KR20150041298A

KR20150041298A - 진토닌을 유효성분으로 함유하는 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20150041298A
Application number: KR20130119646A
Authority: KR
Inventors: 나승열; 김현중
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2015-04-16

Abstract

본 발명은 형광물질-진토닌 컨쥬게이트를 제조하는 방법과 진토닌을 유효성분으로 함유하는 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 형광물질이 표지된 진토닌을 제조함으로써, 분자량이 작은 LPA(lysophosphatidic acid)에 형광물질을 표지하고 in vitro 및 in vivo 연구에서 진토닌의 타겟 세포 또는 장기와 작용 원리를 추적할 수 있는 효과가 있다.
또한, 인삼에서 분리한 당지질단백질인 진토닌을 유효성분으로 하여 뇌 해마에서 신경전구세포의 증식 및 신경세포의 신생을 촉진시킴으로써, 퇴행성 뇌신경질환을 예방 또는 치료하고 기억력 또는 학습능력을 개선시켜 주는 효과가 있다.

Description

진토닌을 유효성분으로 함유하는 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물{COMPOSITION COMPRISING GINTONIN FOR NEURAL PROGENITOR CELLS PROLIFERATION OR NEUROGENESIS IMPROVEMENT}

본 발명은 진토닌을 유효성분으로 함유하는 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물과 형광물질-진토닌 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것이다.

지금까지 인삼의 주요 생리학적, 약리학적 유효성분은 인삼 사포닌인 진세노사이드인 것으로 알려져 왔다. 그러나 최근 본 발명자들은 인삼으로부터 진세노사이드가 아닌 새로운 생리학적, 약리학적 유효성분인 단백질, 탄수화물 및 지방으로 구성된 새로운 당지질단백질(glycolipoprotein)을 순수 분리 동정하여 이를 진토닌(gintonin)으로 명명하고, 이들의 생리학적, 약리학적 효과에 관해 연구해 왔다.

관련 선행문헌으로 대한민국 등록특허 10-0973202(인삼에서 분리 동정한 신규한 당지질단백질 및 그 제조방법), 대한민국 공개특허 10-2013-0077267(구성 단백질이 인삼 메이저 라텍스 유사 단백질 및 인삼 리보뉴클레아제 유사 메이저 저장 단백질로 이루어진 진토닌), 대한민국 공개특허 10-2013-0030729(인삼에서 분리 동정한 당지질단백질 진토닌의 천연 약용식물 유래 리간드로서의 용도) 등이 있다.

선행문헌은 인삼에서 진토닌을 분리하는 방법, 진토닌을 이루는 구성 단백질 서열 및 진토닌의 LPA(lysophosphatidic acid) 수용체에 작용하는 리간드로서의 새로운 용도를 개시하고 있는 반면, 본 발명은 진토닌이 뇌 해마에서 신경전구세포를 증식시키고 신경세포 신생을 촉진시키는 새로운 용도에 관해 개시하고자 한다.

또한, 대한민국 등록특허 10-0517082(동위원소 표지방법)와 같이 수용체나 이온통로에 높은 친화성을 가지고 있는 단백질, 펩타이드 또는 다른 물질들에 동위원소(³H, ¹⁴C)를 표지(labeling)하여 in vitro 및 in vivo 연구에 널리 이용하여 왔다. 그러나 현재는 쓰고 남은 동위원소 폐기물의 처리, 환경 오염 및 동위원소의 인체 유해성 때문에 동위원소의 사용이 엄격하게 제한되고 있다.

이에, 최근에는 수용체 리간드에 동위원소로 표지하는 것 대신에 형광물질을 표지하는 방법이 다양한 분야(분자생물학, 면역학, 암연구, 핵의학 등)에서 널리 이용되고 있다. 동위원소로 표지된 LPA는 존재하더라도, LPA에 형광물질이 표지된 형광-LPA는 아직 알려지지 않고 있으며, LPA 자체는 분자량이 작기 때문에 형광물질을 표지하기가 쉽지 않다. LPA 수용체 리간드로 작용하는 진토닌에 형광물질을 표지할 경우, 형광물질이 표지된 진토닌이 LPA 수용체를 발현하는 세포에 선택적으로 결합하여 LPA 수용체를 발현하는 세포들과 발현하지 않는 세포들을 구분할 수 있는 장점을 제공할 것이다.

본 발명의 목적은 형광물질이 표지된 진토닌을 제조하여 분자량이 작은 LPA(lysophosphatidic acid)에 형광물질을 표지하는 방법을 제공하고, 인삼에서 분리된 당지질단백질인 진토닌을 유효성분으로 하여 뇌 해마에서 신경전구세포를 증식시키고 신경세포 신생을 촉진시켜 주는 조성물을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진토닌을 유효성분으로 함유하는 신경전구세포(Neural progenitor cells) 증식 또는 신경세포 신생(neurogenesis) 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 진토닌은 인삼속(Panax species) 식물의 뿌리, 줄기 또는 잎에서 분리된 것을 특징으로 한다.

상기 진토닌은 조성물 중량의 0.0001 내지 50 중량%로 함유된 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 일일 0.0001 내지 100 mg/kg의 진토닌을 섭취하도록 투여되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물을 함유하는 퇴행성 뇌신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물을 함유하는 퇴행성 뇌신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 상기 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물을 함유하는 기억력 또는 학습능력 개선용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물을 함유하는 기억력 또는 학습능력 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 진토닌은 구성 단백질이 인삼 메이저 라텍스 유사 단백질(major latex-like protein; MLP151)과 인삼 리보뉴클레아제 유사 메이저 저장 단백질(RNAse-like major storage protein)로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기 인삼 메이저 라텍스 유사 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지며 세 곳의 N-글리코실화 부위(N-glycosylation site)를 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 인삼 리보뉴클레아제 유사 메이저 저장 단백질은 서열번호 6 내지 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 인삼속(Panax species) 식물의 뿌리, 줄기 또는 잎에서 분리된 진토닌을 형광물질과 반응시켜 형광물질-진토닌 컨쥬게이트를 제조하고, 상기 형광물질-진토닌 컨쥬게이트를 LPA(lysophosphatidic acid) 수용체를 발현하는 세포에 결합시켜 LPA에 형광물질을 표지하는 방법을 제공한다.

상기 형광물질은 피레닌(Pyrene), 싸이아닌 2(Cyanine 2), GFP, 칼세인(Calcein), FITC, 알렉사(Alexa 488), FAM, 플로레씬 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플로레씬(Fluorescein), 로다민(Rhodamine 110), 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(Calcium Green), JOE, 싸이아닌 3(Cyanine 3), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), TRITC, TAMRA, 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin), 피로닌 Y(Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX, 칼슘크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red), 싸이아닌 5(Cyanine 5), 티아디카복시아닌(Thiadicarbocyanine) 및 이들의 유도체를 포함하는 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 진토닌과 형광물질은 1 : 3 내지 1 : 7의 당량비로 혼합하여 25 내지 45 ℃에서 반응시키는 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 형광물질이 표지된 진토닌을 제조함으로써, 분자량이 작은 LPA(lysophosphatidic acid)에 형광물질을 표지하고 in vitro 및 in vivo 연구에서 진토닌의 타겟 세포 또는 장기와 작용 원리를 추적할 수 있는 효과가 있다.

또한, 인삼에서 분리한 당지질단백질인 진토닌을 유효성분으로 하여 뇌 해마에서 신경전구세포의 증식 및 신경세포의 신생을 촉진시킴으로써, 퇴행성 뇌신경질환을 예방 또는 치료하고 기억력 또는 학습능력을 개선시켜 주는 효과가 있다.

도 1은 Cy3 계통 유도체인 FPR-552의 화학 구조.
도 2는 (A)는 단독 진토닌과 FPR552-진토닌 컨쥬게이트의 15% SDS-PAGE 비교(M; Molecular marker, 1; 4 ug, 2; 8 ug, 3; 16 ug 각각 로딩). 진토닌과 비교해 보았을 때 FPR552-진토닌 컨쥬게이트는 분자량에 큰 변화가 없음(진토닌 위치는 화살표로 표시). (B)는 FPR552-진토닌 컨쥬게이트의 스펙트로그램(1; 28 ug/ml, 2; 14 ug/ml, 3; 0 ug/ml). 최대 흡수 피크는 약 560 nm에서 관찰됨.
도 3은 FPR55-진토닌이 NPC에 결합함을 나타내는 사진 및 그래프. (A) 첫 번째 컬럼은 아무것도 처리하지 않은 NPC, 두 번째 컬럼은 형광물질로 표지되지 않은 진토닌을 전처리한 후 FPR552-진토닌을 처리, 세 번째 컬럼은 FPR552-진토닌을 처리한 공초점 레이저 현미경 사진. (B) FPR552-진토닌을 0, 1, 4 ug 처리하고 2 시간 후에 EDTA를 이용하여 세포 현탁액을 제조한 후 FACS 실시한 결과. NPC에 FPR552-진토닌 컨쥬게이트가 농도별로 다르게 결합함을 보여줌.
도 4는 NPC에서 진토닌에 의한 세포질내 칼슘 농도 [Ca²⁺]_i 변화 그래프.
도 5는 진토닌에 의한 NPC에서 LPA1/3 수용체 길항제, PLC 억제제 및 Ca²⁺ 킬레이터 BAPTA의 영향을 나타낸 그래프.
도 6은 NPC 증식에 대한 진토닌의 농도별 효과를 나타내는 그래프. 진토닌은 투여 농도별로 BrDU의 incorporation을 증가시키나, 10 ug/ml 이상 처리할 경우 세포 증식을 억제하는 것으로 나타남.
도 7은 (A) 여러 농도의 진토닌을 3 주간 경구 투여한 후 뇌 해마에서의 신경세포 신생 촉진을 확인하기 위하여 해마로 incorporation된 BrDU를 염색한 결과(a; 0, b; 25 mg/kg, c; 50 mg/kg, d; 100 mg/kg). (B) 신경세포에만 염색되는 NeuN 염색(green color)을 통하여 BrDU로 incorporation된 세포(red color)들이 신경세포임을 확인함. (C) 진토닌 100mg/kg 투여군에서 통계학적으로 신경세포 신생을 촉진하는 것으로 나타남(*p < 0.01, compared to saline).
도 8은 진토닌의 메탄올 추출 전과 후의 투석막 내부와 외부에 존재하는 성분에 대한 전기영동 후 쿠마시블루 염색 결과(lane 1; Molecular mark, lane 2; 메탄올 추출 전 진토닌, lane 3; 메탄올 추출 후 투석막 내부 투석액, lane 4; 메탄올 추출 후 투석막 외부 투석액).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 진토닌을 유효성분으로 함유하는 신경전구세포(Neural progenitor cells) 증식 또는 신경세포 신생(neurogenesis) 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 진토닌은 인삼속(Panax species) 식물의 뿌리, 줄기 또는 잎에서 분리된 것이 바람직하며, 진토닌의 분자량은 약 67 kDa이다.

상기 인삼속 식물로는 고려인삼(Panax ginseng), 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼(Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonicum), 삼엽삼(Panax trifolium), 히말라야삼(Panax pseudoginseng) 또는 베트남삼(Panax vietnamensis) 등이 있고, 가공여부와 생육환경에 따른 홍삼, 수삼, 백삼, 재배삼, 장뇌삼 또는 산삼 등도 이용 가능하다. 바람직하게는 4 내지 6년근 고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로 제조한 홍삼을 사용하는 것이 최적의 효과를 나타낸다.

상기 진토닌은 조성물 중량의 0.0001 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 50 중량%로 함유된 것이 최적의 효과를 나타낸다.

상기 조성물은 일일 0.0001 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 25 내지 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 50 내지 100 mg/kg의 진토닌을 섭취하도록 비경구 또는 경구 투여하는 것이 최적의 효과를 나타낸다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 질환의 진행 정도, 환자의 나이, 성별, 신체 상태, 투여 기간, 투여 방법, 환자의 체중, 식사, 배출 속도 등에 따라 용량을 달리하여 투여될 수 있다.

상기 조성물은 뇌 해마에서 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생을 촉진시킴으로써, 신경세포 감소에 의한 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료, 기억력 또는 학습능력의 개선에 효과가 있다.

상기 퇴행성 뇌신경질환은 신경세포사에 의해 유발되는 뇌졸중, 중풍, 기억력 상실, 기억력 손상, 치매, 건망증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크병, 크로이츠펠트-야콥병 등이 있다.

본 발명에 따른 진토닌은 구성 단백질이 인삼 메이저 라텍스 유사 단백질(major latex-like protein; MLP151)과 인삼 리보뉴클레아제 유사 메이저 저장 단백질(RNAse-like major storage protein)로 이루어진다.

상기 인삼 메이저 라텍스 유사 단백질(MLP151)은 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지며 세 곳의 N-글리코실화 부위(N-glycosylation site)를 갖는다.

서열번호 5;

mgltgklicq tgiksdgdvf helfgtrphh vpnitpaniq gcdlhegefg kvgsvviwny

sidgnamiak eeivaideed ksvtfkvveg hlfeefksiv fsvhvdtkge dnlvtwsidy

ekl nes vkdp tsyldfllsv trdieahhlp k

이때, 상기 서열 중 밑줄 친 부분은 단백질체학 분석을 통해 얻은 펩타이드 조각(서열번호 1~4)에 해당하는 부분이며, 이탤릭체 아미노산 부위는 N-글리코실화 되는 자리이다.

또한, 상기 인삼 리보뉴클레아제 유사 메이저 저장 단백질(RNAse-like major storage protein)은 서열번호 6 내지 10의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진다.

서열번호 11;

mraiyiisvi ivslsifswg gnarsdypwa mfalrlqwpa gfcevnnacd tksllntfti

hglypynakg tpalycdgta fdvnsvsdfl aemhlawpsh etntediqfw ehewkkhgrc

seallkqtdy frtalafrka fdivgllnqe giypnndlyr pkmikeaikk hlnavpeidf

tknenseyvl tdinvcvnqq atrfvdcptd datddyrlkf vrlpskmkfa dprtnsii

이때, 상기 서열 중 밑줄 친 부분은 단백질체학 분석을 통해 얻은 펩타이드 조각(서열번호 6~10)에 해당하는 부분이다.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말리톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌실내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품은 진토닌을 식품 중량의 0.01 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.3 내지 15 중량%로 함유하는 것이 최적의 효과를 나타내며, 건강음료조성물의 경우 100 ml를 기준으로 0.01 내지 5 g, 바람직하게는 0.03 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 건강기능식품은 진토닌 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며, 육류, 소시지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강 기능성 식품류 등으로 제조 및 가공될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 건강 기능성 음료조성물은 지시된 비율로 상기 진토닌을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 천연 탄수화물은 예를 들어, 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올 등이 있다. 또한, 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

진토닌에 형광물질을 표지함으로써, LPA 수용체 리간드로 작용하는 진토닌을 LPA 수용체를 발현하는 세포에 결합시켜 형광물질이 표지된 세포를 분리할 수 있고, 진토닌의 체내 분포 및 진토닌이 소실되는 배설 경로/시간을 규명하는데 활용하여 in vitro 및 in vivo 연구에서 진토닌의 타겟 세포 또는 장기와 작용 원리를 설명하는데 유용하게 이용될 수 있다.

상기 형광물질은 피레닌(Pyrene), 싸이아닌 2(Cyanine 2), GFP, 칼세인(Calcein), FITC, 알렉사(Alexa 488), FAM, 플로레씬 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플로레씬(Fluorescein), 로다민(Rhodamine 110), 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(Calcium Green), JOE, 싸이아닌 3(Cyanine 3), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), TRITC, TAMRA, 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin), 피로닌 Y(Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX, 칼슘크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red), 싸이아닌 5(Cyanine 5), 티아디카복시아닌(Thiadicarbocyanine) 및 이들의 유도체를 포함하는 군에서 1 이상을 선택하여 진토닌과 반응시킬 수 있고, Cy3 계통의 유도체(derivative) 또는 Cy5 계통의 유도체(derivative)인 것이 최적의 효과를 나타낸다.

상기 진토닌과 형광물질은 1 : 3 내지 1 : 7의 당량비로 혼합하여 25 내지 45 ℃에서 반응시키는 것이 바람직하다.

본 발명은 형광물질-진토닌 컨쥬게이트를 제조하여 LPA 수용체에 형광물질-진토닌 컨쥬게이트를 결합시켜 형광물질이 표지된 세포와 표지되지 않은 세포를 분리하였고, 진토닌이 배양된 해마의 신경전구세포 증식을 자극하고, 경구로 투여할 경우 뇌 해마 치상회(dentate gyrus)에서 신경세포 신생을 촉진시키는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예. 진토닌의 제조

한국인삼공사(대전, 한국)에서 구입한 6년근 홍삼(Panax ginseng C. A. Meyer) 분말 8 ㎏에 80~100 % 에탄올(w/v) 또는 메탄올 16 L를 가하여 80 ℃에서 8 시간 동안 환류냉각추출한 후, 진공여과하여 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3 회 반복하여 상층액을 모은 다음 감압농축하고(에탄올, 메탄올 추출물 각 1.3 ㎏ 수득), 각각의 에탄올, 메탄올 추출물에 대해 물과 n-부탄올의 혼합용매(1:1)(v/v)로 총 2 회 용매 분획하여 얻은 물과 n-부탄올의 분획물 중 n-부탄올 분획물을 진공농축하여 조총사포닌 분획(CGSF) 300 g씩을 수득하였다.

상기 조총사포닌 분획은 50 % 에탄올 또는 메탄올을 함유한 20 mM Tris-HCl(pH 8.2) 또는 20 mM Tris-HCl(pH 8.2)에 용해시킨 다음, 동일한 용매로 미리 충진된 DEAE 세파로스(sepharose) CL-6B 컬럼이 장착된 음이온 교환 크로마토그래피(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에 로딩하여 50 % 에탄올 또는 메탄올을 함유한 20 mM Tris-HCl(pH 8.2) 또는 20 mM Tris-HCl(pH 8.2)를 충분히 통과시켜 컬럼에 결합되지 않는 물질, 즉 음전하를 띠지 않는 진세노사이드 등과 기타 저분자 물질을 제거한 다음, 1 M NaCl이 함유된 50 % 에탄올 또는 메탄올 Tris-HCl(pH 8.2) 또는 1 M NaCl이 함유된 Tris-HCl(pH 8.2)를 통과시켜 음이온 교환수지 컬럼에 결합된 물질을 회수하였다. 이후, 상기 컬럼에 회수된 물질을 투석막(pore size 6,000~8,000)에 넣고 투석하여 염을 제거한 다음, 동결건조 또는 진공농축하여 조진토닌 16 g을 수득하였다(수율 0.20%).

준비예 1. 마우스 뇌 해마 신경 전구 세포(neural precursor cells, NPC) 배양

임신 14일째 되는 마우스 태아에서 뇌를 분리한 다음, 미세 현미경(binocular) 하에서 해마를 분리하였다. 분리된 해마를 모아 Shin et al., Exp Mol Med. 2002 Dec 31;34(6):401-410 방법에 따라 뇌 해마 신경 전구 세포를 배양하였다.

준비예 2. 실험동물 준비

ICR계 18~20 g, 4주령 웅성 마우스를 Koatech Co., Ltd.(한국)에서 구입하여 우리당 10 마리씩, 물과 사료를 자유 급식하면서 온도 23±1 ℃ 및 습도 55±5 %를 유지하고 명암주기는 12 시간으로 조절한 실험환경에 적응시킨 다음 실험에 착수하였다.

준비예 3. FPR552-진토닌 conjugate 제조

진토닌 1 당량 대비 FPR 552 Dye(BioActs사, Korea)(도 1)를 각각 5 당량씩 적용(Gintonin : FPR 552 = 1 : 5)하여 형광물질을 표지(labeling)하였다. 진토닌 표지를 위해 사용되는 완충요액(buffer)은 pH가 9.0인 1 M의 탄산염/중탄산염(carbonate/bicarbonate)이었다. 형광물질과 진토닌의 컨쥬게이트를 위한 반응은 36 ℃에서 4 시간 동안 진행하였다.

컨쥬게이션된 형광물질-진토닌은 Sephadex G-25 resin(PD-10 Column, GE Healthcare 社)으로 진토닌과 결합안된 free 형광물질들을 제거하였고, 용출용매는 PBS를 사용하였다. 형광물질-진토닌의 존재를 확인하기 위하여 15 % SDS-PAGE를 실시하여 확인하였다(도 2A). 또한, 형광물질-진토닌의 흡수파장을 검증하기 위하여 분광형광 광도계(spectrofluorophotometer, 시마츠사)로 확인하였다(도 2B).

실험예 1.

1-1. 배양된 뇌 해마 신경 전구 세포(Neural progenitor cells, NPC) 막에 존재하는 LPA 수용체에 대한 FPR552-진토닌 표지

NPC를 48 시간 배양한 후 FPR552-진토닌(1 μg/ml)을 2 시간 동안 처리하였다. 그리고 포르말린 10 % 용액으로 고정시킨 후 세포에 붙은, 혹은 들어간 진토닌을 제외한 나머지를 씻어낸 후 공초점 레이저 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)을 이용하여 사진을 찍었다.

도 3A에서 보는 바와 같이, 비교를 위해 FPR552-진토닌을 처리하지 않은 군(con)과 비교해 볼 때 FPR552-진토닌을 처리한 NPC는 빨간색으로 발색된 모습이 나타났다. 진토닌과의 경쟁적인 반응임을 증명하기 위해 FPR552-진토닌 처리 전에 보통의 진토닌(1 μg/ml)을 30 분간 처리한 후 동시에 FPR552-진토닌과 진토닌을 2 시간 동안 처리한 경우는 발색이 나타나지 않았다. 이는 진토닌이 수용기에 경쟁적으로 작용한다는 것을 의미한다.

1-2. FACS를 이용하여 배양된 뇌 해마 신경 전구 세포(Neural progenitor cells, NPC) 막에 존재하는 LPA 수용체에 대한 FPR552-진토닌이 표지(labeling)된 세포와 표지되지 않은 세포의 분리

NPC를 48 시간 동안 배양한 후 여기에 다양한 농도의 진토닌(1, 4 μg/ml)을 2 시간 동안 처리하였다. 그 후 2 mM의 ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) 용액을 5 분간 처리하여 세포를 디쉬에서 떼어낸 후 이를 원심분리하여 세포만 따로 취하여 PBS(Welgene, KOREA)에 녹여 FACS 실험에 알맞은 상태로 만들었다.

도 3B를 보면, FACS 실험 결과 FPR552-진토닌을 처리하지 않은 군(con)에 비해 진토닌 1 μg/ml 및 4μg/ml을 처리한 세포들은 파장이 확실히 분리되어 나옴을 확인할 수 있었다. NPC 막에 존재하는 LPA 수용체에 대한 진토닌의 결합이 표지되어 파장별 차이가 나타남을 의미한다.

1-3. 진토닌에 의한 신경 전구 세포(Neural progenitor cells, NPC)에서 세포질내 칼슘 변화 측정

NPC내 자유 칼슘 농도는 Fura-2 AM(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)이 로딩된 세포 현탁액의 dual excitation spectrofluorometric 분석을 통해 측정하였다. 세포는 HEPES 완충액(120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 10 mM 글루코오스, 25 mM HEPES, pH 7.4) 또는 Ca²⁺ free HEPES 완충액(120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM 글루코오스, 0.2 mM EGTA, 25 mM HEPES, pH 7.4)에서 검정하였다. 또한, 세포내 칼슘 농도의 변화는 Fura-2 AM 및 BAPTA-AM이 로딩된 세포 현탁액 내에서 실험하여, Grynkeiwicz 등의 방법에 따라 계산하였다(Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R. Y. (1985) A new generation of Ca²⁺ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450).

1-4. 배양된 뇌 해마 신경 전구 세포(Neural progenitor cells, NPC)에서 진토닌의 한 세포질내 칼슘농도 변화에 대한 영향

배양한 NPC를 트립신(trypsin, Sigma, USA) 처리하여 dish에 띄우고 원심분리한 후 Ca²⁺ HEPES 용액과 Fura-2 형광 dye(Sigma, USA)를 이용하여 세포 내의 Ca²⁺에 dye를 붙였다. 그 후 분광형광 광도계(Spectrofluorophotometer, Shimazu, Japan)를 이용하여 NPC에서의 Ca²⁺방출을 측정하였다.

도 4A는 NPC에 진토닌을 다양한 농도(0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 μg/ml)로 주었을 때, Ca²⁺의 방출을 측정한 결과이다. 농도의 증가에 따라 Ca²⁺의 방출이 증가함을 확인할 수 있었으며, 1 μg/ml 수준에서 포화가 일어남을 확인하였다. 도 4B는 진토닌 농도별 Ca²⁺의 방출을 Hill 상수를 이용하여 나타낸 그래프이다. 역시 1 μg/ml 수준까지 방출의 증가를 보이며 포화가 일어남을 알 수 있다.

1-5. 배양된 뇌 해마 신경 전구 세포(Neural progenitor cells, NPC)에서 진토닌의 한 세포질내 칼슘농도 변화에 대한 신호전달 연구

진토닌으로 인한 Ca²⁺농도의 증가가 어떤 신호전달을 통하는지 여러 가지 약물을 이용하여 실험한 결과를 도 5에 나타내었다.

(A) 진토닌 0.1 μg/ml를 처리하여 Ca²⁺농도의 증가를 확인한 후, LPA1/3 receptor antagonist인 Ki16425 (Cayman chemical company, USA) 10 μM을 3 분간 처리하고 다시 진토닌 0.1 μg/ml을 처리하였을 때, Ca²⁺농도 변화에 큰 차이가 없었다.

(B) 진토닌 0.1 μg/ml를 처리한 후 PLC inhibitor인 U73122 (5 μM)를 3 분간 처리하였다. 그 후 다시 진토닌 0.1 μg/ml을 처리하였을 때 Ca²⁺방출 효과가 나타나지 않았다.

(C) 배양한 NPC에 Ca²⁺ chelator인 BAPTA (10 μM)을 30 분간 처리한 후 세포를 떼어내고 위와 동일한 과정으로 세포를 준비하였다. 준비된 세포에 진토닌 0.1 μg/ml를 처리한 결과 Ca²⁺방출이 나타나지 않았다.

(D) 진토닌 0.1 μg/ml에 대한 Ki16425 10 μM, U73122 5 μM, BAPTA 10 μM의 영향을 히스토그램으로 그린 그래프이다. U73122와 BAPTA의 경우 p<0.01의 유의미한 결과가 나타났다. Ca²⁺의 방출이 PLC를 통해 일어남을 확인할 수 있었다.

1-6. 배양된 뇌 해마 신경 전구 세포(Neural progenitor cells, NPC)에서 진토닌에 의한 세포 증식에 대한 영향

BrdU Cell Proliferation ELISA Kit (chemiluminescent)(Roche, USA)를 이용하여 실험을 진행하였다.

96 well 배양 접시에서 NPC를 48 시간 동안 배양하였다. 그 후, N2 배지를 DMEM/F12 배지로 갈아 주고 12 시간 동안 배양하여 다양한 농도의 진토닌(0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 μg/ml)을 처리한 후, 24 시간 동안 배양하고 각 well 당 10 μM씩 BrdU 표지 용액을 첨가하여 다시 24 시간 동안 배양하였다. 이후, 고정액 처리를 하고 anti-BrdU-POD working solution을 각 well에 처리하여 90 분간 실온에서 반응시키고, Substrate solution을 실온에서 처리한 후 발광측정기(microplate luminometer)를 이용하여 빛 방출을 측정하였다.

도 6은 다양한 농도의 진토닌(0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 μg/ml)에 따른 BrdU 반응 정도를 control과 비교하여 히스토그램으로 정리한 그래프이다. 이를 보면 진토닌의 농도에 따라 BrdU 반응 역시 증가했으며 진토닌 농도 1 μg/ml을 기점으로 다시 감소하는 것을 알 수 있다.

1-7. 마우스에서 진토닌 경구 투여에 의한 뇌 해마에서의 신경세포 신생 촉진에 대한 영향

마우스는 BALB/c 6주령 수컷을 이용하였다. 3 주에 걸쳐 다양한 농도의 진토닌(0, 25, 50 100 mg/kg)을 경구투여하고, 희생시키기 4 일 전부터 매일 BrdU (Sigma, USA) 50 mg/kg을 정맥주사하고 마지막 날은 3 시간 간격으로 세번 준 후 희생시켰다. 위 방법은 Qiao C et al., Neurosci Res. 2005 Jan;51(1):31-8.의 방법을 기본으로 하여 약간 변형하여 적용하였다. 희생시킨 마우스들은 바로 10 % 포르말린으로 퍼퓨전을 거친 후 뇌를 따로 떼어내어 이를 알맞은 두께로 자르고, 자른 조직은 파라핀을 이용하여 고정시키고 고정시킨 조직은 두 가지 방법의 면역조직학적 염색을 이용하여 실험을 진행하였다.

도 7A는 mouse anti-BrdU primary Antibody (Santa cruz, USA) 및 HRP conjugated goat anti-mouse secondary antibody (Millipore, USA)를 이용하여 면역조직학적으로 분석한 것이다. (a)는 대조군, (b)는 진토닌 25 mg/kg, (c)는 진토닌 50 mg/kg, (d)는 진토닌 100mg/kg 처리군으로 진토닌군이 대조군에 비해 세포 신생이 촉진된 모습이 확인되었다. 또한, 진토닌의 농도가 증가할수록 세포 신생의 촉진 역시 증가하는 추세를 보였다.

도 7B는 신생이 일어난 세포가 신경세포인 것인지 확인을 위해 mouse anti-BrdU primary Antibody (Santa cruz, USA)와 신경 세포 표지 단백질인 NeuN antibody (Millipore, USA) 및 HRP conjugated goat anti-mouse secondary antibody (Millipore, USA)를 이용한 이중염색을 하여 공초점 레이저 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)으로 촬영하였다. 도 7C는 진토닌 농도별 BrdU-positive 세포 개수를 센 히스토그램을 나타낸다.

1-8. 진토닌의 단백질 서열 확인

진토닌을 메탄올 투석을 통해 지질 성분을 진토닌의 단백질 성분으로부터 분리한 뒤, 전기영동 후 염색된 단백질 밴드를 잘라 밴드의 조성을 단백질체학 분석방법(proteomic analysis method)으로 분석하였다.

(1) 진토닌의 메탄올 투석

인삼에서 진토닌을 분리하여(국내특허출원 제10-2010-0052913호 참조), 진토닌 200 ㎎을 100 %(w/v) 메탄올 10~15 ㎖에 용해한 후, 용해된 진토닌을 투석막(pore size: 6,000~8,000, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)에 넣어, 30~50 배 부피의 100 % 메탄올을 이용하여 48 시간 동안 투석하였다.

투석 중 메탄올은 2 번 교환해 주었으며, 투석 후에는 투석막 안에 남아있는 투석막 내부 투석액(inner dialysate)과 투석막 밖으로 나간 투석막 외부 투석액(outer dialysate)을 따로 농축 건조하여 정량하였다.

(2) In-gel tryptic digestion 실시

상기 수득한 투석막 안에 남아있는 성분(투석막 내부 투석액)을 건조시킨 다음 100 ㎍/㎖을 취득하여 10 % SDS-PAGE를 실시하였다.

도 8은 메탄올 투석 전후의 진토닌의 전기영동 후 쿠마시 블루 염색 결과를 나타낸 것이다.

메탄올 투석 전의 진토닌 밴드(band)는 넓게 퍼져(broad) 있으면서 밴드의 염색도 강하게 되지 않은 형태로 나타나지만(도 8의 2 lane), 메탄올 투석 후 진토닌의 전기영동 후 쿠마시 블루 염색을 한 경우에는 분자량의 큰 변화 없이 밴드는 넓게 퍼져 있으나 염색은 메탄올 투석전보다 훨씬 강하게 염색됨을 알 수 있었다(도 8의 3 lane). 한편, 메탄올 투석 후 투석막 밖으로 빠져 나간 성분(투석막 외부 투석액)들은 쿠마시 블루에 염색이 되지 않은 것으로 나타났다(도 8의 4 lane). 이는 진토닌의 지방 성분이 쿠마시 블루에 의한 단백질 염색에 영향을 미치고 있음을 시사한다.

쿠마시 블루 염색을 실시하여 염색된 단백질 부분을 겔(gel)로부터 잘라낸 뒤 25 mM 중탄산암모늄(ammonium bicarbonate)과 50 %(w/v) 아세토니트릴(acetonitrile)이 함유되어 있는 용액에서 세척하였다. 겔 조각(gel piece)은 다시 40 mM 중탄산암모늄, 10 %(w/v) 아세토니트릴 및 25 ㎍/㎖ 트립신(trypsin; Promega, Madison, WI, USA)에 넣은 후 37 ℃에서 18~20 시간 동안 배양하였다.

트립신 처리에 의하여 소화된 펩타이드는 50 mM 중탄산암모늄, 50 % 아세토니트릴과 5 %(w/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid; TFA)을 이용하여 2 회 추출하였다. 이때 얻어진 펩타이드 추출물(peptide extracts)을 합친 다음 진공 원심분리기에서 동결건조하였고, 사용하기 전에 4 ℃에서 저장하였다.

(3) 이온-이동도 분광분석(IM-MS) 분석

In-gel tryptic digestion 후 진토닌에 함유되어 있는 단백질 성분의 확인 동정은 서울 소재의 한국기초과학지원연구소에서 실시하였다(Ono et al Mol. Cell Proteomics Sci. 5, 1338-1347, 2006; Gao et al., Mol cell Proteomics Sci 7, 2399-2409, 2008).

상기 동결건조한 펩타이드를 0.1 % 포름산(formic acid) 20 ㎕에 녹인 후 NanoLockSpray 이온원(ion source)을 장착한 nanoACQUITY 초고압력 액체 크로마토그래피(ultrapressure liquid chromatography; UPLC)와 SynapQ-TOF(Time of fight) 질량분석계(mass spectrometer)를 이용하여 LC/MS^E로 분석하였다(Waters, Manchester, UK).

구체적으로, 재부유된 펩타이드(resuspended peptides; 5 ㎕)는 0.1 % 포름산이 있는 용액에서 5 분 동안 유량(flow rate) 10 ㎕/min의 조건으로 Waters Symmetry C18 trapping column(180 ㎛ i.d. × 20 ㎜ length with 5 ㎛ particle size)에 주입하였다. 펩타이드는 전치컬럼(pre-column)에서 용출되었고, 75 ㎛ i.d. × 250 ㎜ length column packed with BEH130 C18 레진(resin)과 1.7 ㎛ 입자크기(particle size; 용출속도 280 nl/min)인 조건에서 55 분 동안 선형 기울기(linear gradient) 3~45 %(w/v) B를 이용하여 분리하였다(A: 0.1 %(w/v) formic acid in water, B: 0.1 %(w/v) formic acid in acetonitrile). 컬럼은 90 %(w/v) B에서 25 분 동안 세척하였다.

사용한 컬럼은 다시 다음 실험 실시 전에 3 % B에서 20 분 동안 다시 평행에 이르도록 하였다. 모든 컬럼의 온도는 35 ℃로 조정하고, 실시하는 Mass accuracy는 400 fmol/㎛와 유량 500 nl/min을 유지하는 NanoACQUITY NanoLockSpray의 보조펌프(auxiliary pump)로 전달되는 펩타이드 [glu1]-피브리노펩타이드 B(fibrinopeptide B)를 통하여 검증하였다.

펩타이드는 양성 이온모드(positive ion mode)로 분석하였으며, 전형적인 분해능(typical resolving power) 10,000 fwhm를 지닌 v-모드에서 작동하도록 하였다. 분석에 앞서 TOF 분석기(analyzer)는 30 eV 충돌 에너지와 mass range 50~1990 m/z에서 얻어진 [glu1]-fibrinopeptide B 조각(fragments)을 표준삼아 보정(calibration)하였다. Q-TOP는 LC/MS^E 획득 모드(acquisition mode)에서 작동하도록 하였으며, MS^E 모드는 적당한 dual exact mass protocol에 따라 데이터를 획득하도록 프로그램화하였다.

ProteinLynx Global SERVER version 2.4(PLGS 2.4)에 통합된 ProteinLynx Global SERVER version 2.4(PLGS 2.4)가 분석을 통해 얻어진 모든 원자료 파일(raw data file)을 프로세스(process)하도록 하였다. 각각의 프로세스된 데이터 파일(processed data file)은 UniProt(www.uniprot.org, May 3, 2011 Released version, number of entries 3,213)에서 얻어진 아피알즈 단백질 데이터베이스(Apiales protein database)에서 검색(search)하였다.

각각의 시료의 low/high collision spectra로부터 얻어진 단백질 동정은 적어도 한 펩타이드가 3개 토막 이온(fragment ion)에 일치하거나, 단백질 하나가 7개의 토막 이온에 일치하거나, 그리고 한 단백질이 2개의 펩타이드와 일치하도록 요구하는 위계적 접근(hierarchical approach)을 통해 작동하도록 하였다.

하기 표 1에서 보는 바와 같이, 진토닌의 전기영동 결과 생긴 단백질 밴드에서 추출한 단백질을 트립신 소화(tryptic digestion) 후에 IM-MS 분석을 실시한 결과, 진토닌에 함유된 단백질은 두 종류인 것으로 확인되었다.

1-9. 통계분석

상기 모든 데이터는 Student's t-test를 사용하여 대조군과 실험군 사이의 통계 비교를 수행하였다. 통계학적 유의성은 p<0.05에서 고려되었다. 동물 실험 데이터는 Newman-Keuls test에 이어 일원분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 사용하여 분석하였다.

실험예 2. 결과 고찰

2-1. 진토닌과 Cy3 계통의 형광물질인 FPR-552의 conjugation을 통한 형광물질-진토닌 제조

도 1에서 보는 바와 같이 FPR-552는 Cy3 계통의 유도체로 이 물질의 바이닐설폰(vinylsulfone)기 -NH-SO₂-C=C는 진토닌을 구성하는 단백질(인삼 메이저 라텍스 유사 단백질 혹은 인삼 메이저 저장 단백질)에 존재하는 리신(lysine)의 아민기 혹은 시스테인의 -SH기와 자발적으로 반응하여 진토닌과 FPR-552의 conjugate를 형성하는 것으로 나타났다.

SDS-PAGE상 FPR552-진토닌의 분자량은 변화가 없는 것으로 나타났고(도 2A), FPR552-진토닌의 흡수 스펙트럼을 검토한 결과 FPR552의 흡수 피크와 일치하는 것으로 나타나 진토닌이 FPR552와 컨쥬게이션된 것이 확인되었다(도 2B).

2-2. FPR552-진토닌에 의한 NPC 표지

진토닌은 LPA 수용체를 활성시키므로 FPR552-진토닌이 LPA 수용체를 발현하는 NPC에 결합하는지를 실험하였다.

도 3A의 첫 번째 컬럼에서 보는 바와 같이, free FPR552만 처리한 경우 NPC에 표지가 되지 않은 것으로 나타났고, FPR522-진토닌을 처리하기 전에 미리 진토닌만을 처리한 다음에 FPR552-진토닌을 처리한 경우에도 NPC가 형광을 띠지 않은 것으로 나타났다. 그러나, FPR552-진토닌만을 NPC에 처리한 경우 모든 세포가 형광을 띠는 것이 아니지만 많은 세포들이 형광을 띠는 것으로 나타났다(도 3A 두 번째 및 세 번째 컬럼 참조). 이는 FPR552-진토닌이 형광을 띠지 않은 진토닌과 경쟁적으로 NPC에 결합하는 것을 의미한다.

2-3. FACS를 이용하여 표지되지 않은 세포들로부터 FPR552-진토닌으로 표지된 NPC 분리

FACS를 이용하여 FPR552-진토닌으로 표지된 NPC들을 분리하였다.

도 3B에서 보는 바와 같이, FPR552-진토닌을 0, 1, 4 ug/ml로 각각 처리한 경우 농도 의존적으로 FPR552-진토닌이 표지된 NPC들이 표지되지 않은 세포들로부터 분리되었다. 이는 NPC에서 LPA 수용체를 발현하는 세포들과 LPA 수용체를 발현하지 않는 세포들을 분리할 수 있고, 분리된 세포들을 활용할 수 있음을 보여주고 있다.

2-4. NPC에서 진토닌에 의한 세포질내 칼슘 농도 변화 측정 및 신호전달

진토닌이 NPC의 칼슘 농도를 증가시키는지 확인하기 위하여, 칼슘을 포함하는 HEPES 완충액에 Fura 2-AM(4 μM) 처리된 NPC 세포에 진토닌을 처리한 결과, 진토닌은 투여 농도에 의존적(도 4A)으로 세포질내 [Ca²⁺]_i를 상승시켰으며, EC₅₀이 0.17±0.02 ㎍/㎖인 것으로 나타났다(도 4B 참조).

또한, LPA1/3 receptor antagonist인 Ki16425는 진토닌의 작용을 차단하지 않은 것으로 나타났다. NPC에는 LPA2 수용체가 많이 발현하는 것을 알려져 있어 LPA1/3 수용체 길항제에 의하여 억제되지 않은 것으로 사료된다 (Fukushima et al., Molecular biology of the Cell, 13, 2692-2705). 인지질분해효소(phospholipase) C의 활성 억제제인 U73122에 의하여 진토닌 작용이 차단되는 것으로 나타났다. 세포막 투과성 BAPTA-AM(25 μM) 및 칼슘을 포함하는 HEPES 완충액에 Fura 2-AM(4 μM, 40분)이 처리된 NPC에 진토닌을 처리한 경우에는 진토닌에 의한 세포질내 [Ca²⁺]_i를 상승시키는 작용이 소멸되는 것이 확인되었다(도 5).

2-5. NPC에서 진토닌에 의한 세포 증식 작용

진토닌을 농도별로 처리하면서 세포 증식의 지표인 BrDU와 반응(BrDU incoporation) 정도를 비교하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, 진토닌은 농도별로 BrDU incorporation을 증가시키는 것으로 나타났고, 진토닌 1 ug/ml에서 최대로 증가하였으나 그 이상의 농도에서는 오히려 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 진토닌이 낮은 농도에서 NPC 증식 효능을 발휘하나 농도가 높아질수록 NPC에 오히려 독성을 나타냄을 시사한다.

2-6. 진토닌 경구 투여의 뇌 해마 치상회(dentate gyrus)에서 신경세포 신생(neurogenesis) 촉진 효과

3 주간 다양한 양의 진토닌(0, 25, 50, 100 mg/kg)을 경구로 먹인 후에 BrDU incoporation 정도와 BrDU로 incoporation된 세포가 신경세포인지 확인하는 면역학적 실험을 실시하였다.

그 결과, 진토닌의 경구 투여는 투요 농도별로 BrDU incorporation을 증가시키는 것으로 나타났다(도 7A). 또한, BrDU로 incorporation된 세포들은 신경세포임을 NeuN 항체를 이용하여 검증하였다(도 7B). 도 7C는 진토닌 100 mg/kg을 투여할 경우 통계학적으로 유의성 있는 신경세포 신생이 이루어짐을 나타낸다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> konkuk university industrial cooperation corp <120> COMPOSITION COMPRISING GINTONIN FOR NEURAL PROGENITOR CELLS PROLIFERATION OR NEUROGENESIS IMPROVEMENT <130> P13-E479 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Ginseng <400> 1 Arg Asp Ile Glu Ala His His Leu Pro Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Ginseng <400> 2 Lys Asp Pro Thr Ser Tyr Leu Asp Phe Leu Leu Ser Val Thr Arg Asp 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Ginseng <400> 3 Lys Glu Glu Ile Val Ala Ile Asp Glu Glu Asp Lys Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Ginseng <400> 4 Lys Leu Asn Glu Ser Val Lys Asp 1 5 <210> 5 <211> 151 <212> PRT <213> Ginseng <400> 5 Met Gly Leu Thr Gly Lys Leu Ile Cys Gln Thr Gly Ile Lys Ser Asp 1 5 10 15 Gly Asp Val Phe His Glu Leu Phe Gly Thr Arg Pro His His Val Pro 20 25 30 Asn Ile Thr Pro Ala Asn Ile Gln Gly Cys Asp Leu His Glu Gly Glu 35 40 45 Phe Gly Lys Val Gly Ser Val Val Ile Trp Asn Tyr Ser Ile Asp Gly 50 55 60 Asn Ala Met Ile Ala Lys Glu Glu Ile Val Ala Ile Asp Glu Glu Asp 65 70 75 80 Lys Ser Val Thr Phe Lys Val Val Glu Gly His Leu Phe Glu Glu Phe 85 90 95 Lys Ser Ile Val Phe Ser Val His Val Asp Thr Lys Gly Glu Asp Asn 100 105 110 Leu Val Thr Trp Ser Ile Asp Tyr Glu Lys Leu Asn Glu Ser Val Lys 115 120 125 Asp Pro Thr Ser Tyr Leu Asp Phe Leu Leu Ser Val Thr Arg Asp Ile 130 135 140 Glu Ala His His Leu Pro Lys 145 150 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Ginseng <400> 6 Arg Ser Asp Tyr Pro Trp Ala Met 1 5 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Ginseng <400> 7 Lys Ala Phe Asp Ile Val Gly Leu Leu Asn Gln Glu Gly Ile Tyr Pro 1 5 10 15 Asn Asn Asp Leu Tyr Arg Pro Lys Met 20 25 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Ginseng <400> 8 Lys Ser Leu Leu Asn Thr Phe Thr Ile His Gly Leu Tyr Pro Tyr Asn 1 5 10 15 Ala Lys Gly <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Ginseng <400> 9 Lys His Leu Asn Ala Val Pro Glu Ile Asp Phe Thr Lys Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Ginseng <400> 10 Arg Thr Ala Leu Ala Phe Arg Lys 1 5 <210> 11 <211> 238 <212> PRT <213> Ginseng <400> 11 Met Arg Ala Ile Tyr Ile Ile Ser Val Ile Ile Val Ser Leu Ser Ile 1 5 10 15 Phe Ser Trp Gly Gly Asn Ala Arg Ser Asp Tyr Pro Trp Ala Met Phe 20 25 30 Ala Leu Arg Leu Gln Trp Pro Ala Gly Phe Cys Glu Val Asn Asn Ala 35 40 45 Cys Asp Thr Lys Ser Leu Leu Asn Thr Phe Thr Ile His Gly Leu Tyr 50 55 60 Pro Tyr Asn Ala Lys Gly Thr Pro Ala Leu Tyr Cys Asp Gly Thr Ala 65 70 75 80 Phe Asp Val Asn Ser Val Ser Asp Phe Leu Ala Glu Met His Leu Ala 85 90 95 Trp Pro Ser His Glu Thr Asn Thr Glu Asp Ile Gln Phe Trp Glu His 100 105 110 Glu Trp Lys Lys His Gly Arg Cys Ser Glu Ala Leu Leu Lys Gln Thr 115 120 125 Asp Tyr Phe Arg Thr Ala Leu Ala Phe Arg Lys Ala Phe Asp Ile Val 130 135 140 Gly Leu Leu Asn Gln Glu Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Asp Leu Tyr Arg 145 150 155 160 Pro Lys Met Ile Lys Glu Ala Ile Lys Lys His Leu Asn Ala Val Pro 165 170 175 Glu Ile Asp Phe Thr Lys Asn Glu Asn Ser Glu Tyr Val Leu Thr Asp 180 185 190 Ile Asn Val Cys Val Asn Gln Gln Ala Thr Arg Phe Val Asp Cys Pro 195 200 205 Thr Asp Asp Ala Thr Asp Asp Tyr Arg Leu Lys Phe Val Arg Leu Pro 210 215 220 Ser Lys Met Lys Phe Ala Asp Pro Arg Thr Asn Ser Ile Ile 225 230 235

Claims

진토닌을 유효성분으로 함유하는 신경전구세포(Neural progenitor cells) 증식 또는 신경세포 신생(neurogenesis) 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 진토닌은 인삼속(Panax species) 식물의 뿌리, 줄기 또는 잎에서 분리된 것을 특징으로 하는 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 진토닌은 조성물 중량의 0.0001 내지 50 중량%로 함유된 것을 특징으로 하는 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 일일 0.0001 내지 100 mg/kg의 진토닌을 섭취하도록 투여되는 것을 특징으로 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물.
제 1항의 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물을 함유하는 퇴행성 뇌신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 1항의 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물을 함유하는 퇴행성 뇌신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제 1항의 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물을 함유하는 기억력 또는 학습능력 개선용 약학조성물.
제 1항의 신경전구세포 증식 또는 신경세포 신생 촉진용 조성물을 함유하는 기억력 또는 학습능력 개선용 건강기능식품.
제 1항에 있어서,
상기 진토닌은 구성 단백질이 인삼 메이저 라텍스 유사 단백질(major latex-like protein; MLP151)과 인삼 리보뉴클레아제 유사 메이저 저장 단백질(RNAse-like major storage protein)로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 인삼 메이저 라텍스 유사 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지며 세 곳의 N-글리코실화 부위(N-glycosylation site)를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 인삼 리보뉴클레아제 유사 메이저 저장 단백질은 서열번호 6 내지 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
인삼속(Panax species) 식물의 뿌리, 줄기 또는 잎에서 분리된 진토닌을 형광물질과 반응시켜 형광물질-진토닌 컨쥬게이트를 제조하고, 상기 형광물질-진토닌 컨쥬게이트를 LPA(lysophosphatidic acid) 수용체를 발현하는 세포에 결합시켜 LPA에 형광물질을 표지하는 방법.
제 12항에 있어서,
상기 형광물질은 피레닌(Pyrene), 싸이아닌 2(Cyanine 2), GFP, 칼세인(Calcein), FITC, 알렉사(Alexa 488), FAM, 플로레씬 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플로레씬(Fluorescein), 로다민(Rhodamine 110), 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(Calcium Green), JOE, 싸이아닌 3(Cyanine 3), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), TRITC, TAMRA, 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin), 피로닌 Y(Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX, 칼슘크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red), 싸이아닌 5(Cyanine 5), 티아디카복시아닌(Thiadicarbocyanine) 및 이들의 유도체를 포함하는 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 LPA에 형광물질을 표지하는 방법.
제 12항에 있어서,
상기 진토닌과 형광물질은 1 : 3 내지 1 : 7의 당량비로 혼합하여 25 내지 45 ℃에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 LPA에 형광물질을 표지하는 방법.