CN111662360B - 一种龟小肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种龟小肽，具有如下任一种氨基酸序列：W‑W‑Y‑W‑R‑Hex；W‑G‑P‑G‑B；W‑R‑W‑X‑H‑T‑H‑N‑W。本发明还公开了所述龟小肽的一种制备方法及其应用。本发明能显著缩短小鼠的睡眠潜伏期和延长睡眠时间，有较好的促进睡眠作用，与现有的多肽相比，其结构组成明确，理化性质稳定，质量更加可控，功效更易于得到保障，而且还能通过合成方法制备，有利于减少资源浪费和降低生产成本。

Description

一种龟小肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种具有促进睡眠作用的龟小肽及其制备方法。

背景技术

失眠症状在人群中越来越常见，而睡眠不足会导致非常严重的健康问题，如抑郁症、心脏病、高血压和肥胖等。虽然目前广泛使用苯二氮卓受体类镇静催眠药物来诱导睡眠，但是这些药物的副作用非常明显，例如认知功能下降、记忆力丧失、长期使用会导致耐受和成瘾等。几十年来，睡眠调节已经成为一个世界性难题，人们迫切需要更加安全有效的催眠镇静药物，与此同时，具有镇静催眠作用的中草药材因其安全性和有效性逐渐被世界所接受，

龟板在我国一直被视为一种高价值中草药，《本草纲目》记载龟板具有解毒、抗炎、镇静、益脑等作用。研究表明，龟板提取物具有良好的抗氧化、抗高血压和抗菌作用。已有研究证实龟蛋白质和肽提取物具有抗氧化作用和免疫增强作用。此外，有许多内源性多肽都可以促进人脑睡眠，我们有理由认为龟板肽具有潜在的促进睡眠的生理功能。

目前对龟肽的研究主要集中在多肽，多肽是氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它通常由10个以上氨基酸缩合而成，而龟肽是龟板中具有一定生理活性的多肽类物质的总称。龟肽的制备经常采用的是蛋白酶解法，所获得的多肽产物虽然收率较高，但纯度不大，而且由于成分复杂导致无法通过人工合成。小肽是由10个以下氨基酸缩合而成，与多肽相比，小肽理化性质更加稳定，作用更加明确，而且可通过人工化学合成来制备，因此可减少资源浪费和降低生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有促进睡眠作用的龟小肽及其制备方法。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种龟小肽，所述龟小肽具有如下a1－a3中任一种氨基酸序列：

a1：W-W-Y-W-R-Hex(Hex代表己糖，即六碳糖，此处是己糖的糖基化修饰)；

a2：W-G-P-G-B；

a3：W-R-W-X-H-T-H-N-W。

所述龟小肽的制备方法，包括以下步骤：

1)从龟板中提取多肽；

2)将步骤1)获得的多肽用溶剂提取，提取液经微孔滤膜过滤，然后上制备型高效液相色谱仪进行分离制备，所述制备型高效液相色谱仪的色谱柱为YMC-Pack ODS-A柱，流动相A为0.05-0.2％(体积)三氟乙酸水溶液，流动相B为含有0.05-0.2％(体积)三氟乙酸的乙腈，梯度洗脱，流速是0.5-5mL/min。

优选地，步骤1)中所述多肽的提取方法包括以下步骤：

1)将龟板打碎，用1-6％体积浓度的醋酸浸泡05-2h，接着加水煎煮，过滤，收集煎煮液并浓缩，再加入石油醚萃取以除去脂溶性杂质，然后冷冻干燥得到蛋白提取物。

2)将蛋白提取物加入到pH 7.2-9.0的NaOH溶液中，再加入碱性蛋白酶，50-60℃水浴条件下酶解3-8h，然后煮沸使酶灭活，过滤，将滤液冷冻干燥得到多肽。

进一步优选地，所述碱性蛋白酶的加入量为NaOH溶液重量的0.8-1.5％。

优选地，所述梯度洗脱时间为60min，分为四个时间段，各时间段中流动相B的体积变化如下，0～9min，0％～9％；9～12min，9％～13％；12～20min，13％～26％；20～60min，26％～70％。

优选地，步骤2)中所述的溶剂为三氯乙酸、无水乙醇、氯化钠混合水溶液，每100ml混合水溶液中含有三氯乙酸6ml、无水乙醇14ml、氯化钠0.4g。

优选地，所述龟板为石金钱龟龟板。

所述的龟小肽在制备促进睡眠药物中的应用。

一种促进睡眠药物，其活性成分是以上所述的龟小肽。

本发明的有益效果是：本发明提供的龟小肽由10个以内氨基酸缩合而成，与从龟板中提取的总多肽相比，其结构组成明确，理化性质更加稳定，质量更加可控，功效更易于得到保障。本发明不仅能从龟板中提取制备，而且也能通过常规的方法人工合成，从而有利于减少资源浪费和降低生产成本。本发明所提供的制备方法能达到95％以上纯度，所提供的小肽能显著缩短小鼠的睡眠潜伏期和延长睡眠时间，证明有较好的促进睡眠作用，具有用于制备改善睡眠保健食品或治疗失眠药品的潜力。

附图说明

图1是质谱分析的总离子流图。

图2是肽段W-R-W-X-H-T-H-N-W的质谱图。

图3是肽段W-G-P-G-B的质谱图。

图4是肽段W-W-Y-W-R-Hex的质谱图。

图5是肽段W-G-X-B的质谱图。

图6是肽段W-N-A-R-W-P-G-J的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一、多肽的提取

(1)石金钱龟龟板经打碎后，用4％体积浓度的醋酸浸泡1h，接着加水煎煮，过滤，收集煎煮液并浓缩，浓缩液经石油醚萃取以除去脂溶性杂质，然后将水相冷冻干燥得到蛋白提取物。

(3)将蛋白提取物冻干粉按照1:25(g/mL)的固液比添加到pH 7.5的NaOH溶液中，再按NaOH溶液重量的1.2％加入碱性蛋白酶，55℃水浴条件下酶解6h，然后煮沸使酶灭活，过滤，将滤液浓缩并冷冻干燥得到多肽。

按照国家标准对最终产物的主要成分进行测定，结果见表1。

表1石金钱龟龟板多肽提取物的主要成分含量

成分	测试方法	含量(g/100g)
			多肽	GB/T 22492-2008(第一法)	72.16
糖类	GB 28050-2011	12.0
			水分	GB 5009.3-2016(第二法)	3.9
脂肪	GB 5009.6-2016(第二法)	0.0

以上结果可知，本发明制备的提取物多肽含量高，更有利于后续的进一步分离纯化。

二、功能肽段的分离和筛选

1.液质联用检测多肽组成

(1)样品预处理：取以上获得的1g石金钱龟龟板肽粉，加入6ml三氯乙酸、14ml无水乙醇、0.4g氯化钠，加水补充到100ml，混匀后37℃下超声10min，过滤，滤液经微孔滤膜过滤后用于分析。

(2)HPLC色谱条件:采用Inter Sustain AQ-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相：含有0.1％三氟乙酸的乙腈(B相)，0.1％三氟乙酸水溶液(A相)；流速0.8ml/min，浓度10mg/ml，进样量8μL，柱温30℃，检测波长215nm。梯度洗脱条件：0～9min，0％～9％B；9～12min，9％～13％B；12～20min，13％～26％B；20～60min，26％～70％B。质谱条件：采用高效液相色谱-电喷雾质谱-质谱联用仪(HPLC-ESI-QqTOF-MS/MS)分析，ESI离子源，离子模式采用正离子；其中干燥器温度为325℃；干燥器流速为10.0L/min喷雾器压力为40.00psi；喷雾电压3500V；质荷比扫描范围为200-1500(m/z)，结果见图1。

(3)用Peakview 2.2软件对质谱进行了分析。其中由肽键断裂形成的y系列离子和b系列离子在质谱图中最为常见且信号强度相对较大，对于肽链一级结构的鉴定，主要根据y、b系列碎片离子。一级质谱中寻找信号较强的峰判断分子离子峰，二级质谱对y、b离子信号进行分析，通过综合计算得出肽段氨基酸组成及顺序。

表2肽段质谱分析

图2－6分别是五种肽段的质谱图。

2.目标肽段的制备

利用制备型高效液相色谱柱对石金钱龟龟板多肽含量最高的几个主要肽段进行分离制备。将预处理后的多肽溶液配成1mg/mL浓度。用0.22μm的水相滤膜过滤，收集滤液。半制备柱为YMC-Pack ODS-A柱(250mm×10mm，5μm)，流速是2mL/min，柱温25℃。流动相：含有0.1％三氟乙酸的乙腈(B相)，0.1％三氟乙酸水溶液(A相)；流速0.8ml/min，浓度10mg/ml，进样量8μL，柱温30℃，检测波长215nm。梯度洗脱条件：0～9min，0％～9％B；9～12min，9％～13％B；12～20min，13％～26％B；20～60min，26％～70％B。按照色谱图洗脱时间点收集样品，为保证纯度，重复上述操作，进行二次制备。最终得到色氨酸-甘氨酸-羟脯氨酸-磷酸谷氨酸四肽(W-G-X-B)、色氨酸-甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-磷酸谷氨酸五肽(W-G-P-G-B)、色氨酸-色氨酸-酪氨酸-色氨酸-精氨酸-己糖五肽(W-W-Y-W-R-Hex)、色氨酸-精氨酸-色氨酸-羟脯氨酸-组氨酸-苏氨酸-组氨酸-天冬酰胺-色氨酸九肽(W-R-W-X-H-T-H-N-W)、色氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-精氨酸-色氨酸-脯氨酸-甘氨酸-γ氨基谷氨酸八肽(W-N-A-R-W-P-G-J)。

经旋转蒸发仪浓缩去除溶剂冻干，获得肽段单体粉末，后续进行活性比较。

3.五种肽段产物的纯度检测

采用高效液相色谱法对分离制备的5个肽段单体进行纯度分析，经过峰面积计算，5个肽段单体的纯度均大于95％。

实施例2动物实验评价不同多肽段单体的促睡眠作用

选用SPF级昆明种雄性小白鼠，体重为18±2g。动物实验室为SPF清洁级，饲养条件为环境温度25±1℃，湿度60±10％，光照/黑暗为12/12，自由摄食和饮水。适应性喂养3天后，将实验动物分组为：空白对照组、W-G-X-B组、W-G-P-G-B组、W-W-Y-W-R-Hex组、W-R-W-X-H-T-H-N-W组、W-N-A-R-W-P-G-J组，每组均有10只小鼠。在保证正常饮食饮水的条件下，每天早上8点对所有小鼠进行断粮处理，9点开始灌胃。空白组灌胃0.9％生理盐水，四个多肽段单体组小鼠分别灌胃50mg/kg·d相应的多肽单体样品溶液，连续14天。最后一天灌胃结束2小时后，所有小鼠腹腔注射45mg/kg戊巴比妥钠水溶液，观察各组小鼠睡眠潜伏期及睡眠时间。

表3不同肽段对小鼠睡眠潜伏期及睡眠时间的影响

分组	小鼠入睡率	睡眠潜伏期(min)	睡眠时间(min)
				空白对照组	100％	5.679±0.766	38.25±7.223
W-G-X-B	100％	5.511±0.512	40.92±4.711
				W-G-P-G-B	100％	4.596±0.767*	64.49±6.498**
W-R-W-X-H-T-H-N-W	100％	4.740±0.875*	53.99±6.218*
				W-W-Y-W-R-Hex	100％	4.315±0.397**	66.08±6.203**
W-N-A-R-W-P-G-J	100％	4.833±0.464*	47.01±5.336

注：与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。

以上结果表明，W-G-P-G-B、W-R-W-X-H-T-H-N-W、W-W-Y-W-R-Hex能显著缩短小鼠睡眠潜伏期并延长睡眠时间，证明具有较好的改善睡眠作用；W-N-A-R-W-P-G-J能缩短小鼠睡眠潜伏期，但在延长睡眠时间方面效果不够显著(p>0.05)；W-G-X-B对小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的影响与空白对照组相比都没有显著差异(p>0.05)。因此W-G-P-G-B、W-R-W-X-H-T-H-N-W、W-W-Y-W-R-Hex三种龟小肽具有用于制备改善睡眠保健食品或治疗失眠药品的潜力。

<110> 华中农业大学

<120> 一种龟小肽及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 石金钱龟(Mauremys mutica)

<400> 1

Trp Trp Tyr Trp Arg

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 石金钱龟(Mauremys mutica)

<400> 2

Trp Gly Pro Gly Asx

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 石金钱龟(Mauremys mutica)

<400> 3

Trp Arg Trp Xaa His Thr His Asn Trp

1 5

Claims (4)

1.一种龟小肽，其特征在于：所述龟小肽的氨基酸序列如以下a1－a3中任一种所示：

a1：W-W-Y-W-R-Hex，所述Hex代表己糖；

a2：W-G-P-G-B，所述B代表磷酸谷氨酸；

a3：W-R-W-X-H-T-H-N-W，所述X代表羟脯氨酸。

2.如权利要求1所述龟小肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将石金钱龟龟板打碎，4%醋酸浸泡1h，接着加水煎煮，过滤，收集煎煮液并浓缩，再加入石油醚萃取以除去脂溶性杂质，然后冷冻干燥得到蛋白提取物；

2）将蛋白提取物按照1:25的固液比加入到pH 7.5的NaOH溶液中，再按NaOH溶液重量的1.2%加入碱性蛋白酶，55℃水浴条件下酶解6h，然后煮沸使酶灭活，过滤，将滤液冷冻干燥得到多肽；

3）将步骤2）得到的多肽用溶剂提取，提取液经微孔滤膜过滤，然后上制备型高效液相色谱仪进行分离制备，所述制备型高效液相色谱仪的色谱柱为YMC-Pack ODS-A柱，流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为含有0.1%三氟乙酸的乙腈，梯度洗脱，流速是0.5-5 mL/min，

所述的溶剂为三氯乙酸、无水乙醇、氯化钠混合水溶液，每100ml混合水溶液中含有三氯乙酸6ml、无水乙醇14ml、氯化钠0.4g，

所述梯度洗脱的条件：0～9min，0%→9%B；9～12min，9%→13%B；12～20min，13%→26%B；20～60min，26%→70%B。

3.权利要求1所述的龟小肽在制备促进睡眠药物中的应用。

4.一种促进睡眠药物，其活性成分是权利要求1所述的龟小肽。

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