EA045126B1 - Ферментированный молочный продукт с пониженным содержанием лактозы - Google Patents
Ферментированный молочный продукт с пониженным содержанием лактозы Download PDFInfo
- Publication number
- EA045126B1 EA045126B1 EA201892599 EA045126B1 EA 045126 B1 EA045126 B1 EA 045126B1 EA 201892599 EA201892599 EA 201892599 EA 045126 B1 EA045126 B1 EA 045126B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- lactase
- lactose
- product
- dairy product
- activity
- Prior art date
Links
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 title claims description 124
- 239000008101 lactose Substances 0.000 title claims description 123
- 235000021001 fermented dairy product Nutrition 0.000 title claims description 56
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 title description 10
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 270
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 claims description 261
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 claims description 261
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 claims description 260
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 96
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 claims description 63
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 63
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 63
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 63
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 claims description 54
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 51
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 claims description 50
- 239000005862 Whey Substances 0.000 claims description 49
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 46
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 46
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims description 42
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 40
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 37
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 32
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 28
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 24
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 24
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000933527 Bifidobacterium bifidum DSM 20215 Species 0.000 claims 1
- 241000933531 Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 Species 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 55
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 55
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 54
- 239000000047 product Substances 0.000 description 53
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 39
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 22
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 16
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 15
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 14
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 13
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 10
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 9
- 235000011868 grain product Nutrition 0.000 description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 8
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 description 8
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 7
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 7
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 7
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 7
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 7
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 7
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 7
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 7
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 7
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 7
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 5
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 description 5
- 235000010492 gellan gum Nutrition 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 5
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 description 4
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 4
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 4
- 235000015155 buttermilk Nutrition 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 4
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 3
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 3
- 235000021102 Greek yogurt Nutrition 0.000 description 3
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 235000020167 acidified milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 235000015142 cultured sour cream Nutrition 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 3
- 108010046301 glucose peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001134770 Bifidobacterium animalis Species 0.000 description 2
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 2
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 2
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 2
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000221696 Sclerotinia sclerotiorum Species 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 239000002535 acidifier Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021255 galacto-oligosaccharides Nutrition 0.000 description 2
- 150000003271 galactooligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000020122 reconstituted milk Nutrition 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2-[(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222518 Agaricus Species 0.000 description 1
- 244000251953 Agaricus brunnescens Species 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 241000567551 Ascovaginospora Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 241000892910 Aspergillus foetidus Species 0.000 description 1
- 241001480052 Aspergillus japonicus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241000223014 Bacillus novalis Species 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241001430332 Bifidobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000221955 Chaetomium Species 0.000 description 1
- 241000611330 Chryseobacterium Species 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 240000008990 Cyperus javanicus Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 description 1
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 1
- 241000935926 Diplodia Species 0.000 description 1
- 241000607473 Edwardsiella <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000607471 Edwardsiella tarda Species 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241001112724 Lactobacillales Species 0.000 description 1
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 description 1
- 235000013960 Lactobacillus bulgaricus Nutrition 0.000 description 1
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000178948 Lactococcus sp. Species 0.000 description 1
- 201000010538 Lactose Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 241000190144 Lasiodiplodia theobromae Species 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001149951 Mucor mucedo Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 1
- 102100040402 Phlorizin hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 240000000697 Pinguicula vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000186429 Propionibacterium Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000222644 Pycnoporus <fungus> Species 0.000 description 1
- 241001125156 Ramboldia stuartii Species 0.000 description 1
- 241000235402 Rhizomucor Species 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000872726 Rhizopus pusillus Species 0.000 description 1
- 241000235546 Rhizopus stolonifer Species 0.000 description 1
- 241000192031 Ruminococcus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000186988 Streptomyces antibioticus Species 0.000 description 1
- 241001337890 Streptomyces castaneoglobisporus Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000006364 Torula Species 0.000 description 1
- 241000222354 Trametes Species 0.000 description 1
- 241000222645 Trametes cinnabarina Species 0.000 description 1
- 241000042002 Trametes sanguinea Species 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 241000223238 Trichophyton Species 0.000 description 1
- 241000223229 Trichophyton rubrum Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 241001464870 [Ruminococcus] torques Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- -1 carbohydrate metabolites of lactose Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 235000020186 condensed milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000021105 fermented cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001310 hydroxy propyl distarch phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 235000015141 kefir Nutrition 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 description 1
- 235000020124 milk-based beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 235000009522 reduced-fat milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 235000008939 whole milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000020138 yakult Nutrition 0.000 description 1
- 235000008924 yoghurt drink Nutrition 0.000 description 1
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к кисломолочному продукту с пониженным содержанием лактозы.
Предшествующий уровень техники
В WO 2009/071539 раскрыта лактаза, происходящая из Bifidobacterium bifidum, которая способна к очень эффективному гидролизу в молоке, и которая является активной в широком интервале рН, включая низкий рН, например рН менее 5. Эта лактаза может использоваться в процессах производства молока и ферментированных молочных продуктов, таких как сыр, йогурт, масло, пахта, сметана и т.д., для уменеения содержания лактозы.
В WO 2013/160413 раскрыт способ производства ферментированного молочного продукта с использованием комбинации глюкозонегативных штаммов молочнокислых бактерий и традиционной лактазы с целью уменеения содержания лактозы в ферментированном молочном продукте при увеличении содержания глюкозы.
В ЕР-А1-2957180 раскрыт способ производства ферментированного молочного продукта с использованием комбинации заквасочных культур и традиционной лактазы с целью уменеения содержания лактозы и уровня последующего закисления в ферментированном молочном продукте.
Краткое изложение сущности изобретения
Целью настоящего изобретения является предложение улучшенного кисломолочного продукта с пониженным содержанием лактозы.
Цель настоящего изобретения достигается посредством кисломолочного продукта, который имеет рН от 3,0 до 5,0 и содержание лактозы по меньшей мере 1,5 мг/мл, где указанный продукт содержит лактазу, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН.
Настоящее изобретение предоставило возможность осуществления модификации лактозосодержащего пищевого продукта с рН от 3,0 до 5,0 в фазе хранения при температуре окружающей среды, т.е. без необходимости охлаждения, после завершения производства в месте производства, например, во время транспортировки и хранения на предприятии розничной торговли, таким образом, чтобы снизить уровень лактозы. Настоящее изобретение основано на признании того, что для продукта, имеющего низкий рН и предназначенного для транспортировки и хранения при температуре окружающей среды, например, ферментированных молочных продуктов после пастеризации, возможно осуществлять уменеение содержания лактозы после завершения производства в месте производства посредством добавления лактазы, активной при низком рН, и после завершения обычного способа производства пищевого продукта, и позволяя лактазе превращать лактозу в галактозу и глюкозу во время последующих фаз жизни продукта вплоть до его конечного потребления конечным потребителем. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает получение стадии превращения лактозы простым и рентабельным способом вне места производства, и, следовательно, способ производства ферментированного молочного продукта в месте производства может быть упрощен посредством исключения стадии завершения превращения лактозы, посредством этого сохраняя время жизни и производительность производственного оборудования.
Кроме того, при добавлении лактазы после термической обработки ферментированного молочного продукта можно использовать менеее количество лактазы, чем когда лактаза является активной во время ферментации, поскольку может обеспечиваться активность лактазы в течение длительного периода времени, в то время как в случае способа ферментации в производстве желательно осуществить этот способ как можно быстрее для того, чтобы снизить затраты. Большая часть лактазы будет инактивироваться во время термической обработки, и, следовательно, не будет активной после термической обработки. Таким образом, настоящее изобретение предоставило возможность уменеения количества лактазы, необходимой для достижения удаления лактозного содержимого ферментированного молочного продукта. Также, при добавлении лактазы после термической обработки ферментированного молочного продукта уровень реакции Майяра, вызванной термической обработкой ферментированного молочного продукта, снижается, так как лактоза приводит к реакции Майяра в меньшей степени, чем углеводные метаболиты лактозы. Наконец, при добавлении лактазы после термической обработки ферментированного молочного продукта можно избежать любого вредного эффекта молочнокислых бактерий, используемых при ферментации, на активность лактазы.
Во всем мире значительное число потребителей не переносят или являются чувствительными к лактозе. Следовательно, в настоящее время существует высокий спрос на молочные продукты, включая ферментированные молочные продукты, с пониженным содержанием лактозы, или которые по существу не содержат лактозу. В настоящем изобретении предложен новый подход для производства такого продукта простым и рентабельным способом.
Подробное описание изобретения
Лактаза.
Лактаза ферментированного молочного продукта по изобретению может представлять собой любую лактазу, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН.
- 1 045126
Согласно настоящему изобретению активность лактазы в LAU (единицах лактазной активности) измеряется, как определено в разделе Определения ниже.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения лактаза сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения лактаза сохраняет свою активность при рН 4,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5%, предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения лактаза сохраняет свою активность при рН 3,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5%, предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН.
Согласно настоящему изобретению оптимальный рН лактазы определяют посредством измерения лактазной активности при различных рН с использованием способа, указанного ниже в разделе Определения, и определения рН с оптимальной активностью. В частности, лактазную активность при разных рН измеряют в М-буфере и при 37°С. Альтернативно, лактазную активность, указанную в настоящей заявке как процентную долю от активности при оптимальном для лактазы рН, рассматривают как процентную долю лактазной активности при рН 6,5.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения лактаза сохраняет свою активность при температуре 10°С и рН 6,0 на уровне по меньшей мере 10%, по сравнению с ее активностью при оптимальной для лактазы температуре. Предпочтительно лактаза сохраняет свою активность при температуре 10°С и рН 6,0 на уровне по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% по сравнению с ее активностью при оптимальной для лактазы температуре.
Согласно настоящему изобретению оптимальную температуру лактазы определяют посредством измерения лактазной активности при различных температурах с использованием способа, указанного ниже в разделе Определения, и определения температуры с оптимальной активностью. Альтернативно, лактазную активность, указанную в настоящей заявке в виде процентной доли активности при оптимальной для лактазы температуре, рассматривают как процентную долю лактазной активности при температуре 37°С.
В предпочтительном воплощении лактаза, которая должна использоваться в продукте по настоящему изобретению, имеет лактазную активность при 37°С и рН 5, которая составляет по меньшей мере 55%, как, например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 75% от ее лактазной активности при 37°С и рН 6.
В другом предпочтительном воплощении лактаза, которая должна использоваться в продукте по настоящему изобретению, имеет лактазную активность при 37°С и рН 4,5, которая составляет по меньшей мере 10%, как, например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35% или по меньшей мере 40% от ее лактазной активности при 37°С и рН 6.
В другом предпочтительном воплощении лактаза, которая должна использоваться в продукте по настоящему изобретению, имеет оптимум рН лактазной активности при 37°С, который выше рН 5,5.
В другом предпочтительном воплощении лактаза, которая должна использоваться в продукте по настоящему изобретению, имеет лактазную активность при температуре 52°С и рН 6,5, которая составляет по меньшей мере 50%, как, например, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 80% от ее лактазной активности при температуре 38°С и рН 6,5.
В предпочтительном воплощении настоящего изобрения Km (константа Михаэлиса) лактазы при 5°С составляет менее 25 мМ, например менее 20 мМ, менее 15 мМ или менее 10 мМ. В другом предпочтительном воплощении Km лактазы при 37°С составляет менее 25 мМ, например менее 20 мМ или менее 15 мМ. Специалисту будет известно как определять Km для лактазной активности при конкретной температуре. Km может быть определена способом, описанным в WO 2009/071539.
В другом предпочтительном воплощении при гидролизе лактозы в молочном продукте данный фермент имеет отношение лактазной к трансгалактозилазной активности больше, чем 1:1, например больше, чем 2:1, или больше, чем 3:1. В другом предпочтительном воплощении ферментативную обра- 2 045126 ботку проводят в условиях, когда лактазная активность у фермента выше, чем трансгалактозилазная активность, например по меньшей мере в два раза выше или по меньшей мере в три раза выше.
Отношение лактазной к трансгалактозилазной активности в молочном продукте, например, может быть определено анализом HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография). В другом предпочтительном воплощении ферментативную обработку проводят в условиях, когда по меньшей мере 50% (% мас./мас.) гидролизованной лактозы превращается в свободную галактозу. В другом предпочтительном воплощении ферментативную обработку проводят в условиях, когда гидролизованная лактоза превращается в равные количества свободной глюкозы и свободной галактозы.
Лактаза в контексте настоящего изобретения представляет собой гликозидгидролазу, имеющую способность гидролизовать дисахарид лактозу на составляющие мономеры - галактозу и глюкозу. Группа лактаз, к которой принадлежит лактаза по изобретению, содержит ферменты, приписанные к подклассу ЕС 3.2.1.108, но не ограничивается ими. Ферменты, приписанные к другим подклассам, таким как, например, ЕС 3.2.1.23, также могут представлять собой лактазы в контексте настоящего изобретения. Лактаза в контексте настоящего изобретения может иметь другие активности, отличные от лактозогидролизующей активности, такие как, например, трансгалактозилирующая активность. В контексте настоящего изобретения лактозогидролизующая активность лактазы может называться ее лактазной активностью или ее бета-галактозидазной активностью.
Ферменты, имеющие лактазную активность, которые должны использоваться в способе по настоящему изобретению, могут иметь животное, растительное или микробное происхождение. Предпочтительные лактазы получают из микробных источников, в частности из нитчатого грибка, или дрожжей, или из бактерии.
Этот фермент, например, может происходить из штамма Agaricus, например А. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, например A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, например D. discoideum; Kluveromyces, например K. fragilis, K. lactis; Mucor, например М. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, например N. crassa; Rhizomucor, например R. pusillus; Rhizopus, например R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, например S. libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, например Т. rubrum; Whetzelinia, например W. sclerotiorum; Bacillus, например В. coagulans, В. circulans, В. megaterium, В. novalis, В. subtilis, В. pumilus, В. stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, например В. longum, В. bifidum, В. animalis; Chryseobacterium; dtrobacter, например С. freundii; Clostridium, например С. perfringens; Diplodia, например D. gossypina; Enterobacter, например E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, например Е. herbicola; Escherichia, например Е. coli; Klebsiella например, K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neurospora, например N. crassa; Proteus, например Р. vulgaris; Providencia, например Р. stuartii; Pycnoporus, например Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus, например R. torques; Salmonella, например S. typhimurium; Serratia, например S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, например S. flexneri; Streptomyces, например S. antibioticus, S. castaneoglobisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, например Т. reesei, Т. viride; Yersinia, например Y. enterocolitica.
В предпочтительном воплощении лактаза происходит из бактерии, например, из семейства Bifidobacteriaceae, например из рода Bifidobacterium, например из штамма В. bifidum, В. animalis или В. longum. В более предпочтительном воплощении лактаза происходит из Bifidobacterium bifidum.
В предпочтительном воплощении фермент, имеющий лактазную активность, который должен использоваться в продукте по настоящему изобретению, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 28-1931 SEQ ID NO: 1, аминокислот 28-1331 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и их фрагментов с лактазной активностью. В более предпочтительном воплощении фермент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 28-1931 SEQ ID NO: 1, аминокислот 28-1331 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и их фрагментам с лактазной активностью.
Предпочтительным ферментом является лактаза, имеющая последовательность, которая по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 28-1931 SEQ ID NO: 1 или ее фрагмент с лактазной активностью. Такой фрагмент SEQ ID NO: 1 с лактазной активностью может представлять собой любой фрагмент SEQ ID NO: 1, имеющий лактазную активность. Фрагмент SEQ ID NO: 1 с лактазной активностью, например, может представлять собой аминокислоты 28-979, аминокислоты 28-1170, аминокислоты 28-1323, аминокислоты 28-1331 или аминокислоты 28-1600 SEQ ID NO: 1.
В предпочтительном воплощении фермент, имеющий лактазную активность, который должен использоваться в продукте по настоящему изобретению, содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 50% идентичной аминокислотам 28-1331 SEQ ID NO: 2. В более предпочтительном воплощении этот фермент содержит аминокислотную последовательность, которая
- 3 045126 является по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичной аминокислотам 28-1331 SEQ ID NO: 2.
В другом воплощении фермент, имеющий лактазную активность, который должен использоваться в продукте по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 50% идентичной SEQ ID NO: 3. Предпочтительно этот фермент имеет аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичной SEQ ID NO: 3.
В другом воплощении фермент, имеющий лактазную активность, который должен использоваться в продукте по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 50% идентичной SEQ ID NO: 4. Предпочтительно данный фермент имеет аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичной SeQ ID NO: 4.
Для целей настоящего изобретения степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяется с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453) в том виде, в котором он осуществляется в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. (2000) Trends in Genetics 16: 276-277), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Необязательные используемые параметры представляют собой gap open penalty (штраф за открытие пробела) 10, gap extension penalty (штраф за удлинение пробела) 0,5 и матрица замен EBLOSUM62 (EMBOSS версия BLOSUM62).
В качестве процента идентичности используется вывод данных Needle, отмеченный как самая длинная идентичность (полученный при использовании опции - no brief (не короткий)), и он рассчитывается следующим образом:
(Идентичные остатки х 100)/(Длина выравнивания - Общее число пробелов в выравнивании)
Конкретной имеющейся в продаже лактазой, подходящей для применения в настоящем изобретении, является лактаза F Amano 100SD, доступная от Amano Enzyme Europe.
Лактазы, которые должны использоваться в способе по настоящему изобретению, могут быть внеклеточными. Они могут иметь сигнальную последовательность на их N-конце, которая отщепляется во время секреции.
Лактазы, которые должны использоваться в способе по настоящему изобретению, могут происходить из любых упомянутых здесь источников. Термин происходящий в данном контексте означает то, что фермент может быть выделен из организма, где он присутствует в природе, т.е. природа аминокислотной последовательности фермента является идентичной нативному ферменту. Термин происходящий также означает то, что ферменты возможно были рекомбинантно продуцированы в организмехозяине, причем рекомбинантно продуцированный фермент либо имеет природу, идентичную нативному ферменту, либо имеет модифицированную аминокислотную последовательность, например имеет одну или более чем одну аминокислоту, которая удалена, вставлена и/или заменена, т.е. представляет собой рекомбинантно продуцированный фермент, который является мутантом и/или фрагментом нативной аминокислотной последовательности. В пределы значения нативный фермент включены природные варианты. Кроме того, термин происходящий включает ферменты, продуцированные синтетически, например посредством пептидного синтеза. Термин происходящий также охватывает ферменты, которые были модифицированы, например посредством гликозилирования, фосфорилирования и т.д., либо in vivo, либо in vitro. В том, что касается рекомбинантно продуцированного фермента, термин происходящий из относится к природе фермента, а не к природе организма-хозяина, в котором он рекомбинантно продуцируется.
Лактаза может быть получена из микроорганизма посредством применения любой подходящей методики. Например, лактазный ферментативный препарат может быть получен посредством ферментации подходящего микроорганизма и последующего выделения препарата лактазы из образующегося ферментационного бульона или микроорганизма посредством способов, известных в данной области. Лактаза также может быть получена посредством применения технологий рекомбинантных ДНК. Такой способ обычно включает культивирование клетки-хозяина, трансформированной вектором на основе рекомбинантной ДНК, содержащим последовательность ДНК, кодирующую рассматриваемую лактазу, причем данная последовательность ДНК функционально связана с подходящим экспрессионным сигналом таким образом, что она способна экспрессировать лактазу в культуральной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию этого фермента и выделение этого фермента из культуры. Эта последовательность ДНК также может быть включена в геном клетки-хозяина. Эта последовательность ДНК может быть геномной, представлять собой кДНК или иметь синтетическое происхождение, или представлять собой их любые комбинации, и может быть выделена или синтезирована согласно способам, известным в данной области.
Лактазы, которые должны использоваться в способе по настоящему изобретению, могут быть очищены. Термин очищенный в том виде, в котором он здесь используется, охватывает белок фермента
- 4 045126 лактазы, по существу не содержащий нерастворимых компонентов из продуцирующего организма. Термин очищенный также охватывает белок фермента лактазы, по существу не содержащий нерастворимых компонентов из природного организма, из которого он получен. Предпочтительно он также отделен от некоторых из растворимых компонентов организма и культуральной среды, из которых он происходит. Более предпочтительно он отделяется посредством одной или более чем одной отдельной операции: фильтрование, осаждение или хроматография.
Соответственно, фермент, имеющий лактазную активность, может быть очищен, то есть присутствуют лишь незначительные количества других белков. Выражение другие белки, в частности, относится к другим ферментам. Термин очищенный в том виде, как он здесь используется, также относится к удалению других компонентов, в частности, других белков и, наиболее конкретно, других ферментов, присутствующих в клетке происхождения лактазы. Лактаза может быть по существу чистой, т.е. не содержащей других компонентов из организма, в котором она продуцируется, т.е., например, организмахозяина для рекомбинантно продуцируемой лактазы. Предпочтительно лактаза представляет собой по меньшей мере 40%-ный (мас./мас.) чистый ферментативный белковый препарат, более предпочтительно имеющий по меньшей мере 50%-ную, 60%-ную, 70%-ную, 80%-ную или даже по меньшей мере 90%-ную чистоту.
Термин фермент, имеющий лактазную активность включает какие бы то ни было вспомогательные соединения, которые могут быть необходимыми для каталитической активности фермента, такие как, например, подходящий акцептор или кофактор, который может присутствовать или может не присутствовать в природе в реакционной системе.
Этот фермент может находиться в любой форме, подходящей для рассматриваемого применения, такой как, например, в форме сухого порошка или гранулята, непылящего гранулята, жидкости, стабилизированной жидкости или защищенного фермента.
Кисломолочный продукт.
В конкретном воплощении изобретения подкисленный продукт по изобретению имеет рН от 3,2 до 4,8, более предпочтительно от 3,4 до 4,6 и наиболее предпочтительно от 3,6 до 4,4.
В одном воплощении изобретения кисломолочный продукт представляет собой химически подкисленный молочный продукт. Подкисление могут проводить посредством любого подкисляющего агента, одобренного для пищевых продуктов, такого как молочная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, винная кислота, фосфорная кислота, фумаровая кислота, фруктовый сок, плодовая мякоть и фруктовый компаунд.
В другом воплощении изобретения кисломолочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт, полученный ферментацией с использованием заквасочной культуры. Заквасочная культура может быть любой традиционной заквасочной культурой молочнокислых бактерий, включая одноштаммовую культуру и смеси культур, используемой для получения конкретного типа ферментированного молочного продукта. Другие полезные бактерии, которые можно добавлять в продукт помимо заквасочной культуры включают пробиотические бактерии Bifidobacterium spp.
В предпочтительном воплощении изобретения ферментированный молочный продукт после ферментации был подвергнут термической обработке таким образом, чтобы снизить количество бактерий заквасочной культуры до не более чем 1х102 КОЕ (колониеобразующих единиц) на грамм, и лактаза была добавлена после термической обработки.
Заквасочная культура может представлять собой любую традиционную заквасочную культуру молочнокислых бактерий, включая одноштаммовую культуру и смеси культур, используемую для получения конкретного типа ферментированного молочного продукта. В предпочтительном воплощении продукта по изобретению ферментацию проводят таким образом, чтобы получить рН от 3,0 до 5,0, предпочтительно от 3,2 до 4,8, более предпочтительно от 3,4 до 4,6 и наиболее предпочтительно от 3,6 до 4,4.
Термическую обработку для снижения количества бактерий заквасочной культуры до не более чем 1,0х102 КОЕ/г ферментированного молока предпочтительно проводят посредством подвергания заквасочной культуры ферментированного молочного продукта воздействию температуры от 50°С до 110°С, предпочтительно от 50°С до 100°С, предпочтительно от 50°С до 90°С, предпочтительно от 60°С до 85°С, более предпочтительно от 65°С до 82°С, и наиболее предпочтительно от 70°С до 80°С. Термическую обработку предпочтительно проводят в течение периода от 5 секунд до 180 секунд, предпочтительно от 5 секунд до 120 секунд, более предпочтительно от 5 секунд до 90 секунд, более предпочтительно от 5 секунд до 60 секунд, более предпочтительно от 8 секунд до 50 секунд и наиболее предпочтительно от 10 до 40 секунд. Предпочтительно количество бактерий заквасочной культуры снижается до не более чем 1,0x10 КОЕ/г ферментированного молока, более предпочтительно до 0 КОЕ/г.
Фермент добавляется в количестве, подходящем для достижения требуемой степени гидролиза лактозы при выбранных реакционных условиях. В конкретном воплощении изобретения молочный продукт содержит лактазу в количестве от 100 до 20000 LAU на литр молочного продукта, предпочтительно от 100 до 10000 LAU на литр молочного продукта, предпочтительно от 100 до 5000 LAU на литр молочного продукта, предпочтительно менее, чем 3000, например менее, чем 1500, менее, чем 1000, менее, чем 750
- 5 045126 или менее, чем 500 LAU на литр молочного продукта.
В предпочтительном воплощении лактазу добавляют в концентрации от 5 до 400 LAU на г лактозы в молочном продукте, предпочтительно от 5 до 200 LAU на г лактозы в молочном продукте, предпочтительно от 5 до 100 LAU на г лактозы в молочном продукте, предпочтительно менее, чем 50, например менее, чем 40, менее, чем 30, менее, чем 20 или менее, чем 10 LAU на г лактозы в молочном продукте.
В предпочтительном воплощении изобретения кисломолочный продукт имеет содержание лактозы от 2,0 мг/мл до 50 мг/мл, предпочтительно от 5 мг/мл до 48 мг/мл, более предпочтительно от 10 мг/мл до 46 мг/мл и наиболее предпочтительно от 20 мг/мл до 45 мг/мл.
В предпочтительном воплощении изобретения кисломолочный продукт содержит дополнительный пищевой продукт, выбранный из группы, состоящей из фруктового напитка, ферментированных злаковых продуктов, химически подкисленных злаковых продуктов, продуктов на основе соевого молока и любой их смеси.
Кисломолочный продукт обычно содержит белок в количестве от 2,0% по массе до 3,5% по массе. Кисломолочный продукт также может представлять собой продукт с низким содержанием белка - с уровнем белка от 1,0% по массе до 2,0% по массе. Альтернативно, молочнокислый продукт может представлять собой продукт с высоким содержанием белка - с уровнем белка более 3,5% по массе. В конкретном воплощении кисломолочный продукт по изобретению представляет собой смесь кисломолочного продукта и злакового продукта, например овсяного продукта, где указанный злаковый продукт может представлять собой ферментированный злаковый продукт, например ферментированный овсяный продукт.
В конкретном воплощении изобретения кисломолочный продукт содержит ферментированный злаковый продукт. Указанный ферментированный злаковый продукт может быть получен посредством размола зерен исходного злакового биологического материала с получением злаковой муки, которую затем подвергают ферментации. Ферментацию злаковой муки могут проводить с использованием тех же молочнокислых бактерий (заквасочной культуры), что и используемые для ферментации молочного субстрата, как описано в других местах в настоящей заявке.
В конкретном воплощении изобретения кисломолочный продукт содержит фруктовый напиток. Фруктовые напитки могут дополнительно содержать, например, овес, сою, миндаль, молочную сыворотку и/или неферментированное молоко, например в виде сухого молока.
В конкретном воплощении изобретения кисломолочный продукт по изобретению представляет собой химически подкисленный продукт. Подкисление могут проводить с использованием любого подкисляющего агента, подходящего для добавления в пищевые продукты, такого как молочная кислота, лимонная кислота, фруктовый сок, плодовая мякоть и фруктовый компаунд. В конкретном воплощении кисломолочный продукт подкисляется фруктовым соком.
В конкретном воплощении изобретения кисломолочный продукт содержит химически подкисленный злаковый продукт. Химически подкисленный злаковый продукт может быть получен посредством размола зерен исходного злакового биологического материала с получением злаковой муки, которую затем используют для получения водной суспензии, и рН указанной суспензии затем доводят до требуемого уровня.
Кисломолочный продукт, содержащий кислую сыворотку или пермеат кислой сыворотки.
В конкретном аспекте настоящего изобретения кисломолочный продукт содержит кислый сывороточный продукт, выбранный из группы, состоящей из кислой сыворотки и пермеата кислой сыворотки. В частности, кислый сывороточный продукт получают в результате концентрирования ферментированного молочного продукта с разделением его на концентрированную фракцию и отделенную фракцию кислой сыворотки.
Кислая сыворотка и пермеат кислой сыворотки представляют собой побочные продукты производства ряда молодых сыров, таких как домашний сыр, рикотта, скир, греческий йогурт, творог, творог кварк и лабне. Кислая сыворотка и пермеат кислой сыворотки имеют рН менее, чем 5,1 в 10%-ном растворе, и исторически было трудно найти применение для побочных продуктов, например из-за их кислотности. Кислую сыворотку получают посредством концентрирования йогурта в сепараторе. Кислый пермеат получают концентрированием йогурта при ультрафильтрации.
Этот настоящий аспект изобретения предоставил возможность использования кислой сыворотки и пермеата кислой сыворотки с получением молочного продукта, например, молочного напитка. Данный аспект основывается на признании того, что кислая сыворотка и пермеат кислой сыворотки подходят для производства молочного продукта по изобретению с пониженным содержанием лактозы, так как производство данного продукта требует ферментативного гидролиза лактозы при низком рН.
В конкретном воплощении третьего аспекта способа по изобретению молочный продукт, ферментированный с использованием заквасочной культуры, подвергают стадии концентрирования для разделения молочного продукта, ферментированного с использованием заквасочной культуры, на концентрированную фракцию и отделенную фракцию кислой сыворотки, где отделенную фракцию кислой сыворотки, но не концентрированную фракцию, подвергают последующим этапам данного способа.
Способ получения ферментированного молочного продукта.
В первом аспекте настоящее изобретение также относится к способу получения кисломолочного
- 6 045126 продукта, включающему стадии обеспечения базового кисломолочного продукта, который имеет рН от 3,0 до 5,0 и содержание лактозы по меньшей мере 1,5 мг/мл, добавление в указанный базовый кисломолочный продукт лактазы, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН, с получением лактазосодержащего кисломолочного продукта, и хранение указанного лактазосодержащего кисломолочного продукта при температуре по меньшей мере 2°С в течеие по меньшей мере 1 суток.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения кисломолочного продукта, включающему стадии обеспечения базового кисломолочного продукта, который имеет рН от 3,0 до 5,0 и содержание лактозы по меньшей мере 1,5 мг/мл, подвергание указанного базового кисломолочного продукта термической обработке таким образом, чтобы снизить количество бактерий до не более чем 1х102 КОЕ/г, с получением термически обработанного кисломолочного продукта, добавление в указанный термически обработанный кисломолочный продукт лактазы, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН, с получением лактазосодержащего кисломолочного продукта, и хранение указанного лактазосодержащего кисломолочного продукта при температуре по меньшей мере 2°С в течение по меньшей мере 1 суток.
Другими словами, вторым аспектом является конкретное воплощение первого аспекта, включающее стадии подвергания базового кисломолочного продукта термической обработке, таким образом, чтобы снизить количество бактерий до не более чем 1х102 КОЕ/г, с получением термически обработанного кисломолочного продукта, добавление в указанный термически обработанный кисломолочный продукт лактазы, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и темпратуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН, с получением лактазосодержащего кисломолочного продукта, и хранение указанного лактазосодержащего кисломолочного продукта при температуре по меньшей мере 2°С в течение по меньшей мере 1 суток.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ферментированного молочного продукта, включающему стадии ферментации молочного субстрата с использованием заквасочной культуры молочнокислых бактерий с получением ферментированного заквасочной культурой молочного продукта, который имеет рН от 3,0 до 5,0 и содержание лактозы по меньшей мере 1,5 мг/мл, подвергание указанного ферментированного заквасочной культурой молочного продукта термической обработке таким образом, чтобы снизить количество бактерий до не более чем 1х102 КОЕ/г, с получением термически обработанного ферментированного молочного продукта, добавление в указанный термически обработанный ферментированный молочный продукт лактазы, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН, с получением лактазосодержащего ферментированного молочного продукта, и хранение указанного лактазосодержащего ферментированного молочного продукта при температуре по меньшей мере 2°С в течение по меньшей мере 1 суток.
Другими словами, третьим аспектом является конкретное воплощение первого аспекта, в котором полученный кисломолочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт, и где способ включает стадии ферментации молочного субстрата с использованием заквасочной культуры молочнокислых бактерий с получением ферментированного заквасочной культурой молочного продукта, который имеет рН от 3,0 до 5,0 и содержание лактозы по меньшей мере 1,5 мг/мл, подвергание указанного ферментированного заквасочной культурой молочного продукта термической обработке таким образом, чтобы снизить количество бактерий до не более чем 1х102 КОЕ/г, с получением термически обработанного ферментированного молочного продукта, добавление в указанный термически обработанный ферментированный молочный продукт лактазы, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН, с получением лактазосодержащего ферментированного молочного продукта, и хранение указанного лактазосодержащего ферментированного молочного продукта при температуре по меньшей мере 2°С в течение по меньшей мере 1 суток.
В одном воплощении способа по изобретению кисломолочный продукт представляет собой химически подкисленный молочный продукт. В другом воплощении изобретения кисломолочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт, произведенный посредством ферментации с использованием заквасочной культуры.
В одном воплощении способа по изобретению базовый кисломолочный продукт или ферментированный заквасочной культурой молочный продукт может быть подвергнут термической обработке таким образом, чтобы снизить количество бактерий до не более чем 1х102 КОЕ/г. Такой термически обработанный подкисленный продукт также называют постпастеризованным продуктом, посредством чего указывается то, что данный продукт подвергали пастеризации после получения химически подкисленного молочного продукта или ферментированного молочного продукта. Такой термически обработанный подкисленный продукт не нужно хранить при низкой температуре, и, следовательно, он подходит для транспортировки и хранения при температуре окружающей среды.
- 7 045126
Таким образом, в предпочтительном воплощении способа по изобретению лактазосодержащий подкисленный или ферментированный молочный продукт выдерживают при температуре по меньшей мере 5°С, предпочтительно по меньшей мере 10°С, более предпочтительно по меньшей мере 15°С и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20°С.
В конкретном воплощении способа по изобретению лактазосодержащий подкисленный или ферментированный молочный продукт выдерживают в течение по меньшей мере двух суток, предпочтительно по меньшей мере 3 суток, более предпочтительно по меньшей мере 4 суток, более предпочтительно по меньшей мере 5 суток, более предпочтительно по меньшей мере 6 суток и наиболее предпочтительно по меньшей мере 7 суток.
В конкретном воплощении изобретения лактазосодержащий подкисленный или ферментированный молочный продукт имеет после выдерживания содержание лактозы менее, чем 40 мг/мл, предпочтительно менее, чем 35 мг/мл, более предпочтительно менее, чем 30 мг/мл, более предпочтительно менее, чем 25 мг/мл, более предпочтительно менее, чем 20 мг/мл, более предпочтительно менее, чем 15 мг/мл, более предпочтительно менее, чем 10 мг/мл, более предпочтительно менее, чем 5 мг/мл, более предпочтительно менее, чем 3 мг/мл и наиболее предпочтительно менее, чем 1,5 мг/мл.
Заквасочная культура может представлять собой любую традиционную заквасочную культуру молочнокислых бактерий, включая одноштаммовую культуру и смеси культур, используемую для производства конкретного типа ферментированного молочного продукта. В предпочтительном воплощении продукта по изобретению ферментация проводится таким образом, чтобы получить рН от 3,0 до 5,0, предпочтительно от 3,2 до 4,8, более предпочтительно от 3,4 до 4,6 и наиболее предпочтительно от 3,8 до 4,4.
Термическую обработку для снижения уровня бактерий заквасочной культуры до не более чем 1,0х102 КОЕ/г ферментированного молочного продукта предпочтительно проводят посредством подвергания молочного продукта, ферментированного заквасочной культурой, температуре от 50°С до 110°С, предпочтительно от 50°С до 100°С, предпочтительно от 50°С до 90°С, предпочтительно от 60°С до 85°С, более предпочтительно от 65°С до 82°С и наиболее предпочтительно от 70°С до 80°С. Термическую обработку предпочтительно проводят в течение периода от 5 секунд до 180 секунд, предпочтительно от 10 секунд до 180 секунд, предпочтительно от 12 секунд до 120 секунд, более предпочтительно от 14 секунд до 90 секунд, более предпочтительно от 16 секунд до 60 секунд, более предпочтительно от 18 секунд до 50 секунд и наиболее предпочтительно от 20 до 40 секунд. Предпочтительно количество бактерий заквасочной культуры снижается до не более чем 10 КОЕ/грамм ферментированного молока, более предпочтительно до 0 КОЕ/г. Ферментированные молочные продукты, подвергнутые термической обработке таким образом, чтобы снизить уровень бактерий до не более чем 1х102 КОЕ/г, подходят для применения с хранением при температуре окружающей среды, как, например, для хранения при температуре по меньшей мере 5°С, предпочтительно по меньшей мере 10°С, более предпочтительно по меньшей мере 15°С и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20°С.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ферментированного молочного продукта, включающему стадии ферментации молочного субстрата с использованием заквасочной культуры молочнокислых бактерий с получением ферментированного заквасочной культурой молочного продукта, который имеет рН от 3,0 до 5,0 и содержание лактозы по меньшей мере 1,5 мг/мл, подвергание данного ферментированного заквасочной культурой молочного продукта термической обработке таким образом, чтобы снизить уровень бактерий до не более чем 1x108 КОЕ/г с получением термически обработанного ферментированного молочного продукта, добавление в указанный термически обработанный ферментированный молочный продукт лактазы, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН с получением лактазосодержащего ферментированного молочного продукта, и хранение указанного лактазосодержащего ферментированного молочного продукта при температуре по меньшей мере 2°С в течение по меньшей мере 1 суток. Предпочтительно уровень бактерий заквасочной культуры снижается до не более чем 1,0x107 КОЕ/г ферментированного молока, более предпочтительно до не более чем 1,0x106 КОЕ/г ферментированного молока и наиболее предпочтительно до не более чем 1,0x105 КОЕ/г ферментированного молока. Ферментированные молочные продукты, подвергнутые термической обработке таким образом, чтобы снизить уровень бактерий до не более чем, например, 1x108 КОЕ/г, имеют увеличенный срок хранения при низкой температуре.
Фермент добавляют в подходящем количестве для достижения требуемой степени гидролиза лактозы при выбранных условиях реакции. В конкретном воплощении изобретения молочный продукт содержит лактазу в количестве от 100 до 20000 LAU на литр молочного продукта, предпочтительно от 100 до 10000 LAU на литр молочного продукта, предпочтительно от 100 до 5000 LAU на литр молочного продукта, предпочтительно менее, чем 3000, например менее, чем 1500, менее, чем 1000, менее, чем 750 или менее, чем 500 LAU на литр молочного продукта.
В предпочтительном воплощении лактазу добавляют в концентрации от 5 до 400 LAU на г лактозы в молочном продукте, предпочтительно от 5 до 200 LAU на г лактозы в молочном продукте, предпочтительно от 5 до 100 LAU на г лактозы в молочном продукте, предпочтительно менее, чем 50, например
- 8 045126 менее, чем 40, менее, чем 30, менее, чем 20 или менее, чем 10 LAU на г лактозы в молочном продукте.
В предпочтительном воплощении изобретения молочнокислый продукт имеет содержание лактозы от 2,0 мг/мл до 45 мг/мл, предпочтительно от 5 мг/мл до 40 мг/мл, более предпочтительно от 10 мг/мл до мг/мл и наиболее предпочтительно от 20 мг/мл до 37 мг/мл.
В предпочтительном воплощении изобретения кисломолочный продукт, в который нужно добавлять лактазу, имеет вязкость, которая обеспечивает легкое распространение лактазы в кисломолочном продукте, например, посредством смешивания. В предпочтительном воплощении способа по изобретению лактаза, которая должна быть добавлена в ферментированный молочный продукт, предоставляется в стерильном препарате. В другом предпочтительном воплощении способа по изобретению лактазу добавляют в ферментированный молочный продукт при асептических условиях, например, посредством стерилизующего фильтрования раствора лактазы.
В предпочтительном воплощении способа по изобретению лактазу добавляют в кисломолочный продукт посредством дозирования в потоке. Согласно настоящему изобретению термин дозирование в потоке означает дозирование непосредственно в трубопровод, через который течет кисломолочный продукт. В настоящем описании термин трубопровод означает трубопровод или любой его синоним, включая канал, трубу, желоб, трубку, линию, напорный трубопровод, проход и шланг. Примерами имеющихся в продаже систем дозирования в потоке, подходящих для применения в настоящем изобретении, являются асептическая система дозирования в потоке Tetra FlexDos и асептическая система дозирования в потоке Tetra Aldose.
В предпочтительном воплощении способа по изобретению лактазу добавляют в кисломолочный продукт посредством дозирования в потоке в трубопровод, и затем лактаза смешивается с йогуртом в трубопроводе посредством смешивающего устройства. Предпочтительно смешивающее устройство выбрано из группы, состоящей из по меньшей мере одного изгиба трубы, пружины обратного клапана, статического миксера или ротора / статического миксера. Примером имеющегося в продаже ротора / статического миксера является гомогенизатор Ytron-Z (насос-диспергатор).
Двухэтапное добавление лактазы.
В конкретном воплощении третьего и четвертого аспекта способа по изобретению лактазу добавляют ранее термической обработки затравочной культуры ферментированного молочного продукта. Добавленная ранее лактаза может быть любой лактазой, включая лактазу, выбранную из группы, состоящей из На-лактазы и лактазы, используемой в способе по изобретению, т.е. лактазы, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН. На-лактаза представляет собой лактазу, полученную из дрожжей из рода Klyveromyces, в частности, выбранных из группы, состоящей из Klyveromyces lactis и Klyveromyces fragilis.
В конкретном воплощении добавленную ранее лактазу добавляют в начале ферментации вместе с заквасочной культурой. В данном случае добавленная ранее лактаза предпочтительно представляет собой На-лактазу.
В другом конкретном воплощении добавленную ранее лактазу добавляют после начала ферментации.
В случае добавления лактазы как в начале ферментации, так и после термической обработки ферментированного заквасочной культурой молочного продукта, часть лактозы будет гидролизоваться во время стадии ферментации, а остальная часть лактозы будет гидролизоваться во время выдерживания термически обработанного ферментированного молочного продукта. В случае добавления лактазы как в начале ферментации, так и после термической обработки ферментированного заквасочной культурой молочного продукта, можно снижать общее количество добавленной лактазы для того, чтобы снизить концентрацию лактозы в ферментированном молочном продукте до требуемого уровня по сравнению со случаем добавления лактазы только после термической обработки ферментированного заквасочной культурой молочного продукта. Таким образом, лактаза, добавленная в начале ферментации, будет активна при более высоком рН, чем рН от 3,0 до 5,0, например, при рН от 5,0 до 7,0, и большинство лактаз имеют более высокую активность при таком более высоком рН. Следовательно, определенное количество лактазы, добавленной в начале ферментации, будет приводить к большему гидролизу лактозы, чем такое же количество лактазы, добавленной после термической обработки молочного продукта, ферментированного заквасочной культурой.
Применение.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению лактазы, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН, для добавления в кисломолочный продукт, который имеет рН от 3,0 до 5,0 и содержание лактозы по меньшей мере 1,5 мг/мл, для того, чтобы снизить содержание указанной лактозы во время хранения.
Определения.
Согласно настоящему изобретению применяются следующие определения.
LAU означает лактозные единицы, и 1 лактазная единица (1 LAU) представляет собой количе-
- 9 045126 ство фермента, которое высвобождает 1 микромоль глюкозы в минуту в М-буфере при рН 6,5 и 37°С с концентрацией лактозы 4,75% масс./об. М-буфер получают посредством растворения 3,98 г C6H5Na3O72H2O, 8,31 г лимонной кислоты, 0,9 г K2SO4, 2,6 г K2HPO4, 7,35 г KH2PO4, 5,45 г KOH, 4,15 г MgCl26H2O, 3,75 г CaCl2-2Н2О и 1,4 г NaHCO3 в 4 литрах воды, добавляя 12,5 мл 4 н. NaOH, доводя рН до 6,5 с использованием HCl и добавляя воду вплоть до общего объема 5 литров.
Активность в LAU конкретной лактазы может быть определена посредством прямого измерения глюкозы, высвобожденной из лактозы, в условиях, описанных выше. Специалист в данной области будет знать, как определять такую активность. В качестве альтернативы, активность может быть определена с использованием анализа лактазной активности, описанного в Примере 1 настоящей заявки. Активность получают сравнением стандарной кривой, полученной с лактазой с известной активностью, и активность неизвестного образца рассчитывается из этого. Лактазой с известной активностью, например, может быть лактозим (Lactozym), приобретенный у Novozymes A/S, Дания.
Выражение термическая обработка означает любую обработку с использованием любой температуры в течение любого периода времени и любыми средствами или оборудованием, которая инактивирует по меньшей мере часть бактерий заквасочной культуры. В связи с этим термин инактивировать означает любую остановку, уменеение или ингибирование роста бактерий, например лизирование клеток.
Выражение молочнокислые бактерии обозначает грамположительные микроаэрофильные или анаэробные бактерии, которые ферментируют сахара с образованием кислот, включающих молочную кислоту в качестве преимущественно образующейся кислоты, уксусную кислоту и пропионовую кислоту. Самые полезные с производственной точки зрения молочнокислые бактерии находятся в пределах порядка Lactobacillales, который включает Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. и Propionibacterium spp. Они часто используются в качестве пищевых культур, одни или в комбинации с другими молочнокислыми бактериями.
Молочнокислые бактерии, включая бактерии вида Lactobacillus sp. и Lactococcus sp., обычно поставляются для молочной промышленности либо в виде замороженных, либо лиофилизированных культур для объемного размножения закваски, или в виде так называемых культур для прямого внесения (DVS), предназначенных для прямой инокуляции в ферментационный сосуд или чан для производства молочного продукта, такого как ферментированный молочный продукт или сыр. Такие культуры молочнокислых бактерий, в общем, называются заквасочные культуры или закваски. Типично заквасочная культура для йогурта содержит Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, и в большинстве стран йогурт по закону определяется как ферментированный молочный продукт, произведенный с использованием заквасочной культуры, содержащей два указанных штамма.
Термин молоко следует понимать как секрет молочных желез, получаемый дойкой любого животного, такого как коровы, овцы, козы, буйволы или верблюды. В предпочтительном воплощении молоко представляет собой коровье молоко. Термин молоко также включает белковые/жировые растворы, сделанные из растительных веществ, например, соевое молоко.
Термин молочный субстрат может относиться к любому сырому и/или переработанному молочному веществу, которое можно подвергать ферментации согласно способу по изобретению. Таким образом, полезные молочные субстраты включают растворы/суспензии любого молока или молокоподобных продуктов, содержащие белок, такие как цельное молоко или молоко пониженной жирности, обезжиренное молоко, пахта, восстановленное сухое молоко, сгущенное молоко, сухое молоко, сыворотка, кислая сыворотка, пермеат сыворотки, включая пермеат кислой сыворотки, сухую сыворотку, включая сухую кислую сыворотку, сухую сладкую сыворотку, деминерализованную сухую сыворотку и безлактозную сухую сыворотку, лактоза, маточная жидкость от кристаллизации лактозы, концентрат белка сыворотки или крем, но не ограничиваются ими. Очевидно то, что молочный субстрат может происходить от любого млекопитающего, например, являясь по существу чистым молоком млекопитающего или восстановленным сухим молоком.
Термин пермеат кислой сыворотки означает пермеат сыворотки, полученный в результате концентрирования ферментированного молочного продукта посредством ультрафильтрации при производстве молодого сыра, такого как домашний сыр, рикотта, скир, греческий йогурт, творог, творог кварк и лабне, полученного посредством кислотной коагуляции за счет ферментации молочнокислой бактерией, и где рН пермеата кислой сыворотки в 10%-ном растворе меньше, чем 5,1.
Термин кислая сыворотка означает фракцию сыворотки, полученную в результате концентрирования ферментированного молочного продукта в сепараторе при производстве молодого сыра, такого как домашний сыр, рикотта, скир, греческий йогурт, творог, творог кварк и лабне, полученного посредством кислотной коагуляции посредством ферментации молочнокислой бактерией, и где рН фракции кислой сыворотки в 10%-ном растворе меньше, чем 5,1.
До ферментации молочный субстрат может быть гомогенизирован и пастеризован в соответствии со способами, известными в данной области.
Термин гомогенизация в том виде, в котором он здесь используется, означает интенсивное перемешивание с получением растворимой суспензии или эмульсии. При проведении гомогенизации перед
- 10 045126 ферментацией ее можно проводить таким образом, чтобы разрушать молочный жир до меньших размеров таким образом, что он больше не отделяется от молока. Это можно осуществлять посредством пропускания молока под высоким давлением через маленькие отверстия.
Термин пастеризация в том виде, в котором он здесь используется, означает обработку молочного субстрата для уменеения или устранения присутствия живых организмов, таких как микроорганизмы. Предпочтительно пастеризация достигается поддержанием определенной температуры в течение определенного периода времени.
Определенная температура обычно достигается посредством нагревания. Температуру и продолжительность можно выбирать для того, чтобы умерщвлять или инактивировать определенные бактерии, такие как вредные бактерии. Затем может следовать стадия быстрого охлаждения.
Ферментация в способах по настоящему изобретению означает превращение углеводов в спирты или кислоты посредством действия микроорганизма. Предпочтительно ферментация в способах по изобретению включает превращение лактозы в молочную кислоту.
Способы ферментации, которые должны использоваться в производстве молочных продуктов, хорошо известны, и специалисту в данной области будет известно, как выбирать подходящие условия процесса, такие как температура, содержание кислорода, количество и характеристики микроорганизма(мов) и время процесса. Очевидно, условия ферментации выбирают таким образом, чтобы поддерживать достижение настоящего изобретения, т.е. получать молочный продукт в твердой (такой как сыр) или жидкой форме (такой как ферментированный молочный продукт).
Применение терминов в единственном числе в контексте описания настоящего изобретения (особенно в контексте последующей формулы изобретения) следует истолковывать как охватывающее термины и в единственном, и во множественном числе, если не указано иное, или это явно не противоречит контексту. Термины содержащий, имеющий, включающий и вмещающий следует истолковывать как открытые термины (т.е. означающие включающий, но не ограничивающийся), если не указано иное. Перечисление интервалов значений в настоящей заявке предназначено только для того, чтобы служить в качестве краткого способа ссылки индивидуально на каждое отдельное значение, попадающее в данный интервал, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включается в настоящее описание изобретения, как если бы оно было индивидуально перечислено. Все описанные в настоящем описании способы могут осуществляться в любом подходящем порядке, если не указано иное, или, в ином случае, это явно не противоречит контексту. Использование любых приведенных в настоящем описании и всех примеров или описывающих примеры формулировок (например, такой как) предназначено только для лучшего иллюстрирования изобретения и не накладывает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное. Никакие формулировки в описании изобретения не следует истолковывать как указывающие на любой незаявленный элемент, существенный для воплощения настоящего изобретения на практике.
Выражение ферментированный молочный продукт означает пищевой или кормовой продукт, где получение пищевого или кормового продукта включает ферментацию молочного субстрата молочнокислыми бактериями. Термин ферментированный молочный продукт в том виде, в котором он здесь используется, включает такие продукты, как термофильно ферментированные молочные продукты, например, йогурт, мезофильно ферментированные молочные продукты, например, сметану и пахту, а также ферментированную сыворотку, но не ограничивается ими.
Термин термофил в настоящем описании относится к микроорганизмам, которые лучше всего растут при температурах выше 35°С. Самые полезные с промышленной точки зрения термофильные бактерии включают Streptococcus spp. и Lactobacillus spp. Термин термофильная ферментация здесь относится к ферментации при температуре выше примерно 35°С, как, например, от примерно 35°С до примерно 45°С. Термин термофильно ферментированный молочный продукт относится к ферментированным молочным продуктам, полученным посредством термофильной ферментации с использованием термофильной заквасочной культуры, и он включает такие ферментированные молочные продукты, как йогурт термостатного способа производства, йогурт с нарушенным сгустком и питьевой йогурт, например, например Yakult.
Термин мезофильный в настоящем описании относится к микроорганизмам, которые лучше всего растут при умеренных температурах (15°С-35°С). Наиболее полезные с промышленной точки зрения мезофильные бактерии включают Lactococcus spp. и Leuconostoc spp. Термин мезофильная ферментация относится здесь к ферментации при температуре от примерно 22°С до примерно 35°С. Термин мезофильно ферментированный молочный продукт относится к ферментированным молочным продуктам, полученным посредством мезофильной ферментации с использованием мезофильной заквасочной культуры, и он включает такие ферментированные молочные продукты, как пахта, простокваша, сквашенное молоко, сметана, сквашенные сливки, кефир и молодой сыр, такой как творог кварк, творог и сливочный сыр.
Графические материалы
На фиг. 1 показаны количества остаточной лактозы в образцах, обработанных лактазой, добавленной в йогурт после постпастеризации, для количеств лактазы 1000, 2000 и 3000 LAU/л.
На фиг. 2 показаны количества остаточной лактозы в образцах, обработанных лактазой, добавленной в йогурт после постпастеризации, для количеств лактазы 200, 400, 600, 800, 1000 и 1200 LAU/л в 8,
- 11 045126
24, 48 и 76 часов.
На фиг. 3 показаны данные фиг. 2 в точке 48 часов.
На фиг. 4 показаны данные фиг. 2 в точке 76 часов.
Примеры
Пример 1.
Анализ лактазной активности в пробирках Эппендорфа при 37°С, рН 6,5.
Принцип.
Лактаза гидролизует лактозу до глюкозы и галактозы. Глюкозу измеряют согласно модифицированной версии обычного глюкозооксидазного/пероксидазного аналитического метода (Werner, W. et al. (1970) Z. analyt. Chem. 252: 224.).
LAU определяется как количество фермента, высвобождающее 1 микромоль глюкозы в мин при 37°С, рН 6,5 в М-буфере (М-буфер определяется в описании настоящей патентной заявки). В качестве альтернативы, активность в LAU для конкретной лактазы может быть определена описанным в настоящем описании способом. Полученное значение сравнивается со стандартной кривой, полученной с лактазой с известной активностью, и активность неизвестного образца рассчитывается из этого. Лактазой с известной активностью, например, может быть лактозим, приобретенный у Novozymes A/S, Дания.
Растворы.
Буфер для анализа: 50 мМ сукцинат, 50 мМ HEPES, 50 мМ CHES, 150 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 0,01% Triton Х100, рН 6,5.
Раствор GOD-Perid: 65 мМ фосфат натрия, рН 7, 0,4 г/л глюкозооксидазы, 0,013 г/л HRP (пероксидаза хрена), 0,65 г/л ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота)).
Субстрат.
160 мМ лактоза, 50 мМ сукцинат, 50 мМ HEPES, 50 мМ CHES, 150 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, рН 6,5.
Стандарт.
Лактозим (доступный от Novozymes A/S, Дания) с известной активностью в LAU/г используется в качестве стандарта при разведении в буфере для анализа в интервале 0,09-0,7 LAU/г.
Образцы.
Образцы фермента разводятся подходящим образом в буфере для анализа.
Методика.
1. 375 мкл субстрата инкубируют 5 минут при 37°С.
2. Добавляют 25 мкл фермента, разведенного в буфере для анализа.
3. Реакцию останавливают через 30 минут посредством добавления 60 мкл 1 М NaOH.
4. 20 мкл переносят в 96-луночный планшет для микротитрования и добавляют 200 мкл раствора GOD-Perid. После 30 минут при комнатной температуре измеряют поглощение при 420 нм.
Пример 2.
100 мл 15% или 30% (мас./мас.) пермеата сыворотки, содержащего, преимущественно, лактозу и ионы, получали смешиванием 15 или 30 г высушенного распылением сухого пермеата сыворотки (Variolac, Arla) в 85 или 70 мл содержащей ионы воды, соответственно. Этот раствор выливали в колбу, содержащую якорь магнитной мешалки, и помещали в водяную баню при 37°С. Через 15 мин добавляли фермент. Тестированными ферментами были лактозим - имеющаяся в продаже лактаза от Novozymes A/S, Дания, имеющая активность 3060 LAU/г, и экспериментальная лактаза из Bifidobacterium bifdum, имеющая кодируемую последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, и активность 295 LAU/г.
Дозировки были следующие: 4225 LAU/л молока лактозима и 2025 LAU/л молока лактазы Bifidobacterium. Образцы молока отбирали с регулярными интервалами вплоть до 5,5 ч, и фермент инактивировали нагреванием до 99°С в течение 10 мин в термомиксере. Образцы подходящим образом разводили и фильтровали через 0,20 мкм фильтр.
Гидролиз лактозы измеряли с использованием Dionex BioLC, оснащенной колонкой Dionex PA1 и импульсным амперометрическим детектором (PAD). Пики идентифицировали и количественно измеряли посредством сравнения с известными стандартами лактозы, глюкозы и галактозы.
Результаты приведены ниже.
- 12 045126
Таблица 1
Лактоза, глюкоза и галактоза в 15% DS пермеате сыворотки после обработки лактозимом или лактазой Bifidobacterium
| Лактозим | Лактаза Bifidobacterium | |||||
| Время мин | Лактоза мМ | Глюкоза мМ | Г алактоза мМ | Лактоза мМ | Глюкоза мМ | Г алактоза мМ |
| 0 | 499 | 1 | 2 | 499 | 1 | 2 |
| 30 | 312 | 135 | 106 | 410 | 61 | 63 |
| 60 | 211 | 224 | 155 | 349 | 119 | 122 |
| 120 | 110 | 295 | 221 | 220 | 199 | 202 |
| 180 | 66 | 324 | 249 | 149 | 281 | 290 |
| 240 | 50 | 346 | 279 | 84 | 336 | 348 |
| 330 | 37 | 372 | 312 | 31 | 350 | 368 |
Таблица 2
Лактоза, глюкоза и галактоза в 30% DS пермеате сыворотки после обработки лактозимом или лактазой Bifidobacterium.
| Лактозим | Лактаза Bifidobacterium | |||||
| Время мин | Лактоза мМ | Глюкоза мМ | Г алактоза мМ | Лактоза мМ | Глюкоза мМ | Г алактоза мМ |
| 0 | 848 | 1 | 4 | 848 | 1 | 4 |
| 30 | 824 | 109 | 75 | 819 | 43 | 45 |
| 60 | 615 | 253 | 150 | 788 | 86 | 83 |
| 120 | 420 | 370 | 242 | 651 | 159 | 158 |
| 180 | 291 | 459 | 300 | 625 | 232 | 230 |
| 240 | 246 | 559 | 373 | 501 | 283 | 273 |
| 330 | 154 | 544 | 367 | 391 | 333 | 324 |
| 1440 | 54 | 649 | 545 | 20 | 727 | 739 |
Также при тестировании при более высоких концентрациях лактозы, таких как в 15% или в 30% пермеате сыворотки, не продуцируется или продуцируется очень мало галактоолигосахаридов. К тому же, уровни продуцированной галактозы и глюкозы являются равными и соответствуют количеству гидролизованной лактозы. Для сравнения, лактозим продуцирует меньше галактозы, чем глюкозы, ясно показывая то, что были продуцированы галактоолигосахариды.
Пример 3.
рН профиль (при 37°С) и температурный профиль (при рН 6,5) экспериментальной лактазы из Bifidobacterium bifidum, определенные с использованием лактозы в качестве субстрата.
Принцип.
Лактаза гидролизует лактозу, и образуется глюкоза и галактоза. Глюкозу измеряют согласно модифицированной версии обычного глюкозооксидазного/пероксидазного метода (Werner, W. et al. (1970) Z. analyt. Chem. 252: 224.).
Профиль рН.
Субстрат.
167 мМ лактоза, 50 мМ сукцинат, 50 мМ HEPES, 50 мМ CHES, 150 мМ KCl, 2 мМ CaCb, 1 мМ MgCl2, и рН доводится до рН 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 с использованем NaOH.
Образец фермента.
Экспериментальную лактазу из Bifidobacterium bifidum, имеющую кодированную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, подходящим образом разводили в 150 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 0,01% Triton Х100.
Методика.
мкл образца фермента, разведенного в буфере для разведения фермента, добавляли в пробирки для ПЦР (полимеразная цепная реакция) при комнатной температуре.
мкл субстрата добавляли при комнатной температуре и быстро помещали в термоциклер Пельтье (РСТ-200, MJ research) при 37°С и инкубировали в течение 30 мин и затем помещали на лед.
Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0,25 M NaOH.
мкл переносили в 96-луночный планшет для микротитрования, и добавляли 230 мкл 65 мМ фосфата натрия, рН 7, 0,4 г/л глюкозооксидазы, 0,013 г/л HRP, 0,65 г/л раствора ABTS. После 30 минут при комнатной температуре измеряли поглощение при 420 нм.
- 13 045126
Температурный профиль.
Субстрат.
167 мМ лактоза, 50 мМ сукцинат, 50 мМ HEPES, 50 мМ CHES, 150 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, и рН доводится до рН 6,5 с использованем NaOH.
Образец фермента.
Экспериментальную лактазу из Bifidobacterium bifidum, имеющую кодированную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, подходящим образом разводили в 50 мМ сукцинате, 50 мМ HEPES, 50 мМ CHES, 150 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 0,01% Triton X100, и рН доводили до рН 6,5.
Методика: 10 мкл образца фермента, разведенного в буфере для разведения фермента, добавляли в пробирки для ПЦР при комнатной температуре.
мкл предварительно нагретого (в термоциклере Пельтье, 30-70°С) субстрата добавляли, и инкубацию проводили с температурным градиентом от 30 до 70°С за 30 мин, и затем помещали на лед.
Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0,25 M NaOH.
мкл переносили в 96-луночный планшет для микротитрования, и добавляли 230 мкл 65 мМ фосфата натрия, рН 7, 0,4 г/л глюкозооксидазы, 0,013 г/л HRP, 0,65 г/л раствора ABTS. После 30 минут при комнатной температуре измеряли поглощение при 420 нм.
Таблица 4
| Темп. °C | Относительная активность лактазы В. bifidum (% от активности при 38,1 °C) |
| 20 | 54 |
| 21 | 63 |
| 22 | 64 |
| 24 | 68 |
| 26 | 73 |
| 29 | 81 |
| 31 | 88 |
| 34 | 94 |
| 36 | 96 |
| 38 | 100 |
| 43 | 96 |
| 48 | 91 |
| 52 | 83 |
| 57 | 76 |
| 62 | 58 |
| 66 | 32 |
| 69 | 20 |
| 70 | 17 |
- 14 045126
Пример 4.
Определение Km для лактазных ферментов при 5°С.
Принцип.
Лактаза гидролизует лактозу, и образуется глюкоза и галактоза. Глюкозу измеряют согласно модифицированной версии обычного глюкозооксидазного/пероксидазного метода (Werner, W. et al. (1970) Z. analyt. Chem. 252: 224.).
Субстрат.
Разные концентрации лактозы, варьирующие от Km/5 до 10*Km, 50 мМ сукцинат, 50 мМ HEPES, 50 мМ CHES, 150 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, и рН доводится до рН 6,5 с использованем NaOH.
Образец фермента.
Экспериментальную лактазу из Bifidobacterium bifdum, имеющую кодированную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, подходящим образом разводили в 50 мМ сукцинате, 50 мМ HEPES, 50 мМ CHES, 150 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 0,01% Triton X100, и рН доводили до рН 6,5 NaOH.
г/л лактозима (лактаза, имеющаяся в продаже у Novozymes A/S, Дания) разводили в 6000 раз в том же самом буфере.
Методика.
мкл образца фермента (5°С) добавляли в 96-луночный планшет для микротитрования на льду.
Добавляли 90 мкл субстрата (5°С) и инкубировали в течение 2 часов при 5°С.
Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0,25 М NaOH.
мкл переносили в 96-луночный планшет для микротитрования, и добавляли 230 мкл 65 мМ фосфата натрия, рН 7, 0,4 г/л глюкозооксидазы, 0,013 г/л HRP, 0,65 г/л раствора ABTS. После 30 минут при комнатной температуре измеряли поглощение при 420 нм.
Определение Km.
Использовали компьютеризированную нелинейную аппроксимацию методом наименьших квадратов и уранение Михаэлиса-Ментена:
V = (Vmax*S)/(Km+S).
Определили то, что Km для лактазы Bifidobacterium и лактозима составляет 8 и 30 мМ соответственно.
В аналогичном анализе, проведенном при 37°С, определили то, что Km для лактазы Bifidobacterium и лактозима составляет 13 мМ и 30 мМ соответственно.
Пример 5.
Получение постпастеризованного йогурта, содержащего лактазу, добавленную после пастеризации.
Молочный субстрат.
Количество жира 2,8%*.
Количество белка 2,8%*.
Лактоза 3,0%.
Сахароза 5,0% (добавлена).
Модифицированный крахмал Е1442 Cargill типа 75720 1,50%.
Пектин типа LMA CP Kelco типа LM 106 AS-YA 0,25%.
Камедь геллан типа Kelcogel YSS 0,05%.
*Количество в конечном продукте, т.е. после термической обработки, добавления штамма для хранения при температуре окружающей среды и хранения в течение 150 суток.
Заквасочная культура.
Заквасочная культура YoFlex® типа FD-DVS YF-L904, содержащая два штамма Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.
Лактаза.
Лактаза из Bifidobacterium bifidum, имеющая кодированную последовательность SEQ ID NO. 2 и активность 295 LAU/г.
Методика для производства продукта.
1. Диспергирование сухих ингредиентов в молоке.
2. Нахождение в состоянии покоя в течение 3 часов с легким перемешиванием.
3. Нагревание молока до достижения температуры 65°С.
4. Гомогенизация при 150 бар (15 МПа).
5. Обработка нагреванием до 95°С в течение 5 мин.
6. Охлаждение до температуры ферментации 43°С.
7. Закачивание молока в бродильный чан.
8. Инокуляция культуры YoFlex типа YF-L904.
9. Ферментация до достижения рН 4,30.
10. Разрушение коагулята и перемешивание до получения однородной структуры.
11. Термическая обработка при 75°С в течение 30 с.
12. Охлаждение до 25°С.
13. Добавление лактазы в количестве 1420 LAU/л йогуртового продукта, и медленное перемешива
- 15 045126 ние йогурта таким образом, чтобы равномерно распределить лактазу в йогурте.
14. Заполнение йогуртом контейнеров.
15. Выдерживание йогурта при температуре 20°С в течение периода 7 суток.
Пример 6.
Последующее добавление лактазы в постпастеризованный йогурт.
Целью проведенной экспериментальной работы была демонстрация того, что возможно добавление подходящей лактазы после последней термической обработки постпастеризованного йогурта с достижением остаточных количеств лактозы менее 0,01%.
Был произведен постпастеризованный йогурт с 2,9% белка и 2,8% жира. Молочный субстрат ферментировали до рН 4,30 с использованием культуры YoFlex типа YF-L904. После достижения рН 4,30 йогурт охлаждали до 15°С в теплообменнике пластинчатого типа и выдерживали в теплоизолированной буферной емкости при 15 °С в течение трех часов перед проведением конечной термической обработки. Конечную термическую обработку проводили при 74°С в течение 20 с в теплообменнике пластинчатого типа, и продуктом заполняли стерильные стаканы при 25°С. Образцы выдерживали при температуре окружающей среды (22°С) в течение одних суток до добавления стерильной лактазы.
Молочный субстрат.
| Ингредиенты | Спецификация | Дозировка |
| Свежее молоко | 3,5% жира, имеющееся в продаже молоко, Aria Foods | 74,15% |
| Вода | 16,6% | |
| Сахароза | 7,0% | |
| Концентрат сывороточного белка | Nutrilac YO-7830, Aria Food Ingredients | 0,60% |
| Модифицированный крахмал | Clearam CJ 5025, Roquette | 1,50% |
| Пектин LM | LM 106-AS YA, CP Kelco | 0,12% |
| Камедь геллан | Kelcogel YSS, CP Kelco | 0,03% |
| Культуры | FD-DVS YF-L904 | 200 единиц/ метрические тонны |
Анализ Milkoscan: уровень жира 2,8%, уровень белка 2,9%.
Для ферментации и переработки использовали следующие параметры.
Температура перемешивания: 10°С.
Время гидратации: 3 часа с легким перемешиванием.
Лактаза.
Лактаза из Bifidobacterium bifidum, имеющая кодированную последовательность SEQ ID NO. 2.
Заквасочная культура.
Культура YoFlex® типа YF-L904 из линейки продуктов YoFlex® Chr. Hansen, содержащая два вида: Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.
Способ производства йогурта.
Давление гомогенизации: 150 бар (15 МПа).
Условия пастеризации: 95°С, 5 минут.
Температура ферментации: 43°С.
Конечный рН: 4,30.
Коагулят разрушают вручную и перемешивают, пока не получается гомогенная структура.
Охлаждение до 15 °С в теплообменнике пластинчатого типа.
Термизация в теплообменнике пластинчатого типа, ток 414 л/ч.
Давление гомогенизации: 0 Па.
Условия термизации: 74°С, 20 с.
Заполнение стерильных 100 мл чашек, температура заполнения 25°С.
Добавление лактазы.
Лактазу подвергали стерилизующему фильтрованию и добавляли в 100 мл стаканы с постпастеризованным йогуртом в следующих дозировках:
а) 0 LAU/л - контроль,
б) 1000 LAU/л,
в) 3000 LAU/л,
- 16 045126
г) 10000 LAU/л.
Образцы выдерживали при комнатной температуре (22°С), и образцы отбирали для анализа остаточной лактозы в следующие моменты времени: 24 часа, 48 часов и 1 неделя.
Результаты.
На фиг. 1 показана остаточная лактоза образцов с добавлением лактазы. Остаточная лактоза контрольного образца была измерена как составляющая 2,4% остаточной лактозы. Как будет видно из фиг. 1, концентрация лактозы снижалась до уровня примерно 0,005% при концентрациях лактазы 3000 LAU/л и 10000 LAU/л через 24 часа с момента добавления. Также концентрация лактозы снижалась до уровня примерно 0,005% для всех трех концентраций лактазы через 48 часов и через 1 неделю с момента добавления.
Пример 7.
Последующее добавление лактазы в постпастеризованный йогурт.
Целью проведенной экспериментальной работы была демонстрация того, что возможно добавлять подходящую лактазу после конечной термической обработки постпастеризованного йогурта с достижением уровней остаточной лактозы менее 0,1%.
Был произведен постпастеризованный йогурт с 2,87% белка и 2,89% жира. Молочный субстрат ферментировали до рН 4,30 с использованием культуры YoFlex типа YF-L904. После достижения рН 4,30 йогурт охлаждали до 15°С в теплообменнике пластинчатого типа и выдерживали в теплоизолированной буферной емкости при 15°С в течение трех часов до проведения конечной термической обработки. Конечную термическую обработку проводили при 74°С в течение 20 с в теплообменнике пластинчатого типа, и продуктом заполняли стерильные стаканы при 25°С. Образцы выдерживали при 25°С в течение одних суток до добавления стерильной лактазы.
Молочный субстрат.
| Ингредиенты | Спецификация | Дозировка |
| Свежее молоко | 3,5% жира, имеющееся в продаже молоко, Aria Foods | 74,15% |
| Вода | 16,6% | |
| Сахароза | 7,0% | |
| Концентрат сывороточного белка | Nutrilac YO-7830, Aria Food Ingredients | 0,60% |
| Модифицированный крахмал | Clearam CJ 5025, Roquette | 1,50% |
| Пектин LM | LM 106-AS YA, CP Kelco | 0,12% |
| Камедь геллан | Kelcogel YSS, CP Kelco | 0,03% |
| Культуры | FD-DVS YF-L904 | 200 единиц/ метрические тонны |
Анализ Milkoscan: уровень жира 2,87%, уровень белка 2,89%.
Для ферментации и переработки использовали следующие параметры.
Температура перемешивания: 10°С.
Время гидратации: 3 часа с легким перемешиванием.
Лактаза.
Лактаза из Bifidobacterium bifidum, имеющая кодированную последовательность SEQ ID NO. 2.
Заквасочная культура.
Культура YoFlex® типа YF-L904 из линейки продуктов YoFlex® Chr. Hansen, содержащая два вида: Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.
Способ производства йогурта.
Давление гомогенизации: 150 бар (15 МПа).
Условия пастеризации: 95°С, 5 минут.
Температура ферментации: 43°С.
Конечный рН: 4,30.
Коагулят разрушают вручную и перемешивают, пока не получается однородная структура.
Охлаждение до 15 °С в теплообменнике пластинчатого типа.
Термизация в теплообменнике пластинчатого типа, ток 414 л/ч.
Условия термизации: 74°С, 20 с.
Заполнение стерильных 100 мл чашек, температура заполнения 25°С.
Добавление лактазы.
Лактазу подвергали стерилизующему фильтрованию и добавляли в 100 мл стаканы с постпастери
- 17 045126 зованным йогуртом в следующих дозировках:
а) 0 LAU/л - контроль,
б) 200 LAU/л,
в) 400 LAU/л,
г) 600 LAU/л,
д) 800 LAU/л,
е) 1000 LAU/л,
ж) 1200 LAU/л.
Образцы выдерживали при 25°С, и отбирали образцы для анализа остаточной лактозы в следующие моменты времени: 8 часов, 24 часа, 48 часов и 76 часов.
Результаты.
На фиг. 2-4 показана остаточная лактоза образцов с добавлением лактазы. Остаточная лактоза контрольного образца была измерена как составляющая 2,4% остаточной лактозы. Горизонтальные линии на уровне остаточной лактозы 0,1 и 0,5 означают уровень лактозы, который согласно регулятивному законодательству по пищевым продуктам квалифицируется как не содержащий лактозу в ЕС (Европейском Союзе) и Китае соответственно.
Как будет видно из фиг. 2-4, концентрация лактозы через 24 часа снижалась до уровня примерно 0,355% при концентрации лактазы 400 LAU/л и до уровня менее 0,01% при более высоких концентрациях лактазы. Через 48 часов концентрация лактозы падала до уровня 0,015% при концентрации лактазы 400 LAU/л и до уровня менее 0,01% при более высоких концентрациях лактазы. Через 76 часов концентрация лактозы падала до уровня менее 0,01% при концентрации лактазы 400 LAU/л и более высоких концентраций лактазы.
Таким образом, настоящие эксперименты показывают то, что возможно соответствовать целевому уровню остаточной лактозы 0,01% или менее при использовании дозы лактазы 600 LAU/л через 48 часов и дозы лактазы 400 LAU/л через 76 часов.
Пример 8.
Последующее добавление лактазы в постпастеризованный йогурт при разных уровнях рН (от 4,0 до 4,4).
Целью проведенной экспериментальной работы была демонстрация того, что в способе удаления лактозы в постпастеризованном йогурте (PPY) с использованием лактазы возможно получение требуемого удаления лактозы для PPY с разным рН в интервале от 4,0 до 4,4.
Молочный субстрат.
| Ингредиенты | Спецификация | Дозировка co стандартным уровнем лактозы | Дозировка с высоким уровнем лактозы |
| Свежее молоко | 3,5% жира, имеющееся в продаже молоко, Aria Foods | 74,30% | 74,0% |
| Вода | 16,45% | 15,95% | |
| Сахароза | 7,0% | 7,0% | |
| Концентрат сывороточного белка | Nutrilac YO-7830, Aria Food Ingredients | 0,60% | 0,60% |
| Модифицированный крахмал | Clearam CJ 5025, Roquette | 1,50% | 1,5% |
| Пектин LM | LM 106-AS YA, CP Kelco | 0,12% | 0,12% |
| Камедь геллан | Kelcogel YSS, CP Kelco | 0,03% | 0,03% |
| Культуры | FD-DVS YF-L904 | 200 единиц/ метрические тонны | 200 единиц/ метрические тонны |
Анализ Milkoscan.
Молочная основа со стандартным уровнем лактозы: уровень жира 2,88%, уровень белка 2,91%.
Молочная основа с высоким уровнем лактозы: уровень жира 2,91%, уровень белка 2,94%.
Лактаза.
Лактаза из Bifidobacterium bifidum, имеющая кодированную последовательность SEQ ID NO. 2.
- 18 045126
Способ производства йогурта.
Давление гомогенизации: 150 бар (15 МПа) при 60°С.
Условия пастеризации: 95 °С, 5 минут.
Температура ферментации: 43 °С.
Конечный рН для молочной основы со стандартным уровнем лактозы: 4,0; 4,1; 4,2; 4,3 и 4,4.
Конечный рН для молочной основы с высоким уровнем лактозы: 4,3.
Коагулят разрушают вручную и перемешивают, пока не получается однородная структура.
Охлаждение до 15 °С в теплообменнике пластинчатого типа.
Термизация в теплообменнике пластинчатого типа, ток 414 л/ч.
Условия термизации: 74°С, 20 с.
Заполнение стерильных 100 мл чашек, температура заполнения 25°С.
Добавление лактазы.
Лактазу подвергали стерилизующему фильтрованию и добавляли в 100 мл стаканы с постпастеризованным йогуртом в следующих дозировках:
а) 0 LAU/л - контроль,
б) 200 LAU/л,
в) 400 LAU/л,
г) 600 LAU/л,
д) 800 LAU/л.
Образцы выдерживали при 15°С, 20°С, 25°С и 30°С, и отбирали образцы для анализа остаточной лактозы в следующие моменты времени: 24 часа, 48 часов и 72 часа.
Результаты.
Для краткости показаны только результаты образцов, хранящихся при 25°С.
Соответствующие результаты были получены для образцов, хранящихся при 15°С, 20°С и 30°С.
Таблица 5
Остаточные уровни лактозы для образцов, хранящихся при 25°С
| Молочная основа | Конечный pH | Дозировка лактазы (LAU/л) | 24 часа (%) | 48 часов (%) | 72 часа (%) |
| Стандартный | 4,4 | 200 | 0,918 | 0,220 | 0,034 |
| Стандартный | 4,4 | 400 | 0,106 | 0,004 | 0,003 |
| Стандартный | 4,4 | 600 | 0,077 | 0,003 | 0,003 |
| Стандартный | 4,4 | 800 | 0,009 | <0,002 | 0,002 |
| Стандартный | 4,4 | 1000 | 0,004 | 0,002 | 0,002 |
| Стандартный | 4,3 | 200 | 1,322 | 0,567 | 0,223 |
| Стандартный | 4,3 | 400 | 0,566 | 0,043 | 0,008 |
| Стандартный | 4,3 | 600 | 0,063 | 0,005 | 0,004 |
| Стандартный | 4,3 | 800 | 0,015 | 0,003 | 0,003 |
| Стандартный | 4,3 | 1000 | 0,007 | <0,002 | 0,002 |
| Стандартный | 4,2 | 200 | 1,422 | 0,0803 | 0,356 |
| Стандартный | 4,2 | 400 | 0,671 | 0,071 | 0,013 |
| Стандартный | 4,2 | 600 | 0,177 | 0,008 | 0,004 |
| Стандартный | 4,2 | 800 | 0,128 | 0,005 | 0,003 |
| Стандартный | 4,2 | 1000 | НО (не определен) | НО | НО |
- 19 045126
| Стандартный | 4,1 | 200 | 1,719 | 1,177 | 0,808 |
| Стандартный | 4,1 | 400 | 0,923 | 0,266 | 0,051 |
| Стандартный | 4,1 | 600 | 0,572 | 0,066 | 0,019 |
| Стандартный | 4,1 | 800 | 0,245 | 0,010 | 0,005 |
| Стандартный | 4,1 | 1000 | 0,108 | 0,005 | 0,003 |
| Стандартный | 4,0 | 200 | 1,725 | 1,196 | 0,933 |
| Стандартный | 4,0 | 400 | 1,236 | 0,589 | 0,265 |
| Стандартный | 4,0 | 600 | 0,773 | 0,187 | 0,039 |
| Стандартный | 4,0 | 800 | 0,502 | 0,049 | 0,010 |
| Стандартный | 4,0 | 1000 | НО | НО | НО |
| Высокий | 4,3 | 200 | 2,011 | 1,139 | 0,584 |
| Высокий | 4,3 | 400 | 0,876 | 0,121 | 0,018 |
| Высокий | 4,3 | 600 | 0,250 | 0,009 | 0,005 |
| Высокий | 4,3 | 800 | 0,053 | 0,006 | 0,003 |
| Высокий | 4,3 | 1000 | 0,017 | 0,004 | 0,003 |
Таблица 6
Уровень остаточной лактозы без добавления лактазы
| Молочная основа | pH | Дозировка лактазы (LAU/л) | 24 часа (%) |
| Стандартный | 4,4 | 0 | 2,6 |
| Стандартный | 4,3 | 0 | 2,7 |
| Стандартный | 4,2 | 0 | 2,6 |
| Стандартный | 4,1 | 0 | 2,5 |
| Стандартный | 4,0 | 0 | 2,5 |
| Высокий | 4,3 | 0 | 3,2 |
| Стандартный (до ферментации) | 0 | з,з | |
| Высокий (до ферментации) | 0 | 4,0 |
Как будет видно из таблицы 5 и 6, чем ниже конечный уровень рН йогурта, тем выше содержание остаточной лактозы. Данные результаты также показывают то, что при наименьшем конечном уровне рН возможно достигнуть целевого уровня остаточной лактозы менее 0,1% при дозе лактазы 800 LAU/л через 48 часов. Кроме того, при конечном уровне рН 4,1 возможно достигнуть уровня остаточной лактозы 0,108% при дозе лактазы 1000 LAU/л через 24 часа.
Пример 9.
Последующее добавление лактазы в постпастеризованный йогурт при низких уровнях добавленной лактазы.
Целью проведенной экспериментальной работы было тестирование эффективности низких дозировок лактазы в способе удаления лактозы в постпастеризованном йогурте (PPY) с использованием лактазы для того, чтобы установить минимальную дозу, требующуюся для получения требуемого целевого уровня остаточной лактозы.
- 20 045126
Молочный субстрат.
| Ингредиенты | Спецификация | Дозировка |
| Свежее молоко | 3,5% жира, имеющееся в продаже молоко, Aria Foods | 74,30% |
| Вода | 16,45% | |
| Сахароза | 7,0% | |
| Концентрат сывороточного белка | Nutrilac YO-7830, Aria Food Ingredients | 0,60% |
| Модифицированный крахмал | Clearam CJ 5025, Roquette | 1,50% |
| Пектин LM | LM 106-AS YA, CP Kelco | 0,12% |
| Камедь геллан | Kelcogel YSS, CP Kelco | 0,03% |
| Культуры | FD-DVS YF-L904 | 200 единиц/ метрические тонны |
Анализ Milkoscan.
Молочная основа: уровень жира 2,81%, уровень белка 3,11%.
Лактаза.
Лактаза из Bifidobacterium bifidum, имеющая кодированную последовательность SEQ ID NO. 2.
Способ производства йогурта.
Давление гомогенизации: 150 бар (15 МПа) при 60°С.
Условия пастеризации: 95 °С, 5 минут.
Температура ферментации: 43 °С.
Конечный рН для молочной основы со стандартным уровнем лактозы: 4,15; 4,20; 4,25 и 4,30.
Конечный рН для молочной основы с высоким уровнем лактозы: 4,3.
Коагулят разрушают вручную и перемешивают, пока не получается однородная структура.
Охлаждение до 15 °С в теплообменнике пластинчатого типа.
Термизация в теплообменнике пластинчатого типа, ток 414 л/ч.
Условия термизации: 74°С, 20 с.
Заполнение стерильных 100 мл чашек, температура заполнения 25°С.
Добавление лактазы.
Лактазу подвергали стерилизующему фильтрованию и добавляли в 100 мл стаканы с постпастеризованным йогуртом в следующих дозировках:
а) 0 LAU/л - контроль,
б) 50 LAU/л,
в) 100 LAU/л,
г) 200 LAU/л,
д) 300 LAU/л.
Образцы выдерживали при 25°С, и отбирали образцы для анализа остаточной лактозы в следующие моменты времени: 24 часа, 48 часов и 72 часа.
Результаты.
Для краткости показаны только результаты для образцов, хранящихся при 25°С. Соответствующие результаты были получены для образцов, хранящихся при 15°С, 20°С и 30°С.
| Молочная основа | Конечный pH | Дозировка лактазы (LAU/л) | 24 часа (%) | 48 часов (%) | 72 часа (%) |
| Стандартный | 4,30 | 50 | 2,1 | 1,8 | 1,5 |
| Стандартный | 4,25 | 100 | 1,8 | 1,3 | 0,9 |
| Стандартный | 4,20 | 100 | 1,9 | 1,4 | 1,1 |
| Стандартный | 4,15 | 100 | 1,9 | 1,5 | 1,2 |
| Стандартный | 4,30 | 200 | 1,2 | 0,4 | 0,087 |
| Стандартный | 4,25 | 200 | 1,1 | 0,5 | 0,119 |
| Стандартный | 4,20 | 200 | 1,4 | 0,7 | 0,237 |
- 21 045126
| Стандартный | 4,15 | 200 | 1,4 | 0,7 | 0,317 |
| Стандартный | 4,30 | 300 | 0,7 | 0,055 | 0,010 |
| Стандартный | 4,25 | 300 | 0,8 | 0,102 | 0,017 |
| Стандартный | 4,20 | 300 | 0,9 | 0,2 | 0,037 |
| Стандартный | 4,15 | 300 | 1,0 | о,з | 0,081 |
Пастеризованная иогуртовая основа с рН 4,3; 4,25; 4,20 и 4,15 и без добавленной лактазы имела уровень лактозы 2,57; 2,52; 2,47 и 2,40, соответственно.
Как будет видно из табл. 7, возможно достижение целевого уровня остаточной лактозы менее 0,5% с использованием дозы лактазы 200 LAU/л через 48 часов для образцов с рН 4,3 и 4,25, и с уровнем лактозы менее 0,3% с использованием дозы лактазы 300 LAU/л через 48 часов для всех протестированных образцов.
Пример 10.
Производство напитка на основе кислой сыворотки с низким уровнем лактозы посредством добавления лактазы.
Целью проведенной экспериментальной работы была демонстрация того, что возможно удалить лактозу из пермеата кислой сыворотки и исследовать эффект разных дозировок лактазы, времени реакции и температур.
Молочный субстрат.
| Ингредиенты | Спецификация | Дозировка (г/1000 г) |
| Кислая сыворотка | Пермеат кислой сыворотки (побочный продукт от производства скира) | 800 |
| Сахароза | Nordic Sugar | 70 |
| Вода (ионизированная) | 90 | |
| Пектин НМ | YM-115-H, CP-Kelco | 4,5 |
| Сумма | 979,5 |
Пермеат кислой сыворотки (от ультрафильтрации) представляет собой побочный продукт от производства скира. Пермеат кислой сыворотки имел следующий состав: белок 0,2%, сахара 3,7%, жир 0,01%, зола 0,8%, влажность 94,7%, рН 4,27.
Лактаза.
Лактаза из Bifidobacterium bifidum, имеющая кодированную последовательность SEQ ID NO. 2. Способ.
1. Нагреть кислый пермеат до 72°С/2 мин.
2. Охладить до:
а) 5°С (2 х 1000 мл),
б) 40°С (3 х 1000 мл).
3. Дозирование лактазы:
а) 5°С: 2500 и 5000 LAU/л (2 х 1000 мл),
б) 40°С: 500, 1000 и 2500 LAU/л (3 х 1000 мл).
4. Образцы для проведения анализа лактозы.
а) До добавления лактазы.
б) При 40°С и 2500 LAU/л: каждый 1 час с 3 до 7 часов и 24 часа.
в) Другие образцы: 24 часа.
5. Переработка напитка на основе кислой сыворотки.
а) Добавление раствора пектина НМ, корригента и сахарозы.
б) Доведение рН до 3,9 лимонной кислотой.
в) Нагревание до 80°С 2 мин.
г) Гомогенизация при 15 МПа при 80°С.
д) Заполнение в бутыли.
Результаты.
-
Claims (5)
- Таблица 8Остаточные уровни лактозы (г/л) для тестированных образцовТемп. 5°С 5°СЛактаза (LAU/л) 0 2500 50000 часов 2,72351 час2 часа3 часа4 часа5 часов6 часов7 часов24 часа 0,5646 0,101840°С 40°С 40°С0 500 1000 25002,72351,77930,55270,31170,16810,13760,4381 0,0830 0,0378Как будет видно из табл. 8, было возможным снижение уровня лактозы до количества около 0,1 г/л для тестированных образцов при температуре 40°С и для концентраций лактазы 1000 и 2500 LAU/л, а также при температуре 5°С для концентрации лактазы 5000 LAU/л. Для двух других образцов было возможным снижение уровня лактозы до уровней менее 0,5 г/л.Перечень последовательностей.SEQ ID NO. 1: показывает последовательность мутанта SEQ ID NO. 4.SEQ ID NO. 2: показывает последовательность мутанта SEQ ID NO. 4.SEQ ID NO. 3: показывает последовательность лактазы из Bifidobacterium bifidum DSM20215.SEQ ID NO. 4: показывает последовательность лактазы из Bifidobacterium bifidum NCIMB41171, нуклеотидная последовательность которой указана в NCBI (Национальный центр биотехнологической информации США) с номером доступа DQ448279.SEQ ID NO. 4 обсуждается в следующих ссылках, где она называется bbgIII:Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:1365-1372, T K Goulas et al,Appl Microbiol Biotechnol (2009) 82:1079-1088, T Goulas et al,Appl Microbiol Biotechnol (2009) 84:899-907, T Goulas et al.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения ферментированного молочного продукта, включающий стадии:а) ферментация молочного субстрата с использованием заквасочной культуры молочнокислых бактерий с получением ферментированного заквасочной культурой молочного продукта, который имеет рН от 3,0 до 5,0 и содержание лактозы по меньшей мере 1,5 мг/мл,б) подвергание указанного ферментированного заквасочной культурой молочного продукта термической обработке таким образом, чтобы снизить количество бактерий заквасочной культуры до не более чем 1х102 КОЕ/г (колониеобразующих единиц), с получением термически обработанного ферментированного молочного продукта,в) добавление в указанный термически обработанный ферментированный молочный продукт лактазы, которая сохраняет свою активность при рН 5,0 и температуре 37°С на уровне по меньшей мере 5% по сравнению с ее активностью при оптимальном для лактазы рН 6,5, с получением лактазосодержащего ферментированного молочного продукта, иг) выдерживание указанного лактазосодержащего ферментированного молочного продукта при температуре от 2 до 25 °С в течение от 1 до 7 суток для гидролиза лактозы.
- 2. Способ по п.1, где лактазосодержащий ферментированный молочный продукт выдерживают при температуре 15°С.
- 3. Способ по п.1 или 2, где лактазосодержащий ферментированный молочный продукт выдерживают в течение 7 суток.
- 4. Способ по любому из пп.1-3, где ферментированный заквасочной культурой молочный продукт подвергают стадии концентрирования для разделения указанного ферментированного заквасочной культурой молочного продукта на концентрированную фракцию и фракцию отделенной кислой сыворотки, где указанную фракцию отделенной кислой сыворотки, но не концентрированную фракцию, подвергают последующим стадиям данного способа.
- 5. Лактазосодержащий ферментированный молочный продукт, полученный способом по п.1, где-
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16174288.7 | 2016-06-14 | ||
| EP16194075.4 | 2016-10-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045126B1 true EA045126B1 (ru) | 2023-10-30 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10555541B2 (en) | Method for producing a dairy product | |
| EP3568024B1 (en) | Process for producing a fermented milk product | |
| US11653659B2 (en) | Fermented milk product with a reduced content of lactose | |
| US20090061046A1 (en) | Method for producing an acidified milk drink | |
| US20220167637A1 (en) | Method for Producing an Acidified Milk Product | |
| EA045126B1 (ru) | Ферментированный молочный продукт с пониженным содержанием лактозы | |
| EA042481B1 (ru) | Способ получения ферментированного молочного продукта |