BR112019021142A2 - Enzimas lactase com propriedades aprimoradas - Google Patents

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eckhardt Thomas
VOJINOVIC Vojislav
Elisabeth Grüner Schöller Charlotte
Maarten Van Den Brink Johannes
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Chr. Hansen A/S
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Abstract

a presente invenção refere-se a peptídeos aprimorados ou peptídeos diméricos que exibem atividade de enzima beta-galactosidase, bem como métodos aprimorados para reduzir o teor de lactose em composições, tais como produtos lácteos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ENZIMAS LACTASE COM PROPRIEDADES APRIMORADAS.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a peptídeos ou peptídeos diméricos inovadores aprimorados que exibem atividade de enzima betagalactosidase, bem como métodos aprimorados para reduzir o teor de lactose em composições, tais como produtos lácteos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Para crescer no leite, a hidrólise da lactose é uma boa maneira pela qual as bactérias do ácido láctico obtêm glicose e galactose como fonte de carbono. A lactase (beta-galactosidase; EC 3.2.1.23) é a enzima que executa a etapa de hidrólise da lactose do açúcar do leite em monossacarídeos. O uso comercial da lactase é decompor a lactose em produtos lácteos. Pessoas intolerantes à lactose têm dificuldade em digerir produtos lácteos com altos níveis de lactose. Estima-se que cerca de 70% da população mundial tenha uma capacidade limitada de digerir lactose. Consequentemente, há uma demanda crescente por produtos lácteos que não contêm ou contêm baixos níveis de lactose.
[0003] As lactases foram isoladas a partir de uma grande variedade de organismos, incluindo micro-organismos tais como Kluyveromyces e Bacillus. Kluyveromyces, especial mente K. fragilis e K. lactis, e outros fungos tais como aqueles dos gêneros Candida, Torula e Torulopsis, são uma fonte comum de lactases fúngicas, enquanto que B. coagulans e B. circulans são fontes bem conhecidas de lactases bacterianas. Várias preparações comerciais de lactase derivadas destes organismos estão disponíveis, como Lactozym® (disponível a partir da Novozymes, Dinamarca), HA-Lactase (disponível a partir da Chr. Hansen, Dinamarca) e Maxilact® (disponível a partir da DSM, na Holanda), todas de
K. lactis. Todas estas lactases são as assim denominadas lactases neutras que têm um pH ideal entre um pH de 6 e um pH de 8, bem como
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2/99 uma temperatura ideal em torno de 37°C. Quando estas lactases são usadas, por exemplo, na produção de iogurte com baixo teor de lactose, o tratamento enzimático deve ser feito em uma etapa separada antes de fermentação ou doses altas de enzimas devem ser usadas, uma vez que sua atividade diminui à medida que o pH diminui durante a fermentação. Além disso, estas lactases não são adequadas para hidrólise da lactose no leite realizada em altas temperaturas o que, em alguns casos, seria benéfico para manter a contagem microbiana baixa e, assim, assegurar uma elevada qualidade do leite. Além disso, as lactases conhecidas não seriam adequadas para uso em um processo desejado para a produção de leite tratado em temperatura ultraelevada (UHT), em que as enzimas foram adicionadas antes do tratamento UHT.
[0004] Os documentos WO2010092057 e WO0104276 se referem a beta-galactosidases ativadas pelo frio. O documento WO07110619 se refere à beta-galactosidase com elevada atividade de transgalactosilação, enquanto que o documento WQ2009071539 se refere à beta-galactosidase com menor atividade de transgalactosilação.
OBJETIVO DA INVENÇÃO
[0005] É um objetivo das modalidades da invenção fornecer betagalactosidases com propriedades que permitem a produção de produtos aprimorados sem lactose ou com baixo teor de lactose.
[0006] É um objetivo adicional das modalidades da invenção fornecer beta-galactosidases com propriedades que permitem métodos aprimorados, tais como tornam mais fácil, mais rápido, mais confiável ou mais barata, a redução de lactose em um produto, tais como produtos sem lactose ou com baixo teor de lactose.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] O(s) presente(s) inventor(es) identificou/identificaram betagalactosidases com propriedades não anteriormente descritas que permitem a produção de produtos aprimorados sem lactose ou com baixo
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3/99 teor de lactose, bem como permitem métodos de produção aprimorados para estes produtos sem lactose ou com baixo teor de lactose. Em particular, foi demonstrado que estas beta-galactosidases são muito estáveis com atividade relativamente alta em uma faixa muito ampla de ambas as temperaturas, bem como valores de pH. Elas também são utilizáveis em temperaturas específicas, tais como altas temperaturas, e valores de pH que normalmente não são encontrados com estas enzimas. Primeiramente, isto permite o uso de beta-galactosidases em valores de pH e temperaturas específicos que não se sabia serem possíveis. Isto também permite o uso da mesma enzima específica em várias aplicações diferentes, o que é altamente solicitado na indústria.
[0008] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12,13,14, 15,16,17,18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos.
[0009] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a um peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3; 5 e 6; 20 e 21; 23 e 24; 26 e 27; ou 28 e 29, ou fragmentos enzimaticamente ativos do mesmo, ou uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos mesmos que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos.
[0010] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo ou peptídeo
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4/99 dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase de acordo com a invenção.
[0011] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a uma célula hospedeira que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase de acordo com a invenção.
[0012] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um método para produzir um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase de acordo com a invenção, método o qual que compreende expressar um vetor que contém uma sequência de nucleotídeos de acordo com a invenção em uma célula hospedeira adequada; e purificar o dito peptídeo ou peptídeo dimérico dos produtos de expressão da dita célula hospedeira.
[0013] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um método para reduzir o teor de lactose em uma composição que contém lactose, tal como em produtos lácteos, que compreende a etapa de contatar a dita composição com um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1- 33; ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21, 23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências; ou uma célula hospedeira que expressa qualquer um dos ditos peptídeos, em um pH que varia entre 3-10 e em uma temperatura que varia a partir de 0°C-140°C.
[0014] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere ao uso de um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 -33 ou peptídeo dimérico o qual consiste
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5/99 em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21, 23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências; ou uma célula hospedeira que expressa qualquer um dos ditos peptídeos para produzir um produto lácteo com um teor reduzido de lactose.
[0015] Em algumas modalidades, esta composição que contém lactose ou este produto lácteo é selecionado a partir do grupo que consiste em leite sem lactose, leite com baixo teor de lactose, iogurte, incluindo iogurte não pasteurizado e pré- e pós-pasteurizado, queijo, produtos lácteos fermentados, suplemento dietético e produtos dietéticos probióticos. Em algumas outras modalidades, esta célula hospedeira é qualquer uma selecionada a partir de uma bactéria do gênero Bifidobacterium, como Bifidobacterium, tal como Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium eatenulatum, Bifidobacterium longum ou do gênero Lactobacillus, tal como L. sakei, L. amylovorus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. Indicus, L. crispatus, L. reuteri, L. helveticus ou de Streptococcus thermophilus. Em algumas outras modalidades, a concentração de lactose é reduzida para menos de cerca de 1%, tal como menos de cerca de 0,1% ou menos, tal como menos de cerca de 0,01%.
[0016] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um método para a produção de um produto lácteo, o método compreendendo as etapas de:
(a) fornecer um substrato à base de leite que compreende lactose;
(b) adicionar um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33; ou peptídeo dimérico
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6/99 o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21,23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências ao dito substrato à base de leite que compreende lactose; e (c) tratar o dito substrato à base de leite com o dito peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de beta-galactosidase.
Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um produto lácteo preparado por meio de um método de acordo com a invenção.
[0017] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um produto alimentício, tal como um produto lácteo, que compreende um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima betagalactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33, ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21, 23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências.
[0018] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um produto alimentício, tal como um produto lácteo, que compreende uma célula hospedeira que expressa um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 133, ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21, 23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências. Em algumas modalidades específicas, este produto
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7/99 alimentício é selecionado a partir de bebidas, alimentos para bebês, cereais, pão, biscoitos, produtos de confeitaria, bolos, suplementos alimentares, produtos probióticos comestíveis, produtos prebióticos comestíveis, ração para animais, ração para aves e medicamentos ou um produtos lácteos selecionados a partir do grupo que consiste em leite sem lactose, leite com baixo teor de lactose, leite em pó, leites para bebês, iogurte, sorvete, queijo, produtos lácteos fermentados, suplemento dietético e produtos dietéticos probióticos.
LEGENDAS DAS FIGURAS
[0019] Figura 1. A atividade específica das enzimas purificadas determinada em um pH de 6,7 a 37°C com lactose como substrato, denominado SUAL-1, discutido no Exemplo 6. O desvio padrão medido sob a condição especificada foi de menos de 6%.
[0020] Figura 2. A atividade específica das enzimas purificadas determinada em um pH de 6,7 a 37°C na presença de galactose, descrita como SUAG, discutido no Exemplo 7. O desvio padrão medido sob a condição especificada foi de menos de 15%.
[0021 ] Figura 3. A atividade específica das enzimas purificadas determinada em um pH de 6,7 a 4°C com lactose como substrato, descrito como SUAL-2, discutido no Exemplo 8. O desvio padrão medido sob a condição especificada foi de menos de 5%.
[0022] Figura 4. A atividade específica das enzimas purificadas determinada em um pH de 6,7 a 43°C com lactose como substrato, descrito como SUAL-3, discutido no Exemplo 9. O desvio padrão medido sob a condição especificada foi de menos de 5%.
[0023] Figura 5. A atividade específica das enzimas purificadas determinada em um pH de 5,5 a 4°C com lactose como substrato, descrito como SUAL-4, discutido no Exemplo 10. O desvio padrão medido sob a condição especificada foi de menos de 5%.
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[0024] Figura 6. A atividade específica das enzimas purificadas determinada em um pH de 5,5 a 37°C com lactose como substrato, descrito como SUAL-5, discutido no Exemplo 11.0 desvio padrão medido sob a condição especificada foi de menos de 5%.
[0025] Figura 7. A atividade específica das enzimas purificadas determinada em um pH de 5,5 a 43°C com lactose como substrato, descrito como SUAL-6, discutido no Exemplo 12. O desvio padrão medido sob a condição especificada foi de menos de 5%.
[0026] Figura 8. A atividade específica das enzimas purificadas determinada em um pH de 4,5 a 4°C com lactose como substrato, descrito como SUAL-7, discutido no Exemplo 13. O desvio padrão medido sob a condição especificada foi de menos de 5%.
[0027] Figura 9. A atividade específica das enzimas purificadas determinadas em um pH de 4,5 a 37°C com lactose como substrato, descrito como SUAL-8, discutido no Exemplo 14. O desvio padrão medido sob a condição especificada foi de menos de 5%.
[0028] Figura 10. A atividade específica das enzimas purificadas determinadas em um pH de 4,5 a 43°C com lactose como substrato, descrito como SUAL-9, discutido no Exemplo 15. O desvio padrão medido sob a condição especificada foi de menos de 5%.
[0029] Figura 11. A porcentagem de lactose residual no leite pasteurizado após tratamento com uma quantidade fixa de enzima, após 24 horas a 5°C, determinada por HPLC.
[0030] Figura 12. A porcentagem de lactose residual no leite UHT após tratamento com uma quantidade fixa de enzima, após 24 horas a 25°C, determinada por HPLC.
[0031 ] Figura 13. A porcentagem de atividade residual das enzimas purificadas em temperaturas elevadas, determinada usando lactose como substrato. A atividade em um pH de 6,7 a 37°C foi considerada como 100%.
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[0032] Figura 14. A atividade específica das enzimas purificadas determinada em um pH de 6,7 a 4°C, 37°C e 43°C. A atividade específica medida é descrita como pmol de glicose formada por minuto por mg de enzima. O método de inibição de galactose é descrito no Exemplo 7 e calculado com base em pmol de glicose formada por minuto por mg de enzima.
[0033] Figura 15. A atividade específica das enzimas purificadas foi determinada em um pH de 5,5 a 4°C, 37°C e 43°C. A atividade específica medida é descrita como pmol de glicose formada por minuto por mg de enzima.
[0034] Figura 16. A atividade específica das enzimas purificadas foi determinada em um pH de 4,5 a 4°C, 37°C e 43°C. A atividade específica medida é descrita como pmol de glicose formada por minuto por mg de enzima.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0035] Os presentes inventores descobriram que determinados peptídeos e peptídeos diméricos que exibem atividade de enzima beta-galactosidase são, surpreendentemente, estáveis em muitas condições físicas diferentes, fornecendo uma atividade relativamente alta fora das faixas tipicamente consideradas ideais para esta classe de enzimas.
[0036] Consequentemente, estas enzimas identificadas pelos presentes inventores têm uma atividade relativamente alta em torno de 4°C ou 5°C e podem, portanto, ser usadas para hidrólise de lactose na produção, por exemplo, de leite fresco. Além disso, as enzimas também têm uma atividade relativamente elevada na faixa a partir de 10°C a 25QC e exatamente as mesmas enzimas podem ser usadas para a hidrólise de lactose em leite UHT. Esta viabilidade das enzimas, mesmo em amplas faixas de temperatura, é altamente relevante, uma vez que o leite pode ser armazenado em temperatura normal/ambiente, a
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10/99 qual pode ser diferente em diferentes partes do mundo, também dependendo das estações do ano. Para o tratamento UHT, a temperatura está, tipicamente, em torno de 135QC ou em torno de 140QC. É altamente desejado que as enzimas possam ter atividade na faixa de uma temperatura de até 140QC, de modo que a enzima possa ser adicionada ao leite bruto antes da etapa de UHT. Nas práticas atuais, a enzima é adicionada após a etapa UHT, uma vez que as enzimas conhecidas na técnica exibem uma diminuição significativa na atividade funcional, tal como um valor abaixo da atividade mensurável, após a etapa de tratamento em temperatura elevada. Também, o leite é armazenado em temperatura ambiente, a qual pode variar significativamente em diferentes partes do mundo.
[0037] Descobriu-se também que estes novos peptídeos aprimorados que exibem atividade de enzima beta-galactosidase têm atividade na faixa de temperatura normalmente usada para pasteurização. Consequentemente, estas enzimas podem ser adicionadas ao leite bruto antes de pasteurização. Deve ser entendido que as enzimas conhecidas na técnica têm uma diminuição significativa na atividade funcional, tal como um valor abaixo da atividade mensurável, após uma etapa de pasteurização.
[0038] Uma vantagem adicional destes novos peptídeos aprimorados que exibem atividade de enzima beta-galactosidase é que eles têm um grau relativamente baixo de inibição de galactose. A menor inibição de galactose destas enzimas inovadoras é altamente relevante para aplicações em que são desejadas concentrações muito baixas de lactose.
[0039] Em termos de aplicabilidade para produtos fermentados, é altamente vantajoso que as enzimas descritas aqui tenham uma elevada atividade enzimática de beta-galactosidase em uma faixa de temperaturas relativamente ampla de entre 4°C e 43°C, tal como em torno
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11/99 de 37°C, onde a fermentação tipicamente seria ideal, mas também que esta atividade da enzima beta-galactosidase esteja presente em um baixo pH, tal como até 4,5 ou 4,0 a 4,0 ou 3,5 ou 3,5 ou mesmo em um pH de 3.
[0040] Em suma, os presentes inventores descobriram que alguns peptídeos que exibem atividade de enzima beta-galactosidase são ativos em uma ampla faixa de temperaturas, ativos em uma ampla faixa de pHs, têm uma elevada atividade hidrolítica geral sem atividades colaterais, que estes peptídeos não têm ou têm pouca inibição de galactose, tal como menos de 60%, e que são estáveis durante armazenamento a longo prazo.
[0041] A atividade de beta-galactosidase pode ser determinada ao medir a quantidade de glicose liberada após incubação com lactose sob condições definidas. A glicose liberada pode ser detectada por meio de uma reação de coloração.
Definições
[0042] O termo leite, conforme usado aqui e no contexto da presente invenção, deve ser entendido como a secreção láctea obtida pela ordenha de qualquer mamífero, tal como vaca, ovelha, cabra, búfala ou camelo.
[0043] O termo composição que contém lactose, conforme usado aqui, se refere a qualquer composição, tal como qualquer líquido, que contenha lactose em um grau mensurável significativo, tal como um teor de lactose maior do que 0,002 % (0,002 g/100 ml). Dentro deste termo estão abrangidos o leite e os substratos à base de leite.
[0044] O termo substrato à base de leite, no contexto da presente invenção, pode ser qualquer material de leite bruto e/ou processado. Substratos à base de leite úteis incluem, dentre outros, soluções/suspensões de qualquer leite ou produtos similares ao leite que
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12/99 contenham lactose, tais como leite integral ou semidesnatado, leite desnatado, leitelho, leite com baixo teor de lactose, leite em pó reconstituído, leite condensado, soluções de leite em pó, leite UHT, soro de leite, permeado de soro de leite, soro ácido, creme, produtos lácteos fermentados, tal como iogurte, queijo, suplemento dietético e produtos dietéticos probióticos. Tipicamente, o termo substrato à base de leite se refere a um material de leite bruto ou processado que é adicionalmente processado para produzir um produto lácteo.
[0045] O termo pasteurização, conforme usado aqui, se refere ao processo de redução ou eliminação da presença de organismos vivos, tais como micro-organismos, em um substrato à base de leite. De preferência, a pasteurização é obtida ao manter uma temperatura especificada durante um período de tempo especificado. A temperatura especificada é, em geral, atingida por meio de aquecimento. A temperatura e a duração podem ser selecionadas para matar ou inativar determinadas bactérias, tais como bactérias nocivas, e/ou inativar enzimas no leite. Uma etapa de resfriamento rápido pode seguir.
[0046] O termo produto lácteo, conforme usado aqui, pode ser qualquer produto alimentício em que um dos principais constituintes seja à base de leite. Tipicamente, o principal constituinte é à base de leite e, em algumas modalidades, o principal constituinte é um substrato à base de leite que foi tratado com uma enzima que tem atividade de beta-galactosidase de acordo com um método da presente invenção.
[0047] Um produto lácteo de acordo com a invenção pode ser, por exemplo, leite desnatado, leite semidesnatado, leite integral, creme, leite UHT, leite longa vida, um produto lácteo fermentado, queijo, iogurte, manteiga, pasta láctea, leitelho, bebida láctea acidificada, creme de leite, bebida à base de soro de leite, sorvete, leite condensado, doce de leite ou uma bebida láctea com sabor.
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[0048] Um produto lácteo pode compreender adicionalmente componentes que não são de leite, por exemplo, componentes vegetais tais como, por exemplo, óleo vegetal, proteína vegetal e/ou carboidratos vegetais. Os produtos lácteos também podem compreender outros aditivos tais como, por exemplo, enzimas, agentes flavorizantes, culturas microbianas, tais como culturas probióticas, sais, adoçantes, açúcares, ácidos, frutas, preparação de frutas, sucos de frutas ou qualquer outro componente conhecido na técnica como componente ou aditivo de um produto lácteo.
[0049] Os termos produto lácteo fermentado ou produto de leite fermentado, conforme usado aqui, devem ser entendidos como qualquer produto lácteo em que qualquer tipo de fermentação faça parte do processo de produção. Exemplos de produtos lácteos fermentados são produtos tais como iogurte, leitelho, creme fraiche, coalhada e fromage frais. Um produto lácteo fermentado pode ser produzido através de ou incluir etapas de qualquer método conhecido na técnica.
[0050] O termo fermentação, conforme usado aqui, se refere à conversão de carboidratos em álcoois ou ácidos através da ação de um micro-organismo. Em algumas modalidades, a fermentação de acordo com a presente invenção compreende a conversão de lactose em ácido láctico. No contexto da presente invenção, micro-organismo pode incluir qualquer bactéria ou fungo capaz de fermentar o substrato lácteo. [0051] O termo atividade de enzima beta-galactosidase aumentada, conforme aqui usado, se refere a uma atividade específica relativamente mais alta de uma enzima beta-galactosidase comparado com uma sequência de referência.
[0052] O termo peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, conforme usado aqui, se refere a qualquer peptídeo que tem atividade enzimática para catalisar a hidrólise do dissacarídeo lactose
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14/99 em seus monossacarídeos componentes glicose e galactose. Este peptídeo também pode ser denominado como uma lactase ou simplesmente uma beta-galactosidase (EC: 3.2.1.23).
[0053] Os termos peptídeo e oligopeptídeo, conforme usado no contexto deste presente pedido, são considerados sinônimos (conforme é comumente reconhecido) e cada termo pode ser usado alternadamente, uma vez que o contexto requer a indicação de uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos acoplados através de ligações de peptidila. A palavra polipeptídeo é usada aqui para cadeias que contêm mais de dez resíduos de aminoácidos. Todas as fórmulas ou sequências peptídicas e polipeptídicas descritas aqui são escritas da esquerda para a direita e na direção do terminal amino para o terminal carboxila. Proteínas, conforme usado aqui, se refere a sequências peptídicas à medida que são produzidas por algum organismo hospedeiro e podem incluir modificação pós-traducional, tais como glicanos adicionados.
[0054] Os termos aminoácido ou sequência de aminoácidos, conforme usado aqui, se referem a uma sequência de oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo ou proteína, ou um fragmento de qualquer um dos mesmos, e a moléculas naturais ou sintéticas. Neste contexto, fragmento se refere a fragmentos de um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que retém alguma atividade enzimática. Onde sequência de aminoácidos é citada aqui para se referir a uma sequência de aminoácidos de uma molécula de proteína que ocorre naturalmente, sequência de aminoácidos e termos similares não se destinam a limitar a sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos nativa completa associada à molécula peptídica citada.
[0055] Peptídeos exemplificativos da invenção também incluem fragmentos de pelo menos cerca de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400,
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450, 500, 550, 600, 650, 650, 700, 750, 800 ou mais resíduos de comprimento ou acima do comprimento total de uma enzima. Consequentemente, um fragmento peptídico ou fragmento enzimaticamente ativo da invenção são fragmentos que retêm pelo menos alguma atividade enzimática funcional. Tipicamente, um fragmento peptídico da invenção ainda conterá o domínio catalítico funcional ou outros sítios ativos essenciais do peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase. Outros domínios podem ser excluídos.
[0056] Tipicamente, a atividade específica da enzima beta-galactosidase será medida e indicada como pmole de glicose formada/min/mg de enzima usada. Este valor específico, no entanto, variará dependendo das condições aplicadas, tais como temperatura e pH. Consequentemente, os valores para a atividade de enzima beta-galactosidase também podem ser denominados como em relação a uma enzima de referência conhecida, tal como a enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 OU SEQ ID NO: 35.
[0057] Alternativamente, a atividade específica da enzima beta-galactosidase pode ser medida e indicada como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima usada. Este valor específico, no entanto, variará dependendo das condições aplicadas, tais como temperatura e pH.
[0058] Salvo indicação em contrário, o termo identidade de sequência para aminoácidos, conforme aqui usado, se refere à identidade de sequência calculada como (nref- ndit) - 1OO/nref, em que ndifé o número total de resíduos não idênticos nas duas sequências quando alinhadas e em que nreté o número de resíduos em uma das sequências.
[0059] Em algumas modalidades, a identidade da sequência é determinada por meio de métodos convencionais, por exemplo, Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, por meio do método de busca por similaridade de Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
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85: 2444, usando o algoritmo CLUSTAL W de Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res 22: 467380, através de implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group ). O algoritmo BLAST (Altschul etal., 1990, Mol. Biol. 215: 403-10) para o qual o software pode ser obtido através do National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/) também pode ser usado. Ao usar qualquer um dos algoritmos supracitados, são usados os parâmetros padrão para o comprimento da Janela, penalidade por lacunas, etc.
[0060] Um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos específica conforme descrito aqui pode variar, em relação a uma sequência peptídica de referência, por qualquer uma de substituições, adições/inserções ou eliminações de aminoácidos.
[0061] Algumas modalidades de acordo com a presente invenção se referem ao uso de um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33 ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências. Em algumas modalidades, esta identidade de sequência pode ser pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, tal como um peptídeo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos comparado com qualquer sequência de aminoácidos de referência individual representada por SEQ ID NO: 133. A invenção também apresenta fragmentos biologicamente ativos dos peptídeos de acordo com a invenção. Fragmentos biologicamente ativos de um peptídeo da invenção incluem peptídeos que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas da sequência de aminoácidos do peptídeo da invenção que incluem me
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17/99 nos aminoácidos do que a proteína de comprimento total, porém, exibem uma parte substancial da atividade biológica do peptídeo de comprimento completo correspondente. Tipicamente, os fragmentos biologicamente ativos compreendem um domínio ou motivo que tem pelo menos uma atividade de uma proteína variante da invenção. Um fragmento biologicamente ativo de um peptídeo da invenção pode ser um peptídeo que tem, por exemplo, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,1000 ou mais aminoácidos de comprimento.
[0062] O termo célula hospedeira, conforme usado aqui, inclui qualquer tipo de célula suscetível à transformação, transfecção, transdução e assim por diante com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica os peptídeos da presente invenção. Uma célula hospedeira pode ser um tipo de célula onde uma enzima específica é derivada ou pode ser um tipo de célula alternativo suscetível de produzir uma enzima específica. O termo inclui cepas de tipo selvagem e atenuadas.
[0063] A célula hospedeira adequada pode ser uma bactéria que inclui ácido láctico da ordem Lactobacillales, a qual inclui Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp. Pediococcus spp., Brevibacterium spp. Enterococcus spp. e Propionibacterium spp. Ela também incluiu uma bactéria produtora de ácido láctico pertencente ao grupo de uma bactéria anaeróbica, bifidobactérias, isto é, Bifidobacterium spp., as quais são frequentemente usadas como culturas alimentícias isoladamente ou em combinação com bactérias do ácido láctico. Também estão incluídos nesta definição Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetilactis, Lactobacillus casei subsp. casei e Lactobacillus subsp. paracasei. Paracasei e bactérias do ácido láctico
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18/99 termofílicas incluem espécies tais como Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e Lactobacillus acidophilus. Outras bactérias específicas dentro desta definição incluem bactérias da família Bifidobacteriaceae, tais como aquelas do gênero Bifidobacterium, tal como uma cepa de Bifidobacterium animalis ou Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brevis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium infantus, o gênero Lactobacillus, tais como L. sakei, L. amylovorus, L. delbrueckii subsp. Lactis e L. helveticus.
[0064] Também incluídos nesta definição de células hospedeiras incluem cepas de Agaricus, por exemplo, A. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, por exemplo, D. discoideum; Kluveromyces, spp. K. fragilis, K. lactis; Mucor, por exemplo, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, spp. N. crassa; Rhizomucor, por exemplo, R. pusillus; Rhizopus, por exemplo, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Esclerotinia, por exemplo, S. libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, por exemplo, T. rubrum; Whetzelinia, por exemplo, l/IZ. sclerotiorum; Bacillus, por exemplo, B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. subtilis, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, por exemplo, B. longum, B. bifidum, B. animalis; Chryseobacterium; Citrobacter, spp. C. freundii; Clostridium, por exemplo, C. perfringens; Diplodia, spp. D. gossypina; Enterobacter, por exemplo, E. aerogenes, E. cloacae, Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por exemplo, E. herbicola; Escherichia, por exemplo, E. coli; Klebsiella, spp. K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neurospora, spp. N. crassa; Proteus, por exemplo, P. vulgaris; Providencia, por
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19/99 exemplo, P. stuartii; Pycnoporus, spp. Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus, spp. R. torques; Salmonella, por exemplo, S. typhimurium; Serratia, spp. S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, spp. S. flexneri; Streptomyces, por exemplo, S. antibioticus, S. castaneoglobisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, por exemplo, T. reesei, T. vi ride; Yersinia, por exemplo, Y. enterocolitica. Modalidades Específicas da Invenção
[0065] Conforme descrito acima, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33 ou uma sequência de aminoácidos que tem no máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. [0066] Consequentemente, em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21
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20/99 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção
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21/99 se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 13 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de ami
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22/99 noácidos representada por SEQ ID NO: 14 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 16 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 19 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21
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23/99 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 21 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção
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24/99 se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 25 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 26 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 27 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 28 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 29 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de ami
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25/99 noácidos representada por SEQ ID NO: 30 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 31 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 33 ou uma sequência de aminoácidos do mesmo que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos.
[0067] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por Segundo por μΜ de enzima sob condições conforme descrito no Exemplo 8 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 6,7, que é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como
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26/99 pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0068] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 6,7, atividade a qual é maior do que a atividade de um enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0069] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 6,7, atividade a qual é maior do que cerca de 2, tal como maior do que cerca de 4, tal como maior do que cerca de 6, tal como maior do que cerca de 8, tal como maior do que cerca de 10, maior do que cerca de 12, maior do que 14, maior do que 16 μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima.
[0070] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob condições conforme fornecido no Exemplo 10 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 5,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO:
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27/99 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0071] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΙΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 5,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 35 de pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0072] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 5,5, atividade a qual é maior do que cerca de 1, tal como maior do que cerca de 2, tal como maior do que cerca de 3, tal como maior do que cerca de 4, tal como maior do que cerca de 5, maior do que cerca de 6, maior do que 7, maior do que 8 μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima.
[0073] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob condições conforme
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28/99 fornecido no Exemplo 13 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 4,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0074] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 4,5, que é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0075] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 4,5, atividade a qual é maior do que cerca de 0,5, tal como maior do que cerca de 1,0, tal como maior do que cerca de 1,5, tal como maior do que cerca de 2,0, tal como maior do que cerca de 2,5, maior do que cerca de 3,0, maior do que 3,5, maior do que 4,0 μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima.
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[0076] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob condições conforme fornecido no Exemplo 9 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 6,7, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0077] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 6,7, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%. [0078] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida em μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 6,7, atividade a qual é maior do que cerca de 10, tal como maior do que cerca de 20, tal como maior do que cerca
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30/99 de 40, tal como maior do que cerca de 60, tal como maior do que cerca de 80, tal como maior do que cerca de 100, tal como maior do que cerca de 120, tal como maior do que cerca de 140, tal como maior do que cerca de 160 μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima. [0079] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob condições conforme fornecido no Exemplo 12 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 5,5, que é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0080] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 5,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
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[0081] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 5,5, atividade a qual é maior do que cerca de 5, tal como maior do que cerca de 10, tal como maior do que cerca de 15, tal como maior do que cerca de 20, tal como maior do que cerca de 25, tal como maior do que cerca de 30, tal como maior do que cerca de 35, tal como maior do que cerca de 40, tal como maior do que cerca de 45, tal como maior do que cerca de 50, tal como maior do que cerca de 55, tal como maior do que cerca de 60 μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima.
[0082] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como //μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob condições conforme fornecido no Exemplo 15 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 4,5, que é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0083] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como //μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 4,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO:
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34ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tai como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tai como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tai como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%. [0084] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como//pM de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 4,5, atividade a qual é maior do que cerca de 1, tal como maior do que cerca de 2, tal como maior do que cerca de 3, tal como maior do que cerca de 4, tal como maior do que cerca de 5, tal como maior do que cerca de 6, maior do que cerca de 7, maior do que cerca de 8, maior do que 9, maior do que 10, maior do que 11, maior do que 11, maior do que 12//μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima.
[0085] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como //μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob condições conforme fornecido no Exemplo 6 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 6,7, que é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
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[0086] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como //μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 6,7, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 35 de pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80 %, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%. Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como//pM de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 6,7, atividade a qual é maior do que cerca de 10, tal como maior do que cerca de 20, tal como maior do que cerca de 30, tal como maior do que cerca de 40, tal como maior do que cerca de 50, tal como maior do que cerca de 60, tal como maior do que cerca de 70, tal como maior do que cerca de 80, tal como maior do que cerca de 90, tal como maior do que cerca de 100, tal como maior do que cerca de 110, tal como maior do que cerca de 110, tal como maior do que cerca de 120, tal como maior do que cerca de 130//μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima.
[0087] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como //μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob condições conforme fornecido no Exemplo 11 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 5,5, que é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34ou SEQ ID NO: 35 em
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34/99 pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0088] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como //μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 5,5, que é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0089] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como//pM de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 5,5, atividade a qual é maior do que cerca de 5, tal como maior do que cerca de 10, tal como maior do que cerca de 15, tal como maior do que cerca de 20, tal como maior do que cerca de 25, tal como maior do que cerca de 30, tal como maior do que cerca de 35, tal como maior do que cerca de 40, tal como maior do que cerca de 45, tal como maior do que cerca de 50, tal como maior do que cerca de 55, tal como maior do que cerca de 60//μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima.
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[0090] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como //μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob condições conforme fornecido no Exemplo 14 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 4,5, que é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0091] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como //μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 4,5, que é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34ou SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%. Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção tem uma atividade de beta-galactosidase medida como//pM de glicose formada por segundo por μΜ de enzima em uma temperatura de cerca de 37°C e um pH de 4,5, atividade a qual é maior do que cerca de 1, tal como maior do que cerca de 2, tal como maior do que cerca de 3, tal como maior do que
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36/99 cerca de 4, tal como maior do que cerca de 5, tal como maior do que cerca de 6, maior do que cerca de 7, maior do que 8, maior do que 9, maior do que 10, maior do que 11, maior do que 11, maior do que 12, maior do que 12 maior do que cerca de 13, maior do que cerca de 14, maior do que cerca de 15, maior do que 16, maior do que 17, maior do que 18//μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima.
[0092] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção é derivado de uma bactéria do gênero Bifidobacterium, tal como Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium long um ou do gênero Lactobacillus, tal como L. sakei, L. amylovorus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. Indicus, L. crispatus, L. reuteri, L. helveticus ou de Streptococcus thermophilus.
[0093] Em algumas modalidades, o peptídeo de acordo com a invenção exibe uma inibição de galactose de menos de 60%, tal como menos de 55%, tal como menos de 50%, tal como menos de cerca de 45%, tal como menos de cerca de 40%.
[0094] Conforme descrito acima, a presente invenção se refere, em parte, a um método para produzir um produto lácteo, o método compreendendo as etapas de:
(a) fornecer um substrato à base de leite que compreende lactose;
(b) adicionar um peptídeo que exibe atividade de beta-galactosidase e tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33 ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências ao dito substrato à base de leite que compreende lactose; e (c) tratar o dito substrato à base de leite com o dito peptídeo que exibe atividade de beta-galactosidase.
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[0095] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, esse peptídeo é derivado de qualquer bactéria do gênero Bifidobacterium, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium Iongum ou do gênero Lactobacillus, tal como L. sakei, L. amylovorus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. Indicus, L. crispatus, L. reuteri, L. helveticus ou de Streptococcus thermophilus.
[0096] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, a etapa c) ocorre em um pH dentro de uma faixa a partir de 3 a 10, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 9, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 8, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 7, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 6, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 5, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 4, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 10, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 9, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 8, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 7, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 6, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 5, tal como dentro de uma faixa a partir de 5 a 10, tal como dentro de uma faixa a partir de 5 a 9, tal como dentro de uma faixa a partir de 5 a 8, tal como dentro de uma faixa a partir de 5 a 7, tal como dentro de uma faixa a partir de 5 a 6, tal como dentro de uma faixa a partir de 6 a 10, tal como dentro de uma faixa a partir de 6 a 9, tal como dentro de uma faixa a partir de 6 a 8, tal como dentro de uma faixa a partir de 6 a 7.
[0097] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, a etapa c) ou uma parte da etapa c) ocorre em uma temperatura de não mais do que cerca de 25QC, tal como não mais do que cerca de 20QC, tal como não mais do que cerca de 18QC, tal como não mais do que 16QC, tal como não mais do que 14QC, tal como não mais do que 12QC, tal como não mais do que 10QC, tal como não mais do que 8QC,
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38/99 tal como não mais do que 7QC, tal como não mais do que 6QC, tal como não mais do que 5QC, tal como não mais do que 4QC, tal como não mais do que 3QC, tal como não mais do que cerca de 2QC.
[0098] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, a etapa c) ou uma parte da etapa c) ocorre em uma temperatura de pelo menos cerca de 25QC, tal como pelo menos cerca de 30QC, tal como pelo menos cerca de 35QC, tal como, pelo menos, cerca de 40QC, tal como pelo menos cerca de 45QC, tal como pelo menos cerca de 50QC, tal como pelo menos cerca de 55QC, tal como pelo menos cerca de 60QC, tal como pelo menos cerca de 65QC, tal como pelo menos cerca de 70QC, tal como pelo menos cerca de 75QC, tal como pelo menos cerca de 80QC, tal como pelo menos cerca de 85QC, tal como pelo menos cerca de 85QC, tal como pelo menos cerca de 90QC, tal como pelo menos cerca de 95QC, tal como pelo menos cerca de 100QC, tal como pelo menos cerca de 110QC, tal como pelo menos cerca de 120QC, tal como pelo menos cerca de 130QC, tal como pelo menos cerca de 120QC, tal como pelo menos cerca de 130QC, tal como pelo menos cerca de 135QC, tal como pelo menos cerca de 140QC.
[0099] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, o produto lácteo é selecionado a partir do grupo que consiste em leite sem lactose, leite com baixo teor de lactose, iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados, suplemento dietético e produtos dietéticos probióticos.
[0100] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, o substrato à base de leite é selecionado a partir de leite fresco ou leite bruto obtido diretamente a partir de uma etapa de pasteurização, leite obtido diretamente após uma etapa de tratamento em temperatura ultraelevada (UHT) ou leite obtido diretamente após uma etapa de fermentação.
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[0101] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, a inibição de galactose pelo peptídeo usado é menor do que 60%, tal como menor do que 55%, tal como menor do que 50%, tal como menor do que cerca de 45%, tal como menor do que cerca de 40%.
[0102] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, o produto lácteo é um produto de leite fermentado e a dita etapa b) é realizada durante ou antes de fermentação.
[0103] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, o método não requer a adição de mais enzima após a fermentação. [0104] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, o produto lácteo é um produto de leite fermentado e a dita etapa b) é realizada imediatamente após a fermentação.
[0105] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, o produto lácteo é leite fresco e a dita etapa b) é realizada antes, em conjunto com ou imediatamente após uma etapa de pasteurização. [0106] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, o produto lácteo é o leite que sofreu tratamento em temperatura ultraelevada (UHT) e a dita etapa b) é realizada antes de, em conjunto com ou imediatamente após uma etapa de tratamento em temperatura ultraelevada.
[0107] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, a etapa c) é iniciada em uma temperatura entre 40°C e 100°C, tal como em uma temperatura entre 50°C e 100°C, tal como em uma temperatura entre 60°C e 100°C, tal como em uma temperatura entre 70°C e 100°C, tal como em uma temperatura entre 80°C e 100°C, tal como em uma temperatura entre 40°C e 90°C, tal como em uma temperatura entre 40°C e 80°C, tal como em uma temperatura entre 40°C e 70°C, tal como em uma temperatura entre 40°C e 60°C, tal como em uma temperatura entre 40°C e 50°C.
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[0108] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, o peptídeo, quando de hidrólise da lactose no substrato à base de leite, tem uma proporção de atividade de lactase para transgalactosilase maior do que 1:1.
[0109] Em algumas modalidades de acordo com a presente invenção, menos de 80% da lactose foram hidrolisados quando a etapa c) é concluída e mais de 90% da lactose foram hidrolisados após uma semana.
Modalidades Numeradas:
[0110] 1. Um peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33 ou fragmentos enzimaticamente ativos dos mesmos ou uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos mesmos que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos.
[0111] 2. O peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima betagalactosidase, peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21,23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou fragmentos enzimaticamente ativos dos mesmos ou uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos mesmos que tem não mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos.
[0112] 3. O peptídeo ou peptídeo dimérico, de acordo com as modalidades 1 ou 2, que tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob condições conforme fornecido no Exemplo 8 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 6,7, atividade a qual é maior do que
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41/99 a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 OU SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%. [0113] 4. O peptídeo ou peptídeo dimérico, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 -3, que tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob condições conforme fornecido no Exemplo 10 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 5,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 OU SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300 %, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0114] 5. O peptídeo ou peptídeo dimérico, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 -4, que tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob as condições conforme fornecido no Exemplo 13 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 4QC e um pH de 4,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 OU SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%,
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42/99 tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0115] 6. O peptídeo ou peptídeo dimérico, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 5, que tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob as condições conforme fornecido no Exemplo 9 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 6,7, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 OU SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0116] 7. O peptídeo ou peptídeo dimérico, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 6, que tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob as condições conforme fornecido no Exemplo 12 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 5,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 OU SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca
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43/99 de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0117] 8. O peptídeo ou peptídeo dimérico, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 7, que tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob as condições conforme fornecido no Exemplo 15 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 43QC e um pH de 4,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 OU SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0118] 9. O peptídeo ou peptídeo dimérico, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 8, que tem uma atividade de beta-galactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob as condições conforme fornecido no Exemplo 6 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 6,7, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 OU SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos
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44/99 cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0119] 10. O peptídeo ou peptídeo dimérico, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 9, que tem uma atividade de betagalactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob as condições conforme fornecido no Exemplo 11 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 5,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 OU SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
[0120] 11.0 peptídeo ou peptídeo dimérico, de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 10, que tem uma atividade de betagalactosidase medida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima sob as condições conforme o exemplo 14 descrito aqui em uma temperatura de cerca de 37QC e um pH de 4,5, atividade a qual é maior do que a atividade de uma enzima beta-galactosidase definida por SEQ ID NO: 34 OU SEQ ID NO: 35 em pelo menos cerca de 20%, tal como pelo menos cerca de 30%, tal como pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60%, tal como pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 100%, tal como pelo menos cerca de 200%, tal como pelo menos cerca de 300%, tal como pelo menos cerca de 400%, tal como pelo menos cerca de 500%.
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[0121] 12. O peptídeo ou o peptídeo dimérico de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, derivado de uma bactéria do gênero Bifidobacterium, tal como Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum ou do gênero Lactobacillus, tais como L. sakei, L. amylovorus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. Indicus, L. crispatus, L. reuteri, L. helveticus ou de Streptococcus thermophilus.
[0122] 13. O peptídeo ou peptídeo dimérico de acordo com qualquer uma das modalidades 1-12, em que o dito peptídeo ou peptídeo dimérico exibe uma inibição da galactose menor do que 60%, tal como menor do que 55%, tal como menor do que 50%, tal como menor do que cerca de 45%, tal como menor do que cerca de 40%.
[0123] 14. Uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo ou peptídeo dimérico, conforme definido em qualquer uma das modalidades 1-13.
[0124] 15. Uma célula hospedeira que compreende uma sequência de nucleotídeos conforme definido na modalidade 14.
[0125] 16. Um método para produzir um peptídeo ou peptídeo dimérico, conforme definido em qualquer uma das modalidades 1-13, método o qual compreende expressar um vetor que contém uma sequência de nucleotídeos conforme definido na modalidade 14 em uma célula hospedeira adequada; e purificar o dito peptídeo ou peptídeo dimérico dos produtos de expressão da dita célula hospedeira.
[0126] 17. Um método para reduzir o teor de lactose em uma composição que contém lactose, tal como em produtos lácteos, que compreende a etapa de contatar a dita composição com um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por
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SEQ ID NO: 1-33, ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21,23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou fragmentos enzimaticamente ativos dos mesmos, ou qualquer sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências ou fragmentos enzimaticamente ativos; ou uma célula hospedeira que expressa qualquer um do dito peptídeo ou peptídeo dimérico, em um pH na faixa a partir de 3-10 e em uma temperatura que varia a partir de 0QC-140QC.
[0127] 18. O método de acordo com a modalidade 17, em que a dita composição é um produto lácteo selecionado a partir do grupo que consiste em leite sem lactose, leite com baixo teor de lactose, iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados, suplemento dietético e produtos dietéticos probióticos.
[0128] 19. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 17-18, em que a dita célula hospedeira é qualquer uma selecionada a partir de uma bactéria do gênero Bifidobacterium, tal como Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum ou do gênero Lactobacillus, tal como L. sakei, L. amylovorus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. Indicus, L. crispatus, L. reuteri, L. helveticus ou de Streptococcus thermophilus.
[0129] 20. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 17-19, em que a concentração de lactose é reduzida para menos de cerca de 1%, tal como menos de cerca de 0,1% ou menos, tal como menos de cerca de 0,01%.
[0130] 21. O uso de um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma se
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47/99 quência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33, ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21,23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências; ou uma célula hospedeira que expressa qualquer um dos ditos peptídeo ou peptídeo dimérico para produzir um produto lácteo com um teor reduzido de lactose.
[0131] 22. O uso de acordo com a modalidade 21, em que o dito produto lácteo é selecionado a partir do grupo que consiste em leite sem lactose, leite com baixo teor de lactose, iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados, suplemento dietético e produtos dietéticos probióticos.
[0132] 23. O uso de acordo com qualquer uma das modalidades 21 -
22, em que a dita célula hospedeira é qualquer uma selecionada a partir de uma bactéria do gênero Bifidobacterium, tal como Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum ou do gênero Lactobacillus, tal como L. sakei, L. amylovorus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus,
L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. Indicus, L. crispatus, L. reuteri, L. helveticus ou de Streptococcus thermophilus.
[0133] 24. Um método para produzir um produto lácteo, o método compreendendo as etapas de:
(a) fornecer um substrato à base de leite que compreende lactose;
(b) adicionar um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33; ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21,23 e 24, 26 e
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48/99 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências ao dito substrato à base de leite que compreende lactose; e (c) tratar o dito substrato à base de leite com o dito peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de beta-galactosidase.
[0134] 25. O método de acordo com a modalidade 24, em que o dito peptídeo ou o peptídeo dimérico é derivado a partir de qualquer uma das bactérias do gênero Bifidobacterium, tal como Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum ou do gênero Lactobacillus, tal como L. sakei, L. amylovorus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. Indicus, L. crispatus, L. reuteri, L. helveticus ou de Streptococcus thermophilus.
[0135] 26. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-25, em que a etapa c) ocorre em um pH dentro de uma faixa a partir de 3 a 10, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 9, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 8, como como dentro de uma faixa a partir de 3 a 7, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 6, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 5, tal como dentro de uma faixa a partir de 3 a 4, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 10, como como dentro de uma faixa a partir de 4 a 9, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 8, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 7, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 6, tal como dentro de uma faixa a partir de 4 a 5, como como dentro de um intervalo de 5 a 10, tal como dentro de uma faixa a partir de 5 a 9, tal como dentro de uma faixa a partir de 5 a 8, tal como dentro de uma faixa a partir de 5 a 7, tal como dentro de uma faixa a partir de 5 a 6, como como dentro de um intervalo de 6 a 10, tal como dentro de uma faixa a partir de 6 a 9, tal como dentro de uma faixa a partir de 6 a 8, tal como dentro de uma faixa a partir de 6 a 7.
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[0136] 27. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-26, em que a etapa c) ou uma parte da etapa c) ocorre em uma temperatura de não mais do que cerca de 25QC, tal como não mais do que cerca de 20QC, tal como não mais do que cerca de 18QC, tal como não mais do que cerca de 16QC, tal como não mais do que cerca de 14QC, tal como não mais do que cerca de 12QC, tal como não mais do que cerca de 10QC, tal como não mais do que cerca de 8QC, tal como não mais do que cerca de 7QC, tal como não mais do que cerca de 6QC, tal como não mais do que cerca de 5QC, tal como não mais do que cerca de 4QC, tal como não mais do que cerca de 3QC, tal como não mais do que cerca de 2QC.
[0137] 28. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-27, em que a etapa c) ou uma parte da etapa c) ocorre em uma temperatura de pelo menos cerca de 25QC, tal como pelo menos cerca de 30QC, tal como pelo menos cerca de 35QC, tal como pelo menos cerca de 40QC, tal como pelo menos cerca de 45QC, tal como pelo menos cerca de 50QC, tal como pelo menos cerca de 55QC, tal como pelo menos cerca de 60QC, tal como, pelo menos, cerca de 65QC, tal como pelo menos cerca de 70QC, tal como pelo menos cerca de 75QC, tal como pelo menos cerca de 80QC, tal como pelo menos cerca de 85QC, tal como pelo menos cerca de 90QC, tal como pelo menos cerca de 95QC, tal como pelo menos cerca de 100QC, tal como pelo menos cerca de 110QC, tal como pelo menos cerca de 120QC, tal como pelo menos cerca de 120QC, tal como pelo menos cerca de 130QC, tal como pelo menos cerca de 120QC, tal como pelo menos cerca de 130QC, tal como pelo menos cerca de 135QC, tal como pelo menos cerca de 140QC.
[0138] 29. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-28, em que o dito produto lácteo é selecionado a partir do grupo que consiste em leite sem lactose, leite com baixo teor de lactose, io
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50/99 gurte, queijo, produtos lácteos fermentados, suplemento dietético e produtos dietéticos probióticos.
[0139] 30. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-29, caracterizado pelo fato de que o dito substrato à base de leite é selecionado a partir de leite fresco ou leite bruto obtido diretamente a partir de uma etapa de pasteurização, leite obtido diretamente após uma etapa de tratamento em temperatura ultraelevada (UHT) ou leite obtido diretamente após uma etapa de fermentação.
[0140] 31. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-30, em que a inibição de galactose pelo dito peptídeo ou peptídeo dimérico é menor do que 60%, tal como menor do que 55%, tal como menor do que 50%, tal como menor do que cerca de 45%, tal como menor do que cerca de 40%.
[0141] 32. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-31, em que o dito produto lácteo é um produto de leite fermentado e a dita etapa b) é realizada durante ou antes de fermentação.
[0142] 33. O método de acordo com a modalidade 32, método o qual não requer a adição de mais enzima após a fermentação.
[0143] 34. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-31, em que o dito produto lácteo é um produto de leite fermentado e a dita etapa b) é realizada imediatamente após a fermentação.
[0144] 35. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-31, em que o dito produto lácteo é leite fresco e a dita etapa b) é realizada antes, em conjunto ou imediatamente após uma etapa de pasteurização.
[0145] 36. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-31, em que o dito produto lácteo é o leite que sofreu tratamento em temperatura ultraelevada (UHT) e a dita etapa b) é realizada antes, em conjunto com ou imediatamente após uma etapa de tratamento em temperatura ultraelevada.
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[0146] 37. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-36, em que a etapa c) é iniciada em uma temperatura entre 40°C e 100°C, tal como em uma temperatura entre 50°C e 100°C, tal como em uma temperatura entre 60°C e 100°C, tal como em uma temperatura entre 70°C e 100°C, tal como em uma temperatura entre 80°C e 100°C, tal como em uma temperatura entre 40°C e 90°C, tal como em uma temperatura entre 40°C e 80°C, tal como em uma temperatura entre 40°C e 70°C, tal como em uma temperatura entre 40°C e 60°C, tal como em uma temperatura entre 40°C e 50°C.
[0147] 38. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-37, em que o peptídeo ou peptídeo dimérico, quando de hidrólise da lactose no substrato à base de leite, tem uma proporção de atividade da lactase para transgalactosilase maior do que 1:1.
[0148] 39. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 24-38, caracterizado pelo fato de que menos de 80% da lactose foram hidrolisados quando a etapa c) é concluída e em que mais de 90% da lactose foram hidrolisados após uma semana.
[0149] 40. Um produto lácteo preparado por meio de um método conforme definido em qualquer uma das modalidades 24-39.
[0150] 41. Um produto alimentício, tal como um produto lácteo que compreende um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33, ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos com um aminoácido sequência ácida representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21,23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências.
[0151] 42. Um produto alimentício, tal como um produto lácteo que compreende uma célula hospedeira que expressa um peptídeo ou pep
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52/99 tídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33, ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21, 23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80 % de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências.
[0152] 43. O produto alimentício de acordo com a modalidade 42, o qual é selecionado a partir de bebidas, alimentos para crianças, cereais, pão, biscoitos, produtos de confeitaria, bolos, suplementos alimentícios, suplementos probióticos, produtos probióticos comestíveis, produtos prebióticos comestíveis, ração para animais, ração para aves e medicamentos, ou um produto lácteo selecionado a partir do grupo que consiste em leite sem lactose, leite com baixo teor de lactose, leite em pó seco, leites para bebês, iogurte, sorvete, queijo, produtos lácteos fermentados, suplemento dietético e produtos dietéticos probióticos.
Sequências
TABELA 1. Os números de gene com o número de identificação de sequência especificado
Número do gene Número de identidade de sequência Nome da espécie
G4 SEQ ID NO 1 Bifidobacterium adolescentis
G16 SEQ ID NO 2 (domínio a) SEQ ID NO 3 (domínio b) Lactobacillus sakei
G35 SEQ ID NO 4 Bifidobacterium adolescentis
G40 SEQ ID NO 5 (domínio a) SEQ ID NO 6 (domínio b) Lactobacillus amylovorus
G44 SEQ ID NO 7 Bifidobacterium bifidum
G51 SEQ ID NO 8 Bifidobacterium bifidum
G57 SEQ ID NO 9 Bifidobacterium brevis
G62 SEQ ID NO 10 Bifidobacterium catenulatum
G66 SEQ ID NO 11 Bifidobacterium catenulatum
G83 SEQ ID NO 12 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
G84 SEQ ID NO 13 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
G95 SEQ ID NO 14 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
G100 SEQ ID NO 15 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
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G104 SEQ ID NO 16 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
G108 SEQ ID NO 17 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
G109 SEQ ID NO 18 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
G118 SEQ ID NO 19 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
G145 SEQ ID NO 20 (domínio a) SEQ ID NO 21 (domínio b) Lactobacillus helvaticus
G158 SEQ ID NO 22 Bifidobacterium longum
G224 SEQ ID NO 23 (domínio a) SEQ ID NO 24 (domínio b) Lactobacillus reuteri
G256 SEQ ID NO 25 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
G282 SEQ ID NO 26 (domínio a) SEQ ID NO 27 (domínio b) Lactobacillus helvaticus
G334 SEQ ID NO 28 (domínio a) SEQ ID NO 29 (domínio b) Lactobacillus crispatus
G335 SEQ ID NO 30 Streptococcus thermophilus
G336 SEQ ID NO 31 Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus
G11 SEQ ID NO 32 Bifidobacterium adolescentis
G33 SEQ ID NO 33 Bifidobacterium adolescentis
G600 SEQ ID NO 34 Bifidobacterium bifidum
G500 SEQ ID NO 35 Kluyveromyces lactis
SEQ ID NO: 1
MADTAELAIVHATTASASWLTDPTVFAANRKPAHSSHRYVIGETSEPK QSLDGEWKVRIEQARNVDVESAPFAAVDFEDGDFGAIEVPGHLQMA GYLKNKYVNIQYPWDGHEDPQAPNIPENNHVAIYRRRFALDAQLART LENDGTVSLTFHGAATAIYVWLDGTFVGYGEDGFTPSEFDVTEALRN GNGNAADSPEAEHTLTVACYEYSSASWLEDQDFWRLHGLFRTVELA AQPHTHVETVQLEADYTAADTAGTADTAELNAALTLRNSADAMTIES TLRDGDGNVVWESTQACNGEIALNSGKMTNIAPWSAESPTLYTLTVR VVGHDGAIIETVTQKIGFRTFRIENGIMTLNGKRIVFKGADRHEFDAKR GRAITREDMLSDVVFCKRHNINAIRTSHYPNQEYWYDLCDEYGLYLID ETNMETHGTWVANNVERPEDGIPGSRPEWEGACVDRINSMMRRDY NHPSVLIWSLGNESSAGEVFRAMYRHAHTIDPNRPVHYEGSVHMRE FEDVTDIESRMYAHADEIERYLNDGSPAHTDGPKKPYISCEYMHAMG NSCGNMDEYTALERYPMYQGGFIWDFIDQAIETKLPDGTTRMCYGG DFGDRPSDYEFSGDGLLFADRTPSPKAQEVKQLYANVKIVVSVDEAR ITNDNLFVSTGDYRFVLRILADGKPVWSTTRRFDVAAGESASFEVDW
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PVDDYRSNAEELVLEVSQQLGNACDWAPAGYELAFGQCVVAGAKTT ADAVDAAGAPADGTVTLGRWNAGVRGQGREALFSRTQGGMVSYTF GEREFVLRRPSITTFRPLTDNDRGAGHAFERAAWAVAGKYARCVDC AIANRGENAVEATYTYELAIPQRTKVTVRYVADTAGLVSLDVEYPGEK NGDLPTIPAFGIEWALPVEYANLRFYGAGPEETYADRRHAKLGVWST TAGDDCAPYLLPQETGNHEDVRWAEITDDSGHGVRVKRGAGAKPFA MSLLPYSSTMLEEALHQDELPKPRHMFLRLLAAQMGVGGDDSWMS PVHEQYQLPADQPLSLNVQLKLF
SEQ ID NO: 2 (G16 Domínio a)
MQPNIQWLDTPAVFRVGQLPAHSDHRYYATLAEMAQQQSSFEQSLN GTWQFHYSVNAASRPKSFYELAFDAQDFEPITVPQHIELAGYEQLHYI NTMYPWEGHYYRRPAFSTSDDKQHLGMFSEADYNPVGSYLHHFDL TPALRNQRVIIRFEGVEQAMYVWLNGQFIGYAEDSFTPSEFDLTPYLK ETDNCLAVEVHKRSSAAFIEDQDFFRFFGIFRDVKLLAKPRTHLEDLW VIPEYDVVQQTGQVKLRLQFSGDENRVHLRIRDQHQIILTADLTSAAQ VNGLYKMPELVQAWSNQTPNLYTLELEVVDQAGETIEISQQPFGFRKI EIKDKVMLLNGKRLVINGVNRHEWHPETGRTITAEDEAWDIACMQRN
HINAVRTSHYPDRLSFYNGCDQAGIYMMAETNLESHGSWQKMGAVE PSWNVPGSYDEWEAATLDRARTNFETFKNHVSILFWSLGNESYAGS VLEKMNAYYKQQDPTRLVHYEGVFRAPEYKATISDVESRMYATPAEI KAYLDNAPQKPFILCEYMHDMGNSLGGMQSYIDLLSQYDMYQGGFI WDFIDQALLVTDPVTGQRELRYGGDFDDRPSDYEFSGDGLVFATRD EKPAMQEVRYYYGEHK
SEQ ID NO: 3 (G16 Domínio b)
MKNQQCRRLDTIMANTNKRLAVIFGDVTLGLKGPDFHYLFSYQTGGP ESLRIQGKEWLYRSPKPTFWRATTDNDRGNQFPLKSGMWLAADQFI ACQSITVAIDGQTIPLPIAPENNRYSGQETAQEVTVTYTYQTITTPQTT VEVSYTIQASGKIRVAVTYHGQAGLPSLPVFGLRFVMPTPATRFIYQG LSGETYPDRMAGGMAGEYEVTGLPVTPYLVPQDCGVHMATDWVTIY
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RQAVLDNRLREPVETGLKFKMVDQPFAFSCLPYTAEELENATHHSEL PAPHRTVLSLLGAVRGVGGIDSWGSDVEAAYQIDATQDHHLEFEISF
SEQ ID NO: 4
MADTAELAIVHATTASASWLTDPTVFAANRKPAHSSHRYVIGETSEPK QSLDGEWKVRIEQARNVDVESAPFAAVDFEDGDFGAIEVPGHLQMA GYLKNKYVNIQYPWDGHEDPQAPNIPENNHVAIYRRRFALDAQLART LENDGTVSLTFHGAATAIYVWLDGTFVGYGEDGFTPSEFDVTEALRN GNGNAADSPEAEHTLTVACYEYSSASWLEDQDFWRLHGLFRTVELA AQPHTHVETVQLEADYTAADTAGTADTAELNAALTLRNPADAMTIES TLRDGDGNVVWESTQACNGEIALNSGKMTNIAPWSAESPTLYTLTVR VVGHDGAIIETVTQKIGFRTFRIENGIMTLNGKRIVFKGADRHEFDAKR GRAITREDMLSDVVFCKRHNINAIRTSHYPNQEYWYDLCDEYGLYLID ETNMETHGTWVANNVERPEDGIPGSRPEWEGACVDRINSMMRRDY NHPSVLIWSLGNESSAGEVFRAMYRHAHTIDPNRPVHYEGSVHMRE FEDVTDIESRMYAHADEIERYLNDGSPAHTDGPKKPYISCEYMHAMG NSCGNMDEYTALERYPMYQGGFIWDFIDQAIETKLPDGTTRMCYGG DFGDRPSDYEFSGDGLLFADRTPSPKAQEVKQLYANVKIAVSVDEAR ITNDNLFVSTGDYRFVLRILADGKPVWSTTRRFDVAAGESASFEVDW PVDDYRSNAEELVLEVSQQLGNACDWAPAGYELAFGQCVVAGAKTT ADAVDAAGAPADGTVTLGRWNAGVRGQGREALFSRTQGGMVSYTF GEREFVLRRPSITTFRPLTDNDRGAGHAFERAAWAVAGKYARCVDC AIANRGENAVEATYTYELAIPQRTKVTVRYVADTAGLVSLDVEYPGEK NGDLPTIPAFGIEWALPVEYANLRFYGAGPEETYADRRHAKLGVWST TAGDDCAPYLLPQETGNHEDVRWAEITDDSGHGVRVKRGAGAKPFA MSLLPYSSTMLEEALHQDELPKPRHMFLRLLAAQMGVGGDDSWMS PVHEQYQLPADQPLSLNVQLKLF
SEQ ID NO: 5 (G40 Dominio a)
MKANIKWLDDPEVFRINQLPAHSDHPFYKDYREWQNHSSSFKQSLN GAWQFHFSKDPQSRPIDFYKRSFDSSSFDTIPVPSEIELNGYAQNQY TNILYPWESKIYRKPAYTLGRGIKDGDFSQGKDNTVGSYLKHFDLNPA
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LAGHDIHIQFEGVERAMYVYLNGHFIGYAEDSFTPSEFDLTPYIQAKD NILAVEVFKHSTASWLEDQDMFRFSGIFRSVELLALPRTHLMDLDIKP TVVNDYHDGVFNAKLHFMGKTSGNVHVLIEDIDGKTLLNKKLPLKSTV EIENETFANVHLWDNHDPYLYQLIIEVHDQDGKLVELIPYQFGFRKIEIT KDHVVLLNGKRLIINGVNRHEWDAKRGRSITLADMKQDIATFKHNNIN AVRTCHYPNQIPWYYLCDQNGIYMMAENNLESHGTWQKLGQVEATS NVPGSIPEWREVVVDRARSNYETFKNHTAILFWSLGNESYAGSNIAA MNKLYKDHDSSRLTHYEGVFHAPEFKKEISDLESCMYLPPKEAEEYL QNPKKPLVECEYMHDMGTPDGGMGSYIKLIDKYPQYMGGFIWDFID QALLVHDPVSGQDVLRYGGDFDDRHSDYEFSGDGLMFADRTPKPA MQEVRYYYGLHK
SEQ ID NO: 6 (G40 Domínio b) MAYTNNLHVVYGEASLGVNGQDFAYLFSYERGGLESLKIKDKEWLY RTPTPTFWRATTDNDRGSGFNQKAAQWLGADMFTKCVGIHVQVDD HRFDELPVAPINNQFSNQEFAHEVKVAFDYETLTTPATKVKIIYNINDF GHMTITMHYFGKKGLPPLPVIGMRFIMPTKAKSFDYTGLSGETYPDR MAGAERGTFHIDGLPVTKYLVPQENGMHMQTNELVITRNSTQNNAD KDGDFSLKITQTKQPFNFSLLPYTAEELENATHIEELPLARRSVLVIAG AVRGVGGIDSWGSDVEEQYHIDPEQDHEFSFTLN
SEQ ID NO: 7
MNTTDDQRKNGDPIVSPSIPTTAWLADPRVYAVHRLDAHSDHACWS RSPVDGESTDLRQSLDGEWRVRVETAPTGRFPDGTSDGPDWISDV SPLFAAPGFDDSSFSRVQVPSHLETAGLLAPQYVNVQYPWDGHEDP KAPAIPEHGHVAVYRREFDADGEVAQAVREGRPVTLTFQGAATAIYV WLNGSFIGYAEDSFTPSEFDVTDAIKVDGNVLAVACYEYSSASWLED QDFWRLHGLFRSVELNARPAAHVADLHADADWDLATSRGSLSLDVLI DGAANAATADFALRDKNGTIVWRTATKADGTLHAEAEIDDAAPWSAE RPDLYELSVTLLDADGKVLETARTRIGFRHVAIEDGILKLNGKRLVFRG VNRHEFDCRRGRAITEEDMLWDIRFMKRHNINAVRTSHYPNQSRWY ELCDEYGIYLIDETNLETHGSWNSPGDIPVGTSVPGDDEAWLGACID
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RLDSMILRDRNHPSVLVWSLGNESYAGEVLKAMSAHAHQLDPGRPV HYEGVNWNHAYDGISDFESRMYAKPAEIQDWLEHGDERGEASKPFV SCEYMHAMGNSCGGLSEFIDLERYERYSGGFIWDYIDQGLVQRLPD GSERLSVGGEWGDRPTDYEFVGNGIVFADRTPSPKAQEVKQLYSPV KLAPDGHGVTIENRNLFAGTDGYVFAARLLEDGHEIWHADYRFDVAA GDTQHHDIAFPDIDADGDTREVTYEVDLLLAEATAWAPAGYELAFGQ LTGTLNPEQDITETSHDDDGRATRTLSRWNAGIRRDDEEILLSRTQG GIVSWKRDDREMVIRRPELVTFRPLTDNDRGNHSGFDRAAWFAAGR YAIVTETKIHESDDGLVAEYQYELADPNHTPVSVTYHVNSDMRMQLT VEYPGNATDMASLPAFGIEWELPGEYDRLRYYGPGPEETYRDRKQG GKLGIWDATAKASMAPYLMVQETGSHEDVRWLEATDIQGHGLRVTQ RGDRHFTASLLPWNTYTIEAARRHEDLPKPRHNYLRLLAAQMGVGG DDSWGAPVHTAYQLPAGRPLTLDVNLELI
SEQ ID NO: 8
MNTTDDQRKNGDPIVSPSIPTTAWLADPRVYAVHRLDAHSDHACWS RSPVDGESTDLRQSLDGEWRVRVETAPTGRFPDGTSDGPDWISDV SPLFAAPGFDDSSFSRVQVPSHLETAGLLAPQYVNVQYPWDGHEDP KAPAIPEHGHVAVYRREFDADGEVAQAVREGRPVTLTFQGAATAIYV WLNGSFIGYAEDSFTPSEFDVTDAIKVDGNVLAVACYEYSSASWLED QDFWRLHGLFRSVELNARPAAHVADLHADADWDLATSRGSLSLDVLI DGAANAATADFALWDKNGTIVWHIVTKADGTLHAEAEIDDAAPWSAE RPDLYELSVTLLDADGKVLETARTRIGFRHVAIEDGILKLNGKRLVFRG VNRHEFDCRRGRAITEEDMLWDIRFMKRHNINAVRTSHYPNQSRWY ELCDEYGIYLIDETNLETHGSWNSPGDIPVGTSVPGDDEAWLGACID RLDSMILRDRNHPSVLVWSLGNESYAGEVLKAMSAHAHRLDPGRPV HYEGVNWNHAYDGISDFESRMYAKPAEIQDWLEHGDERGEASKPFV SCEYMHAMGNSCGGLSEFIDLERYERYSGGFIWDYIDQGLVQRLPD GSERLSVGGEWGDRPTDYEFVGNGIVFADRTPSPKAQEVKQLYSPV KLAPDGHGVTIENRNLFAGTDGYVFAARLLEDGHEIWHADYRFDVAA GDTQHHDIAFPDIDADGDTREVTYEVDLLLAEATAWAPAGYELAFGQ
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LTGTLNPEQDITETSHDDDGRATRTLSRWNAGIRRDDKEILLSRTQG GIVSWKRDDREMVIRRPELVTFRPLTDNDRGNHSGFDRAAWFAAGR YAIVTETKIHESDDGLVAEYQYELADPNHTPVSVTYHVNSDMRMQLT VEYPGNATDMASLPAFGIEWELPGEYDRLRYYGPGPEETYRDRKQG GKLGIWDATAKASMAPYLMVQETGSHEDVRWLEATDIQGHGLRVTQ RGDRHFTASLLPWNTYMIEAARRHEDLPEPRHNYLRLLAAQMGVGG DDSWGAPVHTAYQLPAGRPLTLDVNLELI
SEQ ID NO: 9
MTNSMQGKAKTIMTNLQSAQQFSQAWLTDPRVFAVNRLAAHSSHKF YDHSPQCGEAMDLKQSLDGQWRVQMLDLADLADNELAEAAFAQPG YDAAGFSPIEVPSALETKGFLNHQYVNQQYPWSGHESPVAPDVPKH NHVALYRHEFSLEPKAAAVLEANKTAADDAAKRRVTLTFQGAATAIVV WLNGAFIGYAEDSFTPSEFDVTDVLRDGVNTLAVACFEFSSASWLED QDFWRLHGIFRSVELEAQPLVHVNDLRVLADYDHTTGEGSLDVVALL RNAGTAAAVAATVLDAAGNTVWHSKLTAGADAETLTVKANVGKVNP WSAEEPTLYTLQVVATDAAGQVIEAALQRIGFRHFAIEDGLMKLNGKR IVFKGVDRHEFDARTGRTIAEADMIEDIHSFKRLNINAVRTSHYPNETR WYELCDEYGIYVLDETNLETHGSWTDPGDVFQPARAIPGSKDEWRA ACVDRTASMVRRDYNHPSVVIWSLGNEAFGGDVFYSMRDFVHEND PFRPVHYEGTFNDPEFSAATDIMSRMYAKPDEIVKLYLGEDGKKPYIS CEYSHSMGNSTGGLHLYTELERYPLYQGGFIWDYVDQALWQDCGN GTERLAYGGDFEDRPNDYEFSGDGVMFADRTPSPKAQEVKQLYAN VKLVPDESGVTITNDNLFISTASSLFTARVLVDGAERWHANYRFDVPA GETVREPIAFPKVTDLVALSGSAEVTYEVDQRLAEATDWAPAGYELT FGQYVAAVSFD DG AADAVVAG D AE VAADG FN AG IHTD FG E VLLSKT QGGMVSFKRDGREMVIRRPNLTTFRALTDNDRGNGSGFERAQWMA AGRYARVTGTSVEETADGKGLKATYSYELADAKHTPVTVHYEVDAAL RVHLTVEYPGEADAATLPAFGLEWILPKQYDRLRFYGLGPEETYADR LHGAKLGVFSRTAAEDCAPYLLPQETGNHEQVRWAEITDEYGHGMR
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VTAAGGTRFATSLLPYSSLMFEDALHQNELPKPRHTFLRLLAAQMGV GGDDTWGAPVHDEFQVPADQPLKLDVTLELI
SEQ ID NO: 10
MTQRRSYRWPQPLAGQQARIWYGGDYNPDQWPEEVWDDDVRLMK KAGVNLVSVGIFSWAKIETSEGVYDFDWLDRIIDKLGEAGIAVDLASAT ASPPMWLTQAHPEVLWKDYRGDVCQPGARQHWRPTSPVFREYALK LCRAMAEHYKGNPYVVAWHVSNEYGCHNRFDYSEDAERAFRKWCE ERYGTIDAVNDAWGTAFWAQRMNDFTEIVPPRFIGDGNFMNPGKLL DFKRFSSDALKAFYVAERDALAEITPDLPLTTNFMVSAAGSVLDYDD WGREVDFVSNDHYFIPGEAHLDELAFSASLVDGIARKDPWFLMEHST SAVNWRPVNYRKEPGQLVRDSLAHVAMGADAVCYFQWRQSKAGA EKFHSAMVPHTGEDSAVFRDVCELGADLNTLADNGLLGTKLAKSKVA VVFDYESEWATEHTATPTQKVHHVDEPLQWFRALADHGVTADVVPV SSNWDEYEVVVLPSVYILSEETTRRVRDYVVNGGRLIVTYYTGLSDE KDHVWLGGYPGSIRDVVGVRVEEFMPMGDDFPGVPDCLGLSNGAV AHDIADVIGSVDGTATVLETFRDDPWTGMDGAPAIVANTFGEGRSVY VGARLGRDGIAKSLPEIFESLGMAETGENDSRVLRVEREGSDGSRFV FSFNRTHEAVQIPFEGKIVVSSFAEVSGENVSIKPNGVIVTKQ
SEQ ID NO: 11
MANSNRVEHASETWLTDATVFEVNRTPAHSNHKCFTHDPQSGEHS DLTQSLDGEWRVEIVQASDIDFNEEPFVAENFDDSSFCRAQVPGHLQ MAGLLKNKYVNIQYPWDGHENPLEPNVPENNHVALYRRKFVVSKRL ADTKESEGSVSIVFHGMATAIYVWVNGLFAGYGEDGFTPNEFDITDLL HDGENVVAVACYEYSSASWLEDQDFWRLHGLFRSVELTAQPHVHV ENMQLEADWDAESGTASLDAALSVRNASDAATISATLKDSEGNVVW EASTNADANTTFASGSLQGLEPWSAESPSLYELEVNVIDQAGNIVEA AVQKVGFRRFRIENGIMTLNGKRIVFKGADRHEFDAKRGRSITEQDMI DDVIFCKRHNINAIRTSHYPNQERWYDLCDEYGIYLIDETNLETHGSW CLPGDVVTAETAVPGSKAHWEGACVDRVNSMVRRDYNHPSVVIWS LGNESYTGDVFRAMYKHVHDIDPNRPVHYEGVTKNRDYDDVTDIETR
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 254/301
60/99
MYEHADVVEEYLKNDPQKPYISCEYMHAMGNSVGNLDEYTALERYP HYQGGFIWDFIDQAIYATQPDGSTRLCYGGDFGDRPSDYEFSGNGL VFADRTPTPKAQEVKQLYSNVHIDVTDRSVSIKNDNLFISTGGYQFVL RILADGEPVWQSERRFDVPADSACTFDVEWPVDLYRANADELVLEV SQRLAEATDWAPAGYELAFGQTIVAGTKAAEDAALPADGIVTVGRWN AGVQGSGREILLSRTQGGLVSYTFDGHEFVLRRPAITTFRALTDNDR GAGHGFERAQWMVAGRYARCVDNVIEQVDEDTLKAVYTYELATPQC TKVTVGYTADTTGRLNLHVEYPGESGELPTIPAFGIEWTLPVQYSNLR FFGAGPEETYQDRKHAKLGVWSTDAFKDHAPYLMPQETGNHEEVR WAEITDENGHGLRVSRANGAAPFAVSLQPYSSFMIEEAQHQDELPAP KHMFLRVLAAQMGVGGDDSWMSPVHSQYHITADQPISLDVNLELI
SEQ ID NO: 12
MSNKLVKEKRVDQADLAWLTDPEVYEVNTIPPHSDHESFQSQEELEE GKSSLVQSLDGDWLIDYAENGQGPVNFYAEDFDDSNFKSVKVPGNL ELQGFGQPQYVNVQYPWDGSEEIFPPQIPSKNPLASYVRYFDLDEAF WDKEVSLKFDGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKE NNRLAVALYKYSSASWLEDQDFWRMSGLFRSVTLQAKPRLHLEDLK LTASLTDNYQKGKLEVEANIAYRLPNASFKLEVRDSEGDLVAEKLGPI RSEQLEFTLADLPVAAWSAEKPNLYQVRLYLYQAGSLLEVSRQEVGF RNFELKDGIMYLNGQRIVFKGANRHEFDSKLGRAITEEDMIWDIKTMK RSNINAVRCSHYPNQSLFYRLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGGH EDPSFNVPGDDQHWLGASLSRVKNMMARDKNHASILIWSLGNESYA GTVFAQMADYVRKADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPAK VIEEYLTNKPAKPFISVEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFIW DWIDQGLEKDGHLLYGGDFDDRPTDYEFCGNGLVFADRTESPKLAN VKALYANLKLEVKDGQLFLKNDNLFTNSSSYYFLTSLLVDGKLTYQSR PLTFGLEPGESGTFALPWPEVADEKGEVVYRVTAHLKEDLPWADEG FTVAEAEEVAQKLPEFKPEGRPDLVDSDYNLGLKGNNFQILFSKVKG WPVSLKYAGREYLKRLPEFTFWRALTDNDRGAGYGYDLARWENAG KYARLKDISCEVKEDSVLVKTAFTLPVALKGDLTVTYEVDGRGKIAVT
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 255/301
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ADFPGAEEAGLLPAFGLNLALPKELTDYRYYGLGPNESYPDRLEGNY LGIYQGAVKKNFSPYLRPQETGNRSKVRWYQLFDEKGGLEFTANGA DLNLSALPYSAAQIEAADHAFDLTNNYTWVRALSAQMGVGGDDSWG QKVHPEFCLDAQKARQLRLVIQPLLLK
SEQ ID NO: 13
MSNKLVKEKRVDQADLAWLTDPEVYEVNTIPPHSDHESFQSQEELEE GKSSLVQSLDGNWLIDYAENGQGPINFYAEDFDDSNFKSVKVPGNLE LQGFGQPQYVNIQYPWDGSEEIFPPQVPSKNPLASYVRYFDLDEAL WDKEVSLKFAGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKE GNRLAVALYKYSSASWLEDQDFWRLSGLFRSVTLEAKPLLHLEDLKL TASLTDNYQKGKLEVEANIAYRLPNASFKLEVRDSEGDLVAEKVGPIR SEKLGFSLADLPVAAWSAEKPNLYQVRLYLYQAGSLLEVSRQEVGFR NFELKDGIMYLNGQRIVFKGVNRHEFDSKLGRAITEADMIWDIKTMKQ SNINAVRCSHYPNQSLFYRLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGHED PSFNVPGDDQHWLGASLSRVKNMMARDKNHASILIWSLGNESYAGT VFAQMADYVRKADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPAKEI EEYLTKKPAKPFISVEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFIWD WIDQGLEKDGHLLYGGDFDDRPTDYEFCGDGLVFADRTTSPKLANV KALYSNLKLEVKDGQLFIKNDNLFTNSSAYYFLASLLVDGKLTYQSQP LTFGLEPGESGTFVLPWPEVEDEKGEIVYQVTAHLKEDLPWADEGFT VAEAEEAVTKLPEFYPAGRPELVDSDFNLGLKGNGFRILFSKAKGWP VSIKYAGREYLKRLPEFTFWRALTDNDRGAGYGYDLAKWENAGKYA RLQDISYEIKENSALVKTTFTLPVALKGDLTITYEVDSLGKIAVTANFPG AVENGLLPAFGLNFALPKELSDYRYYGLGPNESYADRLEGSYLGIYQ GAVEKNFTPYLRPQEAGNRSKVRYYQLFDEEGGLEFTANGADLNLS ALPYSAAQIEAADHAFELTNNYTWVRALAAQMGVGGDDSWGQKVH PEFCLDAQEARQLKLVIQPLLLK
SEQ ID NO: 14
MSNKLVKEKRVDQADLAWLTDPEVYEVNTIPPHFDHESFQSQEELEE GKSSLVQSLDGDWLIDYAENGQGPVNFYAEDFDDSNFKSVKVPGNL
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 256/301
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ELQGFGQPQYVNVQYPWDGSEEIFPPQIPSKNPLASYVRYFDLDEAF WDKEVSLKFDGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKE NNRLAVALYKYSSASWLEDQDFWRMSGLFRSVTLQAKPRLHLEDLK LTASLTDNYQKGKLEVEANIAYRLPNASFKLEVRDSEGDLVAEKLGPI RSEQLEFTLADLPVAAWSAEKPNLYQVRLYLYQAGSLLEVSRQEVGF RNFELKDGIMYLNGQRIVFKGANRHEFDSKLGRAITEEDMIWDIKTMK RSNINAVRCSHYPNQSLFYRLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGGH EDPSFNVPGDDQHWLGASLSRVKNMMARDKNHASILIWSLGNESYA GTVFAQMADYVRKADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPAK VIEEYLTNKPAKPFISVEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFIW DWIDQGLEKDGHLLYGGDFDDRPTDYEFCGNGLVFADRTESPKLAN VKALYANLKLEVKDGQLFLKNDNLFTNSSSYYFLTSLLVDGKLTYQSR PLTFGLEPGESGTFALPWPEVADEKGEVVYRVTAHLKEDLPWADEG FTVAEAEEVAQKLPEFKPEGRPDLVDSDYNLGLKGNNFQILFSKVKG WPVSLKYAGREYLKRLPEFTFWRALTDNDRGAGYGYDLARWENAG KYARLKDISCEVKEDSVLVKTAFTLPVALKGDLTVTYEVDGRGKIAVT ADFPGAEEAGLLPAFGLNLALPKELTDYRYYGLGPNESYPDRLEGNY LGIYQGAVKKNFSPYLRPQETGNRSKVRWYQLFDEKGGLEFTANGA DLNLSALPYSAAQIEAADHAFELTNNYTWVRALSAQMGVGGDDSWG QKVHPEFCLDAQKARQLRLVIQPLLLK
SEQ ID NO: 15
MSNKLVKEKRVDQADLAWLTDPEVYEVNTIPPHSDHESFQSQEELEE GKSSLVQSLDGDWLIDYAENGQGPVNFYAEDFDDSNFKSVKVPGNL ELQGFGQPQYVNVQYPWDGSEEIFPPQIPSKNPLASYVRYFDLDEAF WDKEVSLKFDGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKE NNRLAVALYKYSSASWLEDQDFWRMSGLFRSVTLQAKPRLHLEDLK LTASLTDNYQKGKLEVEANIAYRLPNASFKLEVRDSEGDLVAEKLGPI RSEQLEFTLADLPVAAWSAEKPNLYQVRLYLYQAGSLLEVSRQEVGF RNFELKDGIMYLNGQRIVFKGANRHEFDSKLGRAITEEDMIWDIKTMK RSNINAVRCSHYPNQSLFYRLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGGH
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 257/301
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EDPSFNVPGDDQHWLGASLSRVKNMMARDKNHASILIWSLGNESYA GTVFAQMADYVRKADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPAK VIEEYLTNKPAKPFISVEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFIW DWIDQGLEKDGHLLYGGDFDDRPTDYEFCGNGLVFADRTESPKLAN VKALYANLKLEVKDGQLFLKNDNLFTNSSSYYFLTSLLVDGKLTYQSR PLTFGLEPGESGTFALPWPEVADEKGEVVYRVTAHLKEDLPWADEG FTVAEAEEVAQKLPEFKPEGRPDLVDSDYNLGLKGNNFQILFSKVKG WPVSLKYAGREYLKRLPEFTFWRALTDNDRGAGYGYDLARWENAG KYARLKDISCEVKEDSVLVKTAFTLPVALKGDLTVTYEVDGRGKIAVT ADFPGAEEAGLLPAFGLNLALPKELTDYRYYGLGPNESYPDRLEGNY LGIYQGAVKKNFSPYLRPQETGNRSKVRWYQLFDEKGGLEFTANGA DLNLSALPYSAAQIEAADHAFELTNNYTWVRALSAQMGVGGDDSWG QKVHPEFCLDAQKARQLRLVIQPLLLK
SEQ ID NO: 16
MSNKLVKEKRVDQADLAWLTDPEVYEVNTIPPHSDHESFQSQEELEE GKSSLVQSLDGDWLIDYAENGQGPVNFYAEDFDDSNFKSVKVPGNL ELQGFGQPQYVNIQYPWDGSEEIFPPQVPSKNPLASYVRYFDLDEAF WDKEVSLKFAGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKEN NRLAVALYKYSSASWLEDQDFWRLSGLFRSVTLQAKPLLHLEDLKLT ASLTDNYQKGKLEVEANIAYRLPNASFKLEVRDSEGDLVAEKLGPIRS EQLEFTLADLPVAAWSAEKPNLYQVRLYLYQAGSLLEVSRQEVGFRN FELKDGIMYLNGQRIVFKGVNRHEFDSKLGRAITEEDMIWDIKTMKRS NINAVRCSHYPNQSLFYRLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGHEDP SFNVPGDDQHWLGASLSRVKNMMARDKNHASILIWSLGNESYAGTV FAQMADYVRKADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPAKEIE EYLTKKPAKPFISVEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFIWDW IDQGLEKDGHLLYGGGDFDDRPTDYEFCGNGLVFADRTTSPKLANV KALYSNLKLEVKDGQLFLKNDNLFTNSSAYYFLTSLLVDGKLTYQSQP LTFGLEPGESGTFVLPWPEVEDEKGEIVYQVTAHLKEDLPWADEGFT VAEAEEAVTKLPEFYPAGRPELVDSDFNLGLKGNGFRILFSKAKGWP
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 258/301
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VSIKYAGREYLKRLPEFTFWRALTDNDRGAGYGYDLAKWENAGKYA RLQDISYEIKENSVLVKTAFTLPVALKGDLTITYEVDSLGKIAVTANFPG AVENGLLPAFGLNFALPKELSDYRYYGLGPNESYADRLEGSYLGIYQ GAVEKNFTPYLRPQEAGNRSKVRYYQLFDEESGLEFTANGADLNLS ALPYSAAQIEAADHAFELSNNYTWVRALAAQMGVGGDDSWGQKVH PEFCLDAQEARQLKLVIQPLLLK
SEQ ID NO: 17
MSNKLVKEKRVDQADLAWLTDPEVYEVNTIPPHSDHESFQSQEELEE GKSSLVQSLDGDWLIDYAENGQGPVNFYAEDFDDSNFKSVKVPGNL ELQGFGQPQYVNVQYPWDGSEEIFPPQIPSKNPLASYVRYFDLDEAF WDKEVSLKFDGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKE NNRLAVALYKYSSASWLEDQDFWRMSGLFRSVTLQAKPRLHLEDLK LTASLTDNYQKGKLEVEANIAYRLPNASFKLEVRDSEGDLVAEKLGPI RSEQLEFTLADLPVAAWSAEKPNLYQVRLYLYQAGSLLEVSRQEVGF RNFELKDGIMYLNGQRIVFKGVNRHEFDSKLGRAITEEDMIWDIKTIKR SNINAVRCSHYPNQSLFYRLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGGHE DPSFNVPGDDQHWLGASLSRVKNMMARDKNHASILIWSLGNESYAG TVFAQMADYVRKADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPAKVI EEYLTNKPAKPFISVEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFIWD WIDQGLEKDGHLLYGGDFDDRPTDYEFCGNGLVFADRTESPKLANV KALYANLKLEVKDGQLFLKNDNLFTNSSSYYFLTSLLVDGKLTYQSRP LTFGLEPGESGTFALPWPEVADEKGEVVYRVTAHLKEDLPWADEGF TVAEAEEVAQKLPEFKPEGRPDLVDSDYNLGLKGNNFQILFSKVKGW PVSLKYAGREYLKRLPEFTFWRALTDNDRGAGYGYDLARWENAGKY ARLKDISCEVKEDSVLVKTAFTLPVALKGDLTVTYEVDGRGKIAVTAD FPGAEEAGLLPAFGLNLALPKELTDYRYYGLGPNESYPDRLEGNYLGI YQGAVKKNFSPYLRPQETGNRSKVRWYQLFDEKGGLEFTANGADLN LSALPYSAAQIEAADHAFDLTNNYTWVRALSAQMGVGGDDSWGQKV HPEFCLDAQKARQLRLVIQPLLLK
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 259/301
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SEQ ID NO: 18
MSNKLVKEKRVDQADLAWLTDPEVYEVNTIPPHSDHESFQSQEELEE GKSSLVQSLDGDWLIDYAENGQGPVNFYAEDFDDSNFKSVKVPGNL ELQGFGQPQYVNVQYPWDGSEEIFPPQIPSKNPLASYVRYFDLDEAF WDKEVSLKFDGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKE NNRLAVALYKYSSASWLEDQDFWRMSGLFRSVTLQAKPRLHLEDLK LTASLTDNYQKGKLEVEANIAYRLPNASFKLEVRDSEGDLVAEKLGPI GSEQLEFTLADLPVAAWSAEKPNLYQVRLYLYQAGSLLEVSRQEVGF RNFELKDGIMYLNGQRIVFKGVNRHEFDSKLGRAITEEDMIWDIKTIKR SNINAVRCSHYPNQSLFYRLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGGHE DPSFNVPGDDQHWLGASLSRVKNMMARDKNHASILIWSLGNESYAG TVFAQMADYVRKADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPAKVI EEYLTNKPAKPFISVEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFIWD WIDQGLEKDGHLLYGGDFDDRPTDYEFCGNGLVFADRTESPKLANV KALYANLKLEVKDGQLFLKNDNLFTNSSSYYFLTSLLVDGKLTYQSRP LTFGLEPGESGTFALPWPEVADEKGEVVYRVTAHLKEDLPWADEGF TVAEAEEVAQKLPEFKPEGRPDLVDSDYNLGLKGNNFQILFSKVKGW PVSLKYAGREYLKRLPEFTFWRALTDNDRGAGYGYDLARWENAGKY ARLKDISCEVKEDSVLVKTAFTLPVALKGDLTVTYEVDGRGKIAVTAD FPGAEEAGLLPAFGLNLALPKELTDYRYYGLGPNESYPDRLEGNYLGI YQGAVKKNFSPYLRPQETGNRSKVRWYQLFDEKGGLEFTANGADLN LSALPYSAAQIEAADHAFELTNNYTWVRALSAQMGVGGDDSWGQKV HPEFCLDAQKARQLRLVIQPLLLK
SEQ ID NO: 19
MSNKLVKEKRVDQADLAWLTDPEVYEVNTIPPHSDHESFQSQEELEE GKSSLVQSLDGNWLIDYAENGQGPINFYAEDFDDSNFKSVKVPGNLE LQGFGQPQYVNIQYPWDGSEEIFPPQVPSKNPLASYVRYFDLDEAL WDKEVSLKFAGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKE GNRLAVALYKYSSASWLEDQDFWRLSGLFRSVTLEAKPLLHLEDLKL TASLTDNYQKGKLEVEANIAYRLPNASFKLEVRDSEGDLVAEKVGPIR
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 260/301
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SEKLDFSLADLPVAAWSAEKPNLYQVRLYLYQAGSLLEVSRQEVGFR NFELKDGIMYLNGQRIVFKGVNRHEFDSKLGRAITEADMIWDIKTMKQ SNINAVRCSHYPNQSLFYRLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGHED PSFNVPGDDQHWLGASLSRVKNMMARDKNHASILIWSLGNESYAGT VFAQMADYVRKADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPAKEI EEYLTKKPAKPFISVEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFIWD WIDQGLEKDGHLLYGGDFDDRPTDYEFCGDGLVFADRTTSPKLANV KALYSNLKLEVKDGQLFIKNDNLFTNSSAYYFLTSLLVDGKLTYQSQP LTFGLEPGESGTFALPWPEVEDEKGEIVYQVTAHLKEDLPWADEGFT VAEAEEAVTKLPEFYPAGRPELVDSDFNLGLKGNGFRILFSKAKGWP VSIKYAGREYLKRLPEFTFWRALTDNDRGAGYGYDLAKWENAGKYA RLQDISYEIKENSALVKTAFTLPVALKGDLTITYEVDSLGKIAVTANFPG AVENGLLPAFGLNFALPKELSDYRYYGLGPNESYADRLEGSYLGIYQ GMVEKNFTPYLRPQEAGNRSKVRYYQLFDEEGGLEFTANGADLNLS ALPYSAAQIEAADHAFELTNNYTWVRALAAQMGVGGDDSWGQKVH PEFCLDAQEARQLKLVIQPLLLK
SEQ ID NO: 20 (G145 Dominio a)
MQANINWLDNPEVFRVNQLPAHSDHPFFRDYREWQKQHSSYQQSL NGKWKFHFSANPMDRPQDFYQRDFDSSNFDSIPVPSEIELSNYTQN QYINVLFPWEGKIFRRPAYALDPNDHEEGSFSKGADNTVGSYLKRFD LSSALIGKDVHIKFEGVEQAMYVWLNGHFVGYAEDSFTPSEFDLTPYI QDKDNLLAVEVFKHSTASWLEDQDMFRFSGIFRSVELLGIPATHLMD MDLKPRVADNYQDGIFNLKLHFIGKKAGSFHLLVKDIKGHTLLEKNEDI KENVQINNEKFENVHLWNNHDPYLYQLLIEVYDEQQNLLELIPFQFGF RRIEISPEKVVLLNGKRLIINGVNRHEWDAKRGRSITMSDMTTDINTFK ENNINAVRTCHYPNQIPWYYLCDQNGIYVMAENNLESHGTWQKMGE IEPSDNVPGSIPQWKEAVIDRARNNYETFKNHTSILFWSLGNESYAGD NIIAMNEFYKSHDDTRLVHYEGVVHRPELKDKISDVESCMYLPPKKVE EYLQNDPPKPFMECEYMHDMGNSDGGMGSYIKLLDKYPQYFGGFI
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 261/301
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WDFIDQALLVHDEISGHDVLRYGGDFDDRHSDYEFSGDGLMFADRT PKPAMQEVRYYYGLHK
SEQ ID NO: 21 (G145 Domínio b)
MDYTNNQLHIIYGDATFGVNGKDFQYIFSYERGGLESLKVHGKEWLY RVPTPTFWRATTDNDRGSGFNLKAAQWLGADMFTKCTDIHLKVDRH DFAELPIAPFNNKFSNHEYAKSAEISFTYQTLTTPATNAKIIYNIDDVGH IKVTMRYYGKKGLPPLPVIGIRLIMPTAATGFDYEGLSGETYPDRMAG AKEGKFHIDGLPVTEYLVPQENGMHMQTKKLTINRETTQNNVDRTNE KFSLSIQQAEKPFNFSCLPYTAEELENATHIEELPLVRRTVLVIAGAVR GVGGIDSWGTDVESAYHINPELDHEFSFILN
SEQ ID NO: 22
MTDVTHVDRASQAWLTDPTVFEVNRTPAHSSHKWYARDPQSGQWS DLKQSLDGEWRVEVVQAADINLEEEPATAESFDDSSFERIQVPGHLQ TAGLMNHKYVNVQYPWDGHENPLEPNIPENNHVALYRRKFTVSAPV ANAKQAGGSVSIVFHGMATAIYVWVNGAFVGYGEDGFTPNEFDITEL LHDGENVVAVACYEYSSASWLEDQDFWRLHGLFRSVELAARPHVHI ENTQIEADWDPEAGTASLDAALTVLNAADAATVRATLKDADGNTVW QTTGDAEAQTAISSGPLQGIAPWSAESPTLYELDVDVIDQAGDVIECT SQKVGFRRFRIEDGILTINGKRIVFKGADRHEFDAEQGRAITEQDMID DVVFCKRHNINSIRTSHYPNQERWYELCDEYGIYLIDEANLEAHGSW SLPGDVLTEDTIVPGSKREWEGACVDRVNSMMRRDYNHPSVLIWSL GNESYVGDVFRAMYKHVHDIDPNRPVHYEGVTHNRDYDDVTDIETR MYSHADEIEKYLKDDPKKPYLSCEYMHAMGNSVGNMDEYTALERYP KYQGGFIWDFIDQAIYATQPDGTRSLRYGGDFGDRPSDYEFSGDGLL FANRKPSPKAQEVKQLYSNVHIDVTKDSVSVKNDNLFTATGDYVFVL SVLADGKPVWQSTRRFDVPAGETRTFDVAWPVAAYRADARELVLQV SQRLAKATDWAESGYELAFGQTVVPADATATPDTKPADGTITVGRW NAGVRGAGREVLLSRTQGGMVSYTFAGNEFVLRRPAITTFRPLTDND RGAGHGFERVQWLGAGRYARCVDNVLEQIDDSTLKGTYTYELATAQ RTKVTVSYTAHTDGRVNLHVEYPGEQGDLPTIPAFGIEWTLPVQYTN
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 262/301
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LRFFGTGPAETYLDRKHAKLGVWSTNAFADHAPYLMPQETGNHEDV RWAEITDDHGHGMRVSRADGAAPFAVSLLPYSSFMLEEAQHQDELP KPKHMFLRVLAAQMGVGGDDSWMSPVHPQYHIPADKPISLDVDLELI SEQ ID NO: 23 (G224 Domínio a)
MDADIKWLDEPETFRVNQLPAHSDHYYYGNYDEWRHNNSRFAQNL DGQWQFNFAENLRERENDFYKMDYDSSSFGTIEVPSEIELNNYAQN NYINTLIPWEGKIYRRPAYTLSPDDAQEGSFSDGDDNTIGEYLKHFDL DPSLRGKQVRIRFDGVERAMYVWLNGHFIGYAEDSFTPSEFDLTPYI QDEGNVLAVEVFKHSTASWIEDQDMFRFSGIFRSVNLLAQPLVHVED LNIRPIVTDNYQDGIFNVELQLHGEKTGNVNVRVIDNDGNTLVNETHP VDSTVKVQDQFLENVHLWDNHDPYLYQLLIEIRDDEGNLVELVPYRF GFRRIEINKDHVVLLNGQRLIINGVNRHEWDARRGRAITMDDMTSDIH TFKENNINAVRTCHYPDQIPWYYLCDDNGIYMMAENNLESHATWQK MGAIEPSYNVPGSVPQWRDVVVDRARTNYETFKNHPSILFWSLGNE SYAGDNIVKMNEFYKKHDDSRLVHYEGVCHTPEYRDRISDVESWMY LPPKEVEEYLKNNPDKPFMECEYMHDMGNSDGGMGSYISLLDKYPQ YFGGFIWDFIDQALLVKDPVSGQEVMRYGGDFDDRHSDYEFSGDGL MFADRTPKPAMQEVRYYYGLHK
SEQ ID NO: 24 (G224 Domínio b)
MAYTNKLRVIYGDATLGLSGDGFHYIFSYERGGLESLKLNGKEWLYR EPMPTFWRATTDNDRGSGFNIRSAQWLAADTFHKCVGIDLTVDNQH FAELPIAPITNEFSDPVSAESVKIKYTFATLTVPATQVTVIYEVNGQGEI KVTMHYYGHEDLPGLPVVGMRFIMPTVATGFDYQGLSGETYPDRMA GATEGTFHVDGLPVTKYLVPQENGMHMATHALTITRDSTQNNADHS REPFSLTVKQDAQPFAFSCLPYTAEELENATHIEELPLARRTVLVVAG AVRGVGGIDSWGADVEEQYHIPADRDVEFSFVLNAK
SEQ ID NO: 25
MSNKLVKEKRVDQADLAWLTDPEVYEVNTIPPHSDHESFQSQEELEE GKSSLVQSLDGNWLIDYAENGQGPINFYAEDFDDSNFKSVKVPGNLE LQGFGQPQYVNIQYPWDGSEEIFPPQVPSKIPLASYVRYFDLDEALW
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 263/301
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DKEVSLKFAGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKEGN RLAVALYKYSSASWLEDQDFWRLSGLFRSVTLEAKPLLHLEDLKLTA SLTDNYQKGKLEVEANIAYRLPNASFKLEVRDSEGDLVAEKVGPIRSE KLDFSLADLPVAAWSAEKPNLYQVRLYLYQAGSLLEVSRQEVGFRNF ELKDGIMYLNGQRIVFKGVNRHEFDSKLGRAITEADMIWDIKTMKQSN INAVRCSHYPNQSLFYRLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGHEDPS FNVPGDDQHWLGASLSRVKNMMARDKNHASILIWSLGNESYAGTVF AQMADYVRKADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPAKEIEE YLTKKPAKPFISVEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFIWDWI DQGLEKDGHLLYGGDFDDRPTDYEFCGDGLVFADRTTSPKLANVKA LYSNLKLEVKDGQLFIKNDNLFTNSSAYYFLTSLLVDGKLTYQSQPLT FGLEPGESGTFALPWPEVEDEKGEIVYQVTAHLKEDLPWADEGFTVA EAEEAVTKLPEFYPAGRPELVDSDFNLGLKGNGFRILFSKAKGWPVSI KYAGREYLKRLPEFTFWRALTDNDRGAGYGYDLAKWENAGKYARL QDISYEIKENSALVKTTFTLPVALKGDLTITYEVDSLGKIAVTANFPGAV ENGLLPAFGLNFALPKELSDYRYYGLGPNESYADRLEGSYLGIYQGM VEKNFTPYLRPQEAGNRSKVRYYQLFDEEGGLEFTANGADLNLSALP YSAAQIEAADHAFELTNNYTWVRALAAQMGVGGDDSWGQKVHPEF CLDAQEARQLKLVIQPLLLK
SEQ ID NO: 26 (G282 Domínio a) MQANINWLDNPEVFRVNQLPAHSDHPFFRDYREWQKQHSSYQQSL NGKWKFHFSANPMDRPQDFYQRDFDSSNFDSIPVPSEIELSNYTQN QYINVLFPWEGKIFRRPAYALDPNDHEEGSFSKGADNTVGSYLKRFD LSSALIGKDVHIKFEGVEQAMYVWLNGHFVGYAEDSFTPSEFDLTPYI QEKDNLLAVEVFKHSTASWLEDQDMFRFSGIFRSVELLGIPATHLMD MDLKPRVADNYQDGIFNLKLHFIGKKAGSFHLLVKDIKGHTLLEKNEDI KENVQINNEKFENVHLWNNHDPYLYQLLIEVYDEQQNLLELIPFQFGF RRIEISPEKVVLLNGKRLIINGVNRHEWDAKRGRSITMSDMTTDINTFK ENNINAVRTCHYPNQIPWYYLCDQNGIYVMAENNLESHGTWQKMGE IEPSDNVPGSIPQWKEAVIDRARNNYETFKNHTSILFWSLGNESYAGD
Petição 870190100808, de 08/10/2019, pág. 264/301
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NIIAMNEFYKSHDDTRLVHYEGVVHRPELKDKISDVESCMYLPPKKVE EYLQNDPPKPFMECEYMHDMGNSNGGMDSYIKLLDKYPQYFGGFIW DFIDQALLVHDEISGHDVLRYGGDFDDRHSDYEFSGDGLMFADRKPK PAMQEVRYYYGLHK
SEQ ID NO: 27 (G282 Domínio b)
MDYTNNQLHIIYGDATFGVNGKDFQYIFSYERGGLESLKVHGKEWLY RVPTPTFWRATTDNDRGSGFNLKAAQWLGADMFTKCTDIHLKVDRH DFAELPIAPFNNKFSNHEYAKSAEISFTYQTLTTPATNAKIIYNIDDGGH IKVTMRYYGKKGLPPLPVIGIRLIMPTAATGFDYEGLSGETYPDRMAG AKEGKFHIDGLPVTEYLVPQENGMHMQTKKLTINRETTQNNVDRTNE KFSLSIQQAEKPFNFSCLPYTAEELENATHIEELPLVRRTVLVIAGAVR GVGGIDSWGTDVESAYHINPDLDHEFSFILN
SEQ ID NO: 28 (G334 Domínio a)
MKANIKWLDDPEVFRINQLPAHSDHPFYKDYREWQKHSSSFKQSLN GAWQFHFSKDPQSRPIDFYKLSFDSSSFDTIPVPSEIELNGYAQNQYT NILYPWESKIYRKPAYTLGRGIKDGDFSQGKDNTVGSYLKHFDLNPAL AGHDIHIQFEGVERAMYVYLNGHFIGYAEDSFTPSEFDLTPYIQAKDNI LAVEVFKHSTASWLEDQDMFRFSGIFRSVELLALPRTHLMDLDIKPTV VNDYHDGVFNAKLHFMGKTSGNVHVLIEDIDGKTLLNKKLPLKSTVEI ENETFANVHLWDNHDPYLYQLIIEVHDQDGKLVELIPYQFGFRKIEITK DHVVLLNGKRLIINGVNRHEWDAKRGRSITLADMKQDIATFKHNNINA VRTCHYPNQIPWYYLCDQNGIYMMAENNLESHGTWQKLGQVEATS NVPGSIPEWREVVVDRARSNYETFKNHTAILFWSLGNESYAGSNIAA MNKLYKDHDSSRLTHYEGVFHAPEFKKEISDLESCMYLPPKEAEEYL QNPKKPLVECEYMHDMGNSDGGIGSYIKLIDKYPQYMGGFIWDFIDQ ALLVHDPVSGQDVLRYGGDFDDRHSDYEFSGDGLMFADRTPKPAM QEVRYYYGLHK
SEQ ID NO: 29 (G334 Domínio b)
MAYTNNLHVVYGEASLGVNGQDFAYLFSYERGVLESLKIKDKEWLYR TPTPTFWRATTDNDRGSGFNQKAAQWLGADMFTKCVGIHVQVDDH
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QFDELPIAPINNQFSNQEFAHEVKVAFDYETLTTPATKVKIIYNINDAG HMTITMHYFGKKGLPPLPVIGMRFIMPTKAKSFDYTGLSGETYPDRM AGAERGTFHIDGLPVTKYLVPQENGMHMQTNELVITRNSTQNNADK DGDFSLKITQTKQPFNFSLLPYTAEELENATHIEELPLARRSVLVIAGA VRGVGGIDSWGSDVEEQYHIDPEQDHEFSFTLN
SEQ ID NO: 30
MNMTKIQTYLNDPKIVSVNTVDAHSDHKYFESLEEFSEGEMKLRQSL NGKWKIHYAQNTNQVLKDFYKTEFDETDLNFINVPGHLELQGFGSPQ YVNTQYPWDGKEFLRPPQVPQESNAVASYVKHFTLNDALKDKKVFIS FQGVATSIFVWVNGNFVGYSEDSFTPSEFEISDYLVEGDNKLAVAVY RYSTASWLEDQDFWRLYGIFRDVYLYAIPKVHVQDLFVKGDYDYQTK AGQLDIDLKTVGDYEDKKIKYVLSDYEGIVTEGDASVNGDGELSVSLE NLKIKPWSAESPKLYDLILHVLDDDQVVEVVPVKVGFRRFEIKDKLML LNGKRIVFKGVNRHEFNARTGRCITEEDMLWDIKVMKQHNINAVRTS HYPNQTRWYELCDEYGLYVIDEANLETHGTWQKLGLCEPSWNIPAS EPEWLPACLDRANNMFQRDKNHASVIIWSCGNESYAGKDIADMADY FRSVDNTRPVHYEGVAWCREFDYITDIESRMYAKPADIEEYLTTGKLV DLSSVSDKHFASGNLTNKPQKPYISCEYMHTMGNSGGGLQLYTDLE KYPEYQGGFIWDFIDQAIYKTLPNGSEFLSYGGDWHDRPSDYEFCG NGIVFADRTLTPKLQTVKHLYSNIKIAVDEKSVTIKNDNLFEDLSAYTFL ARVYEDGRKVSESEYHFDVKPGEEATFPVNFVVEASNSEQIYEVACV LREATKWAPKGHEIVRGQYVVEKISTETPVKAPLNVVEGDFNIGIQGQ NFSILLSRAQNTLVSAKYNGVEFIEKGPKLSFTRAYTDNDRGAGYPFE MAGWKVAGNYSKVTDTQIQIEDDSVKVTYVHELPGLSDVEVKVTYQV DYKGRIFVTANYDGKAGLPNFPEFGLEFAIGSQFTNLSYYGYGAEES YRDKLPGAYLGRYETSVEKTFAPYLMPQESGNHYGTREFTVSDDNH NGLKFTALNKAFEFSALRNSTEQIENARHQYELQESDATWIKVLAAQ MGVGGDDSWGAPVHDEFLLSSADSYQLSFMIEPLN
SEQ ID NO: 31
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MNNKLAQVKRVDQADLAWLTDPEIYEVNTIPPHSDHESFQSLEELEE GKSSLVQSLDGDWLIDYAENGEGPANFYEENFDDSSFKSVKVPGNL ELQGFGQPQYVNVQYPWDGSDEIFPPMIPSKNPVASYVRYFDLEEA FWDKEVSLKFAGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKE GNRLAVALYKYSSASWLEDQDFWRMSGLFRSVTLEAKPLLHLQDLK LTASLTNDYQKGSLQVEADIDYRLPNSSFKLELRDSAGELVAEKVGPI RSEKLDFSLADLPVAAWSAEEPNLYQVRLSLYQQGSLLEVSRQEVGF RNFELKDGIMYLNGKRIVFKGVNRHEFDSKLGRAITEADMIWDIKTMK QSNINAVRCSHYPNQSIFYHLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGGH EDPSFNVPGDDQRWLGASLSRVKNMMARDKNHASILIWSLGNESYA GKVFAQMADYVRQADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPAK EIEEYLTKKPAKPFVSCEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFI WDWIDQGLEKEGHLLYGGDFDDRPSDYEFCGDGLVFADRTTSPKLA NVKALYSNLKLELKDGQLFLKNDNLFTNSSAYYFLTSLLVDGKLTYQS QPLTFALEPGESGTFALPWPEVEDEKGEIVYQVTAHLKEDLPWADEG FTVAEAEEAVTKLPEFYPAGRPELVDSDYNLGIKGNGFRILFSKAKGW PVSIKYAGREYLKRLPEFTFWRALTDNDRGAGYGYDLAKWENAGKY ARLQDISYEIKENSVLVKTAFTLPVALKGDLTITYEVDSLGKIAVTANFP GAVENGLLPAFGLNFALPKELSDYRYYGLGPNESYADRLEGSYLGIY QGAVEKNFTPYLRPQEVGNRSKVRYYQLFDEEGGLEFTANGANLNL SALPYSAAQIEAADHAFELTNNYTWVRALAAQMGVGGDDSWGQKV HPEFCLDAQEARQLKLVIQPLFTE
SEQ ID NO: 32 MADTAELAIVHATTASASWLTDPTVFAANRKPAHSSHRYVIGETSEPK QSLDGEWKVRIEQARNVDVESAPFAAVDFEDGDFGAIEVPGHLQMA GYLKNKYVNIQYPWDGHEDPQAPNIPENNHVAIYRRRFALDAQLART LENDGTVSLTFHGAATAIYVWLDGTFVGYGEDGFTPSEFDVTEALRN GNGNAADSPEAEHTLTVACYEYSSASWLEDQDFWRLHGLFRTVELA AQPHTHVETVQLEADYTAADTAGTADTAELNAALTLRNPADAMTIES TLRDGDGNVVWESTQACNGEIALNSGKMTNIAPWSAESPTLYTLTVR
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VVGHDGAIIETVTQKIGFRTFRIENGIMTLNGKRIVFKGADRHEFDAKR GRAITREDMLSDVVFCKRHNINAIRTSHYPNQEYWYDLCDEYGLYLID ETNMETHGTWVANNVERPEDGIPGSRPEWEDACVDRINSMMRRDY NHPSVLIWSLGNESSAGEVFRAMYRHAHTIDPNRPVHYEGSVHMRE FEDVTDIESRMYAHADEIERYLNDGSPAHTDGPKKPYISCEYMHAMG NSCGNMDEYTALERYPMYQGGFIWDFIDQAIETKLPDGTTRMCYGG DFGDRPSDYEFSGDGLLFADRTPSPKAQEVKQLYANVKIAVSVDEAR ITNDNLFVSTGDYRFVLRILADGKPVWSTTRRFDVAAGESASFEVDW PVDDYRSNAEELVLEVSQQLGNACDWAPAGYELAFGQCVVAGAKTT ADAVDAAGAPADGTVTLGRWNAGVRGQGREALFSRTQGGMVSYTF GEREFVLRRPSITTFRPLTDNDRGAGHAFERAAWAVAGKYARCVDC AIANRGENAVEATYTYELAIPQRTKVTVRYVADTAGLVSLDVEYPGEK NGDLPTIPAFGIEWALPVEYANLRFYGAGPEETYADRRHAKLGVWST TAGDDCAPYLLPQETGNHEDVRWAEITDDSGHGVRVKRGAGAKPFA MSLLPYSSTMLEEALHQDELPKPRHMFLRLLAAQMGVGGDDSWMS PVHEQYQLPADQPLSLNVQLKLF
SEQ ID NO: 33
MANETRIEHASETWLADSTVFEVNRVPAHSDHKCYAHDSQTNEWSD LRQSLDGEWRVEVVQASDIEFNEEPFVRENFDDSAFERIQVPGHLQ MAGLMNNKYVNIQYPWDGHENPAEPNIPENNHVALYRKTFTMANRL ADTKNAGGTVSIVFHGMATAIYVWVNGMFVGYGEDGFTPNEFDITEM LHDGENVVAVACYEYSSASWLEDQDFWRLHGLFRSVELAAQPHVHI ENMQIESDWDPESGSASLDAALTVRNAADAATISATLKDSDGNVVW ETANCADPDTSISTGSLNGIRPWSAEDPVLYEFEVTVIDHAGNIAEVA VQKVGFRRFRIEDGIMTINGKRIVFKGADRHEFDPKRGRAITEQDMID DVVFCKRHNLNAIRTSHYPNQERWYELCDEYGIYLIDETNLETHGSW CLPGDVLTEETAVPGSKAHWEGACVDRVNSMVRRDYNHPSVLIWSL GNESYTGDVFRAMYKRVHDIDPNRPVHYEGVTHNRDYNDVTDIETR MYAHADAIEEYLKNDPQKPYISCEYMHAMGNSCGNMDEYTALERYP KYQGGFIWDFIDQAIYATQPDGTTSLRYGGDFGDRPSDYEFSGNGLV
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FADRKPTPKAQEVKQLYSNVHIDVAEDSVTIKNDNLFTSTGEYTFVLR VLADGEPVWQSERRFDVPAGSTEKLDVDWPLDLYRDGASELVLEVS QRLAKATNWAVAGYELAFGQTVVAGSKKASAPVKPVDGIVTVGRWN VGVQGSGREVLLSRTQGGLVSYTFNNREFVLRRPAVTTFRALTDND RGAGHGFERAQWLGAGRYARCIGNEIEQIDENTVKASYTYELATPQR TKVTVSYTADTTGRVNLHVEYPGEPGDLPTIPAFGIEWTLPVQYSNLR FFGAGPEETYQDRKHAKLGVWSTDAFKDHAPYLMPQETGNHEDVR WAEITDEKGHGLRISRAEGAEPFAMSLQPYSSFMLEEAQHQDELPAP KHMFLRVLAEQMGVGGDDSWMSPVHPQYHIPADQPISLDVDLDLI
SEQ ID NO: 34 (enzima de referência)
MVEDATRSDSTTQMSSTPEVVYSSAVDSKQNRTSDFDANWKFMLS DSVQAQDPAFDDSAWQQVDLPHDYSITQKYSQSNEAESAYLPGGTG WYRKSFTIDRDLAGKRIAINFDGVYMNATVWFNGVKLGTHPYGYSPF SFDLTGNAKFGGENTIVVKVENRLPSSRWYSGSGIYRDVTLTVTDGV HVGNNGVAIKTPSLATQNGGNVTMNLTTKVANDTEAAANITLKQTVF PKGGKTDAAIGTVTTASKSIAAGASADVTSTITAASPKLWSIKNPNLYT VRTEVLNGDTVLDTYDTEYGFRWTGFDATSGFSLNGEKVKLKGVSM HHDQGSLGAVANRRAIERQVEILQKMGVNSIRTTHNPAAKALIDVCNE KGVLVVEEVFDMWNRSKNGNTEDYGKWFGQTIAGDNAVLGGDKDE TWAKFDLTSTINRDRNAPSVIMWSLGNEMMEGISGSVSDFPATSAKL VAWTKAADSTRPMTYGDNKIKANWNESNTMGDNLTANGGVVGTNY SDGANYDKIRTTHPSWAIYGSETASAINSRGIYNRTTGGAQSSDKQLT SYDNSAVGWGAVASSAWYDVVQRDFVAGTYVWTGFDYLGEPTPW NGTGSGAVGSWPSPKNSYFGIVDTAGFPKDTYYFYQSQWNDDVHT LHILPAWNENVVAKGSGNKVPVVVYTDAAKVKLYFTPKGSTEKRLIGE KSFTKKTTAAGYTYQVYEGTDKDSTAHKNMYLTWNVPWAEGTISAE AYDENNRLIPEGSTEGNASVTTTGKAAKLKADADRKTITADGKDLSYI EVDVTDANGHIVPDAANRVTFDVKGAGKLVGVDNGSSPDHDSYQAD NRKAFSGKVLAIVQSTKEAGEITVTAKADGLQSSTVKIATTAVPGTSTE KTVRSFYYSRNYYVKTGNKPILPSDVEVRYSDGTSDRQNVTWDAVS
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DDQIAKAGSFSVAGTVAGQKISVRVTMIDEIGALLNYSASTPVGTPAV LPGSRPAVLPDGTVTSANFAVHWTKPADTVYNTAGTVKVPGTATVF GKEFKVTATIRVQRSQVTIGSSVSGNALRLTQNIPADKQSDTLDAIKD GSTTVDANTGGGANPSAWTNWAYSKAGHNTAEITFEYATEQQLGQI VMYFFRDSNAVRFPDAGKTKIQISADGKNWTDLAATETIAAQESSDR VKPYTYDFAPVGATFVKVTVTNADTTTPSGVVCAGLTEIELKTATSKF VTNTSAALSSLTVNGTKVSDSVLAAGSYNTPAIIADVKAEGEGNASVT VLPAHDNVIRVITESEDHVTRKTFTINLGTEQEFPADSDERD
SEQ ID NO: 35 (enzima de referência)
MSCLIPENLRNPKKVHENRLPTRAYYYDQDIFESLNGPWAFALFDAP LDAPDAKNLDWETAKKWSTISVPSHWELQEDWKYGKPIYTNVQYPIP IDIPNPPTVNPTGVYARTFELDSKSIESFEHRLRFEGVDNCYELYVNG QYVGFNKGSRNGAEFDIQKYVSEGENLVVVKVFKWSDSTYIEDQDQ WWLSGIYRDVSLLKLPKKAHIEDVRVTTTFVDSQYQDAELSVKVDVQ GSSYDHINFTLYEPEDGSKVYDASSLLNEENGNTTFSTKEFISFSTKK NEETAFKINVKAPEHWTAENPTLYKYQLDLIGSDGSVIQSIKHHVGFR QVELKDGNITVNGKDILFRGVNRHDHHPRFGRAVPLDFVVRDLILMK KFNINAVRNSHYPNHPKVYDLFDKLGFWVIDEADLETHGVQEPFNRH TNLEAEYPDTKNKLYDVNAHYLSDNPEYEVAYLDRASQLVLRDVNHP SIIIWSLGNEACYGRNHKAMYKLIKQLDPTRLVHYEGDLNALSADIFSF MYPTFEIMERWRKNHTDENGKFEKPLILCEYGHAMGNGPGSLKEYQ ELFYKEKFYQGGFIWEWANHGIEFEDVSTADGKLHKAYAYGGDFKE EVHDGVFIMDGLCNSEHNPTPGLVEYKKVIEPVHIKIAHGSVTITNKHD FITTDHLLFIDKDTGKTIDVPSLKPEESVTIPSDTTYVVAVLKDDAGVLK AGHEIAWGQAELPLKVPDFVTETAEKAAKINDGKRYVSVESSGLHFIL DKLLGKIESLKVKGKEISSKFEGSSITFWRPPTNNDEPRDFKNWKKYN IDLMKQNIHGVSVEKGSNGSLAVVTVNSRISPVVFYYGFETVQKYTIF ANKINLNTSMKLTGEYQPPDFPRVGYEFWLGDSYESFEWLGRGPGE SYPDKKESQRFGLYDSKDVEEFVYDYPQENGNHTDTHFLNIKFEGA GKLSIFQKEKPFNFKISDEYGVDEAAHACDVKRYGRHYLRLDHAIHGV
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GSEACGPAVLDQYRLKAQDFNFEFDLAFE
EXEMPLOS
Material e Métodos Gerais
Clonagem Molecular e Técnicas Genéticas
[0153] As técnicas para digestão com enzimas de restrição, ligação, transformação e outras manipulações convencionais de biologia molecular foram com base em métodos descritos na literatura (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3- Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; Miller, Experiment in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972); ou conforme sugerido pelo fabricante. PCR foi realizada em um termociclador de DNA obtido a partir da Bio-Rad, EUA. O sequenciamento de DNA foi realizado pela LGC, Berlim, Alemanha. As proteínas foram analisadas por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) sob condições de desnaturação usando dodecil sulfato de sódio em géis que contêm SDSa 10% (Mini-PROTEAN®TGX StainFree™ Gel, BioRad, EUA). As concentrações de proteínas foram determinadas usando o método BCA, seguindo o protocolo fornecido com o kit.
Linhagens Bacterianas, Plasmídeo e Condições de Crescimento [0154] A cepa TOP10 de Escherichia coli (Invitrogen) foi usada para clonagem e isolamento de plasmídeos. A cepa de E. coli BW25113 deficiente em beta-galactosidase (A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), λ-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514) (Datsenko K.A., Wanner B.L.; 2000, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97: 6640-6645) foi usada em combinação com o vetor pBAD/His (obtido a partir da Invitrogen Life Corporation Europe BV) para produção de proteína recombinante.
Meios de Crescimento Para Expressão de Proteínas
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[0155] Foi usado 2x meio PY que contém (16 g/L de BD BBL™ Phyton TM Peptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCI) para a produção de proteína recombinante. O meio de crescimento foi suplementado com ampicilina (100 μg/mL) para manter o plasmídeo. A produção de proteínas foi iniciada ao adicionar arabinose a 0,05 % ao meio de cultura.
Exemplo 1: Construção do Vetor de Expressão Para a Produção de Lactases
[0156] O DNA genômico das bactérias ou bifidobactérias do ácido láctico foi extraído usando um kit de extração genômica comercial seguindo o protocolo fornecido (DNeasy, Qaigen, Alemanha). O gene da lactase foi amplificado por PCR usando dois iniciadores sintéticos ao empregar a fonte de DNA genômico purificado como biomassa e os reagentes de PCR foram fornecidos no kit Phusion LJ Hot Start DNA Polymerase (Thermo Scientific, EUA). O gene da lactase foi clonado no códon inicial do vetor de expressão pBAD/His usando o método de clonagem USER (Nour-Eldin H.H., Geu-Flores F., Halkier B.A., Plant Secondary Metabolism Engineering, Methods in Molecular Biology, 643; 2010), resultando na construção de expressão. Com o método de clonagem USER longo, foram geradas saliências complementares no produto de PCR e no vetor de destino. Estas saliências podem emparelhar umas às outras para formar um produto de hibridização estável que foi usado para transformação em E. coli sem ligação. Para a geração de saliências no produto de PCR, um único resíduo de desoxiuridina é incluído na região a montante de cada iniciador para amplificar o DNA alvo. O gene da lactase foi amplificado usando o iniciador direto (5'-ATTAACCAUGCGACGCAACTTCGAATGGCC-3') e o iniciador reverso (ATCTTCTCUTTACCGCCTTACCACGAGCACG) que contém uma uridina na 9- posição (conforme mostrado em negrito), seguido pela se
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78/99 quência do gene da lactase. Paralelamente, o DNA de vetor foi amplificado por meio de PCR usando o par de iniciadores direto (5'-AGAGAAGAUTTTCAGCCTGATACAGATTAAATC-3') e reverso (5'-ATGGTTAAUTCCTCCTGTTAGCCCAAAAAACGG-3') o qual contém um único resíduo de desoxiuracila na 9- posição (conforme destacado em negrito), seguido pela sequência do DNA de vetor. Os produtos de PCR foram purificados usando o kit comercial de purificação de PCR (Qiagen, Dinamarca). Os produtos de PCR purificados (gene da lactase e o DNA de vetor) foram misturados em uma quantidade equimolar e incubados com uma mistura de enzima USER comercial (New England Biolabs, EUA) seguindo o protocolo fornecido. Estas enzimas removem o resíduo de uracila e também o pequeno fragmento a montante da uridina, deste modo, criando uma saliência complementar nos produtos de PCR. Estas saliências complementares se fundem, resultando no vetor de expressão de pBAD-lactase. Alíquotas da mistura de ligação foram transformadas em células de E. coliTOP 10 quimicamente competentes. Os transformantes foram selecionados a 37°C em placas LB-Amp (LB; Luria-Bertani, Amp; ampicilina a 100 pg/ml). No dia seguinte, PCR da colônia foi realizada usando uma pequena biomassa do transformante crescido de um dia para o outro usando os iniciadores de vetor (iniciador 1; 5'-CGGCGTCACACTTTGCTATGCC-3' e iniciador 2; 5'CCGCGCTACTGCCGCCAGGC-3'). Os clones positivos provenientes da PCR da colônia foram cultivados em 5 ml de meio LB-Amp e o DNA de plasmídeo foi isolado das células. O gene da lactase clonado foi sequenciado para verificar que nenhuma mutação adicional foi introduzida durante a amplificação gênica. O DNA de plasmídeo foi transformado na cepa de E. colide expressão hospedeira BW25113.
Exemplo 2: Expressão de Lactases na Cepa de E. colide Expressão Hospedeira
[0157] A enzima lactase foi produzida em E. coli BW25113 usando
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79/99 o sistema de expressão pBAD. As células de E. coli BW25113 recém transformadas que portam o DNA de plasmídeo foram coletadas de uma placa Lb-Amp usando uma alça estéril e usadas para inocular 5 mL de meio Lb-Amp. A cultura cultivada de um dia para o outro (200 μΙ) foi usada para inocular 50 mL de 2x meio PY (que contém ampicilina a 100 gg/mL) em um balão de 250 mL em um agitador (Innova® 42). A cultura foi cultivada a 37°C a 220 rpm até aODeoo atingir entre 0,6-0,8. A expressão da lactase foi iniciada ao adicionar arabinose a 0,05% no meio de cultura e as células foram cultivadas durante mais 16-20 horas a 18°C a 180 rpm. As células foram coletadas por meio de centrifugação (5000 rpm, 10 min a 4°C) e foram armazenadas a -20°C até uso posterior.
Exemplo 3: Purificação de Proteínas Usando Cromatografia de Afinidade por Metal Imobilizado
[0158] As células provenientes de 50 mL de cultura foram descongeladas sobre gelo e as células foram submetidas à lise usando 10 mL de mistura de tampão de lise (BugBuster® (Novagen) que contém 2 mg/mL de Lysozyme (Sigma Aldrich), 1 unidade de Benzonase (Sigma Aldrich) e 1X coquetel inibidor Complete Protease (sem EDTA, Roche)) ao incubar as células em temperatura ambiente durante 30 min. Após 30 minutos, os resíduos celulares foram removidos por meio de centrifugação a 16000 rpm durante 20 minutos a 4°C. O sobrenadante obtido foi filtrado através de um filtro com um diâmetro de poro de 0,45 μηπ. Uma coluna de Ni-Sepharose de fluxo por gravidade (GE Healthcare) foi preparada com 1 mL de suspensão através de lavagem do etanol e água. A coluna foi, então, equilibrada com tampão de lavagem (NaH2PO4 a 50 mM, pH de 8,0 que contém NaCI a 300 mM e imidazol a 20 mM). O extrato isento de células foi aplicado à coluna e as proteínas não ligadas foram eluídas da coluna. A coluna foi lavada com 20 mL de tampão de lavagem e as proteínas retidas foram eluídas com 3,5 mL de
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80/99 tampão de eluição (NahfePCU a 50 mM, pH de 8,0 que contém NaCI a 300 mM e imidazol a 250 mM). As frações coletadas foram analisadas por meio de SDS-PAGE em géis que contêm acrilamida a 10% e aquelas que continham as enzimas lactase purificadas foram combinadas. O tampão foi trocado por tampão de armazenamento (tampão de KH2PO4 a 50 mM, pH de 7,0 que contém NaCI a 10 mM, MgCL a 1 mM) usando uma coluna de filtração em gel G-25 de dessalinização PD-10 pré-empacotada (GE Healthcare). As enzimas purificadas foram armazenadas a 4°C até uso posterior.
Exemplo 4: Purificação de Proteínas Usando Cromatografia de Filtração em Gel
[0159] As células provenientes de 50 mL de cultura foram descongeladas sobre gelo e as células foram submetidas à lise usando 10 mL de mistura de tampão de lise (BugBuster® (Novagen) que contém 2 mg/mL de Lysozyme, 1 unidade de Benzonase (Sigma Aldrich) e 1X coquetel inibidor Complete Protease (EDTA Roche)) ao incubar as células em temperatura ambiente (25°C) durante 30 min. Após 30 minutos, os resíduos celulares foram removidos por meio de centrifugação a 16000 rpm durante 20 minutos a 4°C. O sobrenadante obtido foi filtrado através de um filtro com um diâmetro de poro de 0,45 μηπ. O extrato transparente sem células foi concentrado por meio de filtração através de um filtro de 30000 Dalton (Vivaspin 20, GE Healthcare) seguindo 0 protocolo fornecido. Foi preparada uma coluna Sephadex G50 Superfine de fluxo por gravidade (Pharmacia Chemicals, Suécia) com 1 g de material da coluna (preparado ao ferver em 100 mL de água durante 1 hora, esfriado para a temperatura ambiente). Uma coluna foi preparada ao aplicar 20 mL da suspensão esfriada em uma coluna de filtração de 30 mL. A coluna foi lavada com água Milli-Q e equilibrada com tampão de lavagem B (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 7,0). 500 μι do sobrenadante concentrado foram aplicados à coluna e deixado que 0
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81/99 sobrenadante entrasse no leito da coluna. O tampão de lavagem (tampão de NahhPCria 50 mM, pH de 7,0) foi aplicado por cima da coluna e as frações de eluente foram novamente coletadas individualmente. As frações coletadas foram analisadas em um gel de SDS-PAGE (que contém acrilamida a 10%). As frações de proteína foram combinadas e o tampão foi trocado por tampão de armazenamento (tampão de KH2PO4a 50 mM, pH de 7,0 que contém NaCI a 10 mM, MgCha 1 mM) com a coluna de dessalinização, conforme descrito na secção anterior. As enzimas purificadas foram armazenadas a 4°C até uso posterior.
Exemplo 5: Medição da Concentração de Proteínas Usando o Ensaio BCA
[0160] A concentração de lactases purificadas foi determinada usando o kit Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Alemanha) seguindo o protocolo fornecido com o kit.
Exemplo 6: Determinação da Atividade Usando Enzimas Purificadas em Lactose Como Substrato em um pH de 6,7 a 37°C
[0161] Para medir a atividade de beta-galactosidase, as lactases purificadas foram diluídas para 40x em tampão A (tampão de NaH2PO4 a 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSO4a 100 μΜ). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com a solução de lactose preparada em tampão B (lactose a 140 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 6,7, que contém MgSO4a 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 μΙ de enzima diluída e 37 μΙ de solução de lactose em um tubo de PCR. A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA com os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 37°C, inativação enzimática; 10 min a 95°C, resfriamento; 4°C). As misturas de reação foram armazenadas a -20°C até uso posterior. Para determinar a quantidade de gli
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82/99 cose formada durante a reação, 10 μΙ_ da mistura de reação foram transferidos para uma cavidade da placa de microtitulação padrão (Thermo Fischer Scientific, Dinamarca) que contém 80 μΙ_ de tampão C (tampão de NaH2PO4 a 100 mM, pH de 7,0 que contém glicose oxidase; 0,6 g/L (Sigma Aldrich), sal de diamônio de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico); ABTS: 1,0 g/L (Sigma Aldrich), peroxidase de rábano; 0,02 g/L (Sigma Aldrich)) e incubados a 30°C durante 40 min. Após 40 min, a absorbância foi determinada a 610 nm usando o leitor de placa FLUOStar Omega UV (BMG Labtech, Alemanha). Os valores de absorbância entre 0,1 e 1,5 foram usados para os cálculos; se o valor de A610 nm > 1,5, a mistura de reação foi diluída até 10x com tampão A. Com cada enzima purificada, as reações foram realizadas em triplicate e o valor médio da medida em triplicate foi usado para o cálculo. A purificação da proteína realizada com células de E. colitransformadas com vetor vazio pBAD/His foi usada para normalização. Usando uma concentração conhecida de glicose (0-2,5 mM), uma curva padrão foi desenhada e a inclinação da curva foi usada para calcular a glicose formada durante a reação. O valor máximo de absorbância para cada lactase foi usado para determinar μΜ de glicose formada por segundo, descrito como 1 unidade de atividade de lactose em um pH de 6,7 a 37QC (UAL-1). A atividade específica em um pH de 6,7 a 37QC é definida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima (μΜ de glicose/s/μΜ de enzima) e determinada ao dividir UAL-1 pela concentração de proteínas em μΜ, descrita como SUAL-1. A atividade específica de SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 35 foi determinada sob condições similares. A elevada atividade específica em um pH de
6,7 é altamente desejada pela robustez da enzima em aplicações de leite fresco e fermentado. Os resultados detalhados da atividade específica de enzimas em um pH de 6,7 a 37QC são descritos na Figura 1.
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[0162] Adicionalmente, a atividade foi descrita como pmole de glicose formada por minuto por miligrama de enzima adicionada. Os resultados são mostrados na Figura 14.
Exemplo 7: Determinação da Atividade Usando Enzimas Purificadas na Presença de Galactose em um pH de 6,7 a 37°C
[0163] As lactases purificadas foram diluídas para 40x em tampão A (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSÜ4a 100 μΜ). Em reações separadas, as enzimas diluídas foram incubadas com tampão D (lactose a 140 mM e galactose a 140 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 6,7 que contém MgSÜ4a 100 μΜ). A mistura de reação consiste em 13 pL da enzima diluída e 37 μΙde tampão D em um tubo de PCR. A mistura de reação foi incubada em termociclador com os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação: 10 min a 37°C, inativação enzimática: 10 min a 95°C, resfriamento: 4°C). As misturas de reação foram armazenadas a -20°C até uso posterior. Para determinar a quantidade de glicose formada durante a reação, 10 pL da mistura de reação foram transferidos para uma cavidade da placa de microtitulação padrão (Thermo Fischer Scientific, Dinamarca) que contém 80 μΙ_ de tampão C (tampão de NaH2PO4 a 100 mM, pH de 7,0 que contém glicose oxidase; 0,6 g/L (Sigma Aldrich), sal de diamônio de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico); ABTS: 1,0 g/L (Sigma Aldrich), peroxidase de rábano; 0,02 g/L (Sigma Aldrich)) e incubados a 30°C durante 40 min. Após 40 min, a absorbância foi determinada a 610 nm usando o leitor de placa UV FLUOStar Omega (BMG Labtech, Alemanha). Os valores de absorbância entre 0,1 e 1,5 foram usados para os cálculos; se o valor de A610 nm > 1,5, a mistura de reação foi diluída até 10x com tampão A. Com cada enzima purificada, as reações foram realizadas em triplicate e o valor médio da medida em triplicate foi usado para o cálculo. A purificação da proteína realizada com células de E. coli transformadas com o vetor vazio
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84/99 pBAD/His foi usada para normalização. Usando uma concentração conhecida de glicose (0-2,5 mM), uma curva padrão foi desenhada e a inclinação da curva foi usada para calcular a absorbância que corresponde a 1 μΜ de glicose formada durante a reação. O valor máximo de absorbância para cada lactase foi usado para determinar μΜ de glicose formada por segundo, denominada como 1 unidade de atividade com galactose em um pH de 6,7 a 37°C (UAG). A atividade específica em um pH de 6,7 a 37°C na presença de galactose é definida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima (μΜ de glicose/s/μΜ de enzima) e determinada ao dividir UAG pela concentração de proteínas em μΜ, denominada como SUAG.
[0164] A percentagem de inibição de enzimas com galactose é calculada usando a fórmula % de inibição = 100 * (AB)/A onde A é atividade específica das enzimas com lactose em um pH de
6,7 a 37°C (SUAL), conforme descrito no Exemplo 6, e B representa a atividade específica de enzimas na presença de galactose em um pH de 6,7 a 37°C (SUAG) conforme descrito no Exemplo 7. Os resultados detalhados da % de inibição de galactose são descritos na Figura 2 e na Figura 14. A menor inibição de galactose é altamente relevante para as aplicações em que é desejada uma concentração muito baixa de lactose. Além disso, a atividade foi descrita como pmole de glicose formada por minuto por miligrama de enzima adicionada. Os resultados são mostrados na Figura 14.
[0165] Nota: Os desvios padrão relativamente altos na medição da inibição de galactose se devem a pequenas quantidades de impurezas de glicose na galactose adquirida.
Exemplo 8: Determinação da Atividade Usando Enzimas Purificadas em Lactose Como Substrato em um pH de 6,7 a 4°C
[0166] As lactases purificadas foram diluídas até 40x em tampão A
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85/99 (tampão de NahUPCVa 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSCVa 100 μΜ). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com a solução de lactose preparada em tampão B (lactose a 140 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 6,7 que contém MgSCVa 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 μΙ de enzima purificada diluída e 37 μΙ de solução de lactose em um tubo de PCR. A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA usando os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 60 min a 4°C, inativação enzimática; 10 min a 95°C, armazenamento; 4°C). As misturas de reação foram armazenadas em um congelador a 20°C até uso posterior. A quantidade de glicose formada durante a reação foi determinada seguindo o protocolo descrito no Exemplo 6. O valor máximo de absorbância para cada lactase foi usado para determinar μΜ de glicose formada por segundo, denominada como 1 Unidade de Atividade de Lactase em um pH de 6,7 a 4°C (UAL-2). A atividade específica em um pH de 6,7 a 4°C é definida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima (μΜ de glicose/s/μΜ de enzima) e é determinada ao dividir UAL-2 pela concentração de proteína em μΜ, denominada como SUAL-2. A elevada atividade específica em um pH de 6,7 a 4°C é altamente desejada para hidrólise de lactose para aplicações de leite fresco/pasteurizado. Os resultados detalhados da atividade específica de enzimas em um pH de 6,7 a 4°C são descritos na Figura 3. Adicionalmente, a atividade foi descrita como pmole de glicose formada por minuto por miligrama de enzima adicionada. Os resultados são mostrados na Figura 14.
Exemplo 9: Determinação da Atividade Usando Enzimas Purificadas em Lactose Como Substrato em um pH de 6,7 a 43 °C
[0167] As lactases purificadas foram diluídas para 40x em tampão A (tampão de NaH2PÜ4a 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSÜ4a 100 μΜ). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com a
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86/99 solução de lactose preparada em tampão B (lactose a 140 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 6,7 que contém MgSCria 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 μΙ de enzima purificada diluída e 37 μΙ de solução de lactose em um tubo de PCR. A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA usando os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 43°C, inativação enzimática; 10 min a 95°C, armazenamento; 4°C). As misturas de reação foram armazenadas em um congelador a 20°C até uso posterior. A quantidade de glicose formada durante a reação foi determinada seguindo o protocolo descrito no Exemplo 6. O valor máximo de absorbância para cada lactase foi usado para determinar μΜ de glicose formada por segundo, denominada como 1 Unidade de Atividade de Lactase em um pH de 6,7 a 43°C (UAL-3). A atividade específica em um pH de 6,7 a 43°C é definida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima (μΜ de glicose/s/μΜ de enzima) e é determinada ao dividir UAL-3 pela concentração de proteína em μΜ, denominada como SUAL-3. A elevada atividade específica em um pH de
6,7 a 43°C é altamente desejada para hidrólise de lactose para as aplicações de leite fermentado. Os resultados detalhados da atividade específica de enzimas em um pH de 6,7 a 43°C são descritos na Figura Figura 4. Adicionalmente, a atividade foi descrita como pmole de glicose formada por minuto por miligrama de enzima adicionada. Os resultados são mostrados na Figura 14.
Exemplo 10: Determinação da Atividade Usando Enzimas Purificadas em Lactose Como Substrato em um pH de 5,5 a 4°C
[0168] As lactases purificadas foram diluídas até 40x em tampão A (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSO4a 100 μΜ). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com a solução de lactose preparada em tampão E (lactose a 140 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 5,5 que contém
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MgSCria 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 μΙ de enzima purificada diluída e 37 μΙ ui de solução de lactose em um tubo de PCR. A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA usando os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 60 min a 4QC, inativação enzimática; 10 min a 95QC, armazenamento; 4QC). A solução de substrato foi preparada em um tampão com um pH de 5,5 e a solução enzimática tinha um pH de 6,7. Para iniciar a reação, 13 pL de enzima foram adicionados a 37 μΙ_ de solução de substrato. Esta mistura destes dois tampões eventualmente aumenta o pH da reação de 5,5 para 5,7. As misturas de reação foram armazenadas em um congelador a -20°C até uso posterior. Para determinar a quantidade de glicose formada durante a reação, 10 pL da mistura de reação foram transferidos para uma cavidade da placa de microtitulação padrão que contém 80 pL de tampão C e incubados a 30°C durante 40 min. Após 40 min, a absorbância foi determinada a 610 nm usando o leitor de placa UV FLUOStar Omega (BMG Labtech, Alemanha). O valor de absorbância entre 0,1 e 1,5 foi usado para os cálculos; se o valor de A610 nm > 1,5, a mistura de reação foi diluída até 5x com tampão A. Com cada enzima purificada, as reações foram realizadas em triplicata e o valor médio da medida em triplicata foi usado para os cálculos. O valor máximo de absorbância para cada lactase foi usado para determinar μΜ de glicose formada por segundo, denominada como 1 Unidade de Atividade de Lactase em um pH de 5,5 a 4°C (UAL-4). A atividade específica em um pH de 5,5 a 4°C é definida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima (μΜ glicose/s/μΜ de enzima) e é determinada ao dividir UAL-4 pela concentração de proteína em μΜ, denominada como SUAL-4. A elevada atividade específica em um pH de
5,5 a 4°C é relevante para hidrólise de lactose em aplicações de leite fermentado. Os resultados detalhados da atividade específica de enzimas em um pH de 5,5 a 4°C são descritos na Figura 5. Adicionalmente,
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88/99 a atividade foi descrita como pmole de glicose formada por minuto por miligrama de enzima adicionada. Os resultados são mostrados na Figura 15.
Exemplo 11: Determinação da Atividade Usando Enzimas Purificadas em Lactose Como Substrato em um pH de 5,5 a 37°C
[0169] As lactases purificadas foram diluídas até 40x em tampão A (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSO4a 100 μΜ). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com a solução de lactose preparada em tampão E (lactose a 140 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 5,5 que contém MgSO4a 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 pl de enzima purificada diluída e 37 μΙ de solução de lactose em um tubo de PCR. A solução de substrato foi preparada em um tampão com um pH de 5,5 e a solução enzimática tinha um pH de 6,7. Para iniciar a reação, 13 pL de enzima foram adicionados a 37 pL de solução de substrato. Esta mistura destes dois tampões eventualmente aumenta o pH da reação de 5,5 para 5,7. As misturas de reação foram armazenadas a -20°C até uso posterior. A quantidade de glicose formada durante a reação foi determinada seguindo o protocolo descrito no Exemplo 10. O valor máximo de absorbância para cada lactase foi usado para determinar μΜ de glicose formada por segundo, denominada como 1 Unidade de Atividade de Lactase em um pH de 5,5 a 37°C (UAL-5). A atividade específica em um pH de 5,5 a 37°C é definida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima (μΜ de glicose/s/μΜ de enzima) e é determinada ao dividir UAL-5 pela concentração de proteínas em μΜ, denominada como SUAL-5. A elevada atividade específica em um pH de 5,5 a 37°C é relevante para hidrólise de lactose em aplicações de leite fermentado e hidrólise de lactose em soro de leite doce. Os resultados detalhados da atividade específica de enzimas em um pH de 5,5
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89/99 a 37°C são descritos na Figura 6. Adicionalmente, a atividade foi descrita como pmole de glicose formada por minuto por miligrama de enzima adicionada. Os resultados são mostrados na Figura 15.
Exemplo 12: Determinação da Atividade Usando Enzimas Purificadas em Lactose Como Substrato em um pH de 5,5 a 37°C
[0170] As lactases purificadas foram diluídas até 40x em tampão A (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSÜ4a 100 μΜ). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com a solução de lactose preparada em tampão E (lactose a 140 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 5,5 que contém MgSÜ4 a 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 μΙ de enzima purificada diluída e 37 μΙ de solução de lactose em um tubo de PCR. A solução de substrato foi preparada em um tampão com um pH de 5,5 e a solução enzimática tinha um pH de 6,7. Para iniciar a reação, 13 pL de enzima foram adicionados a 37 pL de solução de substrato. Esta mistura destes dois tampões eventualmente aumenta o pH da reação de 5,5 para 5,7.
[0171] A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA usando os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 43°C, inativação enzimática; 10 min a 95°C, armazenamento; 4°C). As misturas de reação foram armazenadas a -20°C até uso posterior. A quantidade de glicose formada durante a reação foi determinada seguindo o protocolo descrito no Exemplo 10. O valor máximo de absorbância para cada lactase foi usado para determinar pM de glicose formada por segundo, denominada como 1 Unidade de Atividade de Lactase em um pH de 5,5 a 43°C (UAL-6). A atividade específica em um pH de 5,5 a 43°C é definida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima (pM de glicose/s/pM de enzima) e é determinada ao dividir UAL-6 pela concentração de proteínas em μΜ, denominada como
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SUAL-6. A elevada atividade específica em um pH de 5,5 a 43°C é relevante para hidrólise de lactose em aplicações de leite fermentado e hidrólise de lactose em soro de leite doce. Os resultados detalhados da atividade específica de enzimas em um pH de 5,5 a 43°C são descritos na Figura 7. Adicionalmente, a atividade foi descrita como pmole de glicose formada por minuto por miligrama de enzima adicionada. Os resultados são mostrados na Figura 15.
Exemplo 13: Determinação da Atividade Usando Enzimas Purificadas em Lactose Como Substrato em um pH de 4,5 a 4°C
[0172] As lactases purificadas foram diluídas até 40x em tampão A (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 6,7, que contém MgSÜ4a 100 μΜ). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com a solução de lactose preparada em tampão F (lactose a 140 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 4,5, que contém MgSÜ4a 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 pl de enzima purificada diluída e 37 μΙ de solução de lactose em um tubo de PCR. A solução de substrato foi preparada em um tampão com um pH de 4,5 e a solução enzimática tinha um pH de 6,7. Para iniciar a reação, 13 pL de enzima foram adicionados a 37 pL de solução de substrato. Esta mistura destes dois tampões eventualmente aumenta o pH da reação de 4,5 para 4,7.
[0173] A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA usando os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 60 min a 4°C, inativação enzimática; 10 min a 95°C, armazenamento; 4°C). Para determinar a quantidade de glicose formada durante a reação, 10 pL da mistura de reação foram transferidos para uma cavidade da placa de microtitulação padrão que contém 80 pL de tampão C (conforme descrito no Exemplo 6) e incubados a 30°C durante 40 min. Após 40 min, a absorbância foi determinada a 610 nm usando o leitor de placa UV FLUOStar Omega. O valor de absorbância entre 0,1 e 1,5 foi usado
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91/99 para os cálculos; se o valor de A610 nm > 1,5, a mistura de reação foi diluída até 5x com tampão A. Com cada enzima purificada, as reações foram realizadas em triplicata e o valor médio da medida em triplicata foi usado para o cálculo. O valor máximo de absorbância para cada lactase foi usado para determinar μΜ de glicose formada por segundo, denominada como 1 Unidade de Atividade de Lactase em um pH de 4,5 a 4°C (UAL-7). A atividade específica em um pH de 4,5 a 4°C é definida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima (μΜ de glicose/s/μΜ de enzima) e é determinada ao dividir UAL-7 pela concentração de proteína em μΜ, denominada como SUAL-7. A elevada atividade específica em um pH de 4,5 a 4°C é relevante para hidrólise de lactose em aplicações de leite fermentado. Os resultados detalhados da atividade específica de enzimas em um pH de 4,5 a 4°C são descritos na Figura 8. Adicionalmente, a atividade foi descrita como pmole de glicose formada por minuto por miligrama de enzima adicionada. Os resultados são mostrados na Figura 16.
Exemplo 14: Determinação da Atividade Usando Enzimas Purificadas em Lactose Como Substrato em um pH de 4,5 a 37°C
[0174] As lactases purificadas foram diluídas até 40x em tampão A (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSO4a 100 μΜ). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com a solução de lactose preparada em tampão F (lactose a 140 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 4,5, que contém MgSCria 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 μΙ de enzima purificada diluída e 37 μΙ de solução de lactose em um tubo de PCR. A solução de substrato foi preparada em um tampão com um pH de 4,5 e a solução enzimática tinha um pH de 6,7. Para iniciar a reação, 13 pL de enzima foram adicionados a 37 pL de solução de substrato. Esta mistura destes dois tampões eventualmente aumenta o pH da reação de 4,5 para 4,7.
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[0175] A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA usando os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 37°C, inativação enzimática; 10 min a 95°C, armazenamento; 4°C). As misturas de reação foram armazenadas a -20°C até uso posterior. A quantidade de glicose formada durante a reação foi determinada seguindo o protocolo descrito no Exemplo 13. O valor máximo de absorbância para cada lactase foi usado para determinar μΜ de glicose formada por segundo, denominada como 1 Unidade de Atividade de Lactase em um pH de 4,5 a 37°C (UAL-8). A atividade específica em um pH de 4,5 a 37°C é definida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima (μΜ de glicose/s/μΜ de enzima) e é determinada ao dividir UAL-8 pela concentração de proteína em μΜ, denominada como SUAL-8. A elevada atividade específica em um pH de 4,5 a 37°C é relevante para hidrólise de lactose em aplicações de leite fermentado e hidrólise ácida de lactose no soro de leite. Os resultados detalhados da atividade específica de enzimas em um pH de 4,5 a 37°C são descritos na Figura 9. Adicionalmente, a atividade foi descrita como pmole de glicose formada por minuto por miligrama de enzima adicionada. Os resultados são mostrados na Figura 16.
Exemplo 15: Determinação da Atividade Usando Enzimas Purificadas em Lactose Como Substrato em um pH de 4,5 a 43°C
[0176] As lactases purificadas foram diluídas até 40x em tampão A (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSÜ4a 100 μΜ). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com a solução de lactose preparada em tampão F (lactose a 140 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 4,5, que contém MgSÜ4a 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 μΙ de enzima purificada diluída e 37 μΙ de solução de lactose em um tubo de PCR. A solução de substrato foi preparada em um tampão com um pH de 4,5 e a solução enzimática tinha um pH de 6,7. Para iniciar a
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93/99 reação, 13 μΙ_ de enzima foram adicionados a 37 μΙ_ de solução de substrato. Esta mistura destes dois tampões eventualmente aumenta o pH da reação de 4,5 para 4,7. A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA usando os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 43°C, inativação enzimática; 10 min a 95°C, armazenamento; 4°C). As misturas de reação foram armazenadas a 20°C até uso posterior. A quantidade de glicose formada durante a reação foi determinada seguindo o protocolo descrito no Exemplo 13. O valor máximo de absorbância para cada lactase foi usado para determinar μΜ de glicose formada por segundo, denominada como 1 Unidade de Atividade de Lactase em um pH de 4,5 em 43°C (UAL-9). A atividade específica em um pH de 4,5 a 43°C é definida como μΜ de glicose formada por segundo por μΜ de enzima (μΜ de glicose/s/μΜ de enzima) e é determinado ao dividir UAL-9 pela concentração de proteína em μΜ, descrita como SUAL-9. A elevada atividade específica em um pH de 4,5 a 43°C é relevante para hidrólise de lactose em aplicações de leite fermentado e hidrólise ácida de lactose em soro de leite. Os resultados detalhados da atividade específica de enzimas em um pH de 4,5 a 43°C são descritos na Figura 10. Adicionalmente, a atividade foi descrita como pmole de glicose formada por minuto por miligrama de enzima adicionada. Os resultados são mostrados na Figura 16.
Exemplo 16: Determinação de Atividade em Unidades BLU
[0177] A enzima NOLA® Fit comercialmente disponível (Chr-Hansen, Dinamarca) foi diluída em uma faixa a partir de 0,5 BLU/mL a 2,5 BLU/mL em tampão L (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 7,0 que contém MgSO4 a 100 μΜ, Brij a 0,045%, Sigma Aldrich). A enzima diluída foi incubada com a solução de lactose preparada em tampão H (lactose a 105 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 6,7 que contém MgSO4a 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 μΙ de enzima purificada diluída e 37 μΙ de solução de
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94/99 lactose em um tubo de PCR. A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA usando os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 37°C, inativação enzimática; 10 min a 95°C, armazenamento; 4°C). A quantidade de conversão de glicose foi determinada ao transferir 10 pL da mistura de reação para uma única cavidade da placa de microtitulação padrão que contém 80 pL de tampão C e incubada a 30°C durante 40 min. Após 40 min, a absorbância foi determinada a 610 nm usando o leitor de placa UV FLUOStar Omega (BMG Labtech, Alemanha). Os valores de absorbância medidos foram usados para desenhar uma curva padrão em função de BLU/mL. A inclinação máxima da curva foi usada para determinar a atividade das enzimas inovadoras em BLU/mL.
Exemplo 17: Determinação da Atividade de Lactases Inovadoras em BLU/mL Usando Lactose Como Substrato
[0178] As lactases purificadas foram diluídas até 50 vezes em tampão A (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSO4a 100 μΜ). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com a solução de lactose preparada em tampão H (lactose a 105 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 6,7 que contém MgSO4a 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 μΙ de enzima purificada diluída e 37 μΙ de solução de lactose em um tubo de PCR. A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA usando os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 37°C, inativação enzimática; 10 min a 95°C, armazenamento; 4°C). Após a reação, 10 pL da mistura de reação foram transferidos para uma cavidade da placa de microtitulação padrão que contém 80 μL de tampão C (conforme descrito no Exemplo 6) e incubados a 30°C durante 40 min. Após 40 min, a absorbância foi determinada a 610 nm usando o leitor de placa UV FLUOStar Omega. O valor de absorbância entre 0,1 e 1,5 foi usado para os cálculos; se o valor de A610 nm > 1,5,
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95/99 a mistura de reação foi diluída até 5x com o tampão A. Os valores máximos de absorbância foram usados para calcular a atividade de enzima em BLU/mL, usando a curva padrão descrita no Exemplo 16.
Exemplo 18: Medição da Percentagem de Lactose Residual em Leite Fresco em Temperatura Gelada
[0179] 2 ml de leite pasteurizado comercial (leite pasteurizado com
1,5% de gordura, Aria Food) foram misturados com 10-125 pL de enzima (equivalente a 10 BLU/mL), conforme determinado no Exemplo 17, em um tubo de vidro de 10 mL. As amostras foram incubadas sob condições constantes durante 24 horas a 4°C. Após incubação, a reação foi interrompida por meio de inativação térmica a 95°C durante 7 min, seguido de armazenamento a -20°C até uso posterior. A quantidade de lactose restante no leite foi analisada usando um ensaio de HPLC. As amostras para análise foram tratadas com 1,8 mL de solução de precipitação de proteínas (M PCA a 0,083 M e Na-EDTA a 2 mM) e 2 mL de MQW antes de centrifugação a 2800 rpm durante 30 min a 4°C. Uma alíquota do sobrenadante foi diluída um total de 200 vezes usando um robô de diluição Janus (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). As amostras diluídas foram analisadas em um sistema Dionex ICS-5000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham (MA), EUA) usando uma coluna analítica CarboPac SA20 de 4 x 250 mm (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EUA) e urn detector amperométrico pulsado. O detector foi ajustado para uma forma de onda potencial em três etapas simples, seletiva para detecção de carboidratos. O eluente foi ajustado para KOH a 1 mM e foi regenerado continuamente através de uma coluna de retenção (CR-TC, Thermo Fischer Scientific, Waltham (MA), EUA). A taxa de fluxo do eluente foi de 1,2 mL/min e o tempo de análise foi de 10 min por injeção. A lactose em cada amostra foi quantificada usando uma curva de calibração externa de três pontos preparada mediante adição de quantidades conhecidas de lactose monoidratada (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
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96/99
EUA) à MQW. As concentrações foram calculadas com base nas alturas dos picos cromatográficos. A porcentagem medida de lactose residual no leite fresco é mostrada na Figura 11.
Exemplo 19: Determinação de Atividade no Leite UHT em Temperatura Ambiente
[0180] 2 mL de leite UHT (leite UHT com 1,5% de gordura, Aria
Food) foram misturados com 2-25 pL de enzima (equivalente a 2 BLU/mL), conforme determinado no Exemplo 17, em tubo de vidro de 10 mL. As amostras foram incubadas sob condições constantes durante 24 horas a 25°C. Após incubação, a reação foi interrompida por meio de inativação térmica a 95°C durante 7 min, seguido de armazenamento a -20°C até uso posterior. A quantidade de lactose residual no leite UHT foi analisada por HPLC, seguindo o protocolo descrito no Exemplo 18. A porcentagem de lactose residual no leite fresco após hidrólise está listada na Figura 12.
Exemplo 20: Desempenho da Enzima em Alta Temperatura em Tampão
[0181] A enzima purificada foi diluída para 5 BLU/mL em tampão A (tampão de NaH2PO4a 50 mM, pH de 6,7 que contém MgSCVa 100 μΜ). Em uma reação separada, 13 pL da enzima diluída foram incubados em um termociclador de DNA com uma solução de lactose (lactose a 105 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 6,7 que contém MgSCVa 100 μΜ). A mistura de reação foi preparada ao misturar 13 pl de enzima e 37 pl de solução de lactose em um tubo de PCR. A mistura de reação foi incubada em um termociclador de DNA usando os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 37°C, inativação enzimática; 10 min a 95°C, armazenamento; 4°C). Após a reação, 10 pL da mistura de reação foram transferidos para uma cavidade da placa de microtitulação padrão que contém 80 pL de tampão C (conforme descrito no Exemplo 6) e incubados a 30°C durante
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97/99 min. Após 40 min, a absorbância foi determinada a 610 nm usando o leitor de placa UV FLUOStar Omega. O valor da absorbância entre 0,1 e 1,5 foi usado para os cálculos; se o valor de A610 nm > 1,5, a mistura de reação foi diluída até 5x com o tampão A. A absorbância medida foi denominada Abs37°C e considerada como valor de referência para os cálculos.
[0182] Para medir o impacto do tratamento térmico sobre a atividade enzimática, em uma reação separada, 13 pL da enzima diluída (5 BLU/mL) foram incubados em um termociclador de DNA usando o seguinte parâmetro de incubação (a 72°C durante 15 s ou 74°C durante 15 s ou 76°C durante 6 s ou 78°C durante 6 s ou 80°C durante 4 s ou 85°C durante 5 s ou 90°C durante 5 s ou 95°C durante 5 s, seguido por armazenamento a 4°C). A atividade da enzima termicamente tratada foi determinada por meio de incubação com a solução de lactose (lactose a 105 mM preparada em tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH de 6,7 que contém MgSCria 100 μΜ), conforme descrito acima. A absorbância medida em diferentes temperaturas (por exemplo, 72°C, 74°C, 76°C, 78°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95°C) foi denominada Abs72°C, Abs74°C, Abs76°C, Abs78°C, Abs80°C, Abs85°C, Abs90°C, Abs95°C.
[0183] A porcentagem de atividade residual em alta temperatura foi determinada usando a fórmula:
% de atividade residual = (Abs72°C/Abs37°C) * 100
[0184] As porcentagens de atividades residuais de diferentes enzimas em diferentes temperaturas são descritas na Figura 13.
Exemplo 21: Percentagem de Lactose Residual Após Tratamento em Temperatura Elevada
[0185] O efeito do tratamento térmico sobre o desempenho da enzima no leite pasteurizado foi determinado por meio de incubação de uma quantidade fixa de enzima no leite, seguido de um tratamento tér
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98/99 mico. Em reações separadas, 50 μΙ_ do leite pasteurizado foram misturados com 10 BLU/mL de enzima purificada (conforme determinado no Exemplo 17) em um tubo de PCR. A amostra de leite foi incubada a 72°C durante 15 ou 76°C durante 10 s ou 85°C durante 5 s e 90 °C durante 5 s, seguido por incubação a 5°C durante 24 h. Após 24 h a 5°C, a reação foi interrompida por meio de aquecimento da reação a 95°C durante 7 min, seguido por armazenamento a -20°C. A lactose residual foi medida usando o kit de ensaio LactoSens® (Chr. Hansen, Dinamarca), seguindo o protocolo fornecido. A lactose residual medida em g/L foi determinada em diferentes temperaturas. O limite de detecção do kit LactoSens® está entre 0,2 g/L e 10 g/L. Os resultados são descritos na Tabela 2:
TABELA 2: Porcentagem de lactose residual no leite pasteurizado tratado com uma quantidade fixa de enzima purificada, seguido por incubação em diferentes temperaturas (72°C durante 15 s, 76°C durante 10 s, 85°C durante 5 s e 90°C durante 5 segundos, seguido de incubação a 4°C durante 24 h), determinado usando o kit de ensaio LactoSens®. Os limites de detecção do kit LactoSens® estão na faixa de 0,2 g/L a 10 g/L de lactose. Aqui, ND: não determinado.
Número G Lactose residual a 4 °C (g/L) Lactose residual a 72 °C (g/L) Lactose residual a 76 °C (g/L) Lactose residual a 85 °C (g/L) Lactose residual a 90 °C (g/L)
G4 <0,2 > 10,0 ND ND ND
G11 <0,2 > 10,0 ND ND ND
G16 <0,2 > 10,0 ND ND ND
G33 <0,2 4,7 ND ND ND
G35 <0,2 > 10,0 > 10,0 ND ND
G40 <0,2 <0,2 <0,2 > 10,0 ND
G44 0,9 > 10,0 ND ND ND
G57 <0,2 > 10,0 ND ND ND
G62 8,4 > 10,0 > 10,0 > 10,0 ND
G66 0,35 > 10,0 ND ND ND
G83 0,3 2,1 6,0 > 10,0 ND
G84 0,25 0,65 0,5 7,6 >10
G95 0,3 6,0 8,6 >10 ND
G100 0,4 2,4 2,6 > 10,0 ND
G104 0,35 0,45 0,5 0,45 >10
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G108 0,35 1,3 1,55 ND ND
G109 0,35 1,45 3,4 > 10,0 ND
G118 0,45 0,95 0,8 > 10,0 >10
G158 <0,2 3,9 > 10,0 ND ND
G256 0,3 1,0 0,75 3,4 >10
G282 <0,2 <0,2 <0,2 <0,2 >10
G335 <0,2 0,35 8,0 > 10,0 ND
G600 <0,2 > 10,0 > 10,0 > 10,0 ND
G500 <0,2 > 10,0 ND ND ND
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Claims (15)

1. Peptídeo que exibe atividade de enzima beta-galactosidase caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25, 26, 27,28, 29, 30,31, 32, 33, ou fragmentos enzimaticamente ativos dos mesmos, ou uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos mesmos que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos.
2. Peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, caracterizado pelo fato de que o peptídeo dimérico consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21,23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29, ou fragmentos enzimaticamente ativos dos mesmos, ou uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos mesmos que tem não mais de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou eliminações de aminoácidos.
3. Método para reduzir o teor de lactose em uma composição que contém lactose, tal como em produtos lácteos, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contatar a dita composição com um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de enzima beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33 ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21,23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29, ou fragmentos enzimaticamente ativos dos mesmos, ou qualquer sequência que tenha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências ou fragmentos enzimaticamente ativos dos mesmos; ou uma célula hospedeira que expressa qualquer um do dito peptídeo ou peptídeo dimérico, em um pH que varia
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2/5 entre 3-10 e em uma temperatura que varia a partir de 0°C-140°C.
4. Uso de um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe a atividade de enzima beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33 ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21,23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências; ou uma célula hospedeira que expressa qualquer um do dito peptídeo ou peptídeo dimérico, caracterizado pelo fato de que é para produzir um produto lácteo com um teor reduzido de lactose.
5. Método para produzir um produto lácteo, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
(a) fornecer um substrato à base de leite que compreende lactose;
(b) adicionar um peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de beta-galactosidase, peptídeo o qual tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1-33; ou peptídeo dimérico o qual consiste em dois peptídeos que têm uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e 3, 5 e 6, 20 e 21,23 e 24, 26 e 27 ou 28 e 29; ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas sequências ao dito substrato à base de leite que compreende lactose; e (c) tratar o dito substrato à base de leite com o dito peptídeo ou peptídeo dimérico que exibe atividade de beta-galactosidase.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a etapa c) ocorre em um pH dentro de uma faixa a partir de 3-10, tal como dentro de uma faixa a partir de 3-9, tal como dentro de uma faixa a partir de 3-8, tal como dentro de uma faixa a partir de 37, tal como dentro de uma faixa a partir de 3-6, tal como dentro de uma
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3/5 faixa a partir de 3-5, tal como dentro de uma faixa a partir de 3-4, tal como dentro de uma faixa a partir de 4-10, tal como dentro de uma faixa a partir de 4-9, tal como dentro de uma faixa a partir de 4-8, tal como dentro de uma faixa a partir de 4-7, tal como dentro de uma faixa a partir de 4-6, tal como dentro de uma faixa a partir de 4-5, tal como dentro de uma faixa a partir de 5-10, tal como dentro de uma faixa a partir de 5-9, tal como dentro de uma faixa a partir de 5-8, tal como dentro de uma faixa a partir de 5-7, tal como dentro de uma faixa a partir de 5-6, tal como dentro de uma faixa a partir de 6-10, tal como dentro de uma faixa a partir de 6-9, tal como dentro de uma faixa a partir de 6-8, tal como dentro de uma faixa a partir de 6-7.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado pelo fato de que a etapa c) ou uma parte da etapa c) ocorre em uma temperatura de não mais do que cerca de 25°C, tal como não mais do que cerca de 20°C, tal como não mais do que cerca de 18°C, tal como não mais do que cerca de 16°C, tal como não mais do que cerca de 14 °C, tal como não mais do que cerca de 12°C, tal como não mais do que cerca de 10°C, tal como não mais do que cerca de 8°C, tal como não mais do que cerca de 7°C, tal como não mais do que cerca de 6°C, tal como não mais do que cerca de 5°C, tal como não mais do que cerca de 4°C, tal como não mais do que cerca de 3°C, tal como não mais do que cerca de 2°C.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a etapa c) ou uma parte da etapa c) ocorre em uma temperatura de pelo menos cerca de 25°C, tal como pelo menos cerca de 30°C, tal como pelo menos cerca de 35°C, tal como pelo menos cerca de 40°C, tal como pelo menos cerca de 45°C, tal como pelo menos cerca de 50°C, tal como pelo menos cerca de 55°C, tal como pelo menos cerca de 60°C, tal como pelo menos
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4/5 cerca de 65°C, tal como pelo menos cerca de 70°C, tal como pelo menos cerca de 75°C, tal como pelo menos cerca de 80°C, tal como pelo menos cerca de 85°C, tal como pelo menos cerca de 90°C, tal como pelo menos cerca de 95°C, tal como pelo menos cerca de 100°C, tal como pelo menos cerca de 110°C, tal como pelo menos cerca de 120°C, tal como pelo menos cerca de 130°C, tal como pelo menos cerca de 120°C, tal como pelo menos cerca de 130°C, tal como pelo menos cerca de 135°C, tal como pelo menos cerca de 140°C.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que a inibição de galactose do dito peptídeo ou peptídeo dimérico é menor do que 60%, tal como menor do que 55%, tal como menor do que 50%, tal como menor do que cerca de 45%, tal como menor do que cerca de 40%.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado pelo fato de que o dito produto lácteo é um produto de leite fermentado e a dita etapa b) é realizada durante ou antes de fermentação.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o método que não requer a adição de mais enzima após a fermentação.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito produto lácteo é um produto lácteo fermentado e a dita etapa b) é realizada imediatamente após a fermentação.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito produto lácteo é o leite fresco e a dita etapa b) é realizada antes de, em conjunção com ou imediatamente após uma etapa de pasteurização.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito produto lácteo é um
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5/5 leite que sofreu tratamento em temperatura ultraelevada (UHT) e a dita etapa b) é realizada antes, em conjunto com ou imediatamente após uma etapa de tratamento em temperatura ultraelevada.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 14, caracterizado pelo fato de que a etapa c) é iniciada em uma temperatura de entre 40°C e 100°C, tal como em uma temperatura de entre 50°C e 100°C, tal como em uma temperatura de entre 60°C e 100°C, tal como em uma temperatura de entre 70°C e 100°C, tal como em uma temperatura de entre 80°C e 100°C, tal como em uma temperatura de entre 40°C e 90°C, tal como em uma temperatura de entre 40°C e 80°C, tal como em uma temperatura de entre 40°C e 70°C, tal como em uma temperatura de entre 40°C e 60°C, tal como em uma temperatura de entre 40°C e 50°C.
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