática mais alta, foi obtido um DP3+ de 31,3%, o que é 3,3% mais alto em comparação com o DP3+ máximo obtido a 5 °C (consultar a Tabela 1). O mesmo aumento relativo em DP3+ é observado em SMP a 60% em altas temperaturas (50 a 65 °C, tabela 4) em comparação com SMP a 60% a 5 °C (tabela 2). Assim, tanto em leite regular quanto em SMP a 60%, um aumento relativo de DP3+ pode ser obtido em temperaturas mais altas.
[0178] A Tabela 4 mostra que é possível obter leite em pó desnatado reconstituído (60%) em que mais de 44 % em peso dos carboidratos livres totais trata-se de GOS DP3+ produzidos in situ. O leite em pó desnatado usado continha 50% de lactose. Assim, a quantidade total de GOS DP3+ produzidos in situ no leite em pó desnatado reconstituído é maior que 13% em peso (44% x 60% x 50%). Se o leite em pó desnatado reconstituído obtido fosse seco, por exemplo, por secagem por aspersão, o leite em pó desnatado obtido compreenderia mais de 22% em peso de GOS DP3+ produzidos in situ (44% x 50%).
[0179] A invenção descrita e reivindicada no presente documento não deve ter o escopo limitados pelos aspectos específicos revelados no presente documento, v isto que esses aspectos se destinam a ilustrar os diversos aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, diversas modificações da invenção, adicionalmente àquelas mostradas e descritas no presente documento, serão tornadas evidentes aos versados na técnica a partir da descrição anterior. Essas modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexadas. No caso de conflito, a presente revelação, incluindo as definições, prevalecerá.
Claims (13)
1. Produto de leite caracterizado por compreender uma quantidade total de pelo menos 11% em peso de galacto-oligossacarídeos (GOS) DP3+ produzidos in situ, em que os GOS DP3+ produzidos in situ constituem pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais, que compreende pelo menos 40% em peso de matéria seca, e em que o produto de leite é um leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou um leite concentrado, tal como leite condensado.
2. Produto de leite, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender pelo menos 45% em peso, de preferência, pelo menos 50% em peso, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso de matéria seca.
3. Produto de leite, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender uma quantidade total de pelo menos 10% em peso de proteína do leite.
4. Produto de leite, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por não compreender lactose adicionada.
5. Produto de leite, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por pelo menos 50% em peso, de preferência, pelo menos 55% em peso ou pelo menos 60% em peso dos carboidratos livres totais serem GOS DP2+ produzidos in situ.
6. Método para produzir um produto de leite caracterizado por compreender: (a) fornecer um substrato de leite que compreende pelo menos 20% em peso de lactose, (b) colocar o substrato de leite em contato com uma enzima que tem atividade de transgalactose por pelo menos 45 minutos, (c) inativar completa ou parcialmente a enzima, e (d) obter, assim, um produto de leite em que pelo menos 35% em peso dos carboidratos livres totais trata-se de galacto-oligossacarídeos (GOS) DP3+ produzidos in situ; em que a enzima que tem atividade de transgalactose tem uma sequência de aminoácidos idêntica aos aminoácidos 1 a 1.304 da SEQ ID NO: 1; em que a enzima com atividade de transgalactose foi modificada por glicação por incubação com 40-70% em peso, de preferência 50-70% em peso ou 55-65% em peso, glicose por 40-100 horas, de preferência 50-90 ou 60-80 horas, a 40-60°C, de preferência, 50-60°C; e em que a enzima com atividade de transgalactose que foi modificada por glicação melhorou a atividade de transgalactose em comparação com uma enzima que não foi modificada por glicação.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o substrato de leite ser leite em pó reconstituído, tal como leite em pó desnatado reconstituído, ou leite concentrado, tal como leite condensado.
8. Método, de acordo a reivindicação 6 ou 7, caracterizado por o substrato de leite compreender uma quantidade total de pelo menos 10% em peso de proteína do leite.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado por o substrato de leite não compreender lactose adicionada.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado por o substrato de leite compreender pelo menos 40% em peso, de preferência, pelo menos 45% em peso, pelo menos 50% em peso, pelo menos 55% em peso ou pelo menos 60% em peso de matéria seca.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado por pelo menos 50% em peso, de preferência, pelo menos 55% em peso, pelo menos 57% em peso ou pelo menos 60% em peso dos carboidratos livres totais no produto de leite ser GOS DP2+ produzidos in situ.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizado por a enzima com atividade de transgalactose ser uma betagalactosidase que tem uma razão entre atividade de transgalactose e de hidrólise de pelo menos 1, de preferência, pelo menos 2, pelo menos 3 ou pelo menos 4, quando medida em uma solução a 60% de leite em pó desnatado após 24 horas a 50°C com o uso de uma concentração de enzimas de 13 LAU(C) por g de lactose.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizado por a enzima com atividade de transgalactose ter um comprimento de 900 a 1.350 aminoácidos, de preferência, 1.300 a 1.305 aminoácidos, com mais preferência, 1.302 ou 1.304 aminoácidos.
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