BR112019024124A2 - Composições de beta-galactosidase glicosiladas tendo atividade transgalactosilante melhorada - Google Patents
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Abstract
a presente invenção se relaciona com composições, particularmente composições líquidas, compreendendo polipeptídeos tendo atividade de beta-galactosidase, métodos de produção das referidas composições e uso das composições para preparação de, p.ex., produtos lácteos. os polipeptídeos tendo atividade de beta-galactosidase são modificados por glicação de resíduos de lisina e/ou arginina por incubação da enzima na presença de açúcares redutores, opcionalmente combinada com um tratamento térmico. deste modo, a atividade transgalactosilante é aumentada.
Description
“COMPOSIÇÕES DE BETA-GALACTOSIDASE GLICOSILADAS TENDO ATIVIDADE TRANSGALACTOSILANTE MELHORADA”
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0001] A presente invenção compreende uma listagem de sequências, que é incorporada por referência aqui.
ÁREA TÉCNICA
[0002] A presente invenção se relaciona com composições, particularmente composições liquidas, compreendendo enzimas, métodos de produção das composições e uso das mesmas para preparação de, p.ex., produtos lácteos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] A beta-galactosidase, também conhecida como lactase, é uma enzima conhecida por hidrolisar os resíduos de beta-Dgalactose não redutores terminais em beta-D-galactosidases. Mais particularmente, sob condições de reação normais, a enzima hidrolisa seu substrato de lactose até aos monossacarídeos componentes D-glucose e Dgalactose. Sob certas condições, certas beta-galactosidases têm a capacidade de transferir galactose para o grupo hidroxila de glucose ou galactose para formar galacto-oligossacarídeos (GOS) em um processo chamado transgalactosilação.
[0004] Uma lactase de Bifidobacterium bifidum foi descrita tendo uma elevada atividade transgalactosilante, tanto na forma de comprimento total e especialmente quando truncada a partir da extremidade C-terminal (ver, p.ex., Jorgensen et al. (2001), Appl. Microbiol. Biotechnol., 57: 647-652 ou patente EP 1 283 876).
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[0005] Em WO 2009/071539 descrevemos um fragmento diferentemente truncado em comparação com Jorgensen. WO 2009/071539 divulga que o fragmento C-terminalmente truncado da lactase extracelular de Bifidobacterium bifidum, que foi originalmente isolada e patenteada quanto à sua capacidade de produzir elevadas quantidades de galactooligossacarídeos a partir de lactose, pode ser usado com muito sucesso para hidrólise de lactose no leite. Quando testada em água + 100 g/L de lactose a 37 °C, a enzima produz galacto-oligossacarídeos com elevada eficiência como descrito na técnica prévia. No entanto, quando testada no leite, a razão entre atividade hidrolítica e transgalactosilante mudou dramaticamente, resultando em hidrólise eficiente e produção muito baixa de galactooligossacarídeos.
[0006] WO 2013/182686 descreve ainda adicionalmente fragmentos diferentemente truncados em comparação com Jorgensen, descritos como produtores eficientes de GOS quando incubados com lactose mesmo a baixos níveis de lactose tal como em um produto à base de leite. WO 2013/182686 descreve também composições compreendendo um estabilizante.
[0007] WO 2015/132349 descreve composições de lactase líquidas compreendendo lactase e adicionalmente compreendendo L-lactato de sódio, cálcio ou potássio ou uma sua combinação e opcionalmente um açúcar.
[0008] Permanece uma necessidade de se desenvolverem enzimas que sejam produtores eficientes de GOS e formulações industrialmente importantes das mesmas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma formulação compreendendo um polipeptídeo tendo atividade de beta
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3/69 galactosidase e, pelo menos, 30% em peso de um açúcar redutor, preferencialmente frutose, galactose, glucose ou lactose.
[0010] Em outra modalidade, a invenção proporciona um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase tendo sido modificado por glicação de, pelo menos, um resíduo de lisina e/ou arginina.
[0011] Em outra modalidade, a invenção proporciona um método de modificação de um polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase compreendendo contato do polipeptídeo com um açúcar redutor, preferencialmente frutose, glucose, galactose ou lactose, durante um tempo e temperaturas suficientes para produzir um polipeptídeo modificado por glicação.
[0012] Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para produção de galacto-oligossacarídeos (GOS) compreendendo contato de uma formulação da invenção ou um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase que foi modificado por um método da invenção com lactose.
[0013] Em ainda outra modalidade, a invenção proporciona um método para produção de galacto-oligossacarídeos compreendendo contato de um polipeptídeo tendo uma sequência compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1, com lactose, sob condições de elevada temperatura e elevada concentração inicial de lactose.
DIVULGAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0014] Apesar das propriedades hidrolíticas dominantes de certas enzimas beta-galactosidases ou lactases, estas enzimas podem ser forçadas a ter propriedades transferidoras a, p.ex., condições ricas em lactose e temperatura elevada. Descobrimos surpreendentemente que, quando sujeita a uma pré-incubação, a enzima previamente com domínio hidrolítico pode ser convertida em uma enzima transferidora, que é também
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4/69 capaz de produzir GOS eficientemente a temperaturas mais baixas do que a enzima não processada. A pré-incubação resulta assim surpreendentemente em uma enzima produtora de GOS mais robusta devido às suas capacidades transferidoras intensificadas (atividade de transgalactosilase).
[0015] Sem desejar estar limitado pela teoria se acredita que estas condições de incubação resultam em glicação da beta-galactosidase, que resulta em propriedades transferidoras aumentadas. Com anexação covalente da fração de açúcar, a beta-galactosidase é convertida de uma enzima hidrolisante para uma transferidora tendo atividade de transgalactosilase.
Beta-Galactosidase
[0016] As beta-galactosidases da família das glicosídeo hidrolases 2 (GH2) são enzimas com atuação exo, que hidrolisam resíduos de beta-D-galactose não redutores terminais em beta-D-galactosídeos, p.ex., a lactose é hidrolisada em galactose e glucose. Pertencem à classe de enzimas EC 3.2.1.23 com o nome oficial beta-D-galactosídeo galactohidrolase. Um nome comum usado para esta enzima é lactase, pois a lactose é o substrato industrial comum. Para além da hidrólise, esta classe de enzimas é também capaz de transferir galactose para outros açúcares e deste modo produzir galacto-oligossacarídeos (GOS). As diferentes enzimas GH2 têm várias preferências pela atividade hidrolítica ou de betagalactosidase e atividade de transgalactosilase e a preferência pode ser expressa em termos da sua capacidade de produção de GOS, tal como pela razão entre atividade transgalactosilante e atividade de beta-galactosidase.
[0017] No presente contexto, o termo “beta-galactosidase” significa qualquer glicosídeo hidrolase tendo a capacidade de hidrolisar o dissacarídeo lactose nos seus monômeros constituintes galactose e glucose. As enzimas atribuídas à subclasse EC 3.2.1.108, também chamadas
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5/69 lactases, são também consideradas uma beta-galactosidase no contexto da presente invenção. No contexto da invenção, a atividade hidrolisante de lactose da beta-galactosidase pode ser referida como sua atividade de lactase ou sua atividade de beta-galactosidase.
[0018] No contexto da presente invenção, o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase pertence preferencialmente à classe de enzimas EC 3.2.1.23 ou EC 3.2.1.108, preferencialmente 3.2.1.23. O polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase pertence preferencialmente à família de glicosídeo hidrolases 2 (GH2), mais preferencialmente à família de glicosídeo hidrolases GH2_5.
[0019] Em certas aplicações, combinações de polipeptídeo tendo predominantemente atividade transgalactosilante e predominantemente atividade hidrolisante podem ser contempladas. Isto pode ser especialmente útil quando existe um desejo de reduzir a lactose residual após tratamento com o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase, por exemplo a baixos níveis de lactose.
[0020] Quando se considera a reação do polipeptídeo em, p.ex., leite, carboidratos estão inicialmente presentes na forma de lactose, um dissacarídeo composto por galactose e glucose que é encontrado no leite. Na formação de GOS, sucessivas moléculas de galactose são adicionadas à lactose e, depois, após incubação prolongada uma mistura dos vários carboidratos está presente (glucose, galactose e ~30 di- e polissacarídeos diferentes).
[0021] O termo “dissacarídeo” como usado aqui significa duas unidades de monossacarídeo unidas por uma ligação covalente conhecida como uma ligação glicosídica formada através de uma reação de desidratação, resultando na perda de um átomo de hidrogênio de um monossacarídeo e um grupo hidroxila do outro. Em um aspecto, o dissacarídeo é celobiose, fucose, lactose, lactulose, maltose, ramnose ou
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6/69 sacarose, o mais preferencialmente lactose.
[0022] Como usado aqui, o termo “transgalactosilase” significa uma enzima que é capaz de transferir galactose para os grupos hidroxila de D-galactose (Gal) ou D-glucose (Glc) por meio do que são produzidos galacto-oligossacarídeos. Em uma modalidade, a atividade de transgalactosilase é identificada por reação da enzima em lactose na qual a quantidade de galactose gerada é menor do que a quantidade de glucose gerada em um dado momento.
[0023] Mais particularmente, a atividade de transgalactosilase ou preferência para uma enzima hidrolisar lactose ou para produzir GOS pode ser avaliada como a quantidade de glucose menos galactose gerada em qualquer dado momento durante reação ou por quantificação direta de GOS gerados durante a reação. Esta medição pode ser realizada por um de vários modos incluindo os métodos mostrados nos Exemplos aqui.
[0024] Quando se avalia a atividade transgalactosilante versus atividade de beta-galactosidase, a atividade de beta-galactosidase é medida como concentração de galactose gerada em qualquer ponto temporal durante a reação.
[0025] No presente contexto, a produção de GOS de um polipeptídeo é medida como (Glucose - Galactose) Galactose
[0026] /.e., a razão entre atividade transgalactosilante e atividade de beta-galactosidase.
[0027] Preferencialmente, a razão entre atividade transgalactosilante e atividade de beta-galactosidase é pelo menos 1, pelo menos 2,5, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11 ou
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7/69 pelo menos 12 como medida em condições ricas em lactose.
[0028] Os polipeptideos tendo atividade de betagalactosidase úteis de acordo com a presente invenção podem ter origem animal, vegetal ou microbiana. Polipeptideos preferenciais são obtidos a partir de fontes microbianas, em particular a partir de um fungo filamentoso ou levedura ou a partir de uma bactéria.
[0029] O polipeptídeo pode, p.ex., ser derivado de uma estirpe de Agaricus, p.ex. A. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, p.ex. A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, p.ex. D. discoideum; Kluveromyces, p.ex. K. fragilis, K. lactis; Mucor, p.ex. M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, p.ex. N. crassa; Rhizomucor, p.ex. R. pusillus; Rhizopus, p.ex. R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, p.ex. S. libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, p.ex. T. rubrum; Whetzelinia, p.ex. I/IZ. sclerotiorum; Bacillus, p.ex. B. sp. B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. subtil is, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, p.ex. B. animal is, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum; Chryseobacterium; Citrobacter, p.ex. C. freundii; Clostridium, p.ex. C. perfringens; Diplodia, p.ex. D. gossypina; Enterobacter, p.ex. E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, p.ex. E. herbicola; Escherichia, p.ex. E. coli; Klebsiella, p.ex. K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neurospora, p.ex. N. crassa; Proteus, p.ex. P. vulgaris; Providencia, p.ex. P. stuartii; Pycnoporus, p.ex. Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus, p.ex. R. torques; Salmonella, p.ex. S. typhimurium; Serratia, p.ex. S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, p.ex. S. flexneri; Streptomyces, p.ex. S. antibioticus, S. castaneoglobisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, p.ex. T. reesei, T. viride; Yersinia, p.ex. Y. enterocolitica.
[0030] Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo é
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8/69 uma beta-galactosidase de uma bactéria, p.ex., da família Bifidobacteriaceae, tal como do gênero Bifidobacterium, tal como de uma estirpe de B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis ou B. longum. Em uma modalidade mais preferencial, o polipeptídeo é uma betagalactosidase de Bifidobacterium bifidum.
[0031] Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo é uma beta-galactosidase de uma bactéria, p.ex., da família Bacillaceae, tal como do gênero Bacillus, tal como de uma estirpe de B. sp. B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. subtil is, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, p.ex. B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum. Em uma modalidade mais preferencial, o polipeptídeo é uma beta-galactosidase de Bacillus circulans ou Bacillus infantis.
[0032] Um polipeptídeo preferencial é uma betagalactosidase tendo uma sequência que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase. Tal fragmento de SEQ ID NO: 1 pode ser qualquer fragmento de SEQ ID NO: 1 tendo atividade de beta-galactosidase.
[0033] Em uma modalidade preferencial, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica aos aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase. Em uma modalidade mais preferencial, a enzima compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 281931 de SEQ ID NO: 2.
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[0034] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3.
[0035] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica a SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 4.
[0036] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica a SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 5.
[0037] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica a SEQ ID NO: 6 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 6.
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[0038] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica a SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 7.
[0039] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica a SEQ ID NO: 8 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 8.
[0040] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 50% idêntica a SEQ ID NO: 9 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 9.
[0041] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica a SEQ ID NO: 10 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ
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ID NO: 10.
[0042] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica a SEQ ID NO: 11 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 11.
[0043] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica a SEQ ID NO: 12 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 12.
[0044] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 50% idêntica a SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 13.
[0045] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 50% idêntica a SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento tendo atividade de beta
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12/69 galactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 14.
[0046] Em outra modalidade, um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a ser usado em um método da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50% idêntica a SEQ ID NO: 15 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica a SEQ ID NO: 15.
[0047] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada como o resultado de “identidade mais longa” usando o algoritmo de NeedlemanWunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 6.6.0 ou posterior. Os parâmetros usados são uma penalidade de abertura de lacunas de 10, uma penalidade de extensão de lacunas de 0.5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). De modo a que o programa de Needle relate a identidade mais longa, a opção -nobrief tem de ser especificada na linha de comando. O resultado de Needle marcado “identificada mais longa” é calculado como se segue:
(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento Número Total de Lacunas no Alinhamento).
[0048] Uma beta-galactosidase pode ser extracelular. Podem ter uma sequência sinal no seu terminal N, que é separada por
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13/69 divagem durante a secreção.
[0049] Um polipeptídeo tenso beta-galactosidase pode ser derivado de qualquer uma das fontes mencionadas aqui. O termo “derivado” significa em este contexto que o polipeptídeo pode ter sido isolado de um organismo onde está presente nativamente, i.e., a identidade da sequência de aminoácidos da enzima é idêntica a um polipeptídeo nativo. O termo “derivado” significa também que os polipeptídeos podem ter sido produzidas recombinantemente em um organismo hospedeiro, tendo o polipeptídeo recombinantemente produzido uma identidade idêntica a um polipeptídeo nativo ou tendo uma sequência de aminoácidos modificada, p.ex., tendo um ou mais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos, i.e., um polipeptídeo recombinantemente produzido que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácidos nativa. Dentro do significado de um polipeptídeo nativo estão incluídas variantes naturais. Além disso, o termo “derivado” inclui polipeptídeo produzidos sinteticamente por, p.ex., síntese de peptídeos. O termo “derivado” engloba também enzimas que foram modificadas p.ex., por glicosilação, fosforilação, etc., quer in v/voquer in vitro. No que diz respeito ao polipeptídeo recombinantemente produzido, o termo “derivado” se refere à identidade do polipeptídeo e não à identidade do organismo hospedeiro no qual é produzido recombinantemente.
[0050] O polipeptídeo tendo beta-galactosidase pode ser obtido de um microrganismo por uso de qualquer técnica adequada. Por exemplo, uma preparação de polipeptídeo de beta-galactosidase pode ser obtida por fermentação de um microrganismo adequado e isolamento subsequente de uma preparação de lactase do caldo fermentado resultante ou microrganismo por métodos conhecidos na técnica. O polipeptídeo tendo beta-galactosidase pode ser também obtido por uso de técnicas de DNA recombinante. Tal método compreende normalmente cultivo de uma célula hospedeira transformada com um vetor de DNA recombinante
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14/69 compreendendo uma sequência de DNA codificando a lactase em questão e estando a sequência de DNA operacionalmente ligada com um sinal de expressão apropriado tal que seja capaz de expressar a beta-galactosidase em um meio de cultura sob condições permitindo a expressão do polipeptídeo e recuperação do polipeptídeo a partir da cultura. A sequência de DNA pode ser também incorporada no genoma da célula hospedeira. A sequência de DNA pode ter origem genômica, cDNA ou sintética, ou quaisquer combinações destas, e pode ser isolada ou sintetizada de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0051] Um polipeptídeo tendo beta-galactosidase pode ser purificado. O termo “purificado” como usado aqui abrange proteína de enzima beta-galactosidase essencialmente isenta de componentes insolúveis do organismo de produção. O termo “purificado” abrange também cobre proteína de enzima beta-galactosidase essencialmente isenta de componentes insolúveis do organismo nativo do qual é obtida. Preferencialmente é também separada de alguns dos componentes solúveis do organismo e meio de cultura dos quais é derivada. Mais preferencialmente é separada por um ou mais das operações unitárias: filtração, precipitação ou cromatografia.
[0052] Conformemente, o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase pode ser purificada, viz. somente quantidades vestigiais de outras proteínas estando presentes. A expressão “outras proteínas” se relaciona em particular com outras enzimas. O termo “purificado” como usado aqui se refere também à remoção de outros componentes, particularmente outras proteínas e o mais particularmente outras enzimas presentes na célula de origem da beta-galactosidase. O polipeptídeo tendo beta-galactosidase pode ser “substancialmente puro”, i.e., isento de outros componentes do organismo no qual é produzido, i.e., p.ex., um organismo hospedeiro para beta-galactosidase recombinantemente produzida.
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Preferencialmente, a beta-galactosidase é uma preparação de proteína de enzima pelo menos 40% (p/p) pura, mais preferencialmente pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou mesmo pelo menos 90% pura.
[0053] O termo polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase inclui quaisquer compostos auxiliares que possam ser necessários para a atividade catalítica, tal como, p.ex., um aceitador ou cofator apropriado, que pode ou não estar naturalmente presente no sistema de reação.
[0054] O polipeptídeo pode estar em qualquer forma adequada para uso em questão, tal como, p.ex., na forma de um pó ou granulado seco, um granulado não poeirento, um líquido, um líquido estabilizado ou em enzima protegida.
[0055] O polipeptídeo é adicionado em uma quantidade adequada para se alcançar o grau desejado de hidrólise de lactose sob as condições de reação escolhidas. O polipeptídeo pode ser adicionado a uma concentração de entre 100 e 15,000 LAU(C) por litro de substrato à base de leite, preferencialmente entre 100-10,000 LAU(C) por litro de substrato à base de leite. Concentrações preferenciais adicionais incluem, p.ex., 100 LAU(C)/L, 250 LAU(C)/L, 500 LAU(C)/L, 750 LAU(C)/L, 1000 LAU(C)/L, 1500 LAU(C)/L, 2000 LAU(C)/L, 5000 LAU(C)/L, 6000 LAU(C)/L, 7000 LAU(C)/L, 8000 LAU(C)/L, 9000 LAU(C)/L, 10,000 LAU(C)/L, 11,000 LAU(C)/L, 12,000 LAU(C)/L, 13,000 LAU(C)/L, 14,000 LAU(C)/L ou 15,000 LAU(C)/L.
[0056] A atividade em LAU(C) de uma beta-galactosidase específica pode ser determinada por medição direta de glucose liberada a partir de lactose. O perito saberá como determinar tal atividade. Alternativamente, a atividade pode ser determinada por uso do ensaio de atividade descrito nos Métodos e Exemplos do presente pedido. Aqui, a atividade é obtida por comparação com uma curva padrão operada com uma beta-galactosidase de atividade conhecida, e a atividade da amostra
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16/69 desconhecida calculada a partir disto.
[0057] A atividade em LAU(B) de uma beta-galactosidase específica pode ser determinada por medição direta de o-nitrofenila (ONP) liberada a partir de β-D-galactopiranosídeo de o-nitrofenila (ONPG) em um tampão contendo substrato a 1,46 mg/mL em MES a 0,05 M, MgSO4 7H2O a 1 mM, Brij 35 a 450 mg/L a pH 6,5 e 30 °C. Após incubação de 600 segundos, a reação é parada por adição de Na2COs a 0,2 M e a ONP liberada é medida a 405 nm após incubação de 126 segundos. O perito saberá como executar este ensaio e determinar tal atividade. Aqui, a atividade é obtida por comparação com uma curva padrão operada com uma lactase de atividade conhecida, e a atividade da amostra desconhecida calculada a partir disto. A lactase de atividade conhecida pode, p.ex., ser Saphera® obtida a partir da Novozymes A/S, Dinamarca.
[0058] O perito saberá como determinar a atividade de lactase a diferentes pH e temperatura. A atividade de lactase a diferentes pH e temperatura é preferencialmente determinada por uso de um método como descrito nos Exemplos do presente pedido.
[0059] Em um aspecto, 0 polipeptídeo é um fragmento tendo um ou mais (vários) aminoácidos deletados do terminal amino ou carboxila do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 em que 0 fragmento tem atividade de beta-galactosidase. Fragmentos que são truncações carbóxi-terminais são particularmente preferenciais.
[0060] Um fragmento de beta-galactosidase contém, pelo menos, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, ou 1300 resíduos de aminoácidos.
[0061] Em um aspecto, a beta-galactosidase é como descrita em WO 2013/182686.
[0062] Em um aspecto, a beta-galactosidase é como descrita em WO 2015/132349.
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[0063] Em aspecto, o beta-galactosidase inclui um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 e um ou mais fragmentos tendo atividade de beta-galactosidase, tal como pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco fragmentos.
Glicacão
[0064] Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase foi modificado por glicação.
[0065] Sem desejar estar limitado pela teoria foi surpreendentemente descoberto que a glicação da beta-galactosidase converte o polipeptídeo de uma enzima mais hidrolisante para uma mais transferidora tendo atividade de transgalactosilase.
[0066] “Glicação” como usada aqui se refere à anexação covalente de um carboidrato a uma proteína. A anexação de carboidratos pode ser através de uma cadeia lateral de, p.ex., arginina, lisina ou terminal N da enzima. Preferencialmente, a anexação de carboidratos é através de uma cadeia lateral de arginina ou lisina.
[0067] A glicação é por vezes referida como glicosilação (não enzimática). No contexto da presente invenção, glicosilação e glicação são usadas indistintamente e a glicosilação pode ser não enzimática.
[0068] Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase foi modificado por glicação de, pelo menos, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 resíduos do polipeptídeo.
[0069] Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase foi modificado por glicação de, pelo menos, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 resíduos de lisina e/ou arginina do polipeptídeo.
[0070] Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase foi modificado por glicação de, pelo menos, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% dos
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18/69 resíduos de lisina e/ou arginina do polipeptídeo. Em uma modalidade, o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase foi modificado por glicação de, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 resíduos de lisina e/ou arginina do polipeptídeo.
[0071] Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase é modificado por glicação de, pelo menos, 1%, preferencialmente pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5%, ainda mais preferencialmente pelo menos 10%, o mais preferencialmente pelo menos 20%, dos resíduos de lisina e arginina do polipeptídeo. Para evitar qualquer dúvida possível, isto significa que pelo menos 1%, preferencialmente pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5%, ainda mais preferencialmente pelo menos 10%, o mais preferencialmente pelo menos 20%, do número total de resíduos de lisina e arginina do polipeptídeo são modificados por glicação.
[0072] Em outra modalidade preferencial, um digerido por tripsina do polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase resultaria em uma percentagem de peptídeos digeridos por tripsina glicados de pelo menos 1%, preferencialmente pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5%, pelo menos 10% ou pelo menos 20%.
[0073] Em uma modalidade, a incubação sob condições adequadas como detalhadas em baixo resulta na glicação de alguns dos, substancialmente todos ou mesmo todos os resíduos superficiais de lisina e/ou arginina. Novamente sem deseja estar limitado pela teoria se acredita que alguns dos, substancialmente todos ou mesmo todos os resíduos glicados estão localizados na direção da extremidade C-terminal do polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase.
Incubação Resultando em Glicação
[0074] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de modificação de um polipeptídeo tendo atividade de beta
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19/69 galactosidase compreendendo contato do polipeptídeo com um açúcar durante um tempo e temperaturas suficientes para produzir um polipeptídeo modificado por glicação.
[0075] Em uma modalidade, o polipeptídeo é contatado com uma solução de 5-90% em peso de açúcar a pH 5-10 durante um tempo de 3-20 horas a uma temperatura de 20-80 °C. Açúcares preferenciais são açúcares redutoras como apresentados em mais detalhe em baixo, e glucose é preferencialmente preferencial.
[0076] Condições adequadas incluem contato do polipeptídeo com uma solução de 5-90% em peso de açúcar, tal como 3090% em peso e, em particular, 30-70% em peso, p.ex., 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ou 90% de açúcar.
[0077] Condições adequadas incluem contato do polipeptídeo a um pH na gama de 5-10, tal como pH 5-8, p.ex., pH 5, pH 5,5, pH 6, pH 6,5, pH 7, pH 7,5, pH 8, pH 8,5, pH 9, pH 9,5 ou pH 10.
[0078] Condições adequadas incluem contato do polipeptídeo durante um tempo na gama de 3-20 horas, tal como na gama de 6-16 horas, p.ex., 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 4,5 horas, 5 horas, 5,5 horas, 6 horas, 6,5 horas, 7 horas, 7,5 horas, 8 horas, 8,5 horas, 9 horas, 9,5 horas, 10 horas, 10,5 horas, 11 horas, 11,5 horas, 12 horas, 12,5 horas, 13 horas, 13,5 horas, 14 horas, 14,5 horas, 15 horas, 15,5 horas, 16 horas, 16,5 horas, 17 horas, 17,5 horas, 18 horas, 18,5 horas, 19 horas, 19,5 horas ou 20 horas.
[0079] Condições adequadas incluem contato do polipeptídeo a uma temperatura na gama de 20-80 °C, tal como na gama de 20-50 °C, alternativamente na gama de 40-80 °C, em particular, 50-70 °C ou, alternativamente, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C ou 80 °C.
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[0080] Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase é contatado com um açúcar redutor a pH 5-8, preferencialmente pH 6-7, durante um tempo de 3-100 horas, preferencialmente 15-80 horas, a uma temperatura de 50-80 °C, preferencialmente 50-70 °C.
[0081] O perito saberá como ajustar o tempo do contato com o açúcar de acordo com a quantidade de enzima adicionada e a temperatura. Em geral, se for adicionada mais enzima, o tempo de contato pode ser reduzido. E, em geral, se a temperatura de reação for aumentada, o tempo de contato pode ser reduzido. Dependendo das condições de armazenamento da enzima após o contato com o açúcar, o processo de glicação pode continuar na prateleira. Portanto, se a temperatura de prateleira da enzima for relativamente elevada, o tempo de reação com o açúcar a uma temperatura elevada especificada pode ser reduzido uma vez que o processo de glicação continuará durante o transporte e armazenamento da enzima antes de ser usado pelo consumidor final, que pode ser, p.ex., uma empresa de laticínios ou uma empresa produzindo GOS como um ingrediente.
[0082] Em outra modalidade preferencial, o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase é contatado com 30-90% em peso, preferencialmente 40-65% em peso, de um açúcar redutor.
Açúcar
[0083] O açúcar na formulação de beta-galactosidase pode incluir monossacarídeos, dissacarídeos ou oligossacarídeos. Combinações de açúcares são também contempladas.
[0084] Preferencialmente, o açúcar é um açúcar redutor. Um açúcar redutor reage com um resíduo de aminoácido da beta-galactosidase através da reação de Maillard.
[0085] Açúcares redutores exemplificativos incluem os
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21/69 monossacarídeos frutose, galactose, glucose, gliceraldeído, ribose, xilose. Frutose, galactose e/ou glucose e mais particularmente frutose e/ou glucose são preferenciais.
[0086] Outros açúcares redutores exemplificativos incluem dissacarídeos tais como celobiose, lactose e maltose, preferencialmente lactose e/ou maltose. Polímeros de glucose, p.ex., maltodextrina e glicogênio são também exemplificativos.
[0087] A presença de um açúcar redutor pode ser detectada por muitos testes bem conhecidos incluindo o uso de reagente de Benedict e/ou reagente de Tollen.
Formulação
[0088] A formulação de acordo com uma modalidade da invenção pode compreender uma composição líquida. Composições líquidas são preferenciais para facilidade de uso.
[0089] Em uma modalidade alternativa, a formulação compreende uma composição sólida, p.ex., um pó ou um granulado.
[0090] Em uma modalidade, a formulação ou composição de acordo com a invenção compreende um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase e pelo menos 30% em peso, 31% em peso, 32% em peso, 33% em peso, 38% em peso, 43% em peso, 48% em peso, 53% em peso, 58% em peso, 63% em peso, 68% em peso, 73% em peso, 78% em peso, 34% em peso, 39% em peso, 44% em peso, 49% em peso, 54% em peso, 59% em peso, 64% em peso, 69% em peso, 74% em peso, 79% em peso, 35% em peso, 40% em peso, 45% em peso, 50% em peso, 55% em peso, 60% em peso, 65% em peso, 70% em peso, 75% em peso, 80% em peso, 36% em peso, 41% em peso, 46% em peso, 51% em peso, 56% em peso, 61% em peso, 66% em peso, 71% em peso, 76% em peso, 81% em peso, 37% em peso, 42% em peso, 47% em peso, 52% em peso, 57% em peso, 62% em peso, 67% em peso, 72% em peso, 77% em peso, 82% em
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22/69 peso, 83% em peso, 84% em peso, 85% em peso, 86% em peso, 87% em peso, 88% em peso, 89% em peso ou 90% em peso de açúcar. Preferencialmente, uma tal composição de beta-galactosidase compreende 200-20,000 LAU(C) porg.
[0091] Em uma formulação adequada, a composição compreende polipeptídeo de enzima tendo atividade de beta-galactosidase e pelo menos 30% em peso, 31% em peso, 32% em peso, 33% em peso, 34% em peso, 35% em peso, 36% em peso, 37% em peso, 38% em peso,
39% em peso, 40% em peso, 41% em peso, 42% em peso, 43% em peso,
44% em peso, 45% em peso, 46% em peso, 47% em peso, 48% em peso,
49% em peso, 50% em peso, 51% em peso, 52% em peso, 53% em peso,
54% em peso, 55% em peso, 56% em peso, 57% em peso, 58% em peso,
59% em peso, 60% em peso, 61% em peso, 62% em peso, 63% em peso,
64% em peso, 65% em peso, 66% em peso, 67% em peso, 68% em peso,
69% em peso, 70% em peso, 71% em peso, 72% em peso, 73% em peso,
74% em peso, 75% em peso, 76% em peso, 77% em peso, 78% em peso,
79% em peso ou 80% em peso de açúcar. Preferencialmente, uma tal composição de beta-galactosidase compreende 200-20,000 LAU(C) por g.
[0092] Uma composição de beta-galactosidase adequada compreende 200-20,000 LAU(C) por g e pelo menos 35% em peso, 36% em peso, 37% em peso, 38% em peso, 39% em peso, 40% em peso, 41% em peso, 42% em peso, 43% em peso, 44% em peso, 45% em peso, 46% em peso, 47% em peso, 48% em peso, 49% em peso, 50% em peso, 51% em peso, 52% em peso, 53% em peso, 54% em peso, 55% em peso, 56% em peso, 57% em peso, 58% em peso, 59% em peso, 60% em peso, 61% em peso, 62% em peso, 63% em peso, 64% em peso ou 65% em peso de açúcar, preferencialmente na gama de 40-80% em peso de açúcar. Uma composição de beta-galactosidase preferencial compreende 200-20,000 LAU(C) por g e preferencialmente 40% em peso, 60% em peso ou 80% em
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23/69 peso de glucose.
[0093] Em uma modalidade, a formulação é uma formulação líquida que compreende 200-15,000 LAU(C)/g, preferencialmente 50010,000 LAU(C)/g.
[0094] Em uma modalidade, a formulação é uma formulação sólida que compreende 1,000-20,000 LAU(C)/g, preferencialmente 3,00015,000 LAU(C)/g.
[0095] Em uma modalidade, a formulação compreende adicionalmente glicerol.
[0096] No entanto, em uma modalidade preferencial, a formulação está isenta de, ou pelo menos substancialmente isenta de, polióis ou dióis, tais como glicerol e/ou sorbitol. A quantidade de poliol ou diol tal como glicerol é preferencialmente menor do que 40% em peso, menor do que 30% em peso, menor do que 25% em peso, menor do que 20% em peso, menor do que 15% em peso, menor do que 10% em peso, o mais preferencialmente menor do que 5% em peso. O mais preferencialmente, a formulação está isenta de poliol ou diol tal como glicerol.
[0097] Em uma modalidade, as formulações aqui são enzimaticamente estáveis. Formulações de enzima líquidas enzimaticamente estáveis são particularmente preferenciais, e formulações de enzima líquidas enzimaticamente estáveis sem uso de glicerol são mais particularmente preferenciais. A estabilidade enzimática é uma medida da taxa à qual a atividade da enzima diminui ao longo do tempo.
[0098] São também preferenciais formulações, especialmente formulações líquidas, que são microbianamente estáveis. A estabilidade microbiana é uma medida da taxa à qual microrganismos indesejados podem proliferar e crescer na composição.
[0099] Em uma modalidade, a formulação compreende adicionalmente cloreto de sódio ou cloreto de potássio, preferencialmente na
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24/69 gama de 0,01-5% em peso, preferencialmente 0,01-3% em peso, mais preferencialmente 0,01-2% em peso.
[0100] Em uma modalidade, a formulação compreende adicionalmente um conservante. Conservantes de grau alimentar são preferenciais, dos quais benzoato, sorbato, parabeno de metila e parabeno de propila são exemplificativos.
[0101] Em uma modalidade alternativa, mas preferencial, a formulação está isenta de conservantes tais como benzoato, sorbato, parabeno de metila e/ou parabeno de propila.
Usos
[0102] A produção de galacto-oligossacarídeos está contemplada sob condições in situ da lactose já presentes no leite, bem como sob condições de elevada concentração inicial de lactose (mais do que 4050% de lactose (p/p)).
[0103] Em uma modalidade, os métodos para produção de galacto-oligossacarídeos compreendem contato de um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase com lactose sob condições de elevada temperatura e elevada concentração inicial de lactose. Em particular, a temperatura pode ser, p.ex., 40-80 °C, tal como 50 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C ou 80 °C. Além do mais, a concentração inicial de lactose pode ser acima de 40% (p/p), tal como 40-50% (p/p), 45% (p/p), 50% (p/p), 55% (p/p), 40-60% (p/p) ou mesmo acima de 60% (p/p), tal como 61% (p/p), 62% (p/p), 63% (p/p), 64% (p/p), 65% (p/p), 66% (p/p), 67% (p/p), 68% (p/p), 69% (p/p), 70% (p/p), 71% (p/p), 72% (p/p), 73% (p/p), 74% (p/p), 75% (p/p) ou 80% (p/p) de lactose.
[0104] Em um aspecto é proporcionado um método para produção de um produto lácteo compreendendo tratamento de um substrato à base de leite compreendendo lactose com um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase como descrito aqui. Tipicamente, sob condições in situ
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25/69 para aplicações de um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase no leite, a concentração inicial de lactose é cerca de 3-10% (p/p) de lactose, p.ex., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% (p/p), o mais tipicamente cerca de 5% (p/p).
[0105] O termo “leite”, no contexto da presente invenção, é para ser entendido como a secreção láctea obtida por ordenha de qualquer mamífero, tal como vacas, ovelhas, cabras, búfalos ou camelos.
[0106] “Substrato à base de leite”, no contexto da presente invenção, pode ser qualquer material de leite cru e/ou processado. Substratos à base de leite úteis incluem, mas não estão limitados a, soluções/suspensões de quaisquer produtos lácteos ou tipo leite compreendendo lactose, tais como leite integral ou com pouca gordura, leite desnatado, soro de leite coalhado, leite em pó reconstituído, leite condensado, soluções de leite em pó, leite UHT, soro de leite, permeado de soro de leite, soro de leite ácido ou nata.
[0107] Preferencialmente, o substrato à base de leite é leite ou uma solução aquosa de leite desnatado em pó. O leite em pó tem tipicamente uma concentração inicial de lactose de 36-52% (p/p).
[0108] O substrato à base de leite pode ser mais concentrado do que leite cru.
[0109] Em uma modalidade, o substrato à base de leite tem uma razão entre proteína e lactose de pelo menos 0,2, preferencialmente pelo menos 0,3, pelo menos 0,4, pelo menos 0,5, pelo menos 0,6 ou, o mais preferencialmente, pelo menos 0,7.
[0110] O substrato à base de leite pode ser homogeneizado e pasteurizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0111] “Homogeneização” como usada aqui significa mistura intensiva para se obter uma suspensão ou emulsão solúvel. Pode ser realizada de modo a quebrar a gordura de leite em tamanhos mais pequenos tal que já não se separe a partir do leite. Isto pode ser alcançado por
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26/69 forçagem do leite a elevada pressão através de pequenos orifícios.
[0112] “Pasteurização” como usada aqui significa redução ou eliminação da presença de organismos vivos, tais como microrganismos, no substrato à base de leite. Preferencialmente, a pasteurização é alcançada por manutenção de uma temperatura especificada durante um período de tempo especificado. A temperatura especificada é usualmente alcançada por aquecimento. A temperatura e duração podem ser selecionadas de modo a matar ou inativar certas bactérias, tais como bactérias prejudiciais, e/ou a inativar enzimas no leite. Um passo de resfriamento rápido pode se seguir. Um “produto lácteo” no contexto da presente invenção pode ser qualquer produto alimenta em que um dos principais constituintes seja à base de leite. Preferencialmente, o principal constituinte é à base de leite. Mais preferencialmente, o principal constituinte é um substrato à base de leite que foi tratado com polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase de acordo com um método da invenção. No contexto da presente invenção, “um dos principais constituintes” significa um constituinte tendo uma matéria seca que constitui mais do que 20%, preferencialmente mais do que 30% ou mais do que 40% da matéria seca total do produto lácteo, ao passo que “o principal constituinte” significa um constituinte tendo uma matéria seca que constitui mais do que 50%, preferencialmente mais do que 60% ou mais do que 70% da matéria seca total do produto lácteo.
[0113] Um produto lácteo de acordo com a invenção pode ser, p.ex., leite desnatado, leite com pouca gordura, leite integral, nata, leite UHT, leite tendo uma vida de prateleira prolongada, um produto lácteo fermentado, queijo, iogurte, manteiga, pasta láctea, soro de leite coalhado, bebida de leite acidificada, nata azeda, bebida à base de soro de leite, sorvete, leite condensado, doce de leite ou uma bebida de leite aromatizada. Um produto lácteo pode ser fabricado por qualquer método conhecido na técnica.
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[0114] Um produto lácteo pode compreender adicionalmente componentes não lácteos, p.ex., componentes vegetais tais como, p.ex., óleo vegetal, proteína vegetal e/ou carboidratos vegetais. Os produtos lácteos podem também compreender aditivos adicionais tais como, p.ex., enzimas, agentes aromatizantes, culturas microbianas tais como culturas probióticas, sais, adoçantes, açúcares, ácidos, fruta, sucos de fruta ou qualquer outro componente conhecido na técnica como um componente de, ou aditivo a, um produto lácteo.
[0115] Em uma modalidade da invenção, um ou mais componentes lácteos e/ou frações lácteas são responsáveis por pelo menos 50% (peso/peso), tal como pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, do produto lácteo.
[0116] Em uma modalidade da invenção, um ou mais substratos à base de leite tendo sido tratados com polipeptídeo de lactase tendo atividade de beta-galactosidase de acordo com um método da invenção são responsáveis por pelo menos 50% (peso/peso), tal como pelo menos 70%, p.ex., pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, do produto lácteo.
[0117] E m uma modalidade da invenção, o produto lácteo é um produto lácteo que não está enriquecido por adição de galactooligossacarídeos pré-produzidos.
[0118] Em uma modalidade da invenção, o substrato à base de leite tratado com enzima não é seco antes de ser usado como um ingrediente no produto lácteo.
[0119] Em uma modalidade da invenção, o produto lácteo é sorvete. No presente contexto, o sorvete pode ser qualquer tipo de sorvete tal como sorvete com muita gordura, sorvete com pouca gordura ou sorvete à base de iogurte ou outros produtos lácteos fermentados. O sorvete pode ser fabricado por qualquer método conhecido na técnica.
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[0120] Em uma modalidade da invenção, o produto lácteo é leite ou leite condensado. O leite condensado tem tipicamente uma concentração de lactose de 10-20% (p/p), tal como 10-16% (p/p) e, em algumas modalidades, 18-18,5% (p/p).
[0121] Em uma modalidade preferencial da invenção, o produto lácteo é leite UHT. Leite UHT no contexto da presente invenção é leite que foi sujeito a um procedimento de esterilização que se destina a matar todos os microrganismos, incluindo os esporos bacterianos. O tratamento UHT (temperatura ultraelevada) pode ser, p.ex., tratamento com calor durante 30 segundos a 130 °C ou tratamento com calor durante um segundo a 145 °C.
[0122] Em uma modalidade preferencial da invenção, o produto lácteo é leite ESL. Leite ESL no contexto da presente invenção é leite que tem uma vida de prateleira prolongada devido à microfiltração e/ou tratamento com calor e que é capaz de permanecer fresco durante pelo menos 15 dias, preferencialmente durante pelo menos 20 dias, na prateleira de armazenamento a 2-5 °C.
[0123] Em outra modalidade preferencial da invenção, o produto lácteo é um produto lácteo fermentado, p.ex., iogurte.
[0124] Um “produto lácteo fermentado” no contexto da presente invenção é para ser entendido como qualquer produto lácteo em que qualquer tipo de fermentação forma parte do processo de produção. Exemplos de produtos lácteos fermentados são produtos como iogurte, soro de leite coalhado, creme fraiche, quark e fromage frais. Um produto lácteo fermentado pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica.
[0125] “Fermentação” no método da presente invenção significa a conversão de carboidratos em álcoois ou ácidos através da ação de um microrganismo. Preferencialmente, a fermentação no método da presente invenção compreende conversão de lactose em ácido láctico.
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[0126] No contexto da presente invenção, “microrganismo” pode incluir qualquer bactéria ou fungo sendo capaz de fermentar o substrato lácteo.
[0127] Os microrganismos usados para a maioria dos produtos lácteos fermentados são selecionados do grupo de bactérias geralmente referidos como bactérias do ácido láctico. Como usado aqui, o termo “bactéria do ácido láctico” designa uma bactéria Gram-positiva, microaerofílica ou anaeróbica, que fermenta açúcares com a produção de ácidos incluindo ácido láctico como o ácido predominantemente produzido, ácido acético e ácido propiônico. As bactérias do ácido láctico industrialmente o mais úteis são encontradas dentro da ordem “Lactobacillales” que inclui Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. e Propionibacterium spp. Adicionalmente, bactérias produtoras do ácido láctico pertencendo ao grupo de bactérias anaeróbicas, bifidobactérias, i.e., Bifidobacterium spp., que são frequentemente usadas como culturas alimentares sozinhas ou em combinação com bactérias do ácido láctico, são geralmente incluídos no grupo de bactérias do ácido láctico.
[0128] As bactérias do ácido láctico são normalmente fornecidas à indústria dos laticínios como culturas congeladas ou liofilizadas para propagação de iniciador a granel ou assim chamadas culturas “Direct Vat Set” (DVS), destinadas para inoculação direta em um vaso ou cuba de fermentação para a produção de um produto lácteo fermentado. Tais culturas são em geral referidas como “culturas iniciadoras” ou “iniciadores”.
[0129] As estirpes de culturas iniciadores comumente usadas de bactérias do ácido láctico são geralmente divididas em organismos mesofílicos tendo temperaturas de crescimento ótimas a cerca de 30 °C e organismos termofílicos tendo temperaturas de crescimento ótimas na gama
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30/69 de cerca de 40 a cerca de 45 °C. Organismos típicos pertencendo ao grupo mesofílico incluem Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactobacillus casei subsp. casei e Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. As espécies bacterianas do ácido láctico termofílicas incluem como exemplos Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e Lactobacillus acidophilus.
[0130] Também as bactérias anaeróbicas pertencendo ao gênero Bifidobacterium incluindo Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis e Bifidobacterium longum são comumente usadas como culturas iniciadoras lácteas e são, geralmente, incluídas no grupo de bactérias do ácido láctico. Adicionalmente, espécies de Propionibacteria são usadas como culturas iniciadoras lácteas, em particular na produção de queijo. Adicionalmente, organismos pertencendo ao gênero Brevibacterium são comumente usados como culturas iniciadoras alimentares.
[0131] Outro grupo de culturas iniciadoras microbianas são culturas fúngicas, incluindo culturas de levedura e culturas de fungos filamentosos, que são particularmente usados na produção de certos tipos de queijo e bebida. Exemplos de fungos incluem Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccharomyces kefir e Saccharomyces cerevisiae.
[0132] Em uma modalidade da presente invenção, o microrganismo usado para fermentação do substrato à base de leite é Lactobacillus casei ou uma mistura de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
[0133] Processos de fermentação a serem usados em um
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31/69 método da presente invenção são bem conhecidos e o perito na técnica saberá como selecionar condições de processo adequadas, tais como temperatura, oxigênio, quantidade e características de microrganismo/s, aditivos tais como, p.ex., carboidratos, aromas, minerais, enzimas e tempo de processo. Obviamente, as condições de fermentação são selecionadas de modo a apoiarem o alcance da presente invenção.
[0134] Como resultado da fermentação, o pH do substrato à base de leite será diminuído. O pH de um produto lácteo fermentado da invenção pode ser, p.ex., na gama 3,5-6, tal como na gama 3,5-5, preferencialmente na gama 3,8-4,8.
[0135] Em uma modalidade preferencial, o produto lácteo fermentado é iogurte.
[0136] Em uma modalidade é proporcionado um método de uso de um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase como descrito aqui, ou uma célula expressando tal polipeptídeo, para produção de oligossacarídeos. Os oligossacarídeos incluem, sem limitação, frutooligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, isomalto-oligossacarídeos, lactossacarose, malto-oligossacarídeos, manana-oligossacarídeo e xilooligossacarídeos. Galacto-oligossacarídeos (GOS) são particularmente preferenciais.
[0137] Em uma modalidade, os oligossacarídeos são produzidos por contato de polipeptídeo como descrito aqui com um meio que compreende um substrato de dissacarídeo incluindo, p.ex., celobiose, lactose, lactulose, maltose, ramnose, sacarose e tre-halose, e incubação sob condições por meio do que são produzidos oligossacarídeos. O meio compreendendo um polipeptídeo como descrito aqui pode ser parte de um produto selecionado do grupo consistindo em queijo, iogurte e outros produtos lácteos fermentados como também descrito mais particularmente acima, bem como suplementos dietéticos e produtos comestíveis probióticos.
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Alternativamente, os oligossacarídeos podem ser recuperados e subsequentemente adicionados ao produto de interesse antes da ou após a sua preparação.
[0138] Similarmente, em uma modalidade, os oligossacarídeos podem ser produzidos por contato de uma célula expressando polipeptídeo de enzima como descrito aqui em um meio que compreende um substrato de dissacarídeo incluindo, p.ex., celobiose, lactose, lactulose, maltose, ramnose, sacarose e tre-halose, e incubação sob condições por meio do que são produzidos oligossacarídeos. As células podem ser parte de um produto selecionado do grupo consistindo em queijo, iogurte e outros produtos lácteos fermentados como também descrito mais particularmente acima, bem como suplementos dietéticos e produtos comestíveis probióticos. Alternativamente, os oligossacarídeos podem ser recuperados e subsequentemente adicionados ao produto de interesse antes da ou após a sua preparação.
[0139] Em um aspecto é proporcionado o uso de uma célula para produção de um produto selecionado do grupo consistindo em iogurte, queijo, produto lácteo fermentado, suplemento dietético e produto comestível probiótico.
[0140] Em um aspecto, os polipeptídeos descritos aqui podem ser usados para preparar produtos de queijo e em métodos para produção dos produtos de queijo. Os produtos de queijo podem ser, p.ex., selecionados do grupo consistindo em queijo creme, queijo cottage e queijo fundido. Por adição de polipeptídeos, os queijos podem conter níveis significativamente aumentados de galacto-oligossacarídeos e níveis reduzidos de lactose. Em um aspecto, os níveis de lactose no produto de queijo final podem ser reduzidos em, pelo menos, cerca de 25 por cento, preferencialmente pelo menos cerca de 50 por cento e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 75 por cento. Os polipeptídeos
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33/69 podem ser usados para reduzir a lactose em produtos de queijo até menos do que cerca de 1 grama por toma, uma quantidade que pode ser tolerada pela maioria dos indivíduos intolerantes à lactose.
[0141] Os produtos de queijo proporcionados aqui são produtos de queijo nutricionalmente intensificados tendo conteúdo de fibra solúvel aumentado, conteúdo calórico reduzido, propriedades organoléticas excelentes, textura melhorada e sabor. Adicionalmente, os polipeptídeos descritos aqui podem reduzir o índice glicêmico dos produtos de queijo porque os GOS são mais lentamente absorvidos do que a lactose ou seus produtos de hidrólise. Finalmente, os polipeptídeos podem reduzir o custo de produção de produtos de queijo, particularmente produtos de queijo creme, porque os GOS proporcionam surpreendentemente textura melhorada ao produto de queijo creme, permitindo assim uso reduzido de estabilizantes ou permitindo conteúdo de umidade aumentado sem sinerese.
[0142] Em um aspecto adicional é proporcionado o uso de um polipeptídeo transgalactosilante como divulgado aqui ou uma célula como divulgada aqui, para produção de galacto-oligossacarídeos. Em um aspecto é proporcionado o uso de um polipeptídeo transgalactosilante como divulgado aqui ou uma célula como divulgada aqui, para produção de galacto-oligossacarídeos como sendo parte de um produto selecionado do grupo consistindo em iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados, suplementos dietéticos e produtos comestíveis probióticos. Em um aspecto, o produto é iogurte, queijo ou produtos lácteos fermentados. Em um aspecto é proporcionado o uso de um polipeptídeo transgalactosilante como divulgado aqui ou uma célula como divulgada aqui, para produção de galacto-oligossacarídeos para intensificar o crescimento de Bifidobactéria. Em um aspecto é proporcionado o uso de um polipeptídeo transgalactosilante como divulgado aqui ou uma célula como divulgada aqui, para produção de galacto-oligossacarídeos para intensificar o crescimento
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34/69 de Bifidobactéria em uma fermentação de cultura mista.
[0143] Em um aspecto é proporcionado um processo para produção de um polipeptídeo transgalactosilante como divulgado aqui, compreendendo cultura de uma célula como divulgada aqui em um meio de cultura adequadas sob condições permitindo expressão do referido polipeptídeo e recuperação do polipeptídeo resultante a partir da cultura. É proporcionado um processo para produção de galacto-oligossacarídeo, compreendendo contato de um polipeptídeo como divulgado aqui ou uma célula como divulgada aqui com uma solução à base de leite compreendendo lactose.
[0144] O tratamento de produtos lácteos com um polipeptídeo que converte lactose em monossacarídeos ou GOS tem várias vantagens. Os produtos podem ser consumidos por pessoas com intolerância à lactose que exibiríam de outro modo sintomas tais como flatulência e diarréia. Os produtos lácteos tratados com lactase terão também uma doçura mais elevada do que produtos não tratados similares devido à doçura apercebida mais elevada de glucose e galactose em comparação com lactose. Este efeito é particularmente interessante para aplicações tais como iogurte e sorvete onde doçura elevada do produto final é desejada e isto permite uma redução líquida de carboidratos no produto consumido. Na produção de sorvete, um fenômeno chamado arenosidade é frequentemente visto, onde as moléculas de lactose cristalizam devido à baixa solubilidade relativa da lactose. Onde a lactose é convertida em monossacarídeos ou GOS, a sensação na boca do sorvete é muito mais melhorada em relação aos produtos não tratados. A presença de uma sensação arenosa devido à cristalização da lactose pode ser eliminada e os custos de matéria-prima podem ser diminuídos por substituição de leite desnatado em pó por soro de leite em pó. Os principais efeitos do tratamento enzimático são doçura aumentada.
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[0145] Outro uso interessante dos polipeptídeos tendo atividade de beta-galactosidase é uma fórmula infantil, de acompanhamento ou para bebês. A fórmula infantil é um alimento produzido desenhado e comercializado para alimentação a bebês e crianças com menos do que 12 meses de idade, usualmente preparada para alimentação com mamadeira ou alimentação com copo a partir um pó (misturado com água) ou um líquido (com ou sem água adicional). As fórmulas infantis o mais comumente usadas contém soro de leite de vaca purificado e caseína como uma fonte de proteínas, uma combinação de óleos vegetais como uma fonte de gordura, lactose como uma fonte de carboidratos, uma mistura de vitaminas-minerais e outros ingredientes.
[0146] Em muitos países, a adição ou transferência de glicerol para a fórmula infantil, de acompanhamento ou para bebês é proibida por lei; portanto, em aplicações para fórmula infantil, de acompanhamento ou para bebês, as formulações de polipeptídeos tendo atividade de betagalactosidase têm de estar isentas de glicerol.
[0147] Em uma modalidade, os polipeptídeos tendo atividade transgalactosilante podem ser usados em conjunto com outras enzimas tais como proteases, incluindo quimosina ou renina, lipases tais como fosfolipases, amilases e transferases.
MODALIDADES PREFERENCIAIS
[0148] 1. Uma formulação compreendendo um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase e, pelo menos, 30% em peso de um açúcar redutor, preferencialmente frutose, galactose, glucose ou lactose.
[0149] 2. A formulação da modalidade 1, em que o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase foi modificado por glicação de, pelo menos, um resíduo de lisina e/ou arginina.
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[0150] 3. A formulação de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase foi modificado por glicação de pelo menos 1%, preferencialmente pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5%, ainda mais preferencialmente pelo menos 10%, o mais preferencialmente pelo menos 20%, dos resíduos de lisina e arginina do polipeptídeo.
[0151] 4. A formulação de qualquer uma das modalidades precedentes, que é uma formulação de enzima.
[0152] 5. A formulação de qualquer uma das modalidades precedentes tendo uma atividade de 200-20,000 LAU(C)/g, preferencialmente 500-15,000 LAU(C)/g.
[0153] 6. A formulação de qualquer uma das modalidades precedentes que é uma formulação líquida, tendo preferencialmente uma atividade de 200-15,000 LAU(C)/g, mais preferencialmente 500-10,000 LAU(C)/g.
[0154] 7. A formulação de qualquer uma das modalidades precedentes que é uma formulação sólida, tendo preferencialmente uma atividade de 1,000-20,000 LAU(C)/g, mais preferencialmente 3,000-15,000 LAU(C)/g.
[0155] 8. A formulação de qualquer umadas modalidades precedentes, compreendendo 40-65% em peso de açúcar.
[0156] 9. A formulação de qualquer umadas modalidades precedentes, em que o açúcar é glucose.
[0157] 10. A formulação de qualquer umadas modalidades precedentes, que está substancialmente isenta de glicerol.
[0158] 11. A formulação de qualquer umadas modalidades precedentes, que compreende adicionalmente cloreto de sódio ou cloreto de potássio, preferencialmente na gama de 0,01-5% em peso, preferencialmente 0,01-3% em peso, mais preferencialmente 0,01-2% em
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37/69 peso.
[0159] 12. A formulação de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 1 -1304 de SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 6 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos
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98% idêntica, a SEQ ID NO: 8 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 9 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 10 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 11 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 12 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; ou pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 15 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase.
[0160] 13. A formulação de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 1 -1304
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39/69 de SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 com os aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; ou pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase.
[0161] 14. A formulação de qualquer uma das modalidades precedentes, em que o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100%, idêntica aos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1 e tem um comprimento de 900-1350 aminoácidos, preferencialmente 1300-1305 aminoácidos, mais preferencialmente 1302 ou
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1304 aminoácidos.
[0162] 15. Um polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase tendo sido modificado por glicação de. pelo menos, um resíduo de lisina e/ou arginina.
[0163] 16. O polipeptídeo da modalidade 15, que foi modificado por glicação de pelo menos 1%, preferencialmente pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5%, ainda mais preferencialmente pelo menos 10%, o mais preferencialmente pelo menos 20%, dos resíduos de lisina e arginina do polipeptídeo.
[0164] 17. O polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 15-16 que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos
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80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 6 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 8 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 9 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 10 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 11 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 12 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; ou pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%,
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42/69 pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 15 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase.
[0165] 18. O polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 15-17 que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 com os aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; ou pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase.
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[0166] 19. O polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 15-18 que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo 100%, idêntica aos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1 e tem um comprimento de 9001350 aminoácidos, preferencialmente 1300-1305 aminoácidos, mais preferencialmente 1302 ou 1304 aminoácidos.
[0167] 20. Um método de modificação de um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase compreendendo contato do polipeptídeo com um açúcar redutor, preferencialmente frutose, glucose, galactose ou lactose, durante um tempo e temperaturas suficientes para produzir um polipeptídeo modificado por glicação.
[0168] 21. O método da modalidade 20 que é um método de modificação por glicação de um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase.
[0169] 22. O método de qualquer uma das modalidades 20-21, em que o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase modificado por glicação tem atividade transgalactosilante melhorada em comparação com o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase que não foi modificado por glicação.
[0170] 23. O método de qualquer uma das modalidades 20-22, em que o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase é modificado por glicação de pelo menos 1%, preferencialmente pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5%, ainda mais preferencialmente pelo menos 10%, o mais preferencialmente pelo menos 20%, dos resíduos de lisina e arginina do polipeptídeo.
[0171] 24. O método de qualquer uma das modalidades 20-23, compreendendo contato do polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase com 30-90% em peso de um açúcar redutor,
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44/69 preferencialmente frutose, glucose ou galactose, a pH 5-8 durante um tempo de 3-100 horas a uma temperatura de 20-80 °C.
[0172] 25. O método de qualquer uma das modalidades 20-24, compreendendo contato do polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a pH 5-8, preferencialmente pH 6-7, durante um tempo de 3-100 horas, preferencialmente 15-80 horas, a uma temperatura de 50-80 °C, preferencialmente 50-70 °C.
[0173] 26. O método de qualquer uma das modalidades 20-25, compreendendo contado do polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase com 30-90% em peso, preferencialmente 40% em peso, 60% em peso ou 80% em peso, de um açúcar redutor, preferencialmente glucose.
[0174] 27. O método de qualquer uma das modalidades 20-25, compreendendo contado do polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase com 30-90% em peso, preferencialmente 40-65% em peso, de um açúcar redutor.
[0175] 28. O método de qualquer uma das modalidades 20-27, em que o açúcar redutor é frutose, glucose ou galactose, preferencialmente glucose.
[0176] 29. O método de qualquer uma das modalidades 20-28, em que o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 1 -1304 de SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica,
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45/69 tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 6 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 8 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 9 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 10 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 11 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos
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50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 12 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; ou pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 15 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase.
[0177] 30. O método de qualquer uma das modalidades 20-29, em que o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 1 -1304 de SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 com os aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica,
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47/69 a SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; ou pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase.
[0178] 31. O método de qualquer uma das modalidades 20-30, em que o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100%, idêntica aos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1 e tem um comprimento de 900-1350 aminoácidos, preferencialmente 1300-1305 aminoácidos, mais preferencialmente 1302 ou 1304 aminoácidos.
[0179] 32. Um método para produção de galactooligossacarídeos (GOS) compreendendo contato da formulação de qualquer uma das modalidades 1-14 ou do polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 15-19 ou um polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase que foi modificado pelo método de qualquer uma das reivindicações 20-31 com lactose.
[0180] 33. Um método para produção de galactooligossacarídeos (GOS) compreendendo contato de um polipeptídeo tendo uma sequência compreendendo os ou consistindo nos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1, com lactose, sob condições de elevada temperatura e
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48/69 elevada concentração inicial de lactose.
[0181] 34. O método da modalidade 33, em que a temperatura é 40-80 °C, tal como 50 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C ou 80 °C e em que a concentração inicial de lactose é acima de 40% (p/p), tal como 40-50% (p/p), 45% (p/p), 50% (p/p), 55% (p/p), 40-60% (p/p) ou mesmo acima de 60% (p/p), tal como 61% (p/p), 62% (p/p), 63% (p/p), 64% (p/p), 65% (p/p), 66% (p/p), 67% (p/p), 68% (p/p), 69% (p/p), 70% (p/p), 71% (p/p), 72% (p/p), 73% (p/p), 74% (p/p), 75% (p/p) ou 80% (p/p) de lactose.
EXEMPLOS
MATERIAIS E MÉTODOS
Ensaio de Atividade (LAU(C))
Princípio:
[0182] A lactase hidrolisa a lactose para formar a-D-glucose. A a-D-glucose é fosforilada por ATP, em uma reação catalisada por hexocinase. A glucose-6-fosfato formada é oxidada até 6-fosfogluconato por glucose-6-fosfato desidrogenase. Concomitante com esta reação, uma quantidade equimolar de NAD+ é reduzida em NADH com um aumento resultante na absorbância a 340 nm.
Reaqentes:
[0183] Brij L23 a 15% (p/v): Pesar 508,0 ± 0,4 g de Brij® L23 (Sigma B4184) em uma proveta. Adicionar aprox. 300 mL de água ultrapura e agitar. Transferir o Brij® L23 quantitativamente para um frasco volumétrico de 1 L. Encher até à marca com água ultrapura. Agitar até à homogeneidade. Armazenabilidade: 2 meses no refrigerador.
[0184] Reagente de cor: (Estojo de reagente de glucose (GHK) (Tris a 0,1 M, ATP a 2,1 mM, NAD a 2,1 mM, Mg2+ a 4 mM, NaN3 a <0,1%, Mg2+ a 4 mM, hexocinase a >7,5 kU/L, G-6-P-DH a > 7,5 kU/L, pH
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7,8)): Abrir um frasco de Reagente de Glucose A (HK), Thermo Fisher Scientific (No. de art.: 981304 ou 981779) e um frasco de Reagente de Glucose B (HK), Thermo Fisher Scientific (No. de art.: 981304 ou 981779). Verter 1 frasco de reagente B em 1 frasco de reagente A. Colocar a tampa. Misturar bem virando lentamente e gentilmente para cima e para baixo o frasco 10-15 vezes. Usar a mistura inteira no frasco com reagente A ou verter quantidade necessária em um recipiente apropriado. Armazenabilidade: 1 mês no refrigerador.
[0185] Tampão de dissolução/diluição (Ácido cítrico monohidratado a 0,01 M, Brij® L23 a 0,0225% (p/v), MgSCU, 7H2O a 1 mM, pH 4,5): Pesar 21,0 ± 0,1 g de Ácido cítrico mono-hidratado (No. Cas. 5949-29-1) e transferir quantitativo para um frasco volumétrico de 10 L. Pesar 2,46 ± 0,01 g de MgSO4, 7H2O (No. cas. 10034-99-8) e transferir quantitativo para o frasco volumétrico. Adicionar aproximadamente 9 L de água desmineralizada e agitar até à dissolução completa. Adicionar 15 mL de Brij L23 a 15% (p/v) ao frasco volumétrico e agitar. Adicionar aproximadamente 35 mL de NaOH a 4 M (No. Cas. 1310-73-2) e agitar. Ajustar pH até 4,50 ±0,05 usando, p.ex., NaOH a 4 M ou, p.ex., HCI como apropriado. Encher até à marca com água desmineralizada e agitar. Armazenabilidade: 13 dias à temperatura ambiente.
[0186] Substrato (lactose mono-hidratada a 31,6% p/p, ácido cítrico mono-hidratado a 0,01 M, Brij L23 a 0,0225% (p/v), MgSOzi, 7H2O a 1 mM): Pesar 7,9 ± 0,2 g de Lactose mono-hidratada (No. Cas. No. 10039-266) diretamente em uma proveta. Dissolver até um volume total de 25,0 ± 0,1 g de tampão de dissolução. Aquecer e agitar até à dissolução completa sem ebulição do substrato. Armazenabilidade: 6 horas à temperatura ambiente.
[0187] Padrão: Padrão de enzima com LAU(C)/g identificado (disponível a partir da Novozymes A/S, Dinamarca) é usado como padrão, eluído em tampão de dissolução na gama de 0,197-0,7880 LAU(C)/mL.
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Procedimento:
[0188] 1. 50 uL de substrato são incubados durante 540 segundos a 50 °C. Branco (50 uL de tampão de dissolução) é subtraído.
[0189] 2. 25 uL de amostra em tampão de dissolução são adicionados.
[0190] 3. A reação é incubada durante 1800 segundos seguida por adição de 160 uL de reagente de cor.
[0191] 4. Após 300 segundos, a absorvância é medida a 340 nm.
Cálculo da Atividade de Enzima:
[0192] A atividade de enzima da amostra diluída é lida a partir da curva padrão. O cálculo da atividade de uma amostra em LAU(C)/g é como apresentado na fórmula:
.S-F-F
S = Leitura a partir da curva padrão em LAU(C)/mL
V = volume do frasco medidor usado em mL
F = Fator de diluição para segunda diluição
W = Peso de amostra em g
Aplicação em Iogurte
[0193] Leite homogeneizado comercial com gordura a 1,5% é pasteurizado a 90 °C durante 20 min. 200 mL do leite são transferidos para garrafas de bebê e temperados até 43 °C. O leite é inoculado com uma cultura de iogurte probiótico congelada, p.ex., Chr. Hansen, Dinamarca (FDVS ABY-3) usando um nível de inoculação de 0,02%. Ao mesmo tempo, enzima é adicionada ao leite. As amostras de leite são fermentadas a 43 °C até o pH ater alcançado 4,55 no espaço de aproximadamente cinco horas. Os iogurtes são depois agitados, resfriados até 25 °C e colocados a 8 °C para armazenamento. As amostras são coletadas 2 horas após adição de
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51/69 cultura e enzima, ao pH final (pH 4,55) e após 20-24 horas (Dia 1) de armazenamento a 8 °C. A atividade biológica é parada por adição de ácido sulfúrico. As proteínas são precipitadas adicionando ácido perclórico e MQW contendo padrões são depois adicionados. A hidrólise da lactose é medida usando um sistema Dionex ICS-3000 equipado com um Carbopac20 conectado a um detector eletroquímico (DE). Os picos são identificados e quantificados por comparação com padrões conhecidos de lactose, glucose e galactose. O conteúdo de sacarídeos DP2, particularmente lactose, e GOS na forma de DP3+ é identificado e quantificado. Vivinal GOS (Friesland Campina) é um padrão útil para quantificação de GOS.
Aplicação em Iogurte
[0194] Leite homogeneizado comercial com gordura a 1,5% é pasteurizado a 90 °C durante 20 min. 200 mL do leite são transferidos para garrafas de bebê e temperados até 43 °C. O leite é inoculado com uma cultura de iogurte probiótico congelada, p.ex., Chr. Hansen, Dinamarca (FDVS ABY-3) usando um nível de inoculação de 0,02%. Ao mesmo tempo, enzima é adicionada ao leite. As amostras de leite são fermentadas a 43 °C até o pH ater alcançado 4,55 no espaço de aproximadamente cinco horas. Os iogurtes são depois agitados, resfriados até 25 °C e colocados a 8 °C para armazenamento. As amostras são coletadas 2 horas após adição de cultura e enzima, ao pH final (pH 4,55) e após 1, 2, 3 e 7 dias de armazenamento a 8 °C. A atividade biológica é parada por adição de ácido sulfúrico. As proteínas são precipitadas adicionando ácido perclórico e MQW contendo padrões são depois adicionados. A hidrólise da lactose é medida usando um sistema Dionex ICS-3000 equipado com um Carbopac20 conectado a um detector eletroquímico (DE). Os picos são identificados e quantificados por comparação com padrões conhecidos de lactose, glucose e galactose. O conteúdo de sacarídeos DP2, particularmente lactose, e GOS na forma de DP3+ é identificado e quantificado. Vivinal GOS (Friesland
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Campina) é um padrão útil para quantificação de GOS.
Aplicação em Leite a 1,5%
[0195] Leite homogeneizado comercial com gordura a 1,5% é transferido para tubos (10 mL) e aquecido em banhos de água até 40 °C, 50 °C e 55 °C, respectivamente. Enzima é depois adicionada às amostras de leite. Amostras são coletadas 2 horas e 4 horas após adição da enzima. A atividade biológica é parada por adição de ácido sulfúrico. As proteínas são precipitadas adicionando ácido perclórico e MQW contendo padrões é depois adicionado. A hidrólise da lactose é medida usando um sistema Dionex ICS3000 equipado com um Carbopac20 conectado a um detector eletroquímico (DE). Os picos são identificados e quantificados por comparação com padrões conhecidos de lactose, glucose e galactose. O conteúdo de sacarídeos DP2, particularmente lactose, e GOS na forma de DP3+ é identificado e quantificado. Vivinal GOS (Friesland Campina) é um padrão útil para quantificação de GOS.
Aplicação em Solução de Leite Desnatado
[0196] 100 mL de solução de leite desnatado a 9% tendo lactose a aproximadamente 5% são preparados por mistura de 9 g de leite desnatado em pó (Kerry) em 91 mL de água iônica. 10 mL da solução são transferidos para um tubo de teste contendo uma barra de agitação magnética e colocados em um banho de água a 37 °C. Após 15 min, enzima é adicionada. Amostras de leite são retiradas a intervalos regulares até 4 hrs. e a enzima inativada por aquecimento até 99 °C durante 10 min em um termomisturador. As amostras são diluídas apropriadamente e filtradas através de um filtro de 0,20 um. A hidrólise da lactose é medida usando um Dionex BioLC equipado com uma coluna Dionex PA1 e um Detector Amperométrico Pulsado (PAD). Os picos são identificados e quantificados por comparação com padrões conhecidos de lactose, glucose e galactose. O conteúdo de sacarídeos DP2, particularmente lactose, e GOS na forma de
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DP3+ é identificado e quantificado. Vivinal GOS (Friesland Campina) é um padrão útil para quantificação de GOS.
Aplicação em Leite a 1,5% - Elevada Temperatura
[0197] Leite homogeneizado comercial com gordura a 1,5% é transferido para tubos (10 mL) e temperado até 63 °C. Enzima é adicionada às amostras de leite. A 63 °C, amostras são coletadas 15 minutos, 30 minutos, 2 horas e 4 horas após adição da enzima. A atividade enzimática nas amostras é parada por adição de ácido sulfúrico e as proteínas precipitadas por adição de ácido perclórico antes da análise de HPLC. A hidrólise da lactose é medida usando um sistema Dionex ICS-3000 equipado com um Carbopac20 conectado a um detector eletroquímico (DE). Os picos são identificados e quantificados por comparação com padrões conhecidos de lactose, glucose e galactose. O conteúdo de sacarídeos DP2, particularmente lactose, e GOS na forma de DP3+ é identificado e quantificado. Vivinal GOS (Friesland Campina) é um padrão útil para quantificação de GOS.
Aplicação em Solução de Permeado de Soro de Leite
[0198] 100 mL de permeado de soro de leite a 15 ou 30% (p/p) contendo principalmente lactose e íons são preparados por mistura de 15 ou 30 g de permeado de soro de leite seco por pulverização em pó (Variolac, Arla) em 85 ou 70 mL de água iônica, respectivamente. A solução é vertida em um frasco contendo uma barra de agitação magnética e colocados em um banho de água a 37 °C. Após 15 min, enzima é adicionada. Amostras de leite são retiradas a intervalos regulares até 5,5 hrs. e a enzima inativada por aquecimento até 99 °C durante 10 min em um termomisturador. As amostras são diluídas apropriadamente e filtradas através de um filtro de 0,20 um. A hidrólise da lactose é medida usando um Dionex BioLC equipado com uma coluna Dionex PA1 e um Detector Amperométrico Pulsado (PAD). Os picos são identificados e quantificados por comparação com padrões
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54/69 conhecidos de lactose, glucose e galactose. O conteúdo de sacarídeos DP2, particularmente lactose, e GOS na forma de DP3+ é identificado e quantificado. Vivinal GOS (Friesland Campina) é um padrão útil para quantificação de GOS.
EXEMPLO 1
Produção de Polipeptídeo β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum (BBB) tendo a sequência mostrada como SEQ ID NO: 1 é expressa em Bacillus licheniformis
EXEMPLO 2
Glicação
[0199] BBB-un_1: β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum não tratada (BBB-un_1) é expressa em Bacillus licheniformis de acordo com o Exemplo 1 e concentrada usando ultrafiltração (limiar de exclusão 10 kDa) e finalmente formulada com glicerol a 50% (p/p). A atividade desta amostra é 7210 LAU(C)/g.
[0200] A um recipiente Distec de 100 mL, 100 gramas de solução de açúcar (glucose (Glc), galactose (Gal) ou lactose (Lac)) a 66% (p/p) com tampão de ácido succinico a 20 mM pH 6,5 são adicionados e préaquecidos até 60 ° C durante 15 min. Depois, 10 mL de BBB-un_1 sem glicerol são adicionados e incubados a 60 °C com mistura durante 16 hr. A solução é resfriada até à temperatura ambiente e dialisada (limiar de exclusão 12 kDa) contra tampão de ácido succinico a 5 mM pH 6,5 durante 16 hr a 5 °C e depois concentrada até ~ 5 mL usando limiar de exclusão de células Amicon 10 kDa e finalmente adicionado o mesmo volume de glicerol para dar uma conc. de glicerol a 50% (v/v). As três amostras geradas a partir deste procedimento são denominadas BBB-Glc, BBB-Gal e BBB-Lac se
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55/69 referindo ao açúcar usado para a incubação.
[0201] Dados de MS de preparação de amostras auxiliada por filtro (FASP) de digeridos trípticos foram feitos e os peptídeos glicados foram identificados como Lys e Arg + 1 Hexose, causando 1 local de divagem perdido. A % de peptídeos digeridos com tripsina glicados foi estimada como sendo 0,66%, 31%, 36% e 27% para não tratado, tratado com lactose, tratado com glucose e tratado com galactose, respectivamente. Assim, a espectrometria de massa de peptídeos preparados a partir de digeridos com tripsina confirma a glicação nos resíduos de lisina e arginina de BBB-Glc, BBB-Gal e BBB-Lac mas estas glicações não estão presentes em BBB-un_1.
Produção de GOS a 25 °C
[0202] Para avaliar os GOS produzidos a 25 °C, 50 uL de enzima com 1280 LAU(C)/g (BBB-un_1, BBB-Glc, BBB-Gal ou BBB-Lac) são misturados com 950 uL de lactose*H2O a 66,5% (p/p) pré-aquecida, succinato a 20 mM pH 6,5 em tubo Eppendorf que dá uma concentração final de lactose a 60%. A mistura é depois incubada a 25 °C com 1000 rpm durante 22 hr e aplicada em gelo. A inativação da enzima é depois realizada por diluição do 1 mL de produto GOS com 49 mL de NaOH a 0,04 M, EDTA a 1 mM e incubação durante 5 min à temperatura ambiente. Depois, uma diluição de 40x adicional com água mili Q (/.e., diluição de 2000x no total) é feita e aplicada a uma coluna PA1 (Cromatografia de Troca Aniônica de Elevado Desempenho) com Detecção Amperométrica Pulsada (HPAEC-PAD).
Produção de GOS a 65 °C
[0203] De modo a se avaliarem os GOS produzidos a 65 °C, 50 uL de enzima com 192 LALJ(C)/g (BBB-un_1, BBB-Glc, BBB-Gal ou BBBLac) são misturados com 950 uL de lactose*H2O a 66,5% (p/p) pré-aquecida, succinato a 20 mM pH 6,5 em tubo Eppendorf que dá uma concentração final de lactose a 60%. A mistura é depois incubada a 65 °C com 1000 rpm durante 22 hr e aplicada em gelo. A inativação da enzima é depois realizada por
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56/69 diluição do 1 mL de produto GOS com 49 mL de NaOH a 0,04 M, EDTA a 1 mM e incubação durante 5 min à temperatura ambiente. Depois, uma diluição de 40x adicional com água mili Q (/.e., diluição de 2000x no total) é feita e aplicada a uma coluna PA1 (Cromatografia de Troca Aniônica de Elevado Desempenho) com Detecção Amperométrica Pulsada (HPAEC-PAD).
Tabela 1.
| (Glc-Gal)/ Gal | (Glc-Gal)/ Gal | |
| 25°C | 65°C | |
| BBBun_1 | 0,79 | 10 |
| BBB-Lac | 6,9 | 12 |
| BBB-Glc | 7,8 | 13 |
| BBB-Gal | 6,0 | 12 |
[0204] Como visto na Tabela 1, a beta-galactosidase de Bifidobacterium bifidum não tratada (BBB-un_1) tem baixa atividade transgalactosilante a 25 °C com uma razão (Glc-Gal)/Gal de 0,79 em comparação com as formas de BBB glicadas (BBB-Glc, BBB-Gal e BBB-Lac) que têm razão (Glc-Gal)/Gal 7-10 mais elevada quando incubadas às mesmas condições de processo. A 65 °C, a diferença é menos pronunciada entre BBB não tratada e glicada e é visto um amento na razão (Glc-Gal)/Gal de somente 1,2-1,3 vezes. No entanto é surpreendente que todas as enzimas BBB-un_1, BBB-Glc, BBB-Gal e BBB-Lac tenham um aumento pronunciado na razão (Glc-Gal)/Gal a temperatura elevada, 65 °C, em comparação com 25 °C, especialmente para BBB-un que tem um aumento de 13 vezes na razão (Glc-Gal)/Gal.
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EXEMPLO 3
Amostra:
[0205] BBB-un_2: β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum não tratada (BBB-un_2) é expressa em Bacillus licheniformis de acordo com o Exemplo 1 e concentrada usando ultrafiltração (limiar de exclusão 10 kDa) e finalmente formulada com glucose a 40% (p/p), 60% (p/p) ou 80% (p/p), com uma concentração de enzima de 7575 LAU(C)/g, 9200 LAU(C)/g e 4600 LAU(C)/g, respectivamente.
Glicação de amostras de enzima:
[0206] Solução de enzima formulada com glucose é incubada durante 16 h e 40 h a três temperaturas diferentes 50 °C, 55 °C e 60 °C, ver Tabela 2.
Produção de GOS a 25 °C
[0207] Para se avaliarem os GOS produzidos a 25 °C, 50 pL de amostra de enzima como mostrado na Tabela 2 são misturados com 950 pL de lactose*H2O a 66,5% (p/p) pré-aquecida, succinato a 20 mM pH 6,5 em tubo Eppendorf que dá uma concentração final de lactose a 60%. A mistura é depois incubada a 25 °C com 1000 rpm durante 22 hr e aplicada em gelo. A inativação da enzima é depois realizada por diluição do 1 mL de produto GOS com 49 mL de NaOH a 0,04 M, EDTA a 1 mM e incubação durante 5 min à temperatura ambiente. Depois, uma diluição de 40x adicional com água mili Q (/.e., diluição de 2000x no total) é feita e aplicada a uma coluna PA1 (que é Cromatografia de Troca Aniônica de Elevado Desempenho, HPAEC) e os carboidratos foram detectados com Detecção Amperométrica Pulsada (PAD).
Resultados & Discussão
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Tabela 2
| Temperatura | Tempo | Cone. de glucose | (Glc-Gal)/Gal | |
| LAU(C)/g | °C | h | % de | Razão |
| 7575 | Sem tratamento térmico | 40 | 0,5 | |
| 7575 | 50 | 16 | 40 | 0,9 |
| 7575 | 55 | 16 | 40 | 0,9 |
| 7575 | 60 | 16 | 40 | 1,4 |
| 7575 | 50 | 40 | 40 | 1,6 |
| 7575 | 55 | 40 | 40 | 2,1 |
| 7575 | 60 | 40 | 40 | 2,5 |
| 9200 | Sem tratamento térmico | 60 | 0,5 | |
| 9200 | 50 | 16 | 60 | 0,9 |
| 9200 | 55 | 16 | 60 | 1,4 |
| 9200 | 60 | 16 | 60 | 2,0 |
| 9200 | 50 | 40 | 60 | 2,2 |
| 9200 | 55 | 40 | 60 | 2,9 |
| 9200 | 60 | 40 | 60 | 3,3 |
| 4600 | 50 | 16 | 80 | 1,9 |
| 4600 | 55 | 16 | 80 | 4,3 |
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| 4600 | 60 | 16 | 80 | 5,0 |
| 4600 | 50 | 40 | 80 | 5,3 |
| 4600 | 55 | 40 | 80 | 6,1 |
| 4600 | 60 | 40 | 80 | 6,1 |
[0208] A Tabela 2 mostra que existe um aumento na razão (Glc-Gal)/Gal quando a temperatura é aumentada de 50 a 60 °C e as razões (Glc-Gal)/Gal são mais elevadas do que o controle onde nenhum tratamento térmico foi feito. O tempo de incubação prolongado também aumenta a razão (Glc-Gal)/Gal, i.e., valores mais elevados são obtidos após 40 h em comparação com 16 h. O efeito da temperatura e tempo é o mesmo para enzimas formuladas com glucose a 40%, 60% e 80%.
EXEMPLO 4
Glicação de amostras de enzima
[0209] β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum não tratada (BBB-un) é expressa em Bacillus licheniformis de acordo com o Exemplo 1 e concentrada usando ultrafiltração (limiar de exclusão 10 kDa) e formulada com glucose a níveis indicados na tabela por incubação durante 44 h a 55 °C, depois armazenada a 4 °C.
Produção de GOS em leite a 5 °C
[0210] Um mL de leite semidesnatado é aplicado em tubo Eppendorf de 2 mL e aquecido até 90 °C durante 5 min e resfriado em banho de gelo durante pelo menos 30 min. Depois, 10 pL de amostra de enzima diluída são adicionados e incubados durante 24 h a 5 °C. A reação é parada por adição de 5 pL de HAc e aquecida até 90 °C durante 5 min e centrifugada a 20,000 g durante 5 min. Depois, 50 pL de sobrenadante são adicionados a 500 pL de água Milli Q + 10 pL de solução de Carrez I em um tubo Eppendorf
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60/69 de 5 mL e misturados seguido por adição de 10 pL de solução de Carrez II e misturados. Depois, 4,43 mL de água milli Q são adicionados e centrifugados a 20,000 g durante 5 min à temperatura ambiente. Depois, 1 mL de sobrenadante é adicionado a 4 mL de água e filtrado através de um filtro de 0,20 pm para um frasco de HPLC e aplicado a uma coluna PA1 HPAEC e os carboidratos são detectados com PAD.
Produção de GOS em leite a 42 °C
[0211] Um mL de leite semidesnatado é aplicado em tubo Eppendorf de 2 mL e aquecido até 90 °C durante 5 min e resfriado em banho de gelo durante pelo menos 30 min. Depois, 10 pL de amostra de enzima diluída são adicionados e incubados durante 6 h a 42 °C. A reação é parada por adição de 5 pL de HAc e aquecida até 90 °C durante 5 min e centrifugada a 20,000 g durante 5 min. Depois, 50 pL de sobrenadante são adicionados a 500 pL de água Milli Q + 10 pL de solução de Carrez I em um tubo Eppendorf de 5 mL e misturados seguido por adição de 10 pL de solução de Carrez II e misturados. Depois, 4,43 mL de água milli Q são adicionados e centrifugados a 20,000 g durante 5 min à temperatura ambiente. Depois, 1 mL de sobrenadante é adicionado a 4 mL de água e filtrado através de um filtro de 0,20 pm para um frasco de HPLC e aplicado a uma coluna PA1 HPAEC e os carboidratos são detectados com PAD.
Produção de GOS em leite desnatado em pó reconstituído a 35% a 42 °C
[0212] Um mL de leite desnatado em pó reconstituído a 35% (p/p) é aplicado em tubo Eppendorf de 2 mL e aquecido até 90 °C durante 5 min e resfriado em banho de gelo durante pelo menos 30 min. Depois, 10 pL de amostra de enzima diluída são adicionados e incubados durante 6 h a 42 °C. A reação é parada por adição de 5 pL de HAc e aquecida até 90 °C durante 5 min e centrifugada a 20,000 g durante 5 min. Depois, 50 pL de sobrenadante são adicionados a 500 pL de água Milli Q + 10 pL de solução
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61/69 de Carrez I em um tube Eppendorf de 5 mL e misturados seguido por adição de 10 pL de solução de Carrez II e misturados. Depois, 4,43 mL de água milli Q são adicionados e centrifugados a 20,000 g durante 5 min à temperatura ambiente. Depois, 0,35 mL de sobrenadante é adicionado a 4,65 mL de água e filtrado através de um filtro de 0,20 pm para um frasco de HPLC e aplicado a uma coluna PA1 (que é Cromatografia de Troca Aniônica de Elevado Desempenho, HPAEC) e os carboidratos são detectados com Detecção Amperométrica Pulsada (PAD).
Resultados & Discussão
Tabela 3 Dados da produção de GOS em leite a 5 °C
| Quantidade de enzima | Temperatura | Tempo | Cone. de glucose | (GlcGal)/ Gal | desvio méd. |
| LAU(C)/mL | °C | h | % de | razão | |
| 640 | 55 | 44 | 40 | 0,34 | 0,01 |
| 640 | 55 | 44 | 60 | 1,06 | 0,03 |
| 640 | Sem tratamento térmico | 40 | 0,07 | 0,002 |
Tabela 4 Dados da produção de GOS em leite a 42 °C
| Quantidade de enzima | Temperatura | Tempo | Cone. de glucose | (GlcGal)/ Gal | desvio méd. |
| LAU(C)/mL | °C | h | % de | razão | |
| 290 | 55 | 44 | 40 | 0,31 | 0,02 |
| 290 | 55 | 44 | 60 | 0,51 | 0,02 |
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| 290 | Sem tratamento térmico | 40 | 0,05 | 0,004 |
Tabela 5 Dados da produção de GOS em leite desnatado em pó reconstituído a 35% (p/p) a 42 °C
| Quantidade de enzima | Temperatura | Tempo | Cone. de glucose | (GlcGal)/ Gal | desvio méd. |
| LAU(C)/mL | °C | h | % de | razão | |
| 840 | 55 | 44 | 40 | 0,68 | 0,005 |
| 840 | 55 | 44 | 60 | 1,8 | 0,2 |
| 840 | Sem tratamento térmico | 40 | 0,07 | 0,003 |
[0213] As Tabelas 3, 4 e 5 mostram que a razão (GlcGal)/Gal é aumentada para formulações de glucose tanto a 40% como a 60% quando incubadas a 55 °C durante 44 h em comparação com controle de glucose a 40% (Sem tratamento térmico). Estes resultados mostram que os GOS podem ser gerados in situ (no leite) a 5 °C, que é a temperatura de armazenamento comum do leite, mas também a 42 °C que é útil para aplicação de iogurte pois 42 °C é uma temperatura de fermentação comum. Uma razão (Glc-Gal)/Gal ainda mais elevada pode ser alcançada em leite desnatado em pó reconstituído a 35% (p/p) (tabela 5), i.e., aumentando o conteúdo de matéria seca e a concentração de lactose aumentando, portanto, a eficiência da transferase.
EXEMPLO 5
Glicosilação de amostras de enzima
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[0214] β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum não tratada (BBB) tendo a sequência mostrada como SEQ ID NO: 1 é expressa em Bacillus licheniformis e concentrada usando ultrafiltração (limiar de exclusão 10 kDa) até 23000 LAU(B)/g e formulada com glucose a 60% (p/p) (3 gramas de glucose + 2 gramas de BBB-un) ou glicerol a 60% (p/p) (3 gramas de glicerol + 2 gramas de BBB-un) e incubada durante 66 h a 50 °C ou não formulada diluída com água com a mesma diluição, i.e., 3 gramas de água + 2 gramas de BBB-un e incubada durante 30 min a 50 °C.
Produção de GOS a 25 °C
[0215] Para se avaliarem os GOS produzidos a 25 °C, 50 uL de enzima 770 LAU(B)/g são misturados com 950 uL de lactose*H2O a 66,5% (p/p) pré-aquecida, succinato a 20 mM pH 6,5 em tubo Eppendorf que dá uma concentração final de lactose a 60%. A mistura é depois incubada a 25 °C com 1000 rpm durante 22 hr e aplicada em gelo. A inativação da enzima é depois realizada por diluição do 1 mL de produto GOS com 9 mL de NaOH a 0,04 M e incubação durante 5 min à temperatura ambiente. Depois, uma diluição de 200x adicional com água mili Q (i.e., diluição de 2000x no total) é feita e aplicada a uma coluna PA1 (Cromatografia de Troca Aniônica de Elevado Desempenho) com Detecção Amperométrica Pulsada (HPAECPAD).
Tabela 6
| Quantidade de enzima | Temper atura | Tem po | (Glc- Gal)/Gal | desvio méd. | |
| Formulação | LAU(B)/g | °C | h | razão | |
| BBB tratada em glucose a 60% | 770 | 50 | 66 | 5,5 | 0,1 |
| BBB tratada em glicerol a 60% | 770 | 50 | 66 | 0,70 | 0,05 |
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| BBB tratada em água | 770 | 50 | 0,5 | 0,68 | 0,01 |
[0216] A incubação em glucose a 60% é feita a 50 °C durante 66 h para assegurar glicação da β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum (BBB). A incubação em glicerol a 60% (que não é um açúcar redutor) é incluída como um controle. A amostra sem agente de formulação (BBB tratada em água) é incluída como outro controle. Devido à instabilidade da enzima quando nenhum estabilizante é adicionado (p.ex., glucose ou glicerol), a enzima não seria estável durante 66 h a 50 °C e, portanto, a amostra “BBB tratada em água” foi incubada somente durante 0,5 h a 50 °C.
[0217] A Tabela 6 mostra que somente razão (Glc-Gal)/Gal elevada (5,5) é obtida por incubação de β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum (BBB) com glucose e não com controles formulados em glicerol ou sem agentes de formulação (água). Assim, estes resultados mostram que não é o aquecimento da amostra de enzima como tal que transforma a enzima para se obter uma razão (Glc-Gal)/Gal elevada. É a incubação com glucose a condições que permitem glicação da enzima que assegura a transformação de razão (Glc-Gal)/Gal elevada para baixa.
EXEMPLO 6
Amostra:
[0218] BBB-1: β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum tendo a sequência mostrada como SEQ ID NO: 1 foi expressa em Bacillus licheniformis e purificada em coluna e depois finalmente formulada com glucose a 60% (BBB-1-G) e incubada durante 66 h a 50 °C como mostrado na Tabela 6 e depois armazenada a -20 °C. A amostra de controle (BBB-1C) não foi formulada com glucose e somente armazenada a -20 °C.
[0219] β-galactosidase de Kluyveromyces lactis (Lactozym®
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Pure) foi expressa em Kluyveromyces lactis e concentrada usando UF (limiar de exclusão 10 kDa) e finalmente formulada com glucose a 60% com mesma conc. de proteína de enzima ([ep]) que BBB-1-G e incubada durante 66 h a 50 °C como mostrado na Tabela 6 e depois armazenada a -20 °C. A amostra de controle não foi formulada com glucose e somente armazenada a -20 °C e tem a mesma conc. de proteína de enzima ([ep]) que BBB-1-C.
[0220] β-galactosidase de Bacillus circulans tendo a sequência mostrada como os aminoácidos 28-1737 de SEQ ID NO: 14 foi expressa em Bacillus subtilis e purificada em coluna e depois finalmente formulada com glucose a 60% com mesma conc. de proteína de enzima ([ep]) que BBB-1-G e incubada durante 66 h a 50 °C como mostrado na Tabela 6 e depois armazenada a -20 °C. A amostra de controle não foi formulada com glucose e somente armazenada a -20 °C e tem a mesma conc. de proteína de enzima ([ep]) que BBB-1-C.
[0221] BBB-2: β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum tendo a sequência mostrada como SEQ ID NO: 1 foi expressa em Bacillus licheniformis e purificada em coluna e concentrada usando UF (limiar de exclusão 10 kDa) e depois finalmente formulada com glicerol a 50% e incubada durante 4 semanas (672 h) a 40 °C como mostrado na Tabela 6 e depois armazenada a -20 °C. A amostra de controle não foi incubada a 40 °C e somente armazenada a -20 °C durante as 4 semanas.
[0222] BBB-3: β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum tendo a sequência mostrada como SEQ ID NO: 1 foi expressa em Bacillus licheniformis e purificada em coluna e concentrada usando UF (limiar de exclusão 10 kDa) e depois finalmente formulada com glucose a 40% e incubada durante 4 semanas (672 h) a 40 °C como mostrado na Tabela 6 e depois armazenada a -20 °C. A amostra de controle não foi incubada a 40 °C e somente armazenada a -20 °C durante as 4 semanas.
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Produção de GOS em leite regular °C durante 24 h (Os resultados são mostrados na Tabela 6)· [0223] Dois mL de leite semidesnatado (Arla, comprado em um supermercado dinamarquês local, 4,7 g de lactose e 3,5 g de proteína por 100 g) foram transferidos para um tubo Eppendorf de 5 mL (determinações duplas para cada dose incluindo controle). Depois, 20 pL de diluição de enzima foram adicionados (ver Tabela 6) e misturados seguidos por uma incubação a 5 °C durante 24 h. Após incubação, 10 pL de ácido acético concentrado foram adicionados a cada amostra e as soluções foram aquecidas até 90 °C durante 5 min. Após inativação, as amostras foram centrifugadas a 14,000 rpm durante 5 min à temperatura ambiente. Um mL de sobrenadante foi transferido para outro tubo e mantido congelado até à análise por HPLC.
Determinação de razão de (Glc-Gal)/Gal
[0224] A Cromatografia de Troca Aniônica de Elevado Desempenho com Detecção Amperométrica Pulsada (HPAEC-PAD) usando uma coluna PA1 para determinação quantitativa de galactose (Gal) e glucose (Glc) é realizada como se segue.
[0225] 50 pL de amostra são misturados em conjunto com
500 pL de água Milli Q + 10 pL de solução de Carrez I em um tubo Eppendorf de 5 mL e, depois, misturados com 10 pL de solução de Carrez II. Depois, 4,43 mL de água milli Q são adicionados e centrifugados a 14,000 rpm durante 5 min à temperatura ambiente. Um mL de sobrenadante é misturado com 4 mL de água Milli-Q e filtrado através de um filtro de 0,2 pm para um frasco de HPLC e aplicado em uma coluna PA1. A determinação quantitativa de Glc e Gal foi feita usando um padrão conhecido de Glc e Gal, respectivamente.
Tabela 6
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| Quantidade de enzima | Temperai ura | Tem po | (GlcGal)/G al | desv io méd. | |
| LAU(B)/g | °C | h | razão | ||
| BBB-1-G (glucose a 60%) | 260 | 50 | 66 | 3,39 | 0,03 |
| K. lactis (glucose a 60%) | “mesma [ep] que BBB-1-G” | 50 | 66 | 0,40 | 0,02 |
| B. circulans (glucose a 60%) | “mesma [ep] que BBB-1-G” | 50 | 66 | 4,09 | 0,07 |
| BBB-1-C - controle | 640 | Sem tratamento térmico | -0,04 | 0,00 5 | |
| K. lactis - controle | “mesma [ep] que BBB-1-C” | Sem tratamento térmico | 0,00 | 0,02 | |
| B. circulans controle | “mesma [ep] que BBB-1-C” | Sem tratamento térmico | 0,00 | 0,00 1 | |
| BBB-2 (glicerol a 50%) | 640 | 40 | 672 | -0,02 | 0,02 |
| BBB-3 (glucose a 40%) | 640 | 40 | 672 | 0,75 | 0,14 |
| BBB-2 (glicerol a 50%) - controle | 640 | -20 | 672 | -0,02 | 0,02 |
| BBB-3 (glucose a 40%) - controle | 640 | -20 | 672 | -0,01 | 0,01 |
[0226] Um aumento pronunciado na razão (Glc-Gal)/Gal é vista quando β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum e β-galactosidase
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68/69 de Bacillus circulans (ambas GH2_5) são incubadas com glucose a 60% a 50 °C durante 66 h com uma razão (Glc-Gal)/Gal de 3,39 e 4,09, respectivamente. Ao passo que um aumento mais pequeno na razão (GlcGal)/Gal é vista para β-galactosidase de Kluyveromyces lactis (GH2_6). Isto sugere que, para a subfamília 5 da família de glicosil hidrolases 2 (GH2_5), a glicação tem um efeito mais pronunciado para desviar a molécula de enzima de ter uma atividade hidrolítica para uma de transferase do que para a subfamília 6 de GH2 (GH2_6).
[0227] Todas as amostras de controle BBB-1 -C, K. lactis e B. circulans, têm uma razão (Glc-Gal)/Gal próxima de zero. Quando comparado com os valores pequenos, mas positivos para os controles do Exemplo 5, isto é tão esperado quanto existe somente ~ 5% de lactose no leite ao passo que os controles na Tabela 5 foram incubados com lactose a 60% (uma elevada cone, de lactose favorece a atividade de transferase).
[0228] Glicação em conc. de glucose mais baixa e temperaturas mais baixas podería ser também alcançada em tempos de incubação prolongados como visto na Tabela 6, onde BBB-3 incubado em glucose a 40% a 40 °C durante 672 h resultou em uma razão (Glc-Gal)/Gal de 0,75 em comparação com o controle que tem um valor de zero. Um controle adicional foi preparado incubando β-galactosidase de Bifidobacterium bifidum em glicerol a 40% a 40 °C durante 672 h que não teve efeito detectável na razão (Glc-Gal)/Gal pois um valor de zero foi obtido exatamente como para o controle. Esta experiência adicional confirma que a glicação e não o tratamento térmico como tal é responsável pela transformação da enzima de uma enzima hidrolítica para uma enzima mais transferidora.
[0229] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspectos se destinam como ilustrações de vários aspectos da
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69/69 invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, diversas modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes aos peritos na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexadas. No caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá.
Claims (15)
1. Formulação compreendendo um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase e, pelo menos, 30% em peso de um açúcar redutor, preferencialmente frutose, galactose, glucose ou lactose; em que o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase foi modificado por glicação de, pelo menos, um resíduo de lisina e/ou arginina.
2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase foi modificado por glicação de pelo menos 1%, preferencialmente pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5%, dos resíduos de lisina e arginina do polipeptídeo.
3. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, tendo uma atividade de 200-20,000 LAU(C)/g,.
4. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, que é uma formulação líquida e que tem, preferencialmente, uma atividade de 200-15,000 LAU(C)/g, mais preferencialmente 500-10,000 LAU(C)/g.
5. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3 ou 4, compreendendo 40-65% em peso de açúcar, em que o açúcar é, preferencialmente, glucose.
6. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4 ou 5, que está substancialmente isenta de glicerol e que compreende opcionalmente ainda cloreto de sódio ou cloreto de potássio, preferencialmente na gama de 0,01-5% em peso, preferencialmente 0,01-3% em peso, mais preferencialmente 0,01-2% em peso.
7. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em que o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos
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50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 6 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 8 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 9 ou um seu fragmento tendo
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3/7 atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 10 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 11 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 12 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; ou pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 15 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase.
8. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7, em que o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98%, idêntica aos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 com os
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4/7 aminoácidos 28-1931 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; ou pelo menos 50% idêntica, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica, a SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase.
9. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100%, idêntica aos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1 e tem um comprimento de 900-1350 aminoácidos, preferencialmente 1300-1305 aminoácidos, mais preferencialmente 1302 ou 1304 aminoácidos.
10. Método de modificação por glicação de um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase compreendendo contato do polipeptídeo com 30-90% em peso de um açúcar redutor,
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5/7 preferencialmente frutose, glucose, galactose ou lactose, durante um tempo e temperaturas suficientes para produzir um polipeptídeo modificado por glicação.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase modificado por glicação tem atividade transgalactosilante melhorada em comparação com o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase que não foi modificado por glicação.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, em que o polipeptídeo tendo atividade de betagalactosidase é modificado por glicação de pelo menos 1%, preferencialmente pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5%, dos resíduos de lisina e arginina do polipeptídeo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11 ou 12, compreendendo contato do polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase a pH 5-8, preferencialmente pH 6-7, durante um tempo de 3-100 horas, preferencialmente 15-80 horas, a uma temperatura de 50-80 °C, preferencialmente 50-70 °C.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12 ou 13, em que o polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase é pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico aos aminoácidos 1-1304 de SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, aos aminoácidos 281931 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou
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6/7 pelo menos 98% idêntico, aos aminoácidos 28-1331 de SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 6 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 8 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 9 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 10 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 11 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%,
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7/7 pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 12 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase; pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento tendo atividade de betagalactosidase; ou pelo menos 50% idêntico, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico, a SEQ ID NO: 15 ou um seu fragmento tendo atividade de beta-galactosidase.
15. Método para produção de galacto-oligossacarídeos (GOS) compreendendo contato da formulação, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, ou um polipeptídeo tendo atividade de beta-galactosidase que foi modificado pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13 ou 14, com lactose.
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