KR20210007460A - 한인진 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 한인진 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 한인진 에탄올 상온 추출물이 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로를 억제하여 간암세포의 성장 및 증식, 이동 및 침윤을 억제하고, 세포사멸 관련 단백질의 발현 변화, 미토콘드리아 막 전위 변화, 시토크롬 c 방출 등을 통해 간암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 확인한 바, 상기와 같은 효과를 가지는 본 발명의 한인진 에탄올 상온 추출물은 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 간암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

한인진 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating liver cancer comprising Artemisia iwayomogi Kitamura extract}
본 발명은 한인진 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
간세포암종(Hepatocellular carcinoma; HCC)은 난치암 중 사망률이 5번째로 매년 발병률이 지속적으로 증가하고 있으며, 주변 장기나 림프절로 급속 전이 되는 특징을 가지고 있어 심각한 이환율과 사망률을 보이는 악성 종양이다. 간암의 조기 진단을 위한 여러 가지 노력에도 불구하고, 초기에 뚜렷한 증상이 없어 대부분의 간암 환자는 간암 중기 혹은 말기에 발견되어 치료 및 완치가 어려우며, 소수의 환자만이 간이식 혹은 수술을 받을 수 있기 때문에 예후가 좋지 않다. 또한, 간암은 재발 위험이 높아 환자의 5년 생존율이 50%에 정도에 미치는 것으로 알려져 있다.
현재 간암을 치료하기 위한 요법으로 화학 요법 및 방사선 요법 등이 실시되고 있으나 치료에 한계가 있고, 여러 가지 부작용을 유발하기 때문에 치료를 받은 간암 환자의 평균 생존율은 11 내지 20개월 밖에 되지 않는다. 간암에서 가장 많이 사용되는 표적 치료제인 소라페닙(sorafenib)은 단독 혹은 다른 항암제와 병행 투여에도 치료 효과가 매우 낮을 뿐만 아니라 약물 내성을 야기하여 치료가 불가능해질 수 있다. 따라서 간암을 치료할 수 있는 새로운 치료 방법 및 전략이 필요한 실정이다.
현재 천연 추출물(natural extracts)은 다양한 질병 치료에 사용되고 있다. 특히, 암 치료에서 천연 추출물은 부작용을 감소시키고, 암 재발 및 진행을 지연시키는 효과를 가져와 항암제와 병용하여 사용되고 있다.
한편, 한인진(Artemisia iwayomogi)은 국화과의 다년초 식물인 더위지기의 지상부를 건조한 것으로, 스코폴레틴(scopoletin), 하이페로사이드(hyperoside), 클로로겐산(chlorogenic acid), 자세오시딘(jaceosidin) 등의 성분을 함유하고 있다. 한인진은 비만 동물 모델에서 고지혈증 완화, 사염화탄소로 유도된 간섬유화 억제, 에탄올로 유도된 간독성 억제 등에서 효능이 보고된 바 있다. 또한, 한인진 메탄올 추출물에서 분리한 두 가지 세스퀴테르펜(sesquiterpene)이 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO 및 iNOS의 발현을 억제하는 것이 보고된 바 있다. 그러나 한인진 추출물에서 간암의 억제 효과를 비교한 연구는 아직까지 보고된 바 없다.
대한민국 등록특허 제10-0388787호 (2003.06.11. 등록)
본 발명의 목적은 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 간암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 억제용 시약 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한인진(Artemisia iwayomogi) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 한인진(Artemisia iwayomogi) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 한인진(Artemisia iwayomogi) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 억제용 시약 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 한인진 에탄올 상온 추출물이 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로를 억제하여 간암세포의 성장 및 증식, 이동 및 침윤을 억제하고, 세포사멸 관련 단백질의 발현 변화, 미토콘드리아 막 전위 변화, 시토크롬 c 방출 등을 통해 간암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 확인한 바, 상기와 같은 효과를 가지는 본 발명의 한인진 에탄올 상온 추출물은 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 간암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 간세포암종인 Hep3B와 Huh-7 세포주의 세포 성장 및 증식에 있어서 한인진 추출물의 효과를 확인한 것으로, (A)는 Huh-7 세포주에서 한인진 추출물(AI)의 세포 성장 억제 효과를 MTT 분석으로 확인한 것이며, (B)는 Hep3B와 Huh-7 세포주에서 한인진 에탄올 상온 추출물(AIE)의 세포 성장 억제 효과를 MTT 분석 및 C) BrdU 세포증식 분석으로 확인한 것이다.
도 2는 (A) 스코폴레틴 및 (B) 이소클로로겐산 B를 이용하여 AIE(C)의 조성 성분을 고성능 액체 크로마토그래피로 확인한 것이다.
도 3은 Hep3B와 Huh-7 세포주를 이용하여 AIE에 의한 세포사멸 유도 효과를 (A) TUNEL 염색 분석 및 (B) 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 것이다.
도 4는 Hep3B와 Huh-7 세포주를 이용하여 AIE에 의한 세포사멸 유도 효과를 (A) 미토콘드리아 막 전위 분석 및 (B) 시토크롬 c 방출 분석으로 확인한 것이다.
도 5는 Hep3B와 Huh-7 세포주를 이용하여 AIE에 의한 세포 이동 및 침윤 억제 효과를 (A) 세포 이동 분석 및 (B) 세포 침윤 분석으로 확인한 것이다.
도 6은 Hep3B와 Huh-7 세포주를 이용하여 AIE에 의한 PI3K 신호전달 억제 효과를 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 것이다.
도 7은 간세포암종(Huh7 세포) 이종이식 마우스 모델에서 AIE에 의한 항암 효과를 (A) 면역조직화학 및 (B) 면역형광 분석으로 확인한 것이다.
본 발명의 발명자들은 한인진 에탄올 상온 추출물(AIE)이 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로를 억제하여 간암세포의 성장 및 증식, 이동 및 침윤을 억제하고, 세포사멸 관련 단백질의 발현 변화, 미토콘드리아 막 전위 변화, 시토크롬 c 방출 등을 통해 간암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 확인하며 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 한인진(Artemisia iwayomogi) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 50 내지 80% 에탄올 수용액으로 상온에서 추출될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 70% 에탄올 수용액으로 상온에서 24시간 동안 추출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 추출물은 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로를 억제하여 암세포의 성장 및 증식, 이동 및 침윤을 억제할 수 있다.
또한, 상기 추출물은 분절된 카스파제-3 및 폴리(ADP-리보오스) 중합효소[poly(ADP-ribose) polymerase; PARP]의 발현을 증가시키고, XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein) 및 골수성 백혈병 세포-1(myeloid cell leukemia-1; MCL-1)의 발현을 감소시켜 암세포의 세포사멸을 유도하고, 미토콘드리아 막 전위 변화에 따른 시토크롬 c 방출을 증가시켜 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 항암 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 한인진(Artemisia iwayomogi) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 50 내지 80% 에탄올 수용액으로 상온에서 추출될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 70% 에탄올 수용액으로 상온에서 24시간 동안 추출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 조성물이 건강식품 조성물인 경우, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품첨가물공전에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
또한, 본 발명은 한인진(Artemisia iwayomogi) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 억제용 시약 조성물을 제공한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 한인진 추출물(Artemisia Iwayomogi; AI) 제조
건조된 한인진(Artemisia Iwayomogi Kitamura) 지상부는 광명당 약초(울산)에서 구입하였고, 바우처 표본(BON17102704)은 경희대학교 약학대학의 한의학 실험실에 보관하였다.
상기 건조된 한인진 지상부를 이용하여 4개의 추출물을 제조하였다: (A) 70% EtOH 가열 추출물 및 DW 가열 추출물; 건조된 시료(5 g)에 70% 에탄올 50 mL을 첨가하고 80℃에서 2시간 동안 추출하거나, 증류수 50 mL를 첨가하고 100℃에서 2시간 동안 추출한 후, 1시간 동안 반복하여 혼합하는 방법, (B) 70% EtOH 상온 추출물(AIE) 및 DW 상온 추출물; 건조된 시료(5 g)에 70% 에탄올 또는 증류수 50 mL을 첨가하고 상온에서 24시간 동안 추출하는 방법.
각 추출물을 여과, 농축 및 동결 건조한 후 분말 시료를 획득하였으며, 상기 분말 시료는 4℃에서 보관하였다. 각 추출물의 수율은 70% EtOH 가열 추출물의 경우 32.8%, DW 가열 추출물의 경우 34.3%, EtOH 상온 추출물의 경우 18.1%, DW 상온 추출물의 경우 12.7%였다.
실시예 2: 표준화
AI의 성분을 확인한기 위해, 표준 화합물인 스코폴레틴(scopoletin) 및 이소클로로겐산 B(isochlorogenic acid B; 3,4-dicaffeoylquinic acid)를 사용하였으며, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 AIE(20 mg/mL)를 정량적으로 분석하였다.
간략하게, AIE(20 mg/mL)를 50% 메탄올에 용해시킨 후, 0.20 μm PVDF(polyvinylidene difluoride) 막(Advantec., Dundas, ON, Canada)을 사용하여 여과하였다. HPLC 등급의 스코폴레틴 및 이소클로로겐산 B는 ChemFaces(Wuhan, Hubei, China)에서 구입하였다. AIE는 Dionex UltiMate 3000 시스템(ThermoFisher scientific Corp., Waltham, MA, USA)을 사용하여 결정된 스코폴레틴 및 이소클로로겐산 B의 함량에 따라 표준화되었다. 크로마토그래피 분리는 Supelco C18 컬럼(250 x 4.6 mm, 5 μm)을 사용하여 수행되었으며, 25℃에서 유지되었다. 이동상(A: 0.1% 포름산 및 B: 0.1% 포름산이 함유된 아세토니트릴)은 0-15분 동안 15-20% B, 15-35분 동안 20-45% B, 45-100% B 40-46분 동안 100% B, 46-48분 동안 100-15% B, 48-53분 동안 15% B의 조건으로 사용되었다. 크로마토그래피는 1.0 mL/분의 유속을 사용하는 구배 모드에서 수행되었다. 크로마토그램은 UV 검출기(ThermoFisher scientific Corp., Waltham, MA, USA)를 사용하여 330 nm에서 검출되었으며, Chromeleon 7.2 SR4 소프트웨어(ThermoFisher scientific Corp., Waltham, MA, USA)를 사용하여 데이터를 획득하였다.
실시예 3: 세포 및 물질
HCC 세포(Huh-7 및 Hep3B)는 일본 암 연구 자원 은행(Shinjuku, Japan)에서 구입하였고, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포 배양 물질, FBS 및 페니실린/스트렙토마이신은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.
실시예 4: 세포 생존율 분석
한인진 추출물이 처리된 세포의 생존력은 MTT 분석을 사용하여 측정하였다. 간략하게, Hep3B 및 Huh-7 세포(6 X 103 세포/웰)를 96 웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 세포에 다양한 농도의 한인진 추출물(1, 10, 50, 100 및 200 ㎍/mL)을 처리한 후, 72시간 동안 배양하였다. 이후, 각 웰에 MTT 용액을 처리하고, 37℃에서 4시간 동안 추가 배양하였다. 생성된 포르마잔 결정은 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시켰다. 540 nm에서의 UV 흡광도 검출을 갖는 자동 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 즉시 판독하였다.
실시예 5: 웨스턴 블롯 분석
세포를 1% Triton X-100 및 1 % NP-40, 프로테아제 및 포스파타아제 저해제가 포함된 버퍼로 용해시켜 단백질을 추출하였다. 단백질을 정량한 후 일정량을 취하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였고, 전기영동으로 분리한 단백질은 PVDF 막으로 흡착 이동시켰다. 이어서 막을 1차 항체로 반응시키고, HRP가 접합된 2차 항체로 반응시킨 다음, 화학 발광 시약을 사용하여 단백질의 발현량을 시각화하였다. 사용된 항체는 cleaved PARP, cleaved caspase-3, XIAP, Mcl-1, p-mTOR, p-AKT(Tyr308), p-4EBP1, p-GSK3β, 및 β-actin에 대한 항체이며, Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA), Abcam(Cambridge, MA, USA), 및 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
실시예 6: 5'-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU) 세포증식 분석
Hep3B 및 Huh-7 세포(7 X 103 세포/웰)를 96 웰 플레이트에 접종하고, 다양한 농도의 AIE와 6시간 동안 배양하였다. 세포 DNA 함량은 BrdU 세포증식 분석 키트(Merck)로 분석하였다. 간략하게, 세포를 5 μM의 BrdU와 3시간 동안 배양한 후, 고정/변성 용액을 첨가하여 상온에서 30분 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포는 100 μL의 검출 항체 용액과 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, TMB 기질을 첨가하여 15-30분 추가 반응시켰다. 이어서 정지 용액(1 mM H2SO4)을 첨가한 후 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 7: TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling) 분석
Hep3B 및 Huh-7 세포(5 X 103)를 18 mm 커버 유리에 접종하고 배양 배지를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 50, 100 μg/mL AIE로 24시간 동안 처리한 후 차가운 아세트산과 에탄올(1 : 2) 혼합물을 처리하여 5분간 고정시키고 PBS로 세척하였다. TUNEL kit(Chemicon, Temecula, CA, USA)를 사용하여 제조사에서 제공된 프로토콜에 따라 사멸된 세포를 분석하였다.
실시예 8: 미토콘드리아 막 전위 분석
미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해, JC-1 미토콘드리아 염색 키트(JC-1, Grand Island, NY, USA)를 사용하였다. 미토콘드리아 내 형광 염료의 축적은 높은 전위 의존성 미토콘드리아 축적을 나타낸다. Hep3B 및 Huh-7 세포를 18 mm 커버 유리에 접종하여 세포를 부착시킨 후, 50, 100 μg/mL AIE로 6시간 동안 처리하고 JC-1 용액(최종 농도 12.5 μg/mL) 100 ㎕를 추가하여 30분 동안 반응시켰다. 핵을 시각화하기 위해 DAPI를 첨가하고 마운팅 용액으로 덮은 후, 공초점 레이저 주사 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포를 관찰하였다.
실시예 9: 시토크롬 C 방출 분석
Hep3B 및 Huh-7 세포를 50, 100 μg/mL AIE로 6시간 동안 처리한 다음 미토콘드리아 특이적 FITC 염료(Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)와 함께 1시간 동안 배양하였다. 세포를 고정하기 위해, 아세톤과 메탄올(1:1) 혼합물을 처리하고 -20℃에서 5분간 반응시켰다. 고정된 세포는 시토크롬 c 항체(Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA)와 4℃에서 밤새 배양하였다. DAPI 용액으로 대조 염색한 후 마우스 형광 표지 2차 항체(Dianova, Hamburg, Germany)와 1시간 동안 배양하였다. 마운팅 용액으로 덮은 후, 공초점 레이저 주사 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포를 관찰하였다.
실시예 10: 세포 이동(migration) 분석
Huh-7 세포를 60 mm 배양 접시에 접종하고 90%의 밀도가 될 때까지 배양한 후, 접시에 부착된 세포를 마이크로 피펫 팁으로 긁어 선형의 균일한 상처를 만들었다. PBS로 탈락된 세포를 제거하고 50, 100 μg/mL 농도의 AIE를 처리한 다음 48시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고 메탄올로 고정시켜 세포의 이동을 분석하였다.
실시예 11: 세포 침윤(invasion) 분석
24 웰 modified Boyden 챔버(기공 크기, 8 μm)를 10% 마트리겔(matrigel)로 코팅하고, 50, 100 μg/mL AIE를 처리한 또는 처리하지 않은 2 X 105 Huh-7 세포를 상부 챔버에 넣고, 하부 챔버에는 750 μL의 배지를 넣어 48시간 동안 배양하였다. 이후, 더 낮은 표면으로 이동한 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛이 포함된 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 염색하였다. 필터의 상부 표면 상의 세포를 면봉으로 제거하고 5개의 무작위 필드를 선택하여 침윤된 세포의 수를 측정하였다.
실시예 12: 면역형광 현미경 분석
세포를 12 웰 플레이트에 접종(2 X 105 세포/웰)하고 24시간 동안 배양한 후, 50, 100 μg/mL AIE로 6시간 동안 처리하였다. 아세트산과 에탄올(2 : 1) 혼합물로 세포를 고정시킨 후, 비특이적 결합을 차단하기 위해 5% 염소 및 말 혈청/PBS를 함유하는 블로킹 용액과 반응시켰다. 이후, 1차 항체로 4℃에서 밤새 반응시키고, 형광 표지된 2차 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 핵을 시각화하기 위해 DAPI를 첨가하고 마운팅 용액으로 덮은 후, 공초점 레이저 주사 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포를 관찰하였다.
실시예 13: 면역조직화학 분석
조직을 고정시킨 후 파라핀에 포매하고, 8 μm 두께의 절편을 제작하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 간략하게, HIER(heat induced epitope retrieval)은 시트르산 버퍼(pH 6.0)로 10분간 수행한 후, 3% 과산화수소가 첨가된 PBS로 8분 동안 퍼옥시다제를 quenching 하였다. 이후, 정상 염소 또는 말 혈청을 포함하는 블로킹 용액으로 40분 동안 블로킹한 다음 항 증식 세포 핵 항원(PCNA, Abcam, Cambridge, MA, USA) 또는 cleaved caspase-3(Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, USA)와 4℃에서 밤새 배양하였다. 절편을 PBS로 세척한 후, 바이오 티닐화 된 2차 항체와 1시간 동안 배양하고 streptavidin-HRP를 적용하였다. 마지막으로 조직 절편을 DAB(diaminobenzidine tetrahydrochloride)으로 발색시킨 후 헤마톡실린으로 대조 염색하였다. 각 섹션에서 3개 이상의 무작위 필드를 선택하여 조직을 분석하였다.
실시예 14: 생체 외 기관형 종양 스페로이드(organotypic tumor spheroid) 분석
수컷 BALB/c 누드 마우스(5주령)는 Orient Bio(서울)에서 구입하였다. 동물 실험은 인하대학교 IACUC의 기관동물관리 및 사용위원회(approval ID: INHA 180523-569)의 지침에 따라 수행하였다.
Huh-7 세포(8 X 106)를 누드 마우스에 피하 주사하여 접종한 후 종양의 크기가 약 300-500 mm3에 도달하였을 때 외과적으로 제거하였다. 케타민(100 mg/kg)과 크실라진(2%, 20 mg/kg)을 혼합하여 마우스를 마취시킨 후 직경 2 mm의 절편을 절제하고, 배양 배지와 함께 2% 아가로스로 코팅된 24 웰 플레이트에서 이식하였다. 배지는 2 내지 3일마다 AIE(100 ㎍/mL)가 포함된 신선한 배양 배지로 6일 동안 대체하였다. 1일 후, 각 종양 스페로이드는 PCNA, cleaved caspase-3, p-AKT 및 p-mTOR에 대하여 면역조직화학 및 면역 형광법을 수행하였다.
실험예 1: 한인진 에탄올 상온 추출물(AIE)에 의한 간세포암종의 세포 성장 및 증식 억제 효과
도 1A는 간세포암종인 Hep3B와 Huh-7 세포주를 이용하여 한인진 추출물에 의한 세포 성장 및 증식 억제 효과를 확인한 것이며, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 한인진 추출물 중 한인진 70% 에탄올 상온 추출물(AIE)이 Hep3B와 Huh-7 세포의 생존율을 농도 의존적으로 감소시키고, 특히, 100 μg/mL 농도에서 세포 생존율을 약 50% 억제하는 것을 확인하였다.
AIE가 세포증식에 미치는 영향을 확인하기 위해, DNA에 BrdU의 결합을 측정하였다. 그 결과, 도 1C에 나타낸 바와 같이, AIE가 농도 의존적으로 BrdU의 결합을 억제하는 것을 확인하였다.
한편, 스코폴레틴 및 이소클로로겐산 B는 한인진 추출물에 포함되어 있는 화합물인 바, AIE를 표준화하는데 상기 화합물들을 사용하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, AIE에서 스코폴레틴 및 이소클로로겐산 B의 비율이 각각 0.451%(4.51 mg/g) 및 0.774%(7.74 mg/g)임을 확인하였다.
실험예 2: AIE에 의한 세포사멸 유도 효과
AIE에 의한 간세포암종의 세포사멸 효과를 확인하기 위해, Hep3B와 Huh-7 세포에서 TUNEL 염색을 수행하였다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, AIE(50 및 100 ㎍/㎖)로 24시간 처리하였을 때, 세포는 DNA 단편화와 같은 세포사멸의 특징을 나타내었으며, AIE 처리군에서 TUNEL 양성 세포의 비율이 더 높게 나타났다. 또한, 도 3B에 나타낸 바와 같이, AIE로 24시간 처리하였을 때, cleaved caspase-3 및 PARP 발현이 증가하고, XIAP 및 Mcl-1 발현이 감소하는 것을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
상기 결과는 AIE가 간세포암종의 세포사멸을 유도하여 세포증식을 억제함을 의미한다.
실험예 3: AIE에 의한 미토콘드리아 의존성 세포 사멸 유도 효과
내인성 세포사멸과 관련이 있는 미토콘드리아 막 전위 변화에서 AIE의 영향을 분석하기 위해 JC-1 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포의 세포기질은 JC-1 형광의 적색 및 녹색으로 모두 염색되어 이종 얼룩을 나타내었고, 미토콘드리아 국소화와 일치하게, 적색 형광은 세포기질 전체에 분산된 과립 구조에서 매우 많이 관찰되었다. AIE는 미토콘드리아 막 전위를 현저하게 변화시켰는데, 이는 대부분의 세포에서 적색 형광이 사라지거나 녹색 형광이 증가함으로 입증되었다. 미토콘드리아 막 전위는 세포기질로 시토크롬 c 방출을 유도하는 것으로 알려져 있다. 더불어, 도 4B에 나타낸 바와 같이, AIE가 시토크롬 c 방출을 증가시키고, 대조군에 비해 시토크롬 c 및 미토콘드리아의 공존화를 감소시키는 것을 확인하였다.
실험예 4: AIE에 의한 세포 이동 및 침윤 억제 효과
암 전이는 세포의 이동 및 침윤과 관련되어 있다. 이에, 간세포암종 세포 이동에 있어서 AIE의 영향을 분석하였다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, Huh-7 세포의 이동이 유의하게 억제된 AIE 처리군과 달리, 대조군 세포의 상처 부위는 최대 90%까지 48시간 이내에 치유되는 것을 확인하였다.
또한, 암세포의 침윤 특성은 전이 초기에 요구되어지는 바, 간세포암종 세포 침윤에 있어서 AIE의 영향을 분석하였다. 그 결과, 도 5B에 나타낸 바와 같이, AIE에 의해 세포 침윤이 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다.
실험예 5: AIE에 의한 PI3K 신호전달 경로 억제 효과
PI3K/AKT/mTOR 경로의 이상, 세포 생존 경로는 간세포암종 발암과 관련되어 있다. 이에, AIE가 간세포암종 세포에서 PI3K/AKT 신호전달 경로를 억제하는지 여부를 분석하였다.
Hep3B 및 Huh-7 세포를 AIE(50 및 100㎍ / mL)로 6시간 동안 처리한 후, 웨스턴 블롯으로 PI3K/AKT 신호 관련 분자의 발현을 측정한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, AIE가 PI3K/AKT 경로의 하류 신호인 p-AKT, p-mTOR, p-GSK3β 및 p-4EBP1의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.
실험예 6: ex vivo에서 AIE에 의한 세포증식 억제 및 세포사멸 유도 효과
AIE의 치료 효과를 확인하기 위해, 약물 전달 및 다세포 구조에 대한 물리적 장벽과 같은 생체 내 생리적 특성과 매우 흡사한 마우스 이종이식 종양 조직을 사용하여 기관형 종양 스페로이드 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 7A에 나타낸 바와 같이, 헤마톡실린 및 에오신 염색 후, 대조군에 비해 AIE 처리군에서 종양 스페로이드의 세포사멸과 괴사가 더 크게 유발되는 것을 확인하였고, 세포사멸의 효과는 cleaved caspase-3 발현 증가와 종양 스페로이드에서의 세포증식 마커인 PCNA의 발현 감소를 통해 확인할 수 있었다. 또한, 도 7B에 나타낸 바와 같이, AIE가 p-AKT 및 p-mTOR의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.
상기 결과는 AIE가 ex vivo 간세포암종 종양 기관형 스페로이드에서 강력한 항종양 효능을 갖는다는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 한인진(Artemisia iwayomogi) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 50 내지 80% 에탄올 수용액으로 상온에서 추출되는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로를 억제하여 암세포의 성장 및 증식, 이동 및 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 분절된 카스파제-3 및 폴리(ADP-리보오스) 중합효소[poly(ADP-ribose) polymerase; PARP]의 발현을 증가시키고, XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein) 및 골수성 백혈병 세포-1(myeloid cell leukemia-1; MCL-1)의 발현을 감소시켜 암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 미토콘드리아 막 전위 변화에 따른 시토크롬 c 방출을 증가시켜 암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 한인진(Artemisia iwayomogi) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 추출물은 50 내지 80% 에탄올 수용액으로 상온에서 추출되는 것을 특징으로 하는 간암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
  8. 한인진(Artemisia iwayomogi) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 억제용 시약 조성물.


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