CN101899463B

CN101899463B - 一种带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶及其应用

Info

Publication number: CN101899463B
Application number: CN2010102169124A
Authority: CN
Inventors: 肖敏; 徐淑泽; 卢丽丽; 李正义
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2010-07-05
Filing date: 2010-07-05
Publication date: 2012-05-02
Anticipated expiration: 2030-07-05
Also published as: CN101899463A

Abstract

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶及其应用，尤其涉及一种带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶及其在生产低聚半乳糖中的应用，属于酶蛋白工程技术领域。一种带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶基因，具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列。其编码的β-半乳糖苷酶，具有如SEQID No.2所示氨基酸序列。本发明所涉及的GOS生产方法具有成本低、产量高、步骤简单合理等优点，具有很大的工业化应用前景。

Description

一种带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶及其应用，尤其涉及一种带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶及其在生产低聚半乳糖中的应用，属于酶蛋白工程技术领域。

技术背景

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，自然界里存在于动物和人乳中，其生理作用主要体现在促进肠道内双歧杆菌(Bifidobacterium)和乳杆菌(Lactobacillus)类益生菌(Probiotics)的增殖，促进有益的肠道微环境的建立，并对维持人体健康具有积极的影响。

目前商品化GOS是通过微生物酶法制备获得的，即利用具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase，Bga)以乳糖为底物通过转糖基作用合成，其分子结构是在葡萄糖或半乳糖分子上连接1～5个半乳糖残基。GOS合成可采用游离酶或固定化酶。游离酶在反应过程中不稳定，并且难与底物分离、不能重复利用；而固定化酶相对稳定、耐用，易与底物分离，可以循环利用，降低成本，更适合于工业化生产。

固定化酶是通过合适的固定化方法将目的酶固定在一定的载体上获得的。传统的固定化方法一般可分为5种，即吸附、包埋、共价结合、交联和微囊化，但这些方法的酶活回收率一般较低，其稳定性也不够理想，有些固定化载体的成本较高，这些因素均在一定程度上制约了固定化酶的实际应用。近年来，通过基因工程的方法将一些特殊的亲和标签，例如聚组氨酸标签、聚精氨酸标签、蛋白A结构域或纤维素吸附域与目标酶蛋白分子融合，获得带有这些标签的融合蛋白，其原有酶活往往没有明显改变并可吸附固定于一定的载体上，这种方法操作简单并有利于保持固定化酶的活力。

纤维素吸附域(Cellulose binding module，CBM)是纤维素酶的一种常见组成成分，对纤维素有很高的亲和力，但通常没有水解酶活性，在高盐和pH2～10的缓冲体系中稳定性很好。CBM作为特异性的亲和多肽，与具有其他功能的蛋白融合在一起，融合蛋白能够与纤维素吸附结合，可用于酶蛋白纯化及酶的固定化。本发明用基因工程的方法把CBM与β-半乳糖苷酶融合在一起，并在大肠杆菌中表达，将融合蛋白特异地固定到化学反应惰性、安全、廉价的纤维素基质上，建立了一种新的固定化β-半乳糖苷酶生产低聚半乳糖的方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶(Bga-CBM)并提供将该酶固定于微晶纤维素颗粒表面转化乳糖批次生产低聚半乳糖的方法。

本发明涉及：

[1]一种带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶基因，由来自德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCCNO.11842的β-半乳糖苷酶和解纤维醋弧菌ATCC NO.33288纤维素水解酶CBM及连接域融合而成，具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

本发明还涉及：

[2]一种由带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶基因序列编码的β-半乳糖苷酶，它具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列。

此外，本发明还涉及：

[3]一种插入了包含根据[1]所述带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶基因的表达载体。

[4]所述核苷酸序列插入pET22b(+)表达载体。

进一步的，本发明还涉及：

[5]一种包含有根据[3]所述的表达载体的重组细胞。

优选的，所述的重组细胞通过将[3]所述带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶基因的表达载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)获得。

进一步的，本发明还涉及：

[6]根据[2]所述的β-半乳糖苷酶的制备方法，步骤如下：

(1)利用GenBank中已知的德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC NO.11842的bga序列(GenBankAccession No.NC_008054)和解纤维醋弧菌ATCC NO.33288纤维素水解酶的cbm序列(GenBankAccession No.AJ969241.1)，利用重叠延伸PCR原理设计引物，并引入质粒pET22b(+)的酶切位点BamHI和Xho I，进行重叠延伸PCR，获得融合基因bga-cbm，酶切后连接pET22b(+)，构建重组质粒pBga-CBM。

(2)将步骤(1)获得的重组质粒pBga-CBM转化大肠杆菌DH5α，然后从阳性重组大肠杆菌中提取此重组质粒，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得含有重组质粒pBga-CBM的重组大肠杆菌BL21(DE3)；

(3)将步骤(2)获得的含有重组质粒pBga-CBM的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB培养液，37℃培养菌液至菌体浓度为OD₆₀₀＝0.5～1.0时，向培养液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4～1.2mmol/L，在28～37℃诱导培养10～24小时，10000转/分钟离心5～10分钟，收集诱导表达的重组大肠杆菌菌体；

(4)以含100mmol/L NaCl的pH7.0、50mmol/L磷酸钾缓冲溶液将步骤(3)获得的诱导表达的重组大肠杆菌菌体重新悬浮，并置于冰水浴中，超声波破壁10～30分钟，破壁后的溶液以12000转/分钟离心15～30分钟，取上清液，即得带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶(Bga-CBM)粗酶液。

所述LB培养液成分为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、pH 7.0，LB液体培养基中加1.5％琼脂粉即得固体培养基，121℃灭菌20分钟。培养大肠杆菌重组菌时培养基中加入过滤除菌的氨苄霉素，终浓度为50μg/mL。

[7]优选的，所述步骤(3)中菌体生长浓度为OD₆₀₀＝0.8，IPTG的终浓度为0.5mmol/L，诱导培养温度为30℃，诱导培养时间为24小时。

[8]根据[2]所述β-半乳糖苷酶在固定化后生产低聚半乳糖的应用，包括β-半乳糖苷酶的固定和低聚半乳糖的转化生产，步骤如下：

(I)β-半乳糖苷酶的固定：

a.将带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶用含50～200mmol/L NaCl，50mmol/L、pH7.0磷酸钾缓冲液稀释到酶活10～20U/mL，得稀释酶液；

b.将步骤a获得的稀释酶液用磷酸调pH至5.0～5.4，并按90～120U加入1克微晶纤维素的比例加入微晶纤维素，在室温下50～100转/分钟搅拌混合10～30分钟，然后6000～8000转/分钟离心5～10分钟，获取沉淀颗粒；

c.用50mmol/L、pH5.4醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤步骤b得到的沉淀颗粒，然后以6000～8000转/分钟离心5～10分钟，取沉淀，即为固定化β-半乳糖苷酶。

(II)低聚半乳糖的转化生产：

d.用50mmol/L、pH7.2～8.0磷酸钾溶液配制1.0～1.5mol/L乳糖溶液，按每毫升乳糖溶液加入2.5U步骤c制得的固定化β-半乳糖苷酶的比例混合，40～60℃水浴震荡反应30～120分钟；

e.将步骤d反应后的体系在6000～8000转/分钟离心5～10分钟，分离回收固定化酶颗粒重复利用，剩余上清液即为低聚半乳糖溶液。

[9]所述步骤a中，NaCl的浓度为100mmol/L；所述步骤b中，按100U加入1克微晶纤维素的比例加入微晶纤维素，搅拌混合时间为20分钟；所述步骤c中，洗涤次数为2次，每次洗涤5～10分钟。

[10]步骤d中配制乳糖溶液的缓冲液为pH7.6磷酸钾缓冲溶液，水浴震荡反应的温度为45℃，时间为50分钟。

所述的游离酶酶活测定方法为：取酶液50μL，加2mmol/L邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)溶液450μL(pH5.4、50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液配制)，37℃反应10分钟，加0.5mol/L Na₂CO₃溶液1mL终止反应，离心，上清液测OD₄₀₀。酶活单位规定：以1分钟水解ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)释放1μmol邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位(U)。

所述的固定化酶酶活测定方法为：取固定化酶悬浮液50μL，加2mmol/L ONPG溶液450μL(pH5.4、50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液配制)，37℃反应10分钟，加0.5mol/L Na₂CO₃溶液1mL终止反应，离心，上清液测OD₄₀₀。酶活单位规定：以1分钟水解ONPG释放1μmol邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位(U)。

本发明提供了一种带有纤维素吸附域的具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶的制备及其固定化生产低聚半乳糖的方法，即首先采用分子生物学方法将CBM基因与β-半乳糖苷酶基因融合在一起，并在大肠杆菌中高效表达融合酶蛋白Bga-CBM，通过CBM与纤维素的吸附结合作用，将酶固定于纤维素载体上，在简化固定化操作步骤的同时还有利于固定化酶活力的回收，在批次反应中固定化酶活力的稳定性也较好。此外，固定化载体纤维素具有化学反应惰性、安全、廉价以及存在形式多样等优点，是一种优良的固定化材料。本发明所涉及的GOS生产方法具有成本低、产量高、步骤简单合理等优点，具有很大的工业化应用前景。

附图说明

图1为采用固定化β-半乳糖苷酶在批次反应中第一批次产物的高效液相色谱图。

其中，保留时间与糖组分的对应关系为：6.983分钟为葡萄糖和半乳糖、11.075分钟为乳糖、9.992分钟和12.986分钟为转移二糖、18.436分钟为低聚三糖、25.620分钟为低聚四糖。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，β-半乳糖苷酶基因来源于菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC NO.11842，但不限于此。

实施例中的质粒pET22b(+)，大肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α购自Invitrogen公司，其他试剂均为市售产品。

实施例1：带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶基因的获得

根据重叠延伸PCR的原理，利用德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)ATCC NO.11842的β-半乳糖苷酶基因序列(GenBank AccessionNo.NC_008054)序列和解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)ATCC NO.33288纤维素水解酶CBM序列(GenBank Accession No.AJ969241.1)以及质粒pET-22b(+)上的限制性内切酶位点BamH I与Xho I(下划线所示)，设计上下游引物P1，P4和连接引物P2，P3，连接引物上带有10个位点的重叠区(加粗字体所示)：序列如下：

P1：5’-TCGGATCCGATGAGCAATAAGTTAGTAAAAG-3’

P2：5’-TGCAAAGCCCTTTTAGTAAAAGGGGCTGAAT-3’

P3：5’-TTTACTAAAAGGGCTTTGCACATACTTT-3’

P4：5’-CGCTCGAGGTCAAACTCTACATAATATACTCCA-3’

采用常规方法提取德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC NO.11842和解纤维醋弧菌ATCCNO.33288总DNA，以P1和P2为引物PCR获得带有BamH I酶切位点和cbm起始端10个碱基的bga的序列，以P3和P4为引物PCR得到带有Xho I酶切位点和bga末端10个碱基的cbm序列，再以P1和P4为引物，以得到的bga和cbm为模板进行第二轮PCR，获得的bga-cbm基因片段经过琼脂糖凝胶电泳回收后，加入BamH I与Xho I 37℃双酶切3小时，16℃过夜连接到同样双酶切处理的质粒pET-22b(+)载体上，构建重组质粒pBga-CBM。采用CaCl₂转化法转化宿主菌大肠杆菌DH5α，转化菌液涂布氨苄霉素LB平板，37℃过夜培养，挑取阳性生长菌菌落，提取质粒验证，测得序列见SEQ ID No.1。

实施例2：带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶的制备

将pBga-CBM转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化菌液涂布氨苄霉素LB平板，37℃过夜培养，挑选生长良好的菌落，采用菌落PCR法验证阳性转化子，并在加入氨苄霉素的液体LB培养基中培养，完全符合要求的重组大肠杆菌作为菌种保存。

将上述保存的重组大肠杆菌菌株接种于3mL加入氨苄霉素的液体LB培养液中，37℃过夜培养，以1％(v/v)接种量转接300mL新的培养液，至菌体浓度OD₆₀₀达到0.8时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃诱导培养24小时。10000转/分钟离心10分钟收集已诱导重组蛋白表达的重组大肠杆菌菌体，用60mL、含100mmol/L NaCl的pH7.0、50mmol/L磷酸钾缓冲溶液重新悬浮菌体，并置于冰水浴中，超声波破壁20分钟，破壁后的溶液以12000转/分钟离心30分钟，上清作为Bga-CBM粗酶液用于固定化或保存于-80℃冰箱备用。Bga-CBM氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述LB培养液成分为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、pH 7.0，LB液体培养基中加1.5％琼脂粉即得固体培养基，121℃灭菌20分钟。培养大肠杆菌重组菌时培养基中加入过滤除菌的氨苄霉素，终浓度为50μg/mL。

实施例3：将Bga-CBM固定于微晶纤维素颗粒表面获得固定化β-半乳糖苷酶

用含100mmol/L NaCl的50mmol/L pH7.0磷酸钾缓冲液将在实施例1中获得的Bga-CBM粗酶液稀释到酶活为16U/mL，用磷酸溶液调pH5.4，按1g微晶纤维素：100U酶液的比例向40mL粗酶液中加入6.4g纤维素，并在室温下70转/分钟搅拌混合20分钟，然后7000转/分钟离心6分钟，弃上清，用40mL、50mmol/L、pH5.4醋酸-醋酸钠缓冲液将纤维素重新悬浮洗涤2次，每次10分钟，7000转/分钟离心6分钟，弃洗涤液，即得固定化β-半乳糖苷酶颗粒，保存于4℃冰箱。

实施例4：利用固定化β-半乳糖苷酶生产低聚半乳糖

用100mL、50mmol/L、pH5.4醋酸-醋酸钠缓冲液将实施例3中的固定化β-半乳糖苷酶悬浮，并测酶活然后量取10U的固定化β-半乳糖苷酶，离心去除缓冲液后，加入4mL 1.2mol/L乳糖溶液(pH7.6磷酸钾溶液配制)，45℃反应50分钟，作为一个批次，7000转/分钟离心6分钟分离固定化β-半乳糖苷酶与反应液，并重新将固定化β-半乳糖苷酶加入新的乳糖溶液作下一批次的反应。

其中所述第1个批次的上清液的高效液相色谱分析结果表明，固定化β-半乳糖苷酶反应产物的糖组成：葡萄糖和半乳糖43.4％，乳糖9.8％，低聚半乳糖46.8％；

按实施例4的方法连续进行8个批次反应，高效液相色谱分析结果表明，固定化β-半乳糖苷酶每个批次所得的低聚半乳糖含量均高于40％。

上述高效液相色谱分析所用设备及条件如下：

安捷伦(Agilent)1200型高压液相色谱仪；安捷伦G1362A示差检测器；ZorbaxCarbohydrate柱(4.6×250mm)；流动相为乙腈/水(3∶1，v/v)；流速为1.0mL/min，柱温30℃；结果分析软件为Agilent Chemstation B.04.01版。反应液按1∶5(v/v)的比例加水稀释，煮沸离心后上清用0.22μm的滤膜过滤后，进样分析。

Claims

1.一种带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶基因，由来自德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCCNO.11842的β-半乳糖苷酶基因序列和解纤维醋弧菌ATCC NO.33288纤维素水解酶的纤维素吸附域及连接域序列融合而成，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种由权利要求1所述的带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶基因编码的β-半乳糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种插入了包含权利要求1所述的带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶基因的表达载体。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述核苷酸序列插入pET22b(+)表达载体。

5.一种包含有权利要求3所述的表达载体的重组细胞。

6.权利要求2所述的β-半乳糖苷酶的制备方法，步骤如下：

(1)利用GenBank中已知的德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC NO.11842的bga序列和解纤维醋弧菌ATCC NO.33288纤维素水解酶的cbm序列，利用重叠延伸PCR原理设计引物，并引入质粒pET22b(+)的酶切位点BamH I和XhoI，进行重叠延伸PCR，获得融合基因bga-cbm，酶切后连接pET22b(+)，构建重组质粒pBga-CBM；

(2)将步骤(1)制得的重组质粒pBga-CBM转化大肠杆菌DH5α，然后从阳性重组大肠杆菌中提取此重组质粒，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得含有重组质粒pBga-CBM的重组大肠杆菌BL21(DE3)；

(3)将步骤(2)获得的含有重组质粒pBga-CBM的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB培养液，37℃培养菌液至菌体浓度为OD₆₀₀＝0.5～1.0时，向培养液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0.4～1.2mmol/L，在28～37℃诱导培养10～24小时，10000转/分钟离心5～10分钟，收集诱导表达的重组大肠杆菌菌体；

(4)以含100mmol/L NaCl的pH7.0、50mmol/L磷酸钾缓冲溶液将步骤(3)获得的诱导表达的重组大肠杆菌菌体重新悬浮，并置于冰水浴中，超声波破壁10～30分钟，破壁后的溶液12000转/分钟离心15～30分钟，取上清液，即得带有纤维素吸附域的β-半乳糖苷酶粗酶液。

7.如权利要求6所述的β-半乳糖苷酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中菌体生长浓度为OD₆₀₀＝0.8，IPTG的终浓度为0.5mmol/L，诱导培养温度为30℃，诱导培养时间为24小时。

8.权利要求2所述β-半乳糖苷酶在固定化后生产β-低聚半乳糖的应用，包括β-半乳糖苷酶的固定和低聚半乳糖溶液的生产，步骤如下：

(I)β-半乳糖苷酶的固定：

c.用50mmol/L、pH5.4醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤步骤b得到的沉淀颗粒然后以6000～8000转/分钟离心5～10分钟，获取沉淀，即为固定化β-半乳糖苷酶；

(II)低聚半乳糖溶液的生产：

d.用50mmol/L、pH7.2～8.0的磷酸钾溶液配制1.0～1.5mol/L乳糖溶液，按每毫升乳糖溶液加入2.5U步骤c制得的固定化β-半乳糖苷酶的比例混合，40～60℃水浴震荡反应30～120分钟；

e.将步骤d反应后的体系在6000～8000转/分钟离心5～10分钟，固定化酶保留在沉淀颗粒中，回收重复利用，上清液即为低聚半乳糖溶液。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤a中，NaCl的浓度为100mmol/L；步骤b中，按100U加入1克微晶纤维素的比例加入微晶纤维素，搅拌混合时间为20分钟；步骤c中，洗涤次数为2次，每次洗涤5～10分钟。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤d中配制乳糖溶液的缓冲液为pH7.6磷酸钾缓冲溶液，水浴震荡反应的温度为45℃，时间为50分钟。