CN112979749A - 一种活性环肽、活性环肽组合物及其在制备具有抗氧化作用或抗衰老作用的产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体公开了一种活性环肽、活性环肽组合物及其在制备具有抗氧化作用或抗衰老作用的产品中的应用。所述的活性环肽，具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构。所述的活性环肽组合物，包含式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽；其中，式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽的摩尔比为1～10:1～10。研究表明，式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽具有优异的抗氧化作用或抗衰老作用；尤其是具有优异的抗环境污染物苯并芘导致的氧化损伤或衰老作用。

Description

一种活性环肽、活性环肽组合物及其在制备具有抗氧化作用 或抗衰老作用的产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种活性环肽、活性环肽组合物及其在制备具有抗氧化作用或抗衰老作用的产品中的应用。
背景技术
污染的大气中含有一系列毒性物质，如汽车尾气、燃煤废水和烟草烟雾的致癌潜力已在体内得到广泛研究。研究认为，污染大气中的多环芳烃(PAHs)是导致肺部氧化性疾病的重要原因。据报道，高接触含PAHs的混合物与随后的肺病发展之间存在相关性，许多国家提出了治理空气污染的目标，以实现减少有害气体的排放。苯并芘(BaP)是一种多环芳烃，可代谢为氧化物或醌，形成大量的活性氧(ROS)。据报道，BaP暴露可导致氧化应激、支气管上皮损伤、肺毒性和炎症。BaP暴露引起的氧化应激，可通过产生包括超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢和脂质过氧化物等。
然而，引起皮肤氧化和炎性损伤的因素有很多，现有的抗氧化以及抗炎药物不一定能够治疗或预防环境污染物导致的氧化损伤，尤其是苯并芘导致的氧化损伤。因此，开发一种具有抗环境污染物苯并芘导致的氧化损伤活性的化合物，对于开发具有针对性的抗氧化产品，具有重要的应用价值。
发明内容
鉴于现有技术对于具有抗环境污染物苯并芘导致的氧化损伤活性的化合物的研究不足；本发明首先提供一种全新结构的活性环肽，经进一步研究表明，所述的活性环肽具有抗环境污染物苯并芘导致的氧化损伤活性。
本发明的详细技术方案如下：
本发明的第一方面提供一种活性环肽，其具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构：
Figure BDA0002953912130000011
Figure BDA0002953912130000021
优选地，式Ⅰ所示的活性环肽是由具有SEQ ID No.1(Trp-Leu-His-Val)所示的线性肽首尾连接环化而成；
式Ⅱ所示的活性环肽是由具有SEQ ID No.2(Pro-Asp-Ile-Phe)所示的线性肽首尾连接环化而成。
在本发明中，式Ⅰ所示结构的活性环肽命名为双歧杆菌环肽-1(简写为SP-1)。所述的双歧杆菌环肽-1的氨基酸序列为：Cycle-[Trp-Leu-His-Val]；其未成环的线性氨基酸序列可以为序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
在本发明中，式Ⅱ所示结构的活性环肽命名为啤酒酵母环肽-1(简写为PP-1)。所述的啤酒酵母环肽-1的氨基酸序列为：Cycle-[Pro-Asp-Ile-Phe]；其未成环的线性氨基酸序列可以为序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
所述的双歧杆菌环肽-1以及啤酒酵母环肽-1可以从双歧杆菌或啤酒酵母中分离纯化得到；也可以按照实施例中的方法人工合成得到。
本发明的第二方面，提供一种活性环肽组合物，其包含式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽。
发明人在经大量的实验研究中发现，含式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽组合后，表现出协同抗环境污染物苯并芘导致的氧化损伤活性；然而并不是所有的活性环肽进行组合都能体现出协同抗环境污染物苯并芘导致的氧化损伤活性；这是本发明的另一重大研究成果。
优选地，式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽的摩尔比为 1～10:1～10。
进一步优选地，式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽的摩尔比为1～5:1～5。
最优选地，式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽的摩尔比为 1:1。
本发明的第三方面，提供上述活性环肽或活性环肽组合物在制备具有抗氧化作用或抗衰老作用的产品中的应用。
优选地，所述的抗氧化作用具体是指抗环境污染物导致的氧化损伤作用。
优选地，所述的抗衰老作用具体是指抗环境污染物导致的衰老作用。
进一步优选地，所述的环境污染物为苯并芘。
优选地，所述的产品为化妆品、护肤品、食品、保健品或药物。
进一步优选地，所述化妆品或护肤品包括乳液、霜膏、凝胶、水剂、油剂、粉剂或面膜。
进一步优选地，所述食品、保健品或药物的形式包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂。
有益效果：
(1)本发明提供了全新结构的活性环肽双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1。试验结果表明活性环肽双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1可以明显提高BaP辐照线虫后的生存周期；这说明本发明全新结构的双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1具有优异的抗氧化作用以及抗衰老作用；尤其是具有优异的抗BaP导致的氧化损伤作用以及抗BaP导致的衰老作用。(2)进一步研究表明，双歧杆菌环肽-1 和啤酒酵母环肽-1的组合物对BaP辐照线虫后的生存周期提升具有明显的提升作用；其提升作用大于单独使用双歧杆菌环肽-1或啤酒酵母环肽-1；这说明双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1组合后具有协同抗BaP导致的氧化损伤作用以及具有协同的抗BaP导致的衰老作用。(3)更进一步地，双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1的组合物可通过降低秀丽隐杆线虫体内BaP诱导的ROS过量产生及抗氧化酶活力下降，抑制脂褐素的产生，促进相关抗氧化基因的表达，达到抗氧化损伤的目的。进一步的研究发现双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1的组合物可通过调控DAF-16相关基因表达发挥抗BaP暴露导致的氧化损伤活性。(4)由于活性环肽双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1具有优异的抗氧化活性，因此，活性环肽双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1可以作为抗氧化剂使用，在美容产品、护肤产品、食品或药物中具有广泛的应用前景。(5)此外，本发明所述的全新的活性环肽双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1可以采用从长双歧杆菌或啤酒酵母中分离得到，来源丰富；且活性环肽双歧杆菌环肽-1为短肽和啤酒酵母环肽 -1为小分子化合物，制备工艺简单、操作方便，制得的活性环肽及化合物纯度高，有利于其在食品、药品、保健品和化妆品中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是SP-1的质谱图。
图2是SP-1的高效液相色谱测定结果图。
图3是PP-1的质谱图。
图4是PP-1的高效液相色谱测定结果图。
图5是SP-1、PP-1以及ZHT对BaP导致的氧化损伤以及对BaP导致的衰老的影响结果图；其中，图5A为SP-1、PP-1以及ZHT对BaP暴露的线虫体内 ROS影响实验结果图；图5B为SP-1、PP-1以及ZHT对BaP暴露的线虫体内 SOD影响实验结果图；图5C为SP-1、PP-1以及ZHT对BaP暴露的线虫体内 MDA影响实验结果图；图5D为SP-1、PP-1以及ZHT对BaP暴露的线虫体长以及细胞内脂褐素的含量的影响实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1活性环肽双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1的分离
将50g双歧杆菌用400mL乙酸乙酯和1000mL水混合均匀，静置后萃取得到水相层，多次重复萃取过程，将水相层进行真空低温冻干，再经制备型HPLC 进行制备分离，得到活性环肽双歧杆菌环肽-1(SP-1)。
将50g啤酒酵母用400mL乙酸乙酯和1000mL水混合均匀，静置后萃取得到水相层，多次重复萃取过程，将水相层进行真空低温冻干，再经制备型HPLC 进行制备分离，得到啤酒酵母环肽-1(PP-1)。
上述制备型HPLC的制备条件为：以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，以 0.1％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相A，流动相A：流动相B＝60:40，测波长为310 μm。由图2和图4可以看出活性环肽双歧杆菌环肽-1(SP-1)和啤酒酵母环肽-1 (PP-1)出峰时间分别为5.315min和14.612min。
实施例2活性环肽双歧杆菌环肽-1及的活性环肽啤酒酵母环肽-1化学合成
(1)取100mg Fmoc-Trp Wang Resin置于固相合成管中，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)后静置使树脂充分溶胀，滤去溶剂，再加入哌啶DMF溶液，振荡后滤出溶剂。将Fmoc-Leu-OH、1-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯溶于DMF中，再加入N,N-二异丙基乙胺混匀避光后即已被活化，并加入树脂中，25℃下氮气吹动搅拌2小时，经抽滤后用DMF和二氯甲烷依次洗涤并抽干溶剂。重复上述步骤，将活化好的Fmoc-His-OH、Fmoc-Val-OH依次加入树脂中，25℃氮气吹动搅拌2小时，反应完全后洗涤树脂，将得到的滤液进行减压蒸除溶剂得沉淀物Z-1，接着将Z-1用TFA溶液切除树脂得到游离的-OH端，水浴40℃下减压蒸除TFA得到的固体加入乙酸乙酯中，并与等摩尔量的对硝基酚混合，以DCC为缩合剂制备得到对硝基酚活性酯Z-2，接着将Z-2 用哌啶DMF溶液脱除保护基Fmoc,游离出N端，除去多余溶剂得粗肽固体后加入碱Na2CO3,，溶剂二氧六环，配成10-3-10-4稀溶液，在25℃下反应5小时即可，有机相水浴40℃下旋蒸除去溶剂并经冷冻干燥后即得活性环肽双歧杆菌环肽-1 (SP-1)，其氨基酸序列为Cycle-[Trp-Leu-His-Val]。
(2)取100mg Fmoc-Pro Wang Resin置于固相合成管中，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)后静置使树脂充分溶胀，滤去溶剂，再加入哌啶DMF溶液，振荡后滤出溶剂。将Fmoc-Asp-OH、1-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯溶于DMF中，再加入N,N-二异丙基乙胺混匀避光后即已被活化，并加入树脂中，25℃下氮气吹动搅拌2小时，经抽滤后用DMF和二氯甲烷依次洗涤并抽干溶剂。重复上述步骤，将活化好的Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH依次加入树脂中，25℃氮气吹动搅拌2小时，反应完全后洗涤树脂，将得到的滤液进行减压蒸除溶剂得沉淀物Z-1，接着将Z-1用TFA溶液切除树脂得到游离的-OH端，水浴40℃下减压蒸除TFA得到的固体加入乙酸乙酯中，并与等摩尔量的对硝基酚混合，以DCC为缩合剂制备得到对硝基酚活性酯Z-2，接着将Z-2 用哌啶DMF溶液脱除保护基Fmoc,游离出N端，除去多余溶剂得粗肽固体后加入碱Na2CO3,，溶剂二氧六环，配成10-3-10-4稀溶液，在25℃下反应5小时即可，有机相水浴40℃下旋蒸除去溶剂并经冷冻干燥后即得活性环肽啤酒酵母环肽-1 (PP-1)，其氨基酸序列为Cycle-[Pro-Asp-Ile-Phe]。
将上述活性环肽双歧杆菌环肽-1和啤酒酵母环肽-1利用质谱对其进行测定，其中质谱测定条件为ESI正离子模式毛细管电压3kV，锥孔电压50V，萃取电压5V，脱溶剂温度350℃，雾化气流350L/h；高效液相色谱测定条件为采用 Boston Green ODS-AQ色谱柱(250*4.6mm)，以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相 A，以0.1％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相A，流动相A：流动相B＝50:50，流速为1mL/min，检测波长为310μm，进样量10μL。
根据质谱数据(见图1)：m/z 536.2996是[M+H]+离子；m/z 437.2300是 [M-Val+H2O+H]+离子；m/z 423.2135是[M-Leu+H2O+H]+离子；m/z 300.1709是 [Trp-Leu-2H2O+H]+离子；m/z 251.1502是[Leu-His-2H2O+H]+离子；m/z 159.0913 是[Trp-COOH+H]+离子；m/z110.0717是[His-COOH+H]+离子；m/z 86.0970是[Leu-COOH+H]+离子。进一步的经过Edman降解方法及结合质谱数据可以确定，双歧杆菌环肽-1(SP-1)的氨基酸序列为Cycle-[Trp-Leu-His-Val]，即式Ⅰ所示的化学结构；
根据质谱数据(见图3)：m/z 473.2396是[M+H]+离子；m/z 360.1557是 [M-Ile+H2O+H]+离子；m/z 213.0865是[Pro-Asp-2H2O+H]+离子。进一步的经过 Edman降解方法及结合质谱数据可以确定，啤酒酵母环肽-1(PP-1)的氨基酸序列为Cycle-[Pro-Asp-Ile-Phe]，即式Ⅱ所示的化学结构。
实验例
为了评估本发明双歧杆菌环肽-1(SP-1)和啤酒酵母环肽-1(PP-1)及ZHT (ZHT为SP-1及PP-1按摩尔比1:1组成的组合物)的生物活性，进行如下效果实施例。
线虫寿命实验：取10条妊娠成虫置于NGM平板上，接种大肠杆菌OP50，产卵5h，获得同步种群。然后，移除产卵线虫，将平板放回20℃，直到子代到达L4幼虫。在实验的第0天，将L4幼虫线虫转移到含有BaP(0.10mM)、BaP (0.10mM)+SP-1(0.10mM)、BaP(0.10mM)+PP-1(0.10mM)以及BaP(0.10mM) +ZHT(0.10mM)的35mm NGM平板上，同时设置空白对照组，每天计数。采用三重平板法，每组线虫数≥80条，重复3次以上。
氧化应激试验：用L4幼虫线虫在20℃下评估其抗BaP导致的氧化应激实验。线虫在含有1.0mM BaP的处理板上孵育1天，然后转移到含有SP-1(0.10mM)、 PP-1(0.10mM)以及ZHT(0.10mM)的制备的NGM/OP50板上。
抗氧化酶活性和活性氧水平测量：用1.0mM BaP孵育3日龄线虫12h，然后移入新鲜制备的含有SP-1(0.10mM)、PP-1(0.10mM)以及ZHT(0.10mM) 的NGM/OP50平板上孵育24h，然后收集所有线虫，用PBS洗涤3次。随后，使用试剂盒测定SOD活性和丙二醛(MDA)含量。使用活性氧特异性荧光探针 DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量。
体长和脂褐素分析：将3日龄线虫与1.0mM BaP孵育12h，然后转移到新鲜制备的含有SP-1(0.10mM)、PP-1(0.10mM)以及ZHT(0.10mM)的NGM/OP50 平板上。第5天，将线虫置于载玻片上1％琼脂糖垫上，用NaN3(20μM)麻醉。在荧光显微镜下观察线虫。用Image J 8.5软件测定线虫的荧光强度和体长。
实验结果如下：
线虫寿命实验结果见表1：
表1.SP-1、PP-1以及ZHT对BaP暴露导致的线虫寿命的影响
Figure BDA0002953912130000071
从表1实验中可以看出，与对照组相比，BaP组的平均寿命仅仅为对照组的72％，这说明BaP暴露会导致线虫寿命的缩短加速线虫的衰老；然而SP-1组以及PP-1组可以显著提升BaP暴露后线虫的寿命，其平均寿命分别提升至对照组的81.5％和82.9％；这说明本发明所述的双歧杆菌环肽-1(SP-1)和啤酒酵母环肽-1(PP-1)可以显著延长BaP暴露后的线虫的寿命，可以有效抑制BaP暴露导致的衰老以及抗BaP导致的氧化损伤；可以用于制备具有抗衰老作用或抗氧化作用的化妆品、护肤品、食品、保健品或药物。
尤其是，从表1中可以看出，ZHT组其对可以进一步提升BaP暴露后线虫的寿命，其平均寿命分别提升至对照组的92.9％，均高于SP-1组以及PP-1组；这说明双歧杆菌环肽-1(SP-1)和啤酒酵母环肽-1(PP-1)组合后可以发挥协同抗衰老作用以及抗氧化作用。
自由基理论认为活性氧参与包括慢性炎症性疾病在内的诸多病理过程。据报道，BaP暴露引起的炎症性皮肤病和皮肤癌都与氧化应激有关。然而，抗氧化剂构成了一个主要的细胞防御氧化应激和保护膜组件免受损伤系统。研究还表明，寿命的延长往往与抗氧化应激能力的增强有关。因此，我们进一步探讨SP-1、 PP-1以及ZHT增强线虫对BaP暴露的抗性是否伴随ROS清除活性的提高。我们通过DCFH-DA分析方法评估线虫体内ROS水平。
如图5A所示，与对照组相比，BaP暴露使ROS水平升高237％(p<0.05)。在经SP-1、PP-1以及ZHT处理后，ROS水平分别降低了12.8％(p<0.05)、20.5％ (p<0.05)和37.1％(p<0.01)。这说明SP-1、PP-1具有ROS清除能力，尤其是ZHT，其ROS水平降低程度均大于SP-1和PP-1；这表明双歧杆菌环肽-1(SP-1) 和啤酒酵母环肽-1(PP-1)组合后可以发挥协同清除ROS作用。
SOD活性和MDA含量是氧化应激的重要指标。如图5B和5C所示，暴露于BaP后，SOD活性显著降低(与对照组相比降低了66.7％)。BaP暴露组MDA 含量比对照组高75.2％。然而，不同于BaP暴露，SP-1、PP-1以及ZHT表现出显著的抗氧化应激活性；尤其是ZHT，其表现出最优异的抗氧化应激活性，其抗氧化应激活性均大于SP-1和PP-1；与BaP组相比，经ZHT处理后，SOD活性提高150％(p<0.01)，MDA含量降低32.4％(p<0.01)。这表明，双歧杆菌环肽-1(SP-1)和啤酒酵母环肽-1(PP-1)具有抗BaP导致的氧化损伤活性；尤其是双歧杆菌环肽-1(SP-1)和啤酒酵母环肽-1(PP-1)组合后可以发挥协同的抗BaP导致的氧化损伤活性。
寿命的延长通常伴随着其他生理指标的下降，因此，我们比较了BaP、SP-1、 PP-1和ZHT处理的线虫体长。结果表明，BaP、SP-1、PP-1和ZHT并未影响线虫的体长(图5D)。
衰老的一个特点是细胞内积累高度氧化和交联的蛋白质，称为脂褐素。脂褐素是不溶性的，不能被溶酶体酶或蛋白酶体系统降解。如图5D所示，BaP组的脂褐素积累量大于对照组。BaP暴露下，线虫脂褐素含量比对照组高59.2％。而在SP-1、PP-1和ZHT下处理的线虫中脂褐素含量比BaP组低28.1％、32.5％以及55.2％。这说明双歧杆菌环肽-1(SP-1)和啤酒酵母环肽-1(PP-1)具有抗BaP 导致的衰老作用；尤其是ZHT下处理的线虫中脂褐素含量降低的幅度远远大于 SP-1或PP-1，这说明双歧杆菌环肽-1(SP-1)和啤酒酵母环肽-1(PP-1)组合后发挥协同抗BaP导致的衰老作用。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 深圳海创生物科技有限公司
<120> 一种活性环肽、活性环肽组合物及其在制备具有抗氧化作用或抗衰老作用的产品中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Trp Leu His Val
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Pro Asp Ile Phe
1

Claims (9)

1.一种活性环肽，其特征在于，具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构：
Figure FDA0002953912120000011
2.一种活性环肽组合物，其特征在于，包含式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽。
3.根据权利要求2所述的活性环肽组合物，其特征在于，式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽的摩尔比为1～10:1～10。
4.根据权利要求2所述的活性环肽组合物，其特征在于，式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽的摩尔比为1～5:1～5；最优选地，式Ⅰ所示结构的活性环肽和式Ⅱ所示结构的活性环肽的摩尔比为1:1。
5.权利要求1～4任一项所述的活性环肽或活性环肽组合物在制备具有抗氧化作用或抗衰老作用的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗氧化作用具体是指抗环境污染物导致的氧化损伤作用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗衰老作用具体是指抗环境污染物导致的衰老作用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的环境污染物为苯并芘。
9.根据权利要求5～8任一项所述的应用，其特征在于，所述的产品为化妆品、护肤品、食品、保健品或药物。
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