CN114315966A - 一种益生菌活性肽、益生菌活性肽组合物及其在制备具有抗衰老作用的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域，具体公开了一种益生菌活性肽、益生菌活性肽组合物及其在制备具有抗衰老作用的产品中的应用。所述的益生菌活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。实验结果表明本发明所述的益生菌活性肽具有优异的抗衰老作用；因此，本发明所述的益生菌活性肽可作为抗衰老活性物使用，在食品、保健品、化妆品或药物中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种益生菌活性肽、益生菌活性肽组合物及其在制备具有抗衰老作用的产品中的应用。
背景技术
衰老是机体各种生化反应综合作用的体现，其本质是正常状况下生物发育成熟后，随年龄增大，自身机能减退，机体内环境稳定性与应激能力下降，结构、功能逐步退行性改变的不可逆过程。自由基氧化应激、炎症性衰老、免疫衰老、肠道菌群失调等均是引发衰老的相关机制。
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。研究表明，益生菌具有抗衰老作用，益生菌对衰老的作用主要体现在对肠道微生物群的积极调节、免疫调节和寿命延长的作用。
活性肽在人的生长发育，新陈代谢，疾病以及衰老，死亡的过程中起着关键作用，因此生物活性肽拥有许多生物学特性，主要有抵抗细菌和病毒,提高免疫能力、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、抗衰老等。例如：谷胱甘肽(GSH)和肌肽(β-Ala-His)，研究发现，肌肽能够抑制人体纤维原细胞生长，同时具有逆转人体细胞的老化进程。谷胱甘肽是一种含有巯基的三肽，它是生物体内的自由基清除剂。
目前，对益生菌中具有抗衰老作用的活性肽研究较少；因此筛选具有抗衰老活性的益生菌或从其中分离具有抗衰老生物活性的化合物具有重要的应用价值。
发明内容
鉴于此，本发明首先提供一种全新结构的益生菌活性肽，经进一步研究表明，所述的益生菌活性肽具有优异的抗衰老作用。
本发明的详细技术方案如下：
本发明首先提供了一种益生菌活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所示。
SEQ ID No.1的氨基酸序列为Phe-Arg-His-Ala-Leu-Ser；SEQ ID No.2的氨基酸序列为Glu-His-Gly-Glu-Tyr-Glu。
在本发明中，我们将具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的益生菌活性肽简写为BBP；将具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的益生菌活性肽简写为BAP。
本发明还提供了一种益生菌活性肽组合物，其通过包含如下步骤的方法制备得到：
(1)将短双歧杆菌冻干粉和水混合均匀，然后进行超声提取，得水相层；
(2)在水相层中加入正丁醇萃取除杂；
(3)正丁醇萃取完成后再加入乙酸乙酯萃取除杂；
(4)乙酸乙酯萃取完成后，将水相层冻干，用制备型HPLC进行制备即得所述的益生菌活性肽组合物。
优选地，步骤(1)中短双歧杆菌冻干粉和水的用量比为1g:8～15mL。
最优选地，步骤(1)中短双歧杆菌冻干粉和水的用量比为1g:10mL。
优选地，超声提取时间为10～20分钟。
优选地，步骤(2)中正丁醇萃取的次数为1～3次；每次萃取时正丁醇的体积用量为水相层体积的0.5～1倍。
优选地，步骤(3)中乙酸乙酯萃取的次数为1～3次；每次萃取时乙酸乙酯的体积用量为水相层体积的0.5～1倍。
优选地，步骤(4)中制备型HPLC的条件为：以0.2％三氟乙酸水溶液为流动相A，以0.2％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；测波长为310μm；进行梯度洗脱；
所述的梯度洗脱条件为：0～5min，流动相B的体积变化为0～30％；5～9min，流动相B的体积变化为30～43％；9～16min，流动相B的体积为43％；收集在9min～16min时间段洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的益生菌活性肽组合物。
发明人在研究过程中惊奇的发现：通过上述梯度洗脱，收集在9min～16min时间段洗脱下来的流份，浓缩干燥后得到的益生菌活性肽组合物，其中含有大量的抗衰老活性成分(其不仅包含在11.95min和15.78min洗脱出来的SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的益生菌活性肽，还包含其它活性成分)，其抗衰老作用要好于SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的益生菌活性肽。
本发明还提供上述益生菌活性肽或益生菌活性肽组合物在制备具有抗衰老作用的产品中的应用。
优选地，所述的产品为食品、保健品、化妆品或药物。
有益效果：(1)本发明提供了一种全新的具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的益生菌活性肽和具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的益生菌活性肽。实验结果表明所述的益生菌活性肽可以明显增强秀丽隐杆线虫的运动能力及抗衰老能力、延缓秀丽隐杆线虫的衰老。这说明本发明所述的益生菌活性肽具有优异的抗衰老作用。(2)进一步地，通过本发明所述方法制备得到的益生菌活性肽组合物，其抗衰好作用要好于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的益生菌活性肽或具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的益生菌活性肽；这可能是采用本发明所述方法制备得到的益生菌活性肽组合物，其中含有大量的具有优异抗衰老活性的益生菌活性肽。(3)由于本发明所述的益生菌活性肽具有优异的抗衰老活性。因此，本发明所述的益生菌活性肽可作为抗衰老活性物使用，在食品、保健品、化妆品或药物中具有广泛的应用前景。(4)本发明所述的益生菌活性肽可以采用从短双歧杆菌或动物双歧杆菌分离得到或者人工全合成得到，来源丰富，有利于其在食品、保健品、化妆品或药物中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是BBP的MS图。
图2是BBP的HPLC图。
图3是BAP的MS图。
图4是BAP的HPLC图。
图5是BAP及BBP延长秀丽隐杆线虫寿命结果图。
图6是BAP及BBP增强秀丽隐杆线虫体内抗氧化酶活性结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1本发明益生菌活性肽的制备
将100g短双歧杆菌冻干粉和1000mL水混合均匀，超声提取10分钟然后得水相层；在水相层中先加入正丁醇萃取(萃取次数为3次，每次正丁醇的用量为1000mL)；再加入乙酸乙酯萃取(萃取次数为3次，每次乙酸乙酯的用量为1000mL)；最后将水相层进行冻干；再经制备型HPLC进行制备分离，具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的益生菌活性肽和具有SEQID No.2所示氨基酸序列的益生菌活性肽。
制备型HPLC的条件是：以0.2％三氟乙酸水溶液为流动相A，以0.2％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；测波长为310μm；进行梯度洗脱：0～5min，流动相B的体积变化为0～30％；5～9min，流动相B的体积变化为30～43％；9～16min，流动相B的体积为43％。SEQ IDNo.1所示氨基酸序列的益生菌活性肽和具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的益生菌活性肽分别为11.95min和15.78min。
将获得的两个益生菌活性肽用质谱分析其分子量及氨基酸组成：SCIEX500RQ-TOF质谱仪质量范围设为m/z 100-1500，以正模式采集Q-TOF-MS数据，MS分析条件为：CAD气体流量7L/min；干燥气体温度，550℃；离子喷涂电压，5500V；去聚电位，80V。软件生成的数据文件：SCIEX OS 1.0。
SEQ ID No.1所示氨基酸序列的益生菌活性肽的解析如下：基于质朴数据分析得，730.3992是[M+H]+离子，625.3592是y5离子，424.2099是b4离子，287.1499是b3离子，209.1040是b4-b2离子，110.0707是[His-COOH-H2O+H]+离子；最终，我们认定SEQ ID No.1所示氨基酸序列为Phe-Arg-His-Ala-Leu-Ser(简写为BBP)。
SEQ ID No.2所示氨基酸序列的益生菌活性肽的解析如下：基于质朴数据分析得，781.3146是[M+H2O+H]+离子，763.3050是[M+H]+离子，616.2372是y5离子，453.1622是[y4-H2O+H]+离子，324.1306是y3离子，267.1086是y2离子，249.0982是[y2-H2O+H]+离子；最终，我们认定SEQ ID No.2所示氨基酸序列为Glu-His-Gly-Glu-Tyr-Glu(简写为BAP)。
实施例2本发明益生菌活性肽组合物的制备
将100g短双歧杆菌冻干粉和1000mL水混合均匀，超声提取10分钟然后得水相层；在水相层中先加入正丁醇萃取(萃取次数为3次，每次正丁醇的用量为1000mL)；再加入乙酸乙酯萃取(萃取次数为3次，每次乙酸乙酯的用量为1000mL)；最后将水相层进行冻干；再经制备型HPLC进行制备分离，收集在9min～16min时间段洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的益生菌活性肽组合物(简写为BTP)。
制备型HPLC的条件是：以0.2％三氟乙酸水溶液为流动相A，以0.2％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；测波长为310μm；进行梯度洗脱：0～5min，流动相B的体积变化为0～30％；5～9min，流动相B的体积变化为30～43％；9～16min，流动相B的体积为43％。
实验例1
为了评估本发明益生菌活性肽及益生菌活性肽组合物的抗衰老作用，进行如下效果实施例。
将秀丽隐杆线虫至于培养皿中，分别加入BBP、BAP以及BTP(实施例2制备得到)，使其终浓度为1mg/mL，测定线虫寿命变化情况。
实验结果如下：
本研究发现(如图4所示)，BBP及BAP能够显著延长线虫的寿命，具有很好地抗衰老活性。其中，在相同作用浓度条件下，BTP延长线虫寿命的活性强于BBP及BAP。这说明采用本发明所述方法制备得到的益生菌活性肽组合物其抗衰老作用要优于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的益生菌活性肽或具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的益生菌活性肽；这有可能是本发明所述方法制备得到的益生菌活性肽组合物，其中含有大量的具有优异抗衰老活性的益生菌活性肽的缘故。
进一步的，抗氧化酶活性检测结果也显示，BBP及BAP均具有抗氧化酶活性；且BTP的抗氧化酶活性同样要好于BBP及BAP。这也证明了这采用本发明所述方法制备得到的益生菌活性肽组合物其抗衰老作用要优于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的益生菌活性肽或具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的益生菌活性肽。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种益生菌活性肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
2.一种益生菌活性肽组合物，其特征在于，通过包含如下步骤的方法制备得到：
(1)将短双歧杆菌冻干粉和水混合均匀，然后进行超声提取，得水相层；
(2)在水相层中加入正丁醇萃取除杂；
(3)正丁醇萃取完成后再加入乙酸乙酯萃取除杂；
(4)乙酸乙酯萃取完成后，将水相层冻干，用制备型HPLC进行制备即得所述的益生菌活性肽组合物。
3.根据权利要求2所述的益生菌活性肽组合物，其特征在于，步骤(1)中短双歧杆菌冻干粉和水的用量比为1g:8～15mL。
4.根据权利要求2所述的益生菌活性肽组合物，其特征在于，步骤(1)中短双歧杆菌冻干粉和水的用量比为1g:10mL。
5.根据权利要求2所述的益生菌活性肽组合物，其特征在于，超声提取时间为10～20分钟。
6.根据权利要求2所述的益生菌活性肽组合物，其特征在于，步骤(2)中正丁醇萃取的次数为1～3次；每次萃取时正丁醇的体积用量为水相层体积的0.5～1倍。
7.根据权利要求2所述的益生菌活性肽组合物，其特征在于，步骤(3)中乙酸乙酯萃取的次数为1～3次；每次萃取时乙酸乙酯的体积用量为水相层体积的0.5～1倍。
8.根据权利要求2所述的益生菌活性肽组合物，其特征在于，步骤(4)中制备型HPLC的条件为：以0.2％三氟乙酸水溶液为流动相A，以0.2％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B；测波长为310μm；进行梯度洗脱；
所述的梯度洗脱条件为：0～5min，流动相B的体积变化为0～30％；5～9min，流动相B的体积变化为30～43％；9～16min，流动相B的体积为43％；收集在9min～16min时间段洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的益生菌活性肽组合物。
9.权利要求1所述的益生菌活性肽或权利要求2～8所述的益生菌活性肽组合物在制备具有抗衰老作用的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的产品为食品、保健品、化妆品或药物。
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