BR112019012001B1 - Processo para produzir um produto de leite fermentado - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a um processo para produzir um produto de leite fermentado compreendendo as etapas de 1) adicionar uma cultura iniciadora compreendendo pelo menos uma cepa da bactéria do ácido láctico a uma base de leite, 2) fermentar o leite por um período de tempo até que um pH-alvo seja atingido, 3) usar uma cultura iniciadora compreendendo pelo menos uma cepa deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose e 4) adicionar uma lactase estável em pH baixo ao processo ou no início, durante ou no final da etapa de fermentação, em que a lactase estável em pH baixo retém sua atividade em um pH de 5,0 e uma temperatura de 37°C em um nível de pelo menos 5% comparado com sua atividade no pH ótimo da lactase.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um processo para produzir um produto de leite fermentado.
[002] O WO 2009/071539 revela uma lactase se originando de Bifidobacterium bifidum, que é capaz de hidrólise muito eficiente em leite, e que é ativa em uma faixa de pH ampla, incluindo pH baixo, por exemplo, um pH abaixo de 5. A lactase pode ser usada em processos para produção de leite e produtos de leite fermentado, tais como queijo, iogurte, manteiga, soro de leite coalhado, creme azedo, etc., para redução do teor de lactose.
[003] O WO 2013/160413 revela um método de produção de um produto de leite fermentado usando uma combinação de cepas de bactérias do ácido láctico negativas para glicose e uma lactase convencional com um objetivo de redução do teor de lactose no produto de leite fermentando enquanto aumentando o teor de glicose.
[004] A EP-A1-2 957 180 em uma modalidade revela um método de produção de um produto de leite fermentado usando uma combinação de culturas iniciadoras e uma lactase convencional com um objetivo de reduzir o teor de lactose e o nível de pós-acidificação no produto de leite fermentado. A EP-A1-2 957 180 em uma segunda modalidade revela um método de produção de um produto de leite fermentado usando bactérias do ácido láctico deficientes em lactose.
[005] O objetivo da presente invenção é prover um processo aperfeiçoado para produzir um produto de leite fermentado.
[006] O objetivo da presente invenção é atingido através de um processo para produzir um produto de leite fermentado compreendendo as etapas de adicionar uma cultura iniciadora compreendendo pelo menos uma cepa da bactéria do ácido láctico a uma base de leite, fermentar o leite por um período de tempo até que um pH- alvo seja atingido, em que a cultura iniciadora compreende pelo menos uma cepa deficiente em lactose, a qual é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e adicionar uma lactase estável em pH baixo ao processo ou no início, durante ou no final da etapa de fermentação, em que a lactase estável em pH baixo retém sua atividade em um pH de 5,0 e uma temperatura de 37°C em um nível de pelo menos 5% comparado com sua atividade no pH ótimo da lactase.
[007] Bactérias do ácido láctico deficientes em lactose tipicamente crescem em uma fonte de carboidrato não lactose, tais como sacarose, galactose e glicose, adicionada ao leite em uma quantidade medida de modo a parar o processo de fermentação e o crescimento das bactérias do ácido láctico através de depleção da fonte de carboidrato adicionada. Desta maneira, a pós-acidificação durante subsequente armazenamento é diminuída significantemente ou até mesmo totalmente prevenida. Uma lactase estável em pH baixo será ativa durante o curso inteiro de um processo de fermentação e desta maneira permite conversão da maior parte ou toda a lactose presente em leite em glicose e galactose. Desta maneira, é possível produzir um produto de leite fermentado com um teor reduzido de lactose ou um produto livre de lactose. Também, é possível produzir um produto de leite fermentado com uma doçura natural aumentada, uma vez que a glicose e a galactose têm uma doçura muito maior do que a lactose.
[008] A presente invenção é baseada no reconhecimento que ao usar uma combinação de uma lactase estável em pH baixo e bactérias do ácido láctico deficientes em lactose é possível obter um produto de leite fermentado que ao mesmo tempo tem teor de lactose reduzido, uma doçura aumentada e pós-acidificação reduzida. Ainda, foi surpreendentemente constatado que a dita combinação resulta em um produto de leite fermentado tendo uma textura aumentada comparado com uso de bactérias do ácido láctico deficientes em lactose e nenhuma lactase e como comparado ao uso de uma lactase estável em pH baixo e bactérias do ácido láctico positivas para lactose.
[009] Ainda, quando a lactase é adicionada antes da etapa de fermentação, o processo da invenção proveu uma possibilidade de redução ou até mesmo eliminação da quantidade de carboidrato não lactose a ser adicionado ao leite. Desta maneira, a glicose e a galactose formadas pela ação enzimática de lactase estarão disponíveis para o crescimento das bactérias do ácido láctico deficientes em lactose.
[0010] Finalmente, quando a lactase é adicionada após a etapa de fermentação, é possível obter vantagem total da habilidade das bactérias do ácido láctico deficientes em lactose em evitar pós- acidificação.
[0011] Em todo o mundo, números significantes de consumidores são intolerantes ou sensíveis à lactose. Desta maneira, há atualmente uma alta demanda por produtos lácteos, incluindo produtos de leite fermentado, com um teor reduzido de lactose ou que sejam substancialmente livres de lactose. A presente invenção proveu uma nova abordagem para produção de tal produto de uma maneira simples e de custo eficiente.
[0012] A lactase do produto de leite fermentado da invenção pode ser qualquer lactase, que retenha sua atividade em um pH de 5,0 e uma temperatura de 37°C em um nível de pelo menos 5% comparado com sua atividade no pH ótimo da lactase.
[0013] Em relação à presente invenção, a atividade em LAU da lactase é medida como especificado na seção "Definições" abaixo.
[0014] Em uma modalidade preferida da invenção, a lactase retém sua atividade em um pH de 5,0 e uma temperatura de 37°C em um nível de pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70% e sobretudo preferivelmente pelo menos 80%, comparado com sua atividade no pH ótimo da lactase.
[0015] Em uma modalidade preferida da invenção, a lactase retém sua atividade em um pH de 4,0 e uma temperatura de 37° C em um nível de pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70% e sobretudo preferivelmente pelo menos 80%, comparado com sua atividade no pH ótimo da lactase.
[0016] Em uma modalidade preferida da invenção, a lactase retém sua atividade em um pH de 3,0 e uma temperatura de 37°C em um nível de pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70% e sobretudo preferivelmente pelo menos 80%, comparado com sua atividade no pH ótimo da lactase.
[0017] Em relação à presente invenção, o pH ótimo da lactase é determinado através da medição da atividade de lactase em pH usando o método indicado na seção "Definições" abaixo e determinação do pH com atividade ótima. Em uma modalidade preferida da invenção, a lactase retém sua atividade em uma temperatura de 10° C e um pH de 6,0 em um nível de pelo menos 10% comparado com sua atividade na temperatura ótima da lactase. Preferivelmente, a lactase retém sua atividade em uma temperatura de 10°C e um pH de 6,0 em um nível de pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70% e sobretudo preferivelmente pelo menos 80%, comparado com sua atividade na temperatura ótima da lactase.
[0018] Em relação à presente invenção, a temperatura ótima da lactase é determinada através da medição da atividade de lactase em temperaturas diferentes usando o método indicado na seção "Definições" abaixo e determinação da temperatura com atividade ótima.
[0019] Em uma modalidade preferida, a lactase a ser usada no produto da presente invenção tem uma atividade de lactase a 37°C e pH 5 que é pelo menos 55%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70% ou pelo menos 75%, de sua atividade de lactase a 37°C e pH 6.
[0020] Em uma outra modalidade preferida, a lactase a ser usada no produto da presente invenção tem uma atividade de lactase a 37°C e pH 4,5 que é pelo menos 10%, tal como pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% de sua atividade de lactase a 37°C e pH 6.
[0021] Em uma outra modalidade preferida, a lactase a ser usada no produto da presente invenção tem um pH ótimo da atividade de lactase a 37°C que é acima de pH 5,5.
[0022] Em uma outra modalidade preferida, a lactase a ser usada no produto da presente invenção tem uma atividade de lactase em uma temperatura de 52°C e um pH de 6,5 que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75% ou pelo menos 80%, de sua atividade de lactase em uma temperatura de 38°C e um pH de 6,5.
[0023] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a Km da lactase a 5°C é abaixo de 25 mM, tal como abaixo de 20 mM, abaixo de 15 mM ou abaixo de 10 mM. Em uma outra modalidade preferida, a Km da lactase a 37°C é abaixo de 25 mM, tal como abaixo de 20 mM ou abaixo de 15 mM. O versado na técnica saberá como determinar a Km para a atividade de lactase em uma temperatura específica, a Km pode ser determinada através do método descrito no WO 2009/071539.
[0024] Em uma outra modalidade preferida, a enzima quando hidrolisando a lactase no produto de leite tem uma razão de atividade de lactase para transgalactosilase de mais de 1:1, tal como mais de 2:1 ou mais do que 3:1. Em uma outra modalidade preferida, o tratamento com enzima é realizado sob condições onde a atividade de lactase da enzima é maior do que a atividade de transgalactosilase, tal como pelo menos duas vezes maior ou pelo menos três vezes maior.
[0025] A razão de atividade de lactase para transgalactosilase no produto de leite pode, por exemplo, ser determinada através de análise de HPLC. Em uma outra modalidade preferida, o tratamento com enzima é realizado sob condições onde pelo menos 50% (p/p) da lactose hidrolisada são convertidos em galactose livre. Em uma outra modalidade preferida, o tratamento com enzima é realizado sob condições onde a lactose hidrolisada é convertida em quantidades iguais de glicose livre e galactose livre.
[0026] Uma lactase no contexto da presente invenção é um glicosídeo hidrolase tendo a habilidade em hidrolisar o dissacarídeo lactose em monômeros de galactose e glicose constituintes. O grupo de lactase, ao qual a lactase da invenção pertence, compreende mas não é limitado às enzimas designadas à subclasse EC 3.2.1.108. As enzimas designadas a outras subclasses, tais como, por exemplo, EC 3.2.1.23, podem ser também lactases no contexto da presente invenção. Uma lactase no contexto da invenção pode ter outras atividades que não a atividade de hidrólise de lactose, tal como, por exemplo, uma atividade de transgalactosilação. No contexto da invenção, a atividade de hidrólise de lactose da lactase pode ser referida como sua atividade de lactase ou sua atividade de beta-galactosidase.
[0027] Enzimas tendo atividade de lactase a serem usadas em um método da presente invenção podem ser de origem animal, de planta ou de micróbio. Lactases preferidas são obtidas a partir de fontes microbianas, em particular a partir de um fungo filamentoso ou levedura ou a partir de uma bactéria.
[0028] A enzima pode, por exemplo, ser derivada de uma cepa de Agaricus, por exemplo, A. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, por exemplo, D. discoideum; Kluveromyces, por exemplo, K. fragilis, K. lactis; Mucor, por exemplo, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por exemplo, N. crassa; Rhizomucor, por exemplo, R. pusillus; Rhizopus, por exemplo, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, por exemplo, S. libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, por exemplo, T. rubrum; Whetzelinia, por exemplo, W. sclerotiorum; Bacillus, por exemplo, B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. subtilis, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, por exemplo, B. longum, B. bifidum, B. animalis; Chryseobacterium; Citrobacter, por exemplo, C. freundii; Clostridium, por exemplo, C. perfringens; Diplodia, por exemplo, D. gossypina; Enterobacter, por exemplo, E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por exemplo, E. herbicola; Escherichia, por exemplo, E. coli; Klebsiella, por exemplo, K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neurospora, por exemplo, N. crassa; Proteus, por exemplo, P. vulgaris; Providencia, por exemplo, P. stuartii; Pycnoporus, por exemplo, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus, por exemplo, R. torques; Salmonella, por exemplo, S. typhimurium; Serratia, por exemplo, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por exemplo, S. flexneri; Streptomyces, por exemplo, S. antibioticus, S. castaneoglobisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, por exemplo, T. reesei, T. viride; Yersinia, por exemplo, Y. enterocolitica.
[0029] Em uma modalidade preferida, a lactase se origina a partir de uma bactéria, por exemplo, a partir da família Bifidobacteriaceae, tal como do gênero Bifidoacterium, tal como de uma cepa de B. bifidum, B. animalis ou B. longum. Em uma modalidade mais preferida, a lactase se origina de Bifidobacterium bifidum.
[0030] Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de lactase a ser usada no produto da presente invenção compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50% idêntica a uma sequência selecionada do grupo consistindo em aminoácidos 28-1931 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 28-1331 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e fragmentos ativos de lactase das mesmas. Em uma modalidade mais preferida, a enzima compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica a uma sequência selecionada do grupo consistindo em aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e fragmentos ativos de lactase das mesmas.
[0031] Uma enzima preferida é uma lactase tendo uma sequência que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica aos aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 1 ou a um fragmento ativo de lactase das mesmas. Tal fragmento ativo de lactase de SEQ ID NO: 1 pode ser qualquer fragmento de SEQ ID NO: 1 tendo atividade de lactase. Um fragmento ativo de lactase de SEQ ID NO: 1 pode ser, por exemplo, aminoácidos 28-979, aminoácidos 28-1170, aminoácidos 28-1323, aminoácidos 28-1331 ou aminoácidos 28-1600 de SEQ ID NO: 1.
[0032] Em uma modalidade preferida, uma enzima tendo atividade de lactase a ser usada no produto da presente invenção compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50% idêntica aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade mais preferida, a enzima compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 2.
[0033] Em uma outra modalidade, uma enzima tendo atividade de lactase a ser usada em produto da presente invenção tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 3. Preferivelmente, a enzima tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 3.
[0034] Em uma outra modalidade, uma enzima tendo atividade de lactase a ser usada no produto da presente invenção tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50% idêntica à SEQ ID NO: 4. Preferivelmente, a enzima tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 4.
[0035] Para propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácido é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice e outros (2000) Trends in Genetics 16: 276-277), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado "identidade mais longa" (obtida usando a opção -não breve) é usado como a identidade percentual e é calculada como segue:
[0036] (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número total de Lacunas em Alinhamento)
[0037] Uma lactase comercial particular adequada para uso na presente invenção é Lactase F "Amano" 100SD disponível da Amano Enzyme Europe.
[0038] Lactases a serem usadas em um método da presente invenção podem ser extracelulares. Elas podem ter uma sequência de sinal em seu terminal N, que é clivado durante secreção.
[0039] Lactases a serem usadas em um método da presente invenção podem ser derivadas de qualquer uma das fontes mencionadas aqui. O termo "derivado" significa neste contexto que a enzima pode ter sido isolada de um organismo onde ela está presente nativamente, isto é, a identidade da sequência de aminoácido da enzima é idêntica a uma enzima nativa. O termo "derivado" também significa que as enzimas podem ter sido produzidas recombinantemente em um organismo hospedeiro, a enzima recombinantemente produzida tendo ou uma identidade idêntica a uma enzima nativa ou tendo uma sequência de aminoácido modificada, por exemplo, tendo um ou mais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácido nativa. Dentro do significado de uma enzima nativa estão incluídas variantes naturais. Ainda, o termo "derivado" inclui enzimas produzidas sinteticamente através de, por exemplo, síntese de peptídeo. O termo "derivado" também compreende enzimas que foram modificadas, por exemplo, através de glicosilação, fosforilação, etc., seja in vivo ou in vitro. Com relação à enzima recombinantemente produzida, o termo "derivado de" refere-se à identidade da enzima e não à identidade do organismo hospedeiro em que ele é produzido recombinantemente.
[0040] A lactase pode ser obtida a partir de um micro-organismo através do uso de qualquer técnica adequada. Por exemplo, uma preparação de enzima lactase pode ser obtida através da fermentação de um micro-organismo adequado e subsequente isolamento de uma preparação de lactase a partir do caldo fermentado resultante ou microorganismo através de métodos conhecidos na técnica. A lactase pode ser também obtida através do uso de técnicas de DNA recombinante. Tal método normalmente compreende cultivo de uma célula hospedeira transformada com um vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência de DNA codificando a lactase em questão e a sequência de DNA sendo operacionalmente ligada com um sinal de expressao apropriado de modo que ela é capaz de expressar a lactase em um meio de cultura sob condições que permitem a expressão da enzima e recuperação da enzima a partir da cultura. A sequência de DNA também pode ser incorporada ao genoma da célula hospedeira. A sequência de DNA pode ser de origem genômica, de cDNA ou sintética ou quaisquer combinações dessas, e pode ser isolada ou sintetizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0041] Lactases a serem usadas em um método da presente invenção podem ser purificadas. O termo "purificado" como usado aqui compreende proteína de enzima lactase essencialmente livre de componentes insolúveis do organismo de produção. O termo "purificado" também compreende proteína enzima lactase essencialmente livre de componentes insolúveis do organismo nativo a partir do qual ela é obtida. Preferivelmente, ela é também separada de alguns dos componentes solúveis do organismo e meio de cultura do qual ela é derivada. Mais preferivelmente, ela é separada através de uma ou mais das operações de unidade: filtragem, precipitação ou cromatografia.
[0042] Desta maneira, a enzima tendo atividade de lactase pode ser purificada, em outras palavras, apenas quantidades pequenas de outras proteínas estando presentes. A expressão "outras proteínas" refere-se em particular a outras enzimas. O termo "purificado" como aqui usado refere-se também à remoção de outros componentes, particularmente outras proteínas e mais particularmente outras enzimas presentes na célula de origem da lactase. A lactase pode ser "substancialmente pura", isto é, livre de outros componentes do organismo no qual ela é produzida, isto é, por exemplo, um organismo hospedeiro para lactase recombinantemente produzida. Preferivelmente, a lactase é uma preparação de proteína de enzima pelo menos 40% pura (p/p), mais preferivelmente pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou ainda pelo menos 90% pura.
[0043] O termo enzima tendo atividade de lactase inclui quaisquer compostos auxiliares que podem ser necessários para a atividade catalítica da enzima tal como, por exemplo, um aceitador ou cofator apropriado, que pode ou não estar naturalmente presente no sistema de reação.
[0044] A enzima pode estar em qualquer forma adequada para o uso em questão, tal como, por exemplo, na forma de um pó ou granulado seco, um granulado não pó, um líquido, um líquido estabilizado ou uma enzima protegida.
[0045] Os termos "deficiência em metabolismo de lactose" e "deficiente em lactose" são usados no contexto da presente invenção para caracterizar LAB que perdeu ou parcialmente ou completamente a habilidade em usar lactose como uma fonte de crescimento celular ou manutenção da viabilidade celular. Respectivos LABs são capazes de metabolizar um ou vários carboidratos selecionados de sacarose, galactose e/ou glicose ou um outro carboidrato fermentado. Uma vez que esses carboidratos não estão naturalmente presentes em leite em quantidades suficientes para apoiar fermentação por mutantes deficientes em lactose, é necessário adicionar esses carboidratos ao leite. LAB deficiente e parcialmente deficiente em lactose pode ser caracterizado como colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.
[0046] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa deficiente em lactose é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose selecionado do grupo consistindo em sacarose, galactose e glicose, preferivelmente glicose. Em uma modalidade particular da invenção, a cepa deficiente em lactose é capaz de metabolizar galactose.
[0047] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa deficiente em lactose é selecionada do grupo consistindo em Streptococcus thermophilus deficiente em lactose e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose.
[0048] Em uma modalidade particular da invenção, a cepa deficiente em lactose é selecionada do grupo consistindo em: uma cepa de Streptococcus thermophiles, cuja cepa é: a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o número de acesso DSM 28952; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28952, onde a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a habilidade em gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (b) uma cepa de Streptococcus thermophiles, cuja cepa é: a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, 1m 12-06-2014 sob número de acesso DSM 28953; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28953, onde a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a habilidade em gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (c) uma cepa de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, cuja cepa é: a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o número de acesso DSM 28910; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28910, onde a cepa derivada é ainda caracterizada como tendo a habilidade em gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.
[0049] Em uma modalidade particular da invenção, a cultura iniciadora contém ambos pelo menos uma Streptococcus thermophilus deficiente em lactose e pelo menos uma Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose.
[0050] Em uma modalidade particular da invenção, a cultura ini ciadora contém ambos pelo menos uma Streptococcus thermophilus e pelo menos uma Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, e onde todas as cepas de Streptococcus thermophilus e todas as cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus são deficientes em lactose.
[0051] Em uma modalidade particular da invenção, a etapa de fermentação é terminada através de um método selecionado do grupo consistindo em 1) acidificação do leite fermentado tornando pelo menos uma cepa da cultura iniciadora incapaz de crescer, 2) tratamento de resfriamento e 3) depleção do carboidrato não lactose.
[0052] Em uma modalidade particular da invenção, carboidrato não lactose é adicionado à base de leite no início da etapa de fermentação.
[0053] Preferivelmente, o carboidrato não lactose é adicionado à base de leite em uma quantidade medida de modo a se tornar depletado e então resultar em parada do crescimento de bactérias do ácido láctico e na parada da fermentação. Preferivelmente, o carboidrato não lactose é adicionado à base de leite em uma quantidade medida de modo a se tornar depletado e então resultar em parada do crescimento de bactérias do ácido láctico e em parada da fermentação em um valor de pH-alvo selecionado.
[0054] A quantidade de carboidrato não lactose a ser adicionada à base de leite depende de vários parâmetros, incluindo as cepas de bactérias do ácido láctico usadas na cultura iniciadora, da composição da base de leite, da temperatura de fermentação e do pH-alvo desejado. Também, a quantidade de carboidrato não lactose a ser adicionada à base de leite pode depender do tipo e quantidade de lactase usada no processo. A quantidade de carboidrato não lactose a ser adicionada à base de leite pode ser determinada através de experimentação, e está dentro das habilidades do versado realizar tal experimentação.
[0055] Em uma modalidade particular da invenção, o carboidrato não lactose adicionado é selecionado do grupo consistindo em sacarose, galactose e glicose, preferivelmente sacarose.
[0056] Em um primeiro aspecto da invenção, a lactase estável em pH baixo é adicionada à base de leite no início da etapa de fermentação. Neste aspecto a lactase adicionada converterá a lactose da base de leite em glicose e galactose, que estarão disponíveis para metabolização para a cultura iniciadora em adição ao carboidrato não lactose adicionado. Neste caso, não será possível parar a fermentação através da depleção do carboidrato não lactose adicionado. Desta maneira, em uma modalidade particular do primeiro aspecto da invenção, a etapa de fermentação é terminada através de um método selecionado do grupo consistindo em 1) acidificação do leite fermentado tornando pelo menos uma cepa da cultura iniciadora incapaz de crescer e 2) tratamento de resfriamento.
[0057] Em uma modalidade particular do primeiro aspecto da invenção, nenhum carboidrato não lactose é adicionado à etapa de fermentação e pelo menos uma cepa de ácido láctico deficiente em lactose da cultura iniciadora é capaz de metabolização de um carboidrato selecionado do grupo consistindo em glicose e galactose. Nesta modalidade a cepa de ácido láctico deficiente em lactose da cultura iniciadora cresce apenas na glicose e/ou galactose formada pela ação enzimática da lactase de pH baixo. Nesta modalidade da invenção, a fermentação é parada em um valor de pH-alvo através de um método selecionado do grupo consistindo em 1) acidificação do leite fermentado tornando pelo menos uma cepa da cultura iniciadora incapaz de crescer, 2) tratamento de resfriamento e 3) depleção da glicose e/ou galactose formada pela lactase estável em pH baixo.
[0058] Em um segundo aspecto da invenção, a lactase estável em pH baixo é adicionada ao leite fermentado no final da fermentação. Neste caso, o produto de leite fermentado contendo lactase é preferivelmente armazenado em uma temperatura de pelo menos 2°C por pelo menos 1 dia. Em uma modalidade particular do processo da invenção, o produto de leite fermentado contendo lactase é armazenado por pelo menos dois dias, preferivelmente pelo menos 3 dias, mais preferivelmente pelo menos 4 dias, mais preferivelmente pelo menos 5 dias, mais preferivelmente pelo menos 6 dias e sobretudo preferivelmente pelo menos 7 dias.
[0059] Em uma modalidade particular do segundo aspecto da invenção, a etapa de fermentação é terminada através de depleção do carboidrato não lactose.
[0060] Em uma modalidade particular da invenção o pH-alvo está entre 3,2 e 4,8, mais preferivelmente entre 3,6 e 4,6, mais preferivelmente entre 3,8 e 4,5 e sobretudo preferivelmente entre 4,0 e 4,4.
[0061] Em uma modalidade particular da invenção a temperatura de fermentação é entre 35°C e 45°C, preferivelmente entre 37°C e 43°C e mais preferivelmente entre 40°C e 43°C.
[0062] Em uma outra modalidade particular da invenção a fermentação é entre 15°C e 35°C, preferivelmente entre 25°C e 35°C e mais preferivelmente entre 30°C e 33°C.
[0063] Em uma modalidade particular da invenção, o produto de leite fermentado é embalado em uma temperatura entre 15 e 45°C.
[0064] Em uma modalidade particular da invenção, o valor do pH do produto de leite fermentado é mantido dentro de uma faixa de 0,3 unidade de pH, preferivelmente dentro de uma faixa de 0,2 unidade de pH e sobretudo preferivelmente dentro de uma faixa de 0,1 unidade de pH, quando armazenado após término da fermentação na temperatura usada para fermentação durante um período de 20 horas.
[0065] Em uma modalidade particular da invenção, a quantidade de carboidrato não lactose adicionado é de a partir de 1 mg/g a 30 mg/g, preferivelmente de a partir de 2 mg/g a 20 mg/g e mais preferivelmente de a partir de 3 mg/g a 10 mg/g de base de leite.
[0066] Em uma modalidade particular da invenção, a quantidade de carboidrato não lactose adicionado é de a partir de 0,1% a 10%, preferivelmente de a partir de 0,2% a 8%, preferivelmente de a partir de 0,3% a 2%, preferivelmente de a partir de 0,4% a 1,5% e mais preferivelmente de a partir de 0,5% a 1,2%, onde % é (p/p) baseada em base de leite.
[0067] A cultura iniciadora pode ter a composição de cepa de qualquer cultura iniciadora convencional de bactérias do ácido láctico, incluindo cultura de cepa simples e misturas de culturas, usada para produção de um tipo específico de produto de leite fermentado. Outras bactérias úteis, que podem ser adicionadas ao produto em adição à cultura iniciadora, incluem a bactéria probiótica Bifidobacterium spp.
[0068] Em uma modalidade particular da invenção, o produto de leite fermentado após fermentação é submetido a um tratamento térmico de modo a reduzir o nível de bactérias da cultura iniciadora para não mais do que 1x10exp02 CFU por g de produto de leite fermentado. Neste caso uma modalidade particular é caracterizada pelo fato de que a lactase é adicionada após o tratamento térmico. Neste caso o produto de leite fermentado contendo lactase é armazenado em uma temperatura de pelo menos 2°C por pelo menos 1 dia. Em uma modalidade particular do processo da invenção, o produto de leite fermentado contendo lactase é armazenado por pelo menos dois dias, preferivelmente pelo menos 3 dias, mais preferivelmente pelo menos 4 dias, mais preferivelmente pelo menos 5 dias, mais preferivelmente pelo menos 6 dias e sobretudo preferivelmente pelo menos 7 dias.
[0069] O tratamento térmico de modo a reduzir o nível de bactérias da cultura iniciadora para não mais do que 1,0X10expo02 CFU por g de leite fermentado é preferivelmente realizado submetendo o produto de leite fermentado de cultural iniciadora a uma temperatura entre 50°C e 110°C, preferivelmente entre 50°C e 100°C, preferivelmente entre 50°C e 90°C, preferivelmente entre 60°C e 85°C, mais preferivelmente entre 65°C e 82°C e sobretudo preferivelmente entre 70°C e 80°C. O tratamento térmico é preferivelmente realizado por um período entre 5 segundos e 180 segundos, preferivelmente entre 5 segundos e 120 segundos, mais preferivelmente entre 5 segundos e 90 segundos, mais preferivelmente entre 5 segundos e 60 segundos, mais preferivelmente entre 8 segundos e 50 segundos e sobretudo preferivelmente entre 10 e 40 segundos. Preferivelmente, o nível de bactérias da cultura iniciadora é reduzido para não mais do que 1,0X10expo01 CFU por g de leite fermentado, mais preferivelmente 0 CFU por g. Produtos de leite fermentado submetidos a tratamento térmico de modo a reduzir o nível de bactérias para não mais do que 1X10exp02 CFU por g são adequados para armazenamento em temperatura ambiente, tal como armazenamento em uma temperatura de pelo menos 5°C, preferivelmente pelo menos 10°C, mais preferivelmente pelo menos 15°C e sobretudo preferivelmente pelo menos 20°C.
[0070] A lactase estável em pH baixo é adicionada em uma quantidade adequada para obter o grau desejado de hidrólise de lactose sob as condições de reação escolhidas. Em uma modalidade particular da invenção, lactase é adicionada em uma quantidade entre 100 e 20000 LAU por litro de base de leite, preferivelmente entre 100 e 10000 LAU por litro de base de leite, preferivelmente entre 100 e 5000 LAU por litro de base de leite, preferivelmente menos do que 3000, tal como menos do que 1500, menos de 1000, menos de 750 ou menos do que 500, LAU por litro de base de leite.
[0071] Em uma modalidade preferida, a lactase é adicionada em uma concentração entre 5 e 400 LAU por g de lactose na base de leite, preferivelmente entre 5 e 200 LAU por g de lactose na base de leite, preferivelmente entre 5 e 100 LAU por g de lactose na base de leite, preferivelmente menos do que 50, tal como menos do que 40, menos do que 30, menos do que 20 ou menos do que 10, LAU por g de lactose na base de leite.
[0072] Em uma modalidade preferida da invenção, a lactase é adicionada à base de leite em uma quantidade entre 2,0 mg/ml e 50 mg/ml, preferivelmente entre 5 mg/ml e 48 mg/ml, mais preferivelmente entre 10 mg/ml e 46 mg/ml e sobretudo preferivelmente entre 20 mg/ml e 45 mg/ml.
[0073] Em uma modalidade preferida da invenção, o nível residual de lactose no final da fermentação é menos do que 40 mg/ml, preferivelmente menos de 35 mg/ml, mais preferivelmente menos do que 30 mg/ml, mais preferivelmente menos do que 25 mg/ml, mais preferivelmente menos do que 20 mg/ml, mais preferivelmente menos do que 15 mg/ml, mais preferivelmente menos do que 10 mg/ml, mais preferivelmente menos do que 5 mg/ml, mais preferivelmente menos do que 3 mg/ml e sobretudo preferivelmente menos do que 1,5 mg/ml.
[0074] Em uma modalidade preferida da invenção, a base de leite no início da etapa de fermentação tem um teor de lactose entre 30,0 mg/ml e 70 mg/ml, preferivelmente entre 35 mg/ml e 65 mg/ml, mais preferivelmente entre 40 mg/ml e 60 mg/ml e sobretudo preferivelmente entre 50 mg/ml e 60 mg/ml.
[0075] Em uma modalidade preferida da invenção, onde a lactase estável em pH baixo é adicionada ao processo no final da etapa de fermentação, o produto de leite fermentado, ao qual a lactase deve ser adicionada, tem uma viscosidade que permite distribuição fácil da lactase no produto de leite fermentado, por exemplo, através de mistura.
[0076] Em uma modalidade preferida do processo da invenção, a lactase a ser adicionada ao processo é provida em uma formulação estéril. Em uma outra modalidade preferida do processo da invenção a lactase é adicionada ao processo sob condições assépticas, por exemplo, através de filtragem estéril de uma solução da lactase.
[0077] A presente invenção refere-se ainda a um produto de leite fermentado produzido através do processo da invenção.
[0078] Em uma modalidade particular a invenção refere-se a um produto de leite fermentado produzido através do processo da invenção compreendendo a cultura iniciadora da etapa 3) do dito processo e a lactase estável em pH baixo adicionada na etapa 4) do dito processo.
[0079] Em uma modalidade particular da invenção, o produto de leite fermentado é um produto que pode ser produzido usando uma cepa de bactéria do ácido láctico selecionada do grupo consistindo em Streptococcus thermophilus deficiente em lactose e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose.
[0080] Em uma modalidade particular da invenção, o produto de leite fermentado é selecionado do grupo consistindo em iogurte, queijo cremoso, leite azedo, creme azedo, soro de leite coalhado, soro de leite fermentado, leite culturado, Smetana, Kefir, iogurte para beber e Yakult. Preferivelmente, o iogurte é selecionado do grupo consistindo em um iogurte endurecido, iogurte batido e iogurte para beber.
[0081] Em uma modalidade preferida da invenção, o produto de leite fermentado contém um produto alimentício adicional selecionado do grupo consistindo em bebida de frutas, produtos cereais fermentados, produtos cereais quimicamente acidificados, produtos de leite de soja e qualquer mistura dos mesmos.
[0082] O produto de leite fermentado tipicamente contém proteína em um nível entre 2,0% em peso a 3,5% em peso. O produto de leite fermentado pode ser também um produto com baixo teor de proteína com um nível de proteína entre 1,0% em peso e 2,0% em peso. Alternativamente, o produto de leite fermentado pode ser um produto com alto teor de proteína com um nível de proteína acima de 3,5% em peso.
[0083] A presente invenção refere-se ainda ao uso em um processo para produzir um produto de leite fermentado compreendendo as etapas de adicionar uma cultura iniciadora compreendendo pelo menos uma cepa de bactéria do ácido láctico a uma base de leite, e fermentar o leite por um período de tempo até que um pH- alvo seja atingido, de a cultura iniciadora compreendendo pelo menos uma cepa deficiente em lactose, a qual é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e uma lactase estável em pH baixo adicionada ao processo ou no início, durante ou no final da etapa de fermentação, onde a lactase estável em pH baixo retém sua atividade em um pH de 5,0 e uma temperatura de 37°C em um nível de pelo menos 5% comparado com sua atividade no pH ótimo da lactase.
[0084] Em relação à presente invenção, a definição que segue se aplica:
[0085] "LAU" significa "Unidades de Lactose" e 1 unidade de lactase (LAU) é a quantidade de enzima que libera 1 micromole de glicose por minuto em tampão M em pH 6,5 e 37°C com uma concentração de lactose de 4,75% p/v. Tampão M é preparado dissolvendo 3,98 g de C6H5Na3O7-2H2O, 8,31 g de ácido cítrico, 0,9 g de K2SO4, 2,6 g de K2HPO4, 7,35 g de KH2PO4, 5,45 g de KOH, 4,15 g de MgCl2-6H2O, 3,75 g de CaCl2-2H2O e 1,4 g de NaHCO3 em 4 litros de água, adicionando 12,5 ml de NaOH 4N, ajustando o pH para 6,5 usando HCl e adicionando água até um volume total de 5 litros.
[0086] A atividade em LAU de uma lactase específica pode ser determinada através de medição direta de glicose liberada a partir de lactose sob as condições descritas acima. O versado na técnica saberá como determinar tal atividade. Alternativamente, a atividade pode ser determinada usando o ensaio de atividade de lactase descrito no Exemplo 1 do presente pedido. Aqui, a atividade é obtida comparando a uma curva padrão realizada com uma lactase de atividade conhecida, e a atividade da amostra desconhecida calculada a partir disso. A lactase de atividade conhecida pode, por exemplo, ser Lactozym obtida da Novozymes A/S, Dinamarca.
[0087] A expressao "tratamento térmico" significa qualquer tratamento usando qualquer temperatura, por qualquer período de tempo e através de qualquer meio ou equipamento, que inative pelo menos uma porção das bactérias na cultura iniciadora. Em relação a isso, o termo "inativar" significa qualquer parada, redução ou inibição de crescimento das bactérias, por exemplo, lise de célula.
[0088] A expressão "bactérias do ácido láctico" ("LAB") designa uma bactéria microaerofílica ou anaeróbica, gram-positiva, que fermenta açúcares com a produção de ácidos incluindo ácido láctico como o ácido predominantemente produzido, ácido acético e ácido propiônico. As bactérias do ácido láctico industrialmente mais úteis são encontradas na ordem "Lactobacillales" que inclui Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. e Propionibacterium spp. Essas são frequentemente usadas como culturas alimentícias sozinhas ou em combinação com outras bactérias do ácido láctico.
[0089] Bactérias do ácido láctico, incluindo bactérias da espécie Lactobacillus sp. e Lactotoccus sp., são normalmente fornecidas para a indústria de laticínios ou como culturas congeladas ou secas por congelamento para propagação inicial em massa ou como as chamadas culturas "Direc Vat Set" (DVS), pretendidas para inoculação direta em um recipiente ou tanque de fermentação para a produção de um produto lácteo, tal como um produto de leite fermentado ou um queijo. Tais culturas bacterianas de ácido láctico são em geral referidas como "culturas iniciadoras" ou "iniciadoras". Tipicamente, uma cultura iniciadora para iogurte compreende Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, e na maioria dos países um iogurte é por legislação definido como um produto de leite fermentado produzido usando uma cultura iniciadora compreendendo as duas ditas cepas.
[0090] O termo "leite" deve ser compreendido como a secreção láctea obtida através de ordenha de qualquer mamífero, tais como vacas, ovelha, cabras, búfalos ou camelos. Em uma modalidade preferida, o leite é leite de vaca. O termo leite também inclui soluções de proteína/gordura feitas de materiais de planta, por exemplo, leite de soja.
[0091] O termo "base de leite" pode ser qualquer material de leite bruto e/ou processado que possa ser submetido à fermentação de acordo com o método da invenção. Desta maneira, bases de leite úteis incluem, mas não estão limitadas a, soluções/suspensões de qualquer leite ou produtos do tipo leite compreendendo proteína, tais como leite integral ou com baixo teor de gordura, leite desnatado, soro de leite coalhado, leite em pó reconstituído, leite condensado, leite em pó, soro, permeado de soro, lactose, licor mãe de cristalização de lactose, concentrado de proteína do soro ou creme. Obviamente, a base de leite pode se originar de qualquer mamífero, por exemplo, sendo leite de mamífero substancialmente puro, ou leite em pó reconstituído.
[0092] Antes da fermentação, a base de leite pode ser homogeneizada e pasteurizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0093] "Homogeneização" como aqui usado significa mistura intensiva para obter uma suspensão ou emulsão solúvel. Se homogeneização for realizada antes da fermentação, ela pode ser realizada de modo a quebrar a gordura do leite em tamanhos menores de modo que ela não se separe mais do leite. Isso pode ser realizado forçando o leite em alta pressão através de orifícios pequenos.
[0094] "Pasteurização" como aqui usado significa tratamento da base do leite para reduzir ou eliminar a presença de organismos vivos, tais como micro-organismos. Preferivelmente, pasteurização é conseguida através da manutenção de uma temperatura especificada por um período de tempo especificado. A temperatura especificada é geralmente atingida através de aquecimento. A temperatura e a duração podem ser selecionadas a fim de matar ou inativar certas bactérias, tais como bactérias prejudiciais. Uma etapa de resfriamento rápido pode seguir.
[0095] "Fermentação" nos métodos da presente invenção significa a conversão de carboidratos em álcoois ou ácidos através da ação de um micro-organismo. Preferivelmente, fermentação nos métodos da invenção compreende conversão de lactose em ácido láctico.
[0096] Processos de fermentação a serem usados na produção de produtos lácteos são bem conhecidos e o versado na técnica saberá como selecionar condições de processo adequadas, tais como temperatura, oxigênio, quantidade e características de micro- organismo(s) e tempo de processo. Obviamente, condições de fermentação são selecionadas de modo a apoiar a realização da presente invenção, isto é, obter um produto lácteo em forma sólida (tal como um queijo) ou líquida (tal como um produto de leite fermentado).
[0097] O uso dos termos "um" e "uma" e "o" e "a" e referentes similares no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações que seguem) deve ser considerado compreender ambos o singular e o plural, a menos que de outro modo indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser considerados como termos abertos (isto é, significando "incluindo, mas não limitado a") a menos que de outro modo mencionado. Menção de faixas de valores aqui pretende apenas servir como um método de abreviação de referência individualmente a cada valor separado dentro da faixa, a menos que de outro modo aqui indicado, e cada valor separado é incorporado ao relatório como se fosse individualmente aqui mencionado. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que de outro modo indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") provida aqui, pretende apenas iluminar melhor a invenção e não impõe uma limitação ao escopo da invenção a menos que de outro modo reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório deve ser considerada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.
[0098] A expressão "produto de leite fermentado" significa um alimento ou produto alimentício onde a preparação do alimento ou produto alimentício envolve fermentação de uma base de leite com uma bactéria do ácido láctico. "Produto de leite fermentado" como aqui usado inclui, mas não é limitado a, produtos tais como produtos de leite fermentado termofílicos, por exemplo, iogurte, produtos de leite fermentado mesofílicos, por exemplo, creme azedo e soro de leite coalhado, bem como soro fermentado.
[0099] O termo "termófilo" aqui refere-se a micro-organismos que crescem melhor em temperaturas acima de 35°C. As bactérias termofílicas industrialmente mais úteis incluem Streptococcus spp. e Lactobacillus spp. O termo "fermentação termofílica" aqui refere-se à fermentação em uma temperatura acima de cerca de 35°C, tal como entre cerca de 35°C a cerca de 45°C. O termo "produto de leite fermentado termofílico" refere-se a produtos de leite fermentado preparados através de fermentação termofílica de uma cultura iniciadora termofílica e incluem tais produtos de leite fermentado como iogurte endurecido, iogurte batido e iogurte para beber, por exemplo, Yakult.
[00100] O termo "mesófilo" refere-se aqui a micro-organismos que crescem melhor em temperaturas moderadas (15°C-35°C). As bactérias mesofílicas industrialmente mais úteis incluem Lactococcus spp. e Leuconostoc spp. O termo "fermentação mesofílica" aqui refere-se à fermentação em uma temperatura entre cerca de 22°C e cerca de 35°C. O termo "produto de leite fermentado mesofílico" refere-se a produtos de leite fermentado preparados através de fermentação mesofílica de uma cultura iniciadora mesofílica e inclui tais produtos de leite fermentado como soro de leite coalhado, leite azedo, leite culturado, Smetana, creme azedo, Kefir e queijo fresco, tais como Quark, Tvarog e queijo cremoso.
[00101] Em relação à presente invenção, "estresse de cisalhamento" pode ser medido através do método que segue:
[00102] sete dias após a produção, o produto de leite fermentado foi trazido para 13°C e agitado manualmente suavemente por meio de uma colher (5 vezes) até homogeneidade da amostra. As propriedades reológicas da amostra foram avaliadas em um reômetro (Anton Paar Physica Rheometer with ASC, Automatic Sample Changer, Anton Paar® GmbH, Austria) usando um bob-cup. O reômetro foi ajustado para uma temperatura constante de 13°C durante o momento da medição. Os ajustes foram como segue:
[00103] 5 minutos sem nenhum estresse físico (oscilação ou rotação) aplicado à amostra.
[00104] Etapa de oscilação (medir os módulos elástico e viscoso, G’ e G"), respectivamente, desta maneira calculando o módulo complexo G*)
[00105] Tensão constante = 0,3%, frequência (f) = [0,5...8] Hz
[00106] 6 pontos de medição durante 60 s (um a cada 10 s)
[00107] Etapa de rotação (para medir estresse de cisalhamento a 300 1/s)
[00108] Duas etapas foram projetadas:
[00109] Taxa de cisalhamento = [0,3-300] 1/s e 2) Taxa de cisalhamento = [275-0,3] 1 s.
[00110] Cada etapa continha 21 pontos de medição durante 210 s (a cada 10 s).
[00111] O estresse de cisalhamento a 300 1/s foi escolhido para análise adicional, uma vez que se relaciona à espessura da boca quando engolindo um produto de leite fermentado.
[00112] Em relação à presente invenção, "firmeza do gel" pode ser medida através do método que segue:
[00113] a firmeza do gel é medida através de um teste de retroextrusão com um analisador de textura (TA.XT Plus, Stable Micro System, Surrey, RU) fornecido com uma placa paralela de 35 mm. A distância de percurso é ajustada para 15 mm e a velocidade de percurso para 2 mm/s. O teste é realizado após 7 dias a partir da produção. O produto de leite fermentado foi trazido para 13°C e manualmente agitado suavemente e medido em um recipiente plástico de 250 g. A força máxima (N ou g) obtida pelas curvas de força versus distância é usada como parâmetro de "firmeza de gel", a área positiva (N*mm) como grau de deformação, a força negativa máxima (N) como formação de goma.
[00114] O termo "lactase estável em pH baixo" aqui refere-se a uma lactase que retém sua atividade em um pH de 5,0 e uma temperatura de 37°C em um nível de pelo menos 5% comparado com sua atividade no pH ótimo da lactase.
[00115] O termo "atividade no pH ótimo" significa a atividade de lactase no pH onde a lactase tem sua atividade ótima.
[00116] O termo "carboidrato não lactose" significa qualquer carboidrato, que não é lactose, e que é uma bactéria do ácido láctico deficiente em lactose usada no processo da invenção que é capaz de metabolização.
[00117] A expressao "no início da etapa de fermentação" significa um pouco antes, ao mesmo tempo que ou um pouco após a adição da cultura iniciadora à base de leite. Aqui, o termo "um pouco antes" significa menos de 30 minutos".
[00118] A expressão "durante a etapa de fermentação" significa em qualquer momento durante a fermentação após o início e antes do final da fermentação.
[00119] A expressão "no final da etapa de fermentação" significa um pouco antes, ao mesmo tempo que ou um pouco após o pH-alvo ter sido atingido. Aqui, o termo "um pouco" significa menos de 30 minutos".
[00120] O termo "pH-alvo" significa o pH no qual a etapa de fermentação termina. Dependendo dos vários parâmetros do processo, a etapa de fermentação é terminada através de um método selecionado do grupo consistindo em 1) acidificação do leite fermentado tornando pelo menos uma cepa da cultura iniciadora incapaz de crescer, 2) tratamento de resfriamento e 3) depleção do carboidrato não lactose.
[00121] O Requerente solicita que uma amostra do micro-organismo depositado seja disponibilizada apenas para um especialista aprovado pela Requerente.
[00122] A cepa de Streptococcus thermophilus depositada com o DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o número de acesso DSM 28952.
[00123] Cepa de Streptococcus thermophilus depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o número de acesso DSM 28953.
[00124] Cepa de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus depositada com o DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-062014 sob o número de acesso DSM 28910.
[00125] Os depósitos foram feitos de acordo com o Tratado de Budapeste sob reconhecimento internacional do depósito de microorganismos para os propósitos de procedimento de patente.
[00126] Ensaio de atividade de lactase em tubos Eppendorf a 37°C, pH 6,5.
[00127] Lactase hidrolisa lactose em glicose e galactose. A glicose é medida após uma versão modificada do ensaio de glicose oxidase/peroxidase comum (Werner, W. e outros (1970) Z. analyt. Chem. 252: 224.).
[00128] LAU é definida como a quantidade de enzima liberando 1 micromole de glicose por min a 37°C, pH 6,5 em tampão M (tampão M é definido na descrição do presente pedido de patente). Alternativamente, a atividade em LAU para uma lactase específica pode ser determinada através do método descrito aqui. O valor obtido é comparado com uma curva padrão realizada com uma lactase de atividade conhecida, e a atividade da amostra desconhecida calculada a partir disso. A lactase de atividade conhecida pode, por exemplo, ser Lactozym obtida da Novozymes A/S, Dinamarca.
[00129] Tampão de ensaio: succinato 50 mM, HEPES 50 mM, CHES 50 mM, KCl 150 mM, CaCl2 2 Mm, MgCl2 1 Mm, Triton X100 0,01%, pH 6,5.
[00130] Solução GOD-Perid: fosfato de sódio 65 mM, pH 7, Glicose oxidase 0,4 g/l, HRP 0,013 g/l (Peroxidase de Rábano Silvestre), ABTS 0,65 g/l (ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico).
[00131] Lactose 160 mM, succinato 50 mM, HEPES 50 Mm, CHES 50 mM, KCl 150 mM, CaCl2 2 Mm, MgCl2 1 Mm, pH 6,5.
[00132] Lactozym (disponível da Novozymes A/S, Dinamarca) com uma atividade conhecida em LAU/g é usada como padrão, diluída em tampão de ensaio na faixa de a partir de 0,09-0,7 LAU/g.
[00133] Amostras de enzima são diluídas apropriadamente em tampão de ensaio.
[00134] 375 μl de substrato são incubados 5 minutos a 37°C
[00135] 25 μl de enzima diluídos em tampão de ensaio são adicionados.
[00136] A reação é parada após 30 minutos através da adição de 60 μl de NaOH 1N
[00137] 20 μl são transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços e 200 μl de solução GOD-Perid são adicionados. Após 30 minutos em temperatura ambiente, a absorbância é medida a 420 nm.
[00138] 100 ml de 15 ou 30% (p/p) de permeado do soro contendo principalmente lactose e íons foram feitos misturando 15 ou 30 g de pó de permeado do soro seco por pulverização (Variolac, Arla) em 85 ou 70 ml de água iônica, respectivamente. A solução foi despejada em um frasco contendo uma barra de agitação magnética e posta em um banho de água a 37°C. Após 15 min, a enzima foi adicionada. As enzimas testadas foram Lactozym, uma lactase comercialmente disponível da Novozymes A/S, Dinamarca, tendo uma atividade de 3060 LAU/g e uma lactase experimental da Bifidobacterium bifidum tendo a sequência codificada mostrada na SEQ ID NO: 2 e uma atividade de 295 LAU/g.
[00139] As dosagens foram 4225 LAU/l de leite de Lactozym e 2025 LAU/l de leite da lactase de Bifidobacterium. Amostras de leita foram obtidas em intervalos regulares até 5,5 horas e a enzima foi inativada aquecendo para 99°C por 10 min em um termomisturador. As amostras foram diluídas apropriadamente e filtradas em um filtro de 0,20 μm.
[00140] Hidrólise de lactose foi medida usando um Dionex BioLC equipado com uma coluna Dionex PA1 e um Pulsed Amperiometrisk Detektor (PAD). Os picos foram identificados e quantificados comparando com padrões conhecidos de lactose, glicose e galactose.
[00141] Os resultados são dados abaixo: Tabela 1. Lactose, glicose e galactose em 15% de permeado de soro DS após tratamento com Lactozym ou lactase de Bifidobacterium. Tabela 2. Lactose, g icose e galactose em 30% de permeado de soro DS após tratamento com Lactozym ou lactase de Bifidobacterium
[00142] Também quando testado em concentrações de lactose maiores como em 15% ou 30% de permeado do soro, poucos ou pouquíssimos galacto-oligossacarídeos são produzidos. Novamente, os níveis de galactose e glicose produzidos são iguais e correspondentes à quantidade de lactose hidrolisada. Para comparação, Lactozym produz menos galactose do que glicose, mostrando claramente que galacto-oligossacarídeos foram produzidos.
[00143] Perfil de pH (a 37°C) e perfil de temperatura (em pH 6,5) da lactase experimental de Bifidobacterium bifidum usando lactose como substrato.
[00144] Lactase hidrolisa lactose e glicose + galactose é formada. A glicose é medida após uma versão modificada do ensaio de glicose oxidase/peroxidase comum (Werner, W. e outros (1970) Z. analyt. Chem. 252: 224.)
[00145] Lactose 167 mM, succinato 50 mM, HEPES 50 mM, CHES 50 mM, KCl 150 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM e o pH ajustado para pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 com NaOH.
[00146] Lactase experimental de Bifidobacterium bifidum tendo a sequência codificada mostrada na SEQ ID NO: 2 foi diluída apropriadamente em KCl 150 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, Triton X100 0,01%. Procedimento: • 10 μl de amostra de enzima diluídos em tampão de diluição de enzima foram adicionados a tubos de PCR em temperatura ambiente. • 90 μl de substrato foram adicionados em temperatura ambiente e rapidamente postos em um Peltier Thermal Cycler (PCT- 200, MJ research) a 37°C e incubados por 30 min e então postos em gelo. • A reação foi parada através da adição de 100 μl de NaOH 0,25 M. • 20 μl foram transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços e 230 μl de fosfato de sódio 65 mM, pH 7, Glicose oxidase 0,4 g/l, HRP 0,013 g/l, solução de ABTS 0,65 g/l foram adicionados. Após 30 minutos em temperatura ambiente, a absorbância foi medida a 420 nm. Tabela 3
[00147] Lactose 167 mM, succinato 50 mM, HEPES 50 mM, CHES 50 mM, KCl 150 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM e pH ajustado para pH 6,5 com NaOH.
[00148] Lactase experimental de Bifidobacterium bifidum tendo a sequência codificada mostrada na SEQ ID NO: 2 foi diluída apropriadamente em succinato 50 mM, HEPES 50 mM, CHES 50 mM, KCl 150 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, Triton X100 0,01% e pH ajustado para pH 6,5. Procedimento: • 10 μl de amostra de enzima diluídos em tampão de diluição de enzima foram adicionados a tubos de PCR em temperatura ambiente. • 90 μl de substrato preaquecido (em um Peltier Thermal Cycler 30-70°C) foram adicionados e incubação foi realizada com um gradiente de temp. de a partir de 30-70°C por 30 min e então postos em gelo. • A reação foi parada adicionando 100 μl de NaOH 0,25 M. • 20 μl foram transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços e 230 μl de fosfato de sódio 65 mM, pH 7,0, Glicose oxidase 0,4 g/l, HRP 0,013 g/l, solução de ABTS 0,65 g/l foram adicionados. Após 30 minutos em temperatura ambiente, a absorbância foi medida a 420 nm. Tabela 4
[00149] Determinação de Km para enzimas de lactase a 5°C.
[00150] Lactase hidrolisa lactose e glicose + galactose é formada. Glicose é medida após uma versão modificada do ensaio de glicose oxidase/peroxidase comum (Werner, W. e outros (1970) Z. analyt. Chem. 252: 224.)
[00151] Concentrações de lactose diferentes variando de Km/5 a 10* Km, succinato 50 mM, HEPES 50 mM, CHES 50 mM, KCl 150 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM e o pH ajustado para pH 6,5 com NaOH.
[00152] Lactase experimental de Bifidobacterium bifidum tendo a sequência codificada mostrada em SEQ ID NO: 2 foi diluída apropriadamente em succinato 50 mM, HEPES 50 mM, CHES 50 mM, KCl 50 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, Triton X100 0,01%, pH ajustado para pH 6,5 com NaOH.
[00153] 12 g/l de Lactozym (lactase comercialmente disponível da Novozymes A/S, Dinamarca) foram diluídos 6000 vezes no mesmo tampão. Procedimento: • 10 μl de amostra de enzima (5°C) foram adicionados a uma placa de microtitulação de 96 poços em gelo. • 90 μl de substrato (5°C) foram adicionados e incubados por 2 horas a 5°C. • A reação foi parada adicionando 100 μl de NaOH 0,25 M. - 20 μl foram transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços e 230 μl de fosfato de sódio 65 mM, pH 7, Glicose oxidase 0,4 g/l, HRP 0,013 g/l, solução de ABTS 0,65 g/l foram adicionados. Após 30 minutos em temperatura ambiente, a absorbância foi medida a 420 nm.
[00154] Ajuste de quadrados mínimos não linear computadorizado e a equação Michaelis-Menten v = (Vmax*S)/(Km + S) foram usados. Km para lactase de Bifidobacterium e Lactozym foram determinadas ser 8 nM e 30 nM, respectivamente.
[00155] Em um teste similar realizado a 37°C, Km para a lactase de Bifidobacterium e Lactozym foram determinadas ser 13 mM e 30 mM, respectivamente.
[00156] Produção de iogurte usando lactase de Bifidobacterium bifidum e uma cultura iniciadora deficiente em lactose - Níveis diferentes de sacarose e lactase.
[00157] Para a combinação selecionada de uma lactase estável em pH baixo e uma cultura iniciadora deficiente em lactose, dois níveis de sacarose adicionada (0,5% e 0,7%) e dois níveis de lactase adicionada (800 LAU/L e 1000 LAU/L) foram testados. Como referência fermentações sem nenhuma lactase adicionada e dois níveis de sacarose (1,0% e 1,5%) foram realizadas. A lactase foi adicionada no início da fermentação junto com a cultura iniciadora. Base de Leite Tabela 5. Composição de base de leite
[00158] A cultura iniciadora é composta de cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob o número de acesso DSM 28952, cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob o número de acesso DSM 28953 e cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus depositada sob o número de acesso DSM 28910.
[00159] Lactase de Bifidobacterium bifidum tendo a sequência codificada de SEQ ID NO: 2.
[00160] Níveis de gordura, proteína e lactose foram determinados usando análise MilkoScan. Pós-acidificação foi medida durante um período de 28 dias de armazenamento a 5°C. O nível de sacarose, glicose, galactose, frutose e lactose no leite fermentado no dia 1 e dia 14 após produção foi medido através de HPLC.
[00161] A firmeza do gel é medida através de um teste de retroextrusão com um analisador de textura (TA.XT Plus, Stable Micro System, Surrey, RU) fornecido com uma placa paralela de 35 mm. A distância de trajeto é ajustada para 15 mm, e a velocidade de trajeto para 2 mm/s. O teste é realizado após 7 dias a partir da produção. O produto de leite fermentado foi trazido para 13°C e manualmente agitado suavemente, e medido em um recipiente plástico de 250 g. A força máxima (g) obtida pelas curvas de força versus distância é usada como parâmetro de "firmeza do gel".
[00162] Sete dias após incubação, o produto de leite fermentado foi trazido para 13°C e manualmente agitado suavemente por meio de uma colher (5 vezes) até homogeneidade da amostra. As propriedades reológicas da amostra foram avaliadas em um reômetro (Anton Paar Physica Rheometer with ASC, Automatic Sample Changer, Anton Paar® GmbH, Áustria) usando um bob-cup. O reômetro foi ajustado para uma temperatura constante de 13°C durante o momento de medição. Os ajustes foram como segue: Tempo de espera (para reconstruir para um pouco da estrutura original) 5 minutos sem nenhum estresse físico (oscilação ou rotação) aplicado à amostra. Etapa de oscilação (medir os módulos elástico e viscoso, G’ e G", respectivamente, desta maneira calculando o módulo complexo G*) Tensão constante = 0,3%, frequência (f) = [0,5...8] Hz 6 pontos de medição durante 60 s (um a cada 10 s) Etapa de rotação (para medir estresse de cisalhamento a 300 1/s) Duas etapas foram planejadas: 1) Taxa de cisalhamento = [0,3-300] 1/s e 2) Taxa de cisalhamento = [275-0,3] 1 s.
[00163] Cada etapa continha 21 pontos de medição durante 210 s (a cada 10 s).
[00164] O estresse de cisalhamento a 300 1/s foi escolhido para análise adicional, uma vez que se relaciona à espessura da boca quando engolindo um produto de leite fermentado.
[00165] Os ingredientes da base de leite foram misturados e deixados reidratar por 2 horas a 5°C. A base de leite foi então pasteurizada a 90°C por 20 minutos. A fermentação foi realizada a 43°C para um pH final de 4,55 para formar iogurte. O iogurte foi esfriado em uma PTU (Unidade de Pós-tratamento) em uma temperatura de resfriamento de 25°C em 2 bars. O iogurte resfriado foi armazenado a 6°C. Resultados Pós-acidificação Tabela 6. Pós-acidificação
[00166] Para todas as seis amostras, isto é, 2 amostras de referência e 4 amostras produzidas de acordo com a invenção (amostras de teste), um pH de cerca de 4,55 foi atingido em 7 horas.
[00167] Como será aparente a partir da Tabela 6, a pós-acidificação durante um período de 28 dias foi fortemente reduzida para a amostra produzida de acordo com a invenção comparado com as amostras de referência. Análise de carboidrato Tabela 7. Níveis de carboidrato residuais após 1 dia a partir da produção * valor está entre Limite de Detecção e Limite de Quantificação.
[00168] Todos os níveis da Tabela 7 são valores médios de duas amostras.
[00169] Para as 4 amostras de teste, no final da fermentação o nível de lactose era muito baixo e o nível de glicose e galactose era muito alto comparado com amostras de referência indicando atividade alta da lactase adicionada. Para as amostras de teste usando um nível de lactase de 1000 LAU/L um nível de lactose residual de aproximadamente 0,04% foi obtido, e para as amostras de teste usando um nível de lactase de 800 LAU/L um nível de lactose residual de aproximadamente 0,1% foi obtido.
[00170] Leite fermentado tendo um nível de lactose baixo e um nível de glicose e galactose alto tem um nível muito maior de doçura percebida do que leite fermentado com um nível de lactose alto e um nível de glicose e galactose baixo tal como as amostras de referência. A razão para isso é que a glicose e a galactose têm um índice de doçura muito maior do que a lactose. Firmeza do gel Tabela 8: firmeza do gel
[00171] Todos os níveis da Tabela 8 são valores médios de duas amostras.
[00172] Como será aparente a partir da Tabela 8, 3 de 4 amostras de teste tinham firmeza de gel significantemente maior do que as 2 amostras de referência. Estresse de cisalhamento Tabela 9: estresse de cisalhamento medido a 300 s-1
[00173] Todos os níveis da Tabela 9 são valores médios de duas amostras.
[00174] Como será aparente a partir da Tabela 9, as 4 amostras de teste tinham estresse de cisalhamento significantemente maior medido a 300 s-1 do que as 2 amostras de referência. No grupo de 4 amostras de teste, as combinações de 1) um nível de sacarose adicionada de 0,5% e um nível de lactase de 1000 LAUL/L e 2) um nível de sacarose adicionada de 0,7% e um nível de lactase de 800 LAU/L tinham o estresse de cisalhamento mais alto.
[00175] Produção de iogurte usando lactase de Bifidobacterium bifidum e uma cultura iniciadora deficiente em lactose - adição de nível em excesso de sacarose antes da fermentação I
[00176] As fermentações foram realizadas com uma amostra de referência não contendo nenhuma lactase e sacarose 9,5% e 2 amostras de teste contendo 800 LAU/L de lactase e 6,5% e 7,0% de sacarose. A lactase foi adicionada no início da fermentação junto com a cultura iniciadora. Base de leite Tabela 10. Composição de base de leite básica 1 Tabela 11. Composição de base de lei1 te básica 2
[00177] A base de leite básica 2 foi usada para preparar as bases de leite finais para a amostra de referência e as duas amostras de teste através da adição de mais sacarose.
[00178] A cultura iniciadora é composta de cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob o número de acesso DSM 28952, cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob o número de acesso DSM 28953 e cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus depositada sob o número de acesso DSM 28910.
[00179] Lactase de Bifidobacterium bifidum tendo a sequência codificada de SEQ ID NO: 2.
[00180] Todas as medições foram realizadas usando os mesmos métodos que no Exemplo 5.
[00181] Os ingredientes da base do leite foram misturados e deixados reidratar por 2 horas a 5°C. A base de leite foi então pasteurizada a 95°C por 5 minutos. A base do leite foi então homogeneizada a 65°C a 200 bar. A fermentação foi realizada a 43°C para um pH final de 4,55 para formar iogurte. O iogurte foi esfriado em uma PTU (Unidade Pós-tratamento) em uma temperatura de resfriamento de 25°C a 2 bars. O iogurte resfriado foi armazenado a 6°C. Resultados Pós-acidificação Tabela 12. Pós-acidificação Tabela 12 (continuação) Análise de carboidrato Tabela 13. Análise de carboidrato
[00182] Todos os níveis da Tabela 13 são valores médios de duas amostras.
[00183] Como será aparente a partir da Tabela 13, para as 2 amostras de teste, no final da fermentação o nível de lactose foi muito baixo e o nível de glicose e galactose foi muito alto comparado com a amostra de referência indicando atividade alta da lactase adicionada.
[00184] Leite fermentado tendo um nível de lactose baixo e um nível de glicose e galactose alto tem um nível muito maior de doçura do que o leite fermentado com um nível de lactose alto e um nível de glicose e galactose baixo tais como as amostras de referência. A razão para isso é que glicose e galactose têm uma doçura muito maior do que lactose. Firmeza do gel e estresse de cisalhamento Tabela 14. Firmeza do gel e estresse de cisalhamento a 300 s-1
[00185] Como será aparente a partir da Tabela 14, o estresse de cisalhamento a 300 s-1 das duas amostras contendo lactase foi significantemente aumentado comparado com a amostra de referência sem nenhuma lactase.
[00186] Produção de iogurte usando lactase de Bifidobacterium bifidum e uma cultura iniciadora deficiente em lactose - adição de nível em excesso de sacarose antes da fermentação II
[00187] As fermentações foram realizadas com duas amostras de referência não contendo nenhuma lactase e 1,5% e 9,5% de sacarose e 3 amostras de teste contendo 1000 LAU/L de lactase e 0,5%, 6,5% e 7,0% de sacarose. A lactase foi adicionada ao início da fermentação junto com a cultura iniciadora.
[00188] As duas bases de leite básicas do Exemplo 6 foram usadas para preparar as bases de leite finais para as amostras de referência e as três amostras de teste através da adição de mais sacarose.
[00189] A cultura iniciadora é composta da cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob número de acesso DSM 28952, cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob número de acesso DSM 28953 e cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus depositada sob número de acesso DSM 28910.
[00190] Lactase de Bifidobacterium bifidum tendo uma sequência codificada de SEQ ID NO: 2.
[00191] Todas as medições foram realizadas usando os mesmos métodos que no Exemplo 5.
[00192] Os ingredientes da base de leite foram misturados e deixados reidratar por 2 horas a 5°C. A base de leite foi então pasteurizada a 90°C por 20 minutos. A fermentação foi realizada a 43°C para um pH final de 4,55 para formar iogurte. O iogurte foi resfriado em uma PTU (Unidade de Pós-tratamento) em uma temperatura de resfriamento de 25°C a 2 bars. O iogurte resfriado foi armazenado a 6°C. Resultados Pós-acidificação Tabela 15. Pós-acidificação
*A fermentação é parada através de resfriamento em pH = 4,55
[00193] Como será aparente a partir da Tabela 15, a pós-acidificação foi ao mesmo nível para as amostras de referência contendo nenhuma lactase e as amostras de teste contendo lactase. Análise de carboidrato Tabela 16: Análise de carboidrato Dia 1 Tabela 17. Análise de carboidrato Dia 28
[00194] Como será aparente a partir das Tabelas 16 e 17, para as 3 amostras de teste, no final da fermentação o nível de lactose era muito baixo e o nível de glicose e galactose era muito alto comparado à amostra de referência indicando atividade alta da lactase adicionada.
[00195] Leite fermentado tendo um nível de lactose baixo e um nível de glicose e galactose alto tem um nível muito maior de doçura do que o leite fermentado com um nível de lactose alto e um nível de glicose e galactose baixo tais como as amostras de referência. A razão para isso é que a glicose e a galactose têm uma doçura muito maior do que a lactose. Firmeza do gel e estresse de cisalhamento Tabela 18: firmeza do gel e estresse de cisalhamento
[00196] Como será aparente a partir da Tabela 18, o estresse de cisalhamento das três amostras de teste contendo lactase foi significantemente aumentado comparado com a amostra de referência sem nenhuma lactase.
[00197] Produção de iogurte usando lactase de Bifidobacterium bifidum e uma cultura iniciadora deficiente em lactose - adição de lactase antes e após fermentação Plano experimental Tabela 19. Plano experimental
[00198] A temperatura de fermentação foi 43°C. O pH final foi 4,50. Os ingredientes da base de leite foram misturados e deixados reidratar por 2 horas a 6°C. A base de leite foi então pasteurizada a 95°C por 5 minutos e homogeneizada a 200/50 bar a 65°C. A fermentação foi realizada a 43°C para um pH final de 4,50 para formar iogurte. O iogurte foi resfriado para 6°C. O iogurte resfriado por armazenado a 6°C.
[00199] A cultura iniciadora é composta de cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob o número de acesso DSM 28952, cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob o número de acesso DSM 28953 e cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus depositada sob o número de acesso DSM 28910.
[00200] Lactase de Bifidobacterium bifidum tendo a sequência codificada de SEQ ID NO: 2. Base de leite Tabela 20. Composição da base de leite 1 Tabela 21. Composição da base de leite 2
[00201] Todas as medições foram realizadas usando os mesmos métodos que no Exemplo 5. Resultados Pós-acidificação Tabela 22. Pós-acidificação *Sacarose insuficiente para obter fermentação para pH-alvo. Desta maneira, esta amostra não pode ser usada como referência
[00202] Como será aparente a partir da Tabela 22, a pós-acidificação durante um período de 42 dias foi em um nível baixo de menos de 0,09 para todos os níveis de lactase testados com adição de lactase no início da fermentação e em um nível ainda menor de menos de 0,05 para todos os níveis de lactase testados com adição de lactase no final da fermentação. A adição de lactase no final da fermentação não resultou em uma pós-acidificação estatisticamente diferente como comparado com a amostra de referência sem nenhuma lactase adicionada. Desta maneira, o presente experimento mostra que o uso de uma lactase estável em pH baixo em combinação com uma cultura iniciadora deficiente em lactose não resulta em um aumento inaceitável da pós- acidificação baixa, que pode ser obtido com tal cultura iniciadora. Isso é verdadeiro ambos quando a lactase é adicionada no início e no final da fermentação. Firmeza do gel e estresse de cisalhamento Tabela 23: firmeza do gel e estresse de cisalhamento *Sacarose insuficiente para obter fermentação para pH-alvo. Desta maneira, esta amostra não pode ser usada como referência
[00203] Como será aparente a partir da Tabela 23, níveis altos de ambos firmeza de gel e estresse de cisalhamento foram obtidos para todos os níveis de lactase testados com adição de lactase no início da fermentação. Para níveis de lactase testados com adição de lactase no final da fermentação, os níveis de firmeza de gel e estresse de cisalhamento são um pouco menores, o que é devido à mistura da lactase em iogurte, o que parcialmente rompe a textura do iogurte. Para todos os níveis de lactase testados com adição de lactase no final da fermentação, a firmeza do gel é ligeiramente maior do que a amostra de referência sem nenhuma lactase adicionada. Para todos os níveis de lactase testados com adição de lactase no final da fermentação, o estresse de cisalhamento é mantido no mesmo nível ou ligeiramente menor. Análise de carboidrato Tabela 24: análise de carboidrato
[00204] Como será aparente a partir d a Tabela 24, no Dia 20 concentrações altas de galactose e glicose são formadas para todos os níveis de lactase testados ambos com adição de lactase no início e no final da fermentação. Também, no Dia 20 o nível de glicose estava abaixo do limite de detecção de 0,5 mg/g, que qualifica como livre de lactose em alguns países. Para os níveis maiores de lactase, a maioria da remoção de lactose foi obtida 24 horas após o final da fermentação.
[00205] Produção de iogurte usando lactase de Bifidobacterium bifidum e uma cultura iniciadora deficiente em lactose - adição de lactase antes da fermentação II Plano experimental Tabela 25. Plano experimental
[00206] A temperatura de fermentação foi 43°C. O pH final foi 4,45. Os ingredientes da base de leite foram misturados e deixados reidratar por 2 horas a 6°C. A base de leite foi então pasteurizada a 95°C por 5 minutos e homogeneizada a 200/50 bar a 65°C. A fermentação foi realizada a 43°C para um pH final de 4,45 para formar iogurte. O iogurte foi resfriado para 5°C. O iogurte resfriado foi armazenado a 6°C.
[00207] A cultura iniciadora é composta de cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob número de acesso DSM 28952, cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob número de acesso DSM 28953 e cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp, bulgaricus depositada sob número de acesso DSM 28910.
[00208] Lactase de Bifidobacterium bifidum tendo a sequência codificada de SEQ ID NO: 2. Base de leite Tabela 26. Composição da base de leite
[00209] Todas as medições foram realizadas usando os mesmos métodos que no Exemplo 5. Resultados Tabela 27. Pós-acidificação
[00210] Como será aparente a partir da Tabela 27, a pós-acidificação durante um período de 42 dias foi em um nível muito baixo de aproximadamente 0,06 para todos os níveis de lactase e sacarose testados. Desta maneira, o presente experimento mostra que o uso de uma lactase estável em pH baixo em combinação com uma cultura iniciadora deficiente em lactose não resulta em um aumento inaceitável da pós-acidificação baixa, o que pode ser obtido com tal cultura iniciadora. Firmeza do gel e estresse de cisalhamento Tabela 28. Firmeza do gel e Estresse de cisalhamento
[00211] Como será aparente a partir da Tabela 28, níveis altos de ambos firmeza de gel e estresse de cisalhamento foram obtidos para todos os níveis de lactase testados. A firmeza do gel e o estresse de cisalhamento estão na mesma ordem de magnitude para todos os três níveis de lactase testados. Análise de carboidrato Tabela 29. Análise de carboidrato
[00212] Como será aparente a partir da Tabela 29, para as amostras de teste contendo lactase, no final da fermentação o nível de lactose era muito baixo e o nível de glicose e galactose era muito alto comparado com a amostra de referência indicando atividade alta da lactase adicionada.
[00213] Leite fermentado tendo um nível de lactose baixo e um nível de glicose e galactose alto tem um nível muito maior de doçura do que o leite fermentado com um nível de lactose alto e um nível de glicose e galactose baixo tais como as amostras de referência. A razão para isso é que a glicose e a galactose têm uma doçura muito maior do que a lactose. Listagem de Sequência SEQ ID NO.: 1 mostra a sequência de um mutante de SEQ ID NO. 4. SEQ ID NO.: 2 mostra a sequência de um mutante de SEQ ID NO. 4. SEQ ID NO.: 3 mostra a sequência de uma lactase de Bifidobacterium bifidum DSM20215. SEQ ID NO.: 4 mostra a sequência de uma lactase de Bifidobacterium bifidum NCIMB41171, cuja sequência de nucleotídeo é listada em NCBI com o número de acesso DQ448279. SEQ ID NO: 4 é discutida nas referências que seguem, onde ela é referida como bbgIII: Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:1365-1372, T. K., Goulas e outros Appl Microbiol Biotechnol (2009) 82:1079-1088, T., Goulas e outros Appl Microbiol Biotechnol (2009) 84:899-907, T., Goulas e outros
Claims (14)
1. Processo para produzir um produto de leite fermentado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: 1) adicionar uma cultura iniciadora compreendendo pelo menos uma cepa da bactéria do ácido láctico a uma base de leite, 2) fermentar o leite por um período de tempo até que um pH-alvo seja atingido, 3) em que a cultura iniciadora compreende pelo menos uma cepa deficiente em lactose, que é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e 4) adicionar uma lactase estável em pH baixo ao processo no início, durante ou no final da etapa de fermentação, em que a lactase estável em pH baixo retém sua atividade em um pH de 5,0 e uma temperatura de 37°C em um nível de pelo menos 5% comparado com sua atividade no pH ótimo da lactase.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a lactase estável em pH baixo retém sua atividade em uma temperatura de 10°C e um pH de 6,0 em um nível de pelo menos 10% comparado com sua atividade na temperatura ótima da lactase.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cepa deficiente em lactose é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose selecionado do grupo consistindo em sacarose, galactose e glicose.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que carboidrato não lactose é adicionado à base de leite no início da etapa de fermentação.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o carboidrato não lactose é adicionado à base de leite em uma quantidade medida de modo a se tornar depletado e desta maneira resultar na parada do crescimento de bactérias do ácido láctico e na parada da fermentação.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a lactase estável em pH baixo é adicionada à base de leite no início da etapa de fermentação.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que nenhum carboidrato não lactose é adicionado à etapa de fermentação, e em que pelo menos uma cepa do ácido láctico deficiente em lactose da cultura iniciadora é capaz de metabolizar um carboidrato selecionado do grupo consistindo em glicose e galactose.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a lactase estável em pH baixo é adicionada à base de leite no final da etapa de fermentação.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a cepa deficiente em lactose é selecionada do grupo consistindo em Streptococcus thermophilus deficiente em lactose e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus deficiente em lactose.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a cepa deficiente em lactose é selecionada do grupo consistindo em: (a) uma cepa de Streptococcus thermophiles, cuja cepa é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o número de acesso DSM 28952; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28952, em que a cepa derivada é tem ainda a habilidade em gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (b) uma cepa de Streptococcus thermophiles, cuja cepa é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob número de acesso DSM 28953; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28953, em que a cepa derivada tem ainda a habilidade de gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal; (c) uma cepa de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, cuja cepa é: (i) a cepa depositada com DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, em 12-06-2014 sob o número de acesso no. DSM 28910; (ii) ou uma cepa derivada de DSM 28910, em que a cepa derivada em ainda a habilidade em gerar colônias brancas em um meio contendo lactose e X-Gal.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a cultura iniciadora contém ambos pelo menos um Streptococcus thermophilus deficiente em lactose e pelo menos um Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaricus deficiente em lactose.
12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a cultura iniciadora contém ambos pelo menos um Streptococcus thermophilus e pelo menos um Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaricus, e em que todos os Streptococcus thermophilus e todos Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaricus são deficientes em lactose.
13. Uso em um processo para produzir um produto de leite fermentado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: 1) adicionar uma cultura iniciadora compreendendo pelo menos uma cepa de bactéria do ácido láctico a uma base de leite, e 2) fermentar o leite por um período de tempo até que um pH-alvo seja atingido, de 3) a cultura iniciadora compreendendo pelo menos uma cepa deficiente em lactose, a qual é capaz de metabolizar um carboidrato não lactose, e 4) uma lactase estável em pH baixo adicionada ao processo ou no início, durante ou no final da etapa de fermentação, em que a lactase estável em pH baixo retém sua atividade em um pH de 5,0 e uma temperatura de 37°C em um nível de pelo menos 5% comparado com sua atividade no pH ótimo da lactase.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para aumentar a textura do produto de leite fermentado comparado com o uso de bactérias do ácido láctico deficientes em lactose e nenhuma lactase e como comparado com uso de uma lactase estável em pH baixo e bactérias do ácido láctico positivas para lactose.
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|---|---|---|---|
| EP17151378.1 | 2017-01-13 | ||
| EP17151378 | 2017-01-13 | ||
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Publications (2)
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