KR101720610B1 - Ｓｔａｔ３ 저해활성을 갖는 토목향 헥산 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
Ｓｔａｔ３ 저해활성을 갖는 토목향 헥산 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 토목향(Inula helenium) 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 유방암 세포 및 유방암 세포가 이식된 마우스에 대하여 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타내므로, 상기 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물, 유방암 전이 억제용 조성물, 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품, 유방암 전이 억제용 건강기능식품, 또는 항암 보조제의 유효성분에 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 STAT3 저해활성을 갖는 토목향(Inula helenium) 헥산 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
유방암은 서구 여러 나라에서 여성의 가장 흔한 암의 하나로, 2008년 통계에 따르면 우리나라의 유방암은 갑상선암에 이어 두 번째로 많으며 전체 여성암의 14.7%를 차지한다. 보건복지부 통계에 의하면, 우리나라 유방암 환자의 발생은 계속 증가 되는 추세이고, 서구화가 진행됨에 따라 생활양식, 출산율 및 수유 감소, 유방 정기검사 강화 등에 의해 더욱 증가 될 것으로 판단된다.
종양은 생체 자기 세포가 계속해서 분화, 증식을 하는 이상세포 집단이고, 종양 관련 악액질(cancer cachexia)은 악성 종양 환자의 삶의 질을 저하 시키는 가장 중요한 원인으로 다양한 만성 합병증을 초래한다. 현재 사용되는 종양 치료제들은 종양세포만이 아닌 정상세포에도 동시에 독성을 나타내는 문제점이 있다.
유방암의 현재 치료방법은 외과적 수술이나 방사선 치료와 같은 전통적인 방법, 그리고 에스트로겐 수용체나 HER2를 타겟팅하는 호르몬 치료 또는 표적 치료와 같은 방법이 이용되고 있다. 대부분의 유방암은 주로 호르몬 양성 유방암으로 외과적 수술 방법이나, 타목시펜(tamoxifen) 과 같은 약물요법으로 치료되고 있다. 그러나, 유방암은 화학적 치료방법에 빈번하게 내성이 잘 생기며, 호르몬 의존적인 형태에서 호르몬 비의존적이며, 전이능을 가진 형태로 쉽게 진화한다. 따라서 유방암 환자의 절반 이상은 암이 다른 장기로의 전이되며, 이때는 호르몬 수용체 치료가 매우 어렵게 된다. 특히 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, HER2를 발현하지 않는 삼중음성유방암의 경우 현재까지 별다른 치료방법이 없어서 주로 비특이적 항암치료에 의해 치료가 이루어진다. 그렇지만 삼중음성유방암은 지속적으로 활성화된 STAT3가 발현되어 있는 것을 특징으로 하는데, STAT3는 종양 형성과 침윤, 전이에 직접적으로 관여하며, 암세포 사멸에도 내성을 가지게 한다. 따라서 STAT3를 타겟 물질 탐색은 유망한 항암치료 전략으로 최근에 대두되고 있다.
STATs(Signal Transducers and Activators of Transciption) 단백질은 세포질에서 신호전달 단백질로 작용하여, 세포막으로부터 핵 내로 신호를 전달한다. STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6의 모두 7종류의 STAT이 보고되어 있다. 이 중에서 STAT3은 대부분의 암에서 필수적으로 활성화되고, 암의 발생과 분화에 중요한 역할을 한다. 또한 많은 악성종양 환자에서 STAT3의 활성화가 관찰되며, 전이능을 가지는 암에서도 지속적으로 활성화된 STAT3가 빈번하게 관찰된다. STAT3은 종양형성과 침윤, 전이에 직접적으로 관여하며, 암세포 사멸에도 내성을 가지게 한다. 따라서 STAT3을 타겟 물질 탐색은 유망한 항암치료 전략으로 최근에 대두되고 있다.
STAT3은 인산화가 되면서 활성화되는데, C-말단(C-terminal)에 타이로신 705번 잔기(Tyrosine 705)와 세린 727번 잔기(Serine 727)를 가지고 있다. STAT3은 사이토카인과 성장인자의 중요한 매개체로써, 주로 IL-6, 표피성장인자, Src 나 Ras와 같은 종양 단백에 의해 활성화된다. IL-6와 같은 사이토카인 또는 표피성장인자와 같은 성장인자가 그에 해당하는 수용체와 결합하게 되면, JAK kinase는 수용체에 있는 타이로신 인산화를 유도하게 되고, 이렇게 인산화된 타이로신은 STAT이 수용체에 결합하도록 도와준다. 타이로신 705번 잔기의 인산화에 의해서 STAT3은 두 개의 STAT3가 SH2 domain 간의 상호결합에 의해 하나의 이합체를 형성한다. STAT3 이합체는 핵 내로 이동한 후에는 전사 인자로 작용하여, 세포 성장 및 생존에 중요한 타겟 유전자의 프로모터 유전자에 직접 결합하여, 하위 타켓 유전자들의 전사를 조절한다. 대표적으로, 세포 성장 및 분열 주기를 진행하는 Cyclin D1, 그리고 세포사멸을 억제하는 유전자인 Bcl-2를 조절한다. 그 밖에, STAT3 은 암의 증식과 관련된 다양한 유전자의 발현을 조절한다.
유방암 시장은 높은 미충족 의학적 수요를 가지고 있는 분야이다. 호르몬 요법, 화학 요법, 표적 치료 등 다양한 질환의 특성을 가진 환자들을 대상으로 하는 여러 기전의 치료제가 있지만, 안전하고 효과적인 만족할만한 치료제에 대한 수요가 계속 요구되고 있다. 이 중에서도 전체 유방암의 16%를 차지하는 삼중음성유방암(Triple-Negative Breast Cancer, TNBC)은 치료 예후가 불량하여 치료에 어려움이 있으나, 아직 삼중음성유방암을 대상으로 한 치료제가 없어 이에 대한 수요가 높다.
한편, 국화과의 다년초인 토목향(土木香, Inulae Radix Inulae Radix L.)은 유럽원산의 재배식물로써 줄기는 곧고 전처에 짧은 털이 밀생하여 높이는 80 ㎝ 내지 2 m이다. 중국에서는 운목향(학명: Saussurea lappa 또는 Aucklandia lappa)의 뿌리를 약재로 사용하며, 대한약전외 한약규격집에서는 이것을 목향 이라 규정하여, 토목향(학명: Inula helenium, 대한약전외 한약규격집에 수재)과는 구별하고 있다. 토목향(Inulae Heleni Radix)은 토목향(Inula helenium Linne, 국화과 Compositae)의 뿌리이다. 성상은 뿌리로 원뿔모양이고 약간 구부러졌으며 길이 10 내지 30cm, 지름 1 내지 3 cm이다. 바깥면은 황갈색 내지 어두운 갈색이고 세로주름 및 수염뿌리 자국이 있다. 머리 부위는 굵고 위쪽 끝에는 줄기자국이 있으며 잎이 붙어있는 경우도 있고 그 주위에는 원뿔모양의 곁가지가 있다. 질은 단단하여 쉽게 꺾이지 않는다. 꺾은 면은 약간 평탄하며 황백색 내지 연한 회황색이며 약간 패여진 유실(油室)이 있다. 이 약의 횡단면을 현미경으로 볼 때 코르크층은 5 내지 8 열의 코르크세포로 되어 있다. 사부는 넓고 형성층은 고리를 이루며 뚜렷하지 않다. 목부는 도관이 한 줄로 비교적 불규칙하게 배열하고 있다. 사부 및 목부에는 유실이 흩어져 있다. 사부의 유세포와 목부의 수선 세포에는 이눌린 덩어리가 비교적 많이 들어 있다. 토목향은 특유한 향기가 약간 있으며 맛은 쓰고 맵다. 한방 및 민간에서 목향의 뿌리를 목향(木香) 또는 토목향(土木香)이라 하여 가래, 토사, 복통, 구토, 기관지염, 백일해, 만성장염, 결핵성이질, 수양성하리, 위경련, 말라리아에 약재로 사용한다. 그러나, 아직까지 토목향의 유방암 활성에 대하여는 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 천연물 유래의 유방암 예방 및 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 토목향(Inula helenium) 추출물 또는 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 유방암 세포 및 유방암 세포가 이식된 마우스에 대하여 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타내므로, 상기 토목향 추출물 또는 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 토목향(Inula helenium) 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 알란토락톤(Alantolactone, C15H20O2) 또는 화학식 2로 표시되는 이소알란토락톤(Isoalantolactone, C15H20O2)을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
[화학식 2]
본 발명의 또 다른 목적은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토목향(Inula helenium) 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 알란토락톤(Alantolactone, C15H20O2) 또는 화학식 2로 표시되는 이소알란토락톤(Isoalantolactone, C15H20O2)을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.
아울러, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.
본 발명은 토목향(Inula helenium) 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 분획물은 유방암 세포 및 유방암 세포가 이식된 마우스에 대하여 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타내므로, 상기 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물, 유방암 전이 억제용 조성물, 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품, 유방암 전이 억제용 건강기능식품, 또는 항암 보조제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 토목향(Inula helenium) 헥산 분획물에 포함된 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 실제 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 맞는지 HPLC를 사용하여 확인한 도이다.
도 2는 토목향 메탄올 추출물에 포함된 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 실제 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 맞는지 HPLC를 사용하여 확인한 도이다.
도 3은 알란토락톤 및 이소알란토락톤의 HPLC 표준폼을 나타낸 도이다.
도 4는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 토목향 메탄올 추출물의 세포 성장 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 토목향 헥산 분획물, 메틸렌 클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물의 세포 성장 억제 효과 비교를 나타낸 도이다.
도 6은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 토목향 헥산 분획물의 세포 성장 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 알란토락톤 및 이소알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과 비교를 나타낸 도이다.
도 8은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 및 단백질 발현의 억제 효과를 확인한 도이다.
도 9는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포에서 알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 10은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 헥산 분획물을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 및 Cyclin D1 단백질 발현의 억제 효과를 확인한 도이다.
도 11은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 메탄올 추출물을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 및 Cyclin D1 단백질 발현의 억제 효과를 확인한 도이다.
도 12는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동을 차단하는 효과를 확인한 도이다.
도 13은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 상기 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 차단하는 효과를 확인한 도이다.
도 14는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 발현이 3, 6, 12, 24 시간의 모든 시간에서 억제되는 것을 확인한 도이다.
도 15는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3의 인산 작용기인 세린(Serine) 잔기의 인산화는 억제하지 못하는 것을 확인한 도이다.
도 16은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하고, STAT3 활성억제를 효과적으로 시키는 S31-201 물질을 대조군으로 처리하여 STAT3(Tyr 705) 및 STAT3(ser 727) 활성억제를 비교한 도이다.
도 17 및 도 18은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리에 의한 EGF 및 IL-6 자극원 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 19 및 도 20은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리에 의한 특이적 STAT3 인산화 차단의 효과를 나타낸 도이다.
도 21은 알란토락톤 및 항암제인 독소루비신의 병용 투여에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 22는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 헥산 분획물 처리에 의한 특이적 STAT3 인산화 차단의 효과를 나타낸 도이다.
도 23은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 헥산 분획물 처리에 의한 DNA 분절화 및 이의 경로를 확인하여 나타낸 도이다.
도 24는 토목향 헥산 분획물에 포함된 세스퀴테르펜락톤 계열 성분인 알란토락톤, 이소알란토락토, 이가란(igalan) 및 디구시알락톤(degusialactone), 알로안토락톤(alloantolactone)의 혼합물의 존재 여부, 구조 및 STAT3 활성 억제를 나타낸 도이다.
도 25는 A549 인간폐암세포, AGS 위암 세포 및 인간 췌장암세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 STAT3 활성 억제의 효과를 확인한 도이다.
도 26은 A549 인간폐암세포, AGS 위암 세포 및 인간 췌장암세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 상기 세포들의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 효과적으로 차단하는 것을 확인한 도이다.
도 27은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포 이동률이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 28은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포 부착률이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 29는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포 침윤이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 30은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포의 균집 형성률이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 31은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 MMP-9의 분해 활성이 억제하는 것을 확인한 도이다.
도 32는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 c-Myc, COX-2, Cyclin D1, VEGF 및 CXCR4 유전자 발현이 농도의존적으로 억제되는 것을 확인한 도이다.
도 33은 생체내(In vivo)에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 유방암 종양 억제의 효과를 확인한 도이다;
a)는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 종양 부피 감소 효과를 확인한 도이다;
b)는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 종양 무게 감소 효과를 확인한 도이다; 및
c)는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 마우스 체중을 확인한 도이다.
도 34는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 마우스 조직에서 Cyclin D1 및 p-STAT3 발현의 감소 효과를 확인한 도이다.
도 2는 토목향 메탄올 추출물에 포함된 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 실제 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 맞는지 HPLC를 사용하여 확인한 도이다.
도 3은 알란토락톤 및 이소알란토락톤의 HPLC 표준폼을 나타낸 도이다.
도 4는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 토목향 메탄올 추출물의 세포 성장 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 토목향 헥산 분획물, 메틸렌 클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물의 세포 성장 억제 효과 비교를 나타낸 도이다.
도 6은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 토목향 헥산 분획물의 세포 성장 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 알란토락톤 및 이소알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과 비교를 나타낸 도이다.
도 8은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 및 단백질 발현의 억제 효과를 확인한 도이다.
도 9는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포에서 알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 10은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 헥산 분획물을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 및 Cyclin D1 단백질 발현의 억제 효과를 확인한 도이다.
도 11은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 메탄올 추출물을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 및 Cyclin D1 단백질 발현의 억제 효과를 확인한 도이다.
도 12는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동을 차단하는 효과를 확인한 도이다.
도 13은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 상기 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 차단하는 효과를 확인한 도이다.
도 14는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 발현이 3, 6, 12, 24 시간의 모든 시간에서 억제되는 것을 확인한 도이다.
도 15는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3의 인산 작용기인 세린(Serine) 잔기의 인산화는 억제하지 못하는 것을 확인한 도이다.
도 16은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하고, STAT3 활성억제를 효과적으로 시키는 S31-201 물질을 대조군으로 처리하여 STAT3(Tyr 705) 및 STAT3(ser 727) 활성억제를 비교한 도이다.
도 17 및 도 18은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리에 의한 EGF 및 IL-6 자극원 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 19 및 도 20은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리에 의한 특이적 STAT3 인산화 차단의 효과를 나타낸 도이다.
도 21은 알란토락톤 및 항암제인 독소루비신의 병용 투여에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 22는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 헥산 분획물 처리에 의한 특이적 STAT3 인산화 차단의 효과를 나타낸 도이다.
도 23은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 헥산 분획물 처리에 의한 DNA 분절화 및 이의 경로를 확인하여 나타낸 도이다.
도 24는 토목향 헥산 분획물에 포함된 세스퀴테르펜락톤 계열 성분인 알란토락톤, 이소알란토락토, 이가란(igalan) 및 디구시알락톤(degusialactone), 알로안토락톤(alloantolactone)의 혼합물의 존재 여부, 구조 및 STAT3 활성 억제를 나타낸 도이다.
도 25는 A549 인간폐암세포, AGS 위암 세포 및 인간 췌장암세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 STAT3 활성 억제의 효과를 확인한 도이다.
도 26은 A549 인간폐암세포, AGS 위암 세포 및 인간 췌장암세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 상기 세포들의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 효과적으로 차단하는 것을 확인한 도이다.
도 27은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포 이동률이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 28은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포 부착률이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 29는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포 침윤이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 30은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포의 균집 형성률이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 31은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 MMP-9의 분해 활성이 억제하는 것을 확인한 도이다.
도 32는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 c-Myc, COX-2, Cyclin D1, VEGF 및 CXCR4 유전자 발현이 농도의존적으로 억제되는 것을 확인한 도이다.
도 33은 생체내(In vivo)에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 유방암 종양 억제의 효과를 확인한 도이다;
a)는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 종양 부피 감소 효과를 확인한 도이다;
b)는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 종양 무게 감소 효과를 확인한 도이다; 및
c)는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 마우스 체중을 확인한 도이다.
도 34는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 마우스 조직에서 Cyclin D1 및 p-STAT3 발현의 감소 효과를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 토목향(Inula helenium) 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 분획물은 토목향 추출물로부터 헥산(hexane), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol) 또는 물로 순차적으로 분획하여 얻은 헥산 분획물, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것이 바람직하며, 헥산으로 추출한 것이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 추출물은 토목향을 물, C1 내지 C2 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것이 바람직하며, 메탄올이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출 방법으로는 냉침 추출, 가열 추출, 초음파 추출 또는 환류 냉각 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 감압농축은 진공 감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 토목향 분획물은 STAT3 억제활성을 갖는 것이고, STAT3 과발현되는 암 억제활성을 갖는 것이 더 바람직하다.
상기 STAT3 과발현되는 암은 유방암인 것이 바람직하고, 삼중음성유방암인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 토목향 분획물은 STAT3 타이로신(Tyr 705) 및 STAT3 세린(Ser 727) 억제활성을 갖는 것이 바람직하다.
상기 토목향 분획물은 EGF 및 IL-6 자극원 억제활성을 갖는 것이 바람직하다.
상기 토목향 분획물은 STAT3 인산화 억제활성, MMP-9의 분해 억제활성을 갖는 것이 바람직하다.
상기 토목향 분획물은 c-Myc, COX-2, Cyclin D1, VEGF 및 CXCR4 유전자 발현 억제활성을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 토목향 추출물을 제조하고, 상기 추출물로부터 분획물을 제조하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 토목향 헥산 분획물로부터 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 추출하였다(도 1 참조).
또한, 토목향 헥산 분획물과 메탄올 추출물에 포함된 알란토락톤 및 이소알란토락톤의 함유량을 비교하기 위하여, 토목향 메탄올 추출물로부터 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 HPLC를 이용하여 확인한 결과, 토몰향 헥산 분획물이 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 2배 이상 함유하는 것을 확인하였으며(도 2 참조), 상기 분획물 및 추출물로부터 검출된 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 확인하기 위하여, HPLC를 이용하여 표준품과 비교하였다(도 3 참조).
또한, 토목향 메탄올 추출물의 세포 성장 억제를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 토목향 메탄올 추출물을 각기 다른 농도로 처리하여, 상기 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 토목향 헥산 분획물, 메틸렌 클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물의 세포 성장 억제 효과를 비교하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 토목향 순차적 분획물을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 상기 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며, 토목향 헥산 분획물을 처리한 상기 세포에서 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 토목향 헥산 분획물의 세포 성장 억제를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 토목향 헥산 분획물을 각기 다른 농도로 처리하여, 상기 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며, 상기 분획물의 처리 농도가 높을(8 ug/ml)수록 MDA-MB-231 인간 유방암 세포가 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다(도 6 참조).
또한, 알란토락톤 및 이소알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과를 비교하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 알란토락톤을 처리한 상기 세포가 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다(도 7 참조).
또한, 알란토락톤 및 이소알란토락톤에 의한 STAT3 인산화 및 단백질 발현 억제 효과를 확인하기 위해, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 및 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, 알란토락톤을 처리한 상기 세포의 STAT3 타이로신 인산화 발현이 이소알란토락톤을 처리한 세포보다 억제되는 것을 확인하였다(도 8 참조).
또한, 알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 다양한 세포에서 비교하기 위해, MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포에 알란토락톤을 각기 다른 농도로 처리하였을 때 정상 유방 세포인 MCF-10A에서는 알란토락톤이 세포 성장에 영향을 미치지 않았으나, 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231 및 MCF-7에서는 알란토락톤이 세포의 성장을 감소시키는 것을 확인하였고, 이러한 효과는 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231에서 가장 뛰어나게 억제하는 것을 확인하였으며, 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231에서 STAT3가 가장 활성화된 상태로 존재하였고, MCF-10A, MCF-7의 순서로 나타났으며, 알란토락톤을 처리하였을 때, 모든 세포에서 STAT3의 과발현을 현저히 억제하는 것을 확인하였다(도 9 참조).
또한, 토목향 헥산 분획물에 의한 STAT3 인산화 및 단백질 발현 억제 효과를 확인하기 위해, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 헥산 분획물을 처리하였을 때 상기 세포에서 농도 의존적으로 STAT3 타이로신 인산화, ERK 인산화 및 Cyclin D1 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 10 참조).
또한, 토목향 헥산 분획물과 토목향 메탄올 추출물에 의한 STAT3 인산화 및 단백질 발현 억제 효과를 비교하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 메탄올 추출물을 처리하여 비교한 결과, 토목향 헥산 분획물을 처리한 세포에서 효과적으로 STAT3 타이로신 인산화, ERK 인산화 및 Cyclin D1 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 11 참조).
또한, 토목향 분획물로부터 분리된 알락토란톡에 의한 STAT3 활성 억제를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서 알란토락톤에 의한 STAT3 활성 억제를 확인한 결과, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알락토란톡을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 STAT3의 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동을 차단하여 전사인자로서의 역활을 무력화시키는 것을 확인하였다(도 12 참조).
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 핵 단백질에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 DNA 결합 활성 억제를 확인하기 위하여 Electophoretic mobility shift assay(EMSA)을 수행한 결과, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알락토란톡을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 매우 효과적으로 차단하는 것을 확인하였다(도 13 참조).
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알락토란톡에 의한 STAT3(Tyr 705) 및 STAT3(ser 727)활성 억제를 확인한 결과, 상기 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 STAT3(Tyr 705) 발현은 3, 6, 12, 및 24시간의 모든 시간에서 억제되는 것을 확인하였고, 초기시간대에서 발현이 더 억제되는 것을 확인하였다(도 14 참조).
또한, STAT3의 또 다른 인산 작용기인 세린(Serine) 잔기의 인사화는 억제하지 못한 것을 확인하였다(도 15 참조).
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 알란토락톤에 의한 STAT3(Tyr 705) 및 STAT3(ser 727)활성 억제 효과를 확인하기 위하여, STAT3 활성 억제제로 시판되는 S31-201을 사용하여 STAT3 활성 억제를 비교한 결과, 상용화된 STAT3 억제제인 S31-201과 토목향 분획물 유래의 알란토락토를 상기 세포에 처리하여 비교한 결과, 상기 분획물을 처리한 세포에서 STAT3(Tyr 705) 인산화 활성이 낮은 농도에서 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 16 참조).
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 EGF 및 IL-6 자극원 활성 억제를 확인한 결과, 상기 세포에서 인터루킨(IL-6) 자극 20분 후 또는 표피성장인자(EGF) 자극 10분 후 STAT3 인산화 활성이 최고조로 나타나는 것을 확인하였으며, 상기 분획물 유래의 알란토락톤을 처리하였을 때, 두 종류의 자극원에 의한 STAT3의 활성이 완전하게 차단되는 것을 확인하였다(도 17 및 도 18 참조).
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락토에 의한 특이적 STAT3 인산화 차단을 확인한 결과, 상기 분획물 유래의 알란토락톤을 처리한 상기 세포에서 JAK1, JAK2 또는 Src 인산화에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으며, STAT3의 인산화는 억제하는 것을 확인하였다. 또한, STAT3의 대표적 인산가수분해효소인 SHP-1, SHP-2 및 PTEN 등의 발현 증가에도 영향을 미치지 않는 것을 확인함으로써, 상기 분획물 유래의 알란토락톤은 STAT3 인산화만 특이적으로 차단하는 것을 확인하였다(도 19 및 도 20 참조).
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 알란토락톤 및 항암제인 독소루비신의 병용 투여에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 인산화 억제 효과를 확인한 결과, 알란토락톤 및 독소루비신을 병용 처리하였을 때, 알란토락톤 또는 독소루비신 단독 처리하였을 때보다 세포 성장을 현저히 억제하는 것을 확인하였고, 독소루비신을 처리하였을 때 과발현되는 STAT3을 알란토락톤과 병용 처리시 억제하는 것을 확인하였다(도 21 참조).
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 헥산 분획물에 의한 AK1, JAK2의 인산화 및 SHP-1, SHP-2 경로에 영향을 확인한 결과, 상기 헥산 분획물을 처리한 상기 세포에서 JAK1 및 JAK2 인산화에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으며, STAT3의 인산화는 억제하는 것을 확인하였다. 또한, STAT3의 대표적 인산가수분해효소인 SHP-1 및 SHP-2의 발현 증가에도 영향을 미치지 않는 것을 확인함으로써, 상기 헥산 분획물은 STAT3 인산화만 특이적으로 차단하는 것을 확인하였다(도 22 참조).
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 헥산 분획물에 의한 DNA 분절화 및 이의 경로에 영향을 미치는지 확인한 결과, 상기 헥산 분획물을 처리한 상기 세포에서 DNA 분절화가 농도 의존적으로 증가함으로써 세포사멸이 증가하는 것을 확인하였고, 토목향 헥산 분획물로 인해 유도되는 세포사멸은 세포사멸의 대표적인 경로인 extrinsic 경로를 대표하는 caspase 8의 증가 및 intrinsic 경로를 대표하는 procaspase 9의 감소, 두 경로가 만나는 하위단계인 caspase 3 및 cleaved PARP1의 증가를 확인함으로써 두 경로 모두 경유하는 것을 확인하였다(도 23 참조).
또한, 토목향 헥산 분획물에 포함된 세스퀴테르펜락톤 계열 성분인 알란토락톤, 이소알란토락토, 이가란(igalan) 및 디구시알락톤(degusialactone), 알로안토락톤(alloantolactone)의 혼합물의 존재 여부, 구조 및 STAT3 활성 억제를 확인한 결과, 상기 토목향 헥산 분획물에 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 각각 40% 이상 존재하였으며, 미량성분으로 이가란, 디구시알락톤, 알로안토락톤이 존재하는 것을 확인하였고, 토목향 헥산 분획물의 모든 화합물에서 뛰어난 STAT3 타이로신 인산화 발현 억제 효능을 확인하였다(도 24 참조).
또한, 인간 폐암 세포, 인간 췌장암 세포 및 위암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 STAT3 활성 억제를 확인한 결과, 상기 알란토락톤을 처리한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포에서 STAT3의 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동을 차단하여 전사인자로서의 역활을 무력화시키는 것을 확인하였다(도 25 참조).
또한, 인간 폐암 세포, 인간 췌장암 세포 및 위암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 DNA 결합 활성 억제 효과를 확인하기 위하여, 각기 다른 세포에 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 상기 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 확인한 결과, 상기 분획물의 알란토락톤을 처리한 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 매우 효과적으로 차단하는 것을 확인하였다(도 26 참조).
또한, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포 이동 억제 효과를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 각기 다른 농도로 알란토락톤을 처리하였을 때, 세포의 이동이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 27 참조).
또한, 토목향 분획물 유래 알란토락톤의 세포 부착 억제 효과를 확인하기 위하여, CytoSelect™ 48-well 세포 부착 분석(Cell Biolabs, 미국)을 사용하여 측정한 결과, 토목향 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포 부착률이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 28 참조).
또한, 토목향 분획물 유래 알란토락톤의 세포 침윤 억제 효과 확인한 결과, 상기 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포 침윤이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 29 참조).
또한, 토목향 분획물 유래 알란토락톤의 균집 형성 억제 효과 확인한 결과, 상기 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포의 균집 형성이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 30 참조).
또한, STAT3 표적 유전자의 하나인 MMP-9는 세포외 기질 단백질을 분해시키는 대표적인 효소로써, 토목향 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 처리하여 MMP-9 활성 억제를 확인한 결과, 토목향 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포에서 MMP-9의 분해 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 31 참조).
또한, STAT3 활성은 세포 증식(cell proliferation), 생존(survival), 혈관 신생(angiogenesis), 세포 주기 진행(cell cycle progression) 및 세포 예정 사(programmed cell death)를 포함하는 여러 유전자의 활성을 조절한다고 보고되고 있다. 따라서, 토목향 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 처리하여 STAT3 표적 유전자의 발현을 확인한 결과, 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 c-Myc, COX-2, Cyclin D1, VEGF 및 CXCR4 유전자의 발현이 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 32 참조).
또한, 생체 내(in vivo)에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 유방암 세포 성장 억제를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 BALB/c 면역 결핍 마우스 우측 옆구리에 상기 세포를 피하주사하여 종양을 형성시 킨 후 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 알란토락톤에 의한 유방암 종양 억제를 확인한 결과, 상기 알란토락톤을 처리한 군에서 종양부피 및 종양 평균 무게가 유의적으로 낮은 것을 확인하였으며, 마우스의 체중은 변화가 없는 것을 확인함으로써, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 독성을 가지고 있지 않는 것을 확인하였다(도 33 참조).
또한, 유방암 세포를 이식한 마우스의 종양 조직에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 p-STAT3 및 Cyclind D1 발현 억제를 확인한 결과, 상기 알란토락톤을 처리한 대조군과 처리군의 조직에서 Cyclin D1 및 p-STAT3의 발현을 확인하였을 때, 상기 알란토락톤을 처리한 군의 조직에서 Cyclin D1 및 p-STAT3의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 34 참조).
따라서, 본 발명의 토목향(Inula helenium) 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 유의적으로 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타냄으로써, 상기 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 분획물은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 알란토락톤(Alantolactone, C15H20O2) 또는 화학식 2로 표시되는 이소알란토락톤(Isoalantolactone, C15H20O2)을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 토목향 분획물로부터 분리된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 STAT3 활성 억제를 특징인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 유방암은 STAT3 과발현 유방암인 것이 바람직하고, 삼중음성유방암인 것이 더 바람직하다.
본 발명의 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 유의적으로 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타냄으로써, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 유방암은 STAT3 과발현 유방암인 것이 바람직하고, 삼중음성유방암인 것이 더 바람직하다.
본 발명의 토목향 분획물은 유의적으로 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타냄으로써, 상기 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 유방암 전이 억제용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 유방암은 삼중음성유방암인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공한다.
상기 유방암은 삼중음성유방암인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 유의적으로 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타냄으로써, 상기 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품 또는 유방암 전이 억제용 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화합물이 상기와 같은 유방암 예방 및 개선, 또는 유방암 전이 억제를 위해 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.
본 발명의 건강기능식품은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 유방암 예방 및 개선, 또는 유방암 전이 억제를 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 유방암 예방 및 개선, 또는 유방암 전이 억제 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.
상기 분획물은 토목향 추출물로부터 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 부탄올 또는 물로 순차적으로 분획하여 얻은 헥산 분획물, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것이 바람직하며, 헥산으로 추출한 것이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 추출물은 토목향을 물, C1 내지 C2 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것이 바람직하며, 메탄올이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출 방법으로는 냉침 추출, 가열 추출, 초음파 추출 또는 환류 냉각 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 감압농축은 진공 감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 토목향 분획물, 또는 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 항암제와 병용 처리되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 캄포테신 (camptothecin), 플루오로우라실(fluorouracil), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이마티닙(imatinib), 제피티님(gefitinib), 베바시주맙(bevacizumab), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 허셉틴(herceptin), 독소루비신(doxorubicin) 및 에토포사이드(etoposide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 시스플라틴, 독소루비신 및 에토포사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 보다 바람직하며, 독소루비신인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 항암제인 독소루비신과 병용 처리하였을 때, 세포 성장을 더 뛰어나게 억제하고, 과발현된 STAT3를 현저히 억제함을 나타냄으로써, 상기 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 항암 보조제에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
토목향
(
Inula
helenium
) 추출물의 제조
(주)광명당제약(울산)에서 구입한 토목향(Inula helenium)의 건조 뿌리를 구입한 후, 깨끗하게 세척한 후, 1.5 kg을 100% 메탄올 10리터에 넣고, 환류냉각 장치를 이용, 수욕상에서 3시간씩 3회 추출하였다. 추출물을 여과한 다음 감압 농축하여 500 g의 추출물을 제조하였다.
<
실시예
2>
토목향
(
Inula
helenium
) 추출물
헥산
가용성
분획물의
제조
상기 <실시예 1>에서 얻어진 토목향 메탄올 추출물 중 100 g 에 물 1 L를 첨가하여 현탁시키고, 동량의 100% 헥산을 가하여 혼합하고 3 차례 반복 추출하여 얻은 추출물을 여과지로 여과한 다음, 진공 건조하여 헥산 분획물 25 g을 수득하였다.
<
실시예
3>
토목향
(
Inula
helenium
)
헥산
분획물에서
알란토락톤(
Alantolactone
) 및
이소알란토락톤
(
isoalantolactone
) 확인
토목향 헥산 분획물에서 알란토락톤 및 이소알란토락토의 존재 여부를 확인하기 위하여, HPLC를 사용하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 제조한 헥산 분획물을 HPLC로 순도를 확인하였다. HPLC를 위한 표준품으로 시판되는 알란토락토표준품(순도 99% 이상;TAUTO Biotech, 상하이, 중국) 및 이소알란토락톤(순도 99% 이상: TAUTO Biotech, 상하이, 중국) 표준품을 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 분획물에 알란토락톤(38.4%) 및 이소알란토락톤(46.2%)이 검출됨으로써, 알란토락톤 및 이소알락톤이 제대로 추출됨을 확인하였다(도 1).
<
실시예
4>
토목향
(
Inula
helenium
)
분획물로부터
알란토락톤(
Alantolactone
) 분리
상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 제조한 헥산 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 분리하였다(Biol Pharm Bull 25(10) 1370-1372, 2002).
<
실시예
5>
토목향
(
Inula
helenium
) 메탄올 추출물에서 알란토락톤(
Alantolactone
) 및
이소알란토락톤
(
isoalantolactone
) 확인
토목향 메탄올 추출물에서 알란토락톤 및 이소알란토락토의 존재 여부를 확인하기 위하여, HPLC를 사용하였다.
구체적으로, 토목향의 뿌리 1.5 kg을 100% 메탄올 10리터에 넣고, 환류냉각 장치를 이용, 수욕상에서 3시간씩 3회 추출하였다. 추출물을 여과한 다음 감압 농축하여 500 g의 추출물을 제조하였다. HPLC를 위한 표준품으로 시판되는 알란토락토표준품(순도 99% 이상;TAUTO Biotech, 상하이, 중국) 및 이소알란토락톤(순도 99% 이상: TAUTO Biotech, 상하이, 중국) 표준품을 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 토목향 메탄올 추출물에 알란토락톤(15.7%) 및 이소알락톤(15.9%)이 검출됨으로써, 상기 <실시예 3>에서 제조한 토목향 헥산 분획물이 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 2배 이상 더 함유하는 것을 확인하였다(도 2).
<
실험예
1>
토목향
(
Inula
helenium
) 메탄올 추출물의 세포 성장 억제 측정
토목향 메탄올 추출물의 세포 성장 억제 측정을 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 인간 유방암 세포는 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, 상기 세포는 10% FBS, 100ug/ml 페니실린 및 스트렙토마이신의 항생제를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 96웰 프레이트(well plate)에 1×104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후상기 <실시예 5>에서 제조한 토목향 메탄올 추출물을 0, 20, 40, 60, 80, 100 ug/ml 농도로 처리하고 6시간 및 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액의 배지를 제거하고 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시약을 웰당 0.5 mg/ml 로 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양시킨 후 배지를 제거하였고 웰 바닥에 붙은 포르마잔(formazan)을 녹이기 위해 DMSO 100 ul를 처리하였다. 그런 다음, 추가로 10분 동안 흔들어 주고 540 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 토목향 분획물을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율(%)을 계산하였다. 아울러, 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 데이터의 다중 비교의 통계학적 분석을 위해 ANOVA 분석 및 student's t-테스트를 사용하였다. P 값이 0.05 이하일 때, 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 토목향 추출물을 각기 다른 농도로 처리하였을 때 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며, 상기 분획물의 처리 농도가 높을 수록 MDA-MB-231 인간 유방암 세포가 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다(도 4).
<
실험예
2>
토목향
(
Inula
helenium
) 순차적
분획물의
세포 성장 억제 측정
토목향 순차적 분획물의 세포 성장 억제 측정을 비교하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 토목향 메탄올 추출물 중 100 g에 증류수 1 L를 첨가하여 현탁시키고 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 부탄올의 순서로 용매 분획하였다. 먼저 토목향 메탄올 추출물의 현탁액에 동량의 헥산을 가하여 혼합하고 하층의 현탁액을 분리한 후 상층의 헥산을 취하였고 이를 3차례 반복 시행하였다. 헥산 분획층을 여과지로 여과한 다음, 진공 건조하여 헥산 분획물 25 g을 수득하였다. 1 L의 메틸렌 클로라이드를 따로 분리한 현탁액과 혼합하여 하층의 메틸렌 클로라이드를 취하여 3차례 반복 시행하였다. 메틸렌 클로라이드 분획층을 여과지로 여과한 다음, 진공 건조하여 메틸렌 클로라이드 분획물 5 g을 수득하였다. 에틸 아세테이트 1 L와 현탁액을 혼합하여 하층의 현탁액을 분리한 후 상층의 에틸 아세테이트를 취하였고 이를 3 차례 반복 시행하였다. 에틸 아세테이트 분획층을 여과지로 여과한 다음, 진공 건조하여 에틸 아세테이트 분획물 2 g을 수득하였다. 부탄올 1 L와 현탁액을 혼합하여 하층의 현탁액을 분리한 후 상층의 부탄올을 취하였고 이를 3 차례 반복 시행하였다. 부탄올 분획층을 여과지로 여과한 다음, 진공 건조하여 부탄올 분획물 11 g을 수득하였다. 나머지 토목향 메탄올 추출물의 현탁액을 진공 건조하여 57 g을 수득하였다. 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 배양하였다. 그런 다음, 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 96웰 프레이트(well plate)에 1×104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 메틸렌 클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 헥산 분획물을 0, 10, 25, 50, 100 ug/ml 농도로 처리하고 6시간 및 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MTT를 수행하였고, 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 토목향 순차적 분획물을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율(%)을 계산하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 토목향 순차적 분획물을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 상기 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며, 상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 헥산 분획물을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 농도 의존적으로 사멸하는 것을 확인하였다(도 5).
<
실험예
3>
토목향
(
Inula
helenium
)
분획물의
세포 성장 억제 측정
토목향 헥산 분획물과 상기 <실험예 1>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 메탄올 추출물 및 상기 <실험예 2>에 기재된 방법으로 제조한 각각의 토목향 분획물의 세포 성장 억제 효과를 비교하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 인간 유방암 세포는 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, 상기 세포는 10% FBS, 100ug/ml 페니실린 및 스트렙토마이신의 항생제를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 96웰 프레이트(well plate)에 1×104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 헥산 분획물을 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 ug/ml 농도로 처리하고 6시간 및 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액의 배지를 제거하고 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시약을 웰당 0.5 mg/ml 로 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양시킨 후 배지를 제거하였고 웰 바닥에 붙은 formazan을 녹이기 위해 DMSO 100 ul를 처리하였다. 그런 다음, 추가로 10분 동안 흔들어 주고 540 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 토목향 분획물을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율(%)을 계산하였다. 아울러, 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 데이터의 다중 비교의 통계학적 분석을 위해 ANOVA 분석 및 student's t-테스트를 사용하였다. P 값이 0.05 이하일 때, 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 토목향 헥산 분획물을 각기 다른 농도로 처리하였을 때 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며, 상기 토목향 헥산 분획물의 처리 농도가 높을(8 ug/ml)수록 MDA-MB-231 인간 유방암 세포가 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다(도 6). 따라서, 상기 <실험예 3>의 결과를 통해 토목향 헥산 분획물이 메탄올 추출물 및 각각의 분획물 보다 인간 유방암 세포를 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다.
<
실험예
4>
알란토락톤
및
이소알란토락톤에
의한 세포 성장 억제 효과 비교
알란토락톤 및 이소알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과를 비교하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 배양하였다. 그런 다음, 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 96웰 프레이트(well plate)에 1×104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 0, 5, 10, 및 15 uM 농도로 처리하고 6시간 및 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MTT를 수행하였고, 540 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율(%)을 계산하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포가 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다(도 7).
<
실험예
5>
알란토락톤
및
이소알란토락톤에
의한
STAT3
인산화 및 단백질 발현 억제 효과 비교
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토란톤 및 이소알란토락톤을 처리하여 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 비교하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 알란토란톤 및 이소알란토락톤을 0, 5, 10 및 15 uM 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포 전체 단백질 분리는 용해 버퍼(20 mM HEPES [pH 7.6], 350 mM NaCl, 20% 글리세롤, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1% NP-40, 50 mM NaF, 0.1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail))를 사용하여 세포 용해물을 수득한 다음, 20 내지 30 ug의 단백질을 8% SDS-PAGE gel를 이용하여 100 V에서 2시간 동안 전기영동하고, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abcam), p-STAT3 Serine 727(제품번호: ab32143, Abcam), STAT3(제품번호: ab32500, Abcam), Cyclin D1(제품번호: ab40754, Abcam)을 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 항-rabbit(제품번호: sc-2004, Santacruz)을 2차 항체로 하여 1:1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광(luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 알란토란톤 및 이소알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 농도 의존적으로 STAT3 타이로신 인산화 및 Cyclin D1 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, 알란토락톤을 처리한 상기 세포의 STAT3 타이로신 인산화 발현이 이소알란토락톤을 처리한 세포보다 억제되는 것을 확인하였다(도 8).
<
실험예
6>
알란토락톤에
의한 세포 성장 및
STAT3
인산화 및 단백질 발현 억제 효과 비교
알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 다양한 세포에서 비교하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포를 배양하였다. 그런 다음, 세포 성장 억제 효과는 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포를 각각 96웰 프레이트(well plate)에 1×104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 알란토락톤을 처리하고 4시간 동안 배양한 후, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MTT를 수행하였고, 540 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 알란토락톤을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율(%)을 계산하였다.
또한, STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과는 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포에 상기 <실험예 5>와 동일한 방법으로 1차 항체 p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abcam) 및 STAT3(제품번호: ab32500, Abcam)을 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였고, 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포에 알란토락톤을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 정상 유방 세포인 MCF-10A에서는 알란토락톤이 세포 성장에 영향을 미치지 않았으나, 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231 및 MCF-7에서는 알란토락톤이 세포의 성장을 감소시키는 것을 확인하였고, 이러한 효과는 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231에서 가장 뛰어나게 억제하는 것을 확인하였으며, 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231에서 STAT3가 가장 활성화된 상태로 존재하였고, MCF-10A, MCF-7의 순서로 나타났으며, 알란토락톤을 처리하였을 때, 모든 세포에서 STAT3의 과발현을 현저히 억제하는 것을 확인하였다(도 9).
<
실험예
7>
토목향
(
Inula
helenium
)
분획물에
의한
STAT3
인산화 및 단백질 발현 억제 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 헥산 분획물 유래 알락토란톤을 처리하여 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물 유래 알락토란톤을 0, 1, 2, 4, 6 ug/ml 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포 전체 단백질 분리는 용해 버퍼(20 mM HEPES [pH 7.6], 350 mM NaCl, 20% 글리세롤, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1% NP-40, 50 mM NaF, 0.1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail))를 사용하여 세포 용해물을 수득한 다음, 20 내지 30 ug의 단백질을 8% SDS-PAGE gel를 이용하여 100 V에서 2시간 동안 전기영동하고, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abcam), p-STAT3 Serine 727(제품번호: ab32143, Abcam), STAT3(제품번호: ab32500, Abcam), Cyclin D1(제품번호: ab40754, Abcam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 항-rabbit(제품번호: sc-2004, Santacruz)을 2차 항체로 하여 1:1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광(luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 농도 의존적으로 STAT3 타이로신 인산화, ERK 인산화 및 Cyclin D1 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 10).
<
실험예
8>
토목향
(
Inula
helenium
) 메탄올 추출물에 의한
STAT3
인산화 및 단백질 발현 억제 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 5>에서 제조한 토목향 메탄올 추출물을 처리하여 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 5>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 추출물을 0, 10, 20, 40, 60 ug/ml 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 <실험예 7>과 동일한 방법을 수행하여 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제를 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 5>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 메탄올 추출물을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 농도 의존적으로 STAT3 타이로신 인산화 및 Cyclin D1 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였으나, 토목향 헥산 분획물을 처리한 세포에서 효과적으로 STAT3 타이로신 인산화, ERK 인산화 및 Cyclin D1 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 11).
<
실험예
9>
토목향
(
Inula
helenium
)
분획물로부터
분리된
알란토락톤에
의한
STAT3
활성 억제 확인
<9-1>
MDA
-MB-231 인간 유방암 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서
알
란토락톤에 의한
STAT3
활성 억제 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서 상기 <실시예 4>에서 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 STAT3 활성 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하거나, 알란토락톤을 15 uM 농도로 처리하여 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포 전체 단백질 분리는 용해 버퍼(20 mM HEPES [pH 7.6], 350 mM NaCl, 20% 글리세롤, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1% NP-40, 50 mM NaF, 0.1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)를 사용하여 세포 용해물을 수득하였다. 또한, 세포 핵 단백질은 순차적 방법에 따라서 수행하였다. 먼저 세포에 세포질 용해 버퍼(10 mM HEPES[pH 7.9], 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)와 NP-40을 처리하여 세포막을 터뜨려준 후, 원심분리하여 세포질 용해물을 제거하였다. 남아있는 핵 단백질은 핵 용해 버퍼(20 mM HEPES[pH 7.9], 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제(protease inhibitor cocktail)를 사용하여 세포내 핵 용해물을 수득하였다. 전체 단백질 또는 핵 단백질은 Bradford 시약(Bio-rad)을 사용하여 단백질의 농도를 계산하였다. 아울러, 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 상기 세포의 단백질을 분리하고, 웨스턴 블랏을 수행하여 p-STAT3(Tyr705) 및 STAT 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 STAT3의 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동을 차단하여 전사인자로서의 역할을 무력화시키는 것을 확인하였다(도 12).
<9-2>
MDA
-MB-231 인간 유방암 세포의 핵 단백질에서
알란토락톤에
의한 DNA 결합 활성 억제 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 핵 단백질에서 상기 <실시예 4>에서 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 STAT3 전사인자의 DNA에 대한 결합 능력을 확인하기 위하여 Electophoretic mobility shift assay(EMSA)를 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하거나, 알란토락톤을 15 uM 농도로 처리하여 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 상기 세포로부터 분리된 핵 단백질은 서열번호 1로 기재된 염기서열을 가진 P-end-labeled 이중-가닥 STAT3 consensus oligonucleotide(Santa Cruz)와 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 경쟁적 반응을 확인하기 위해서, 100배 농도의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 STAT3 항체를 배양 10분 전에 첨가하였다. 30분간 배양한 후, 결합된 DNA와 핵 단백질은 6% native PAGE를 이용하여 100 V에서 2시간 동안 전기영동하였다. 젤 드라이어를 이용하여 젤을 건조시켰고, BAS-1500(푸지필름)을 이용하여, 방사능 표지 밴드를 검출하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 매우 효과적으로 차단하는 것을 확인하였다(도 13).
| 서열번호 | 서열 |
| 서열번호 1 | 5'-GAT CCT TCT GGG ATT TCC TAG ATC-3' |
<9-3>
MDA
-MB-231 인간 유방암 세포에서
알란토락톤에
의한
STAT3
(
Tyr
705) 및
STAT3
(
ser
727)활성 억제 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4>에서 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 시간에 따른 STAT3(Tyr 705) 및 STAT3(ser 727)활성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM 농도로 처리하여 3, 6, 12 및 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분리한 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시키고 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abcam), p-STAT3 Serine 727(제품번호: ab32143, Abcam), STAT3(제품번호: ab32500, Abcam), Cyclin D1(제품번호: ab40754, Abcam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 항-rabbit(제품번호: sc-2004, Santacruz)를 2차 항체로 하여 1:1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광(luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 3>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 STAT3(Tyr 705) 발현은 3, 6, 12, 및 24시간의 모든 시간에서 억제되는 것을 확인하였고, 초기시간대에서 발현이 더 억제되는 것을 확인하였다(도 14).
또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, STAT3의 또 다른 인산 작용기인 세린(Serine) 잔기의 인사화는 억제하지 못한 것을 확인하였다(도 15).
<9-4>
MDA
-MB-231 인간 유방암 세포에서
알란토락톤에
의한
STAT3
(
Tyr
705) 및
STAT3
(
ser
727)활성 억제와
S31
-201에 의한
STAT3
활성 억제 비교
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4>에서 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 시간에 따른 STAT3(Tyr 705) 및 STAT3(ser 727)활성 억제와 S31-201에 의한 STAT3 활성 억제를 비교하기 위해 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 15 uM 농도로 처리하고 상용화된 STAT3 억제제 S31-201는 10, 20, 50 및 100 uM을 처리하여 6 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분리한 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시키고 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abcam), p-STAT3 Serine 727(제품번호: ab32143, Abcam), STAT3(제품번호: ab32500, Abcam), Cyclin D1(제품번호: ab40754, Abcam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 항-rabbit(제품번호: sc-2004, Santacruz)를 2차 항체로 하여 1:1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광(luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 상용화된 STAT3 억제제인 S31-201과 토목향 분획물 유래의 알란토락톤을 상기 세포에 처리하여 비교한 결과, 상기 분획물을 처리한 세포에서 STAT3(Tyr 705) 인산화 활성이 낮은 농도에서 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 16).
<9-5>
MDA
-MB-231 인간 유방암 세포에서
알란토락톤에
의한
EGF
및 IL-6 자극원 활성 억제 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4>에서 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 EGF 및 IL-6 자극원 활성 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 세럼(serum)이 함유되어 있지 않은 배지에서 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포와 10 ng/ml 인터루킨(IL-6) 및 100 ng/ml 표피성장인자(EGF)를 처리하였다. 또한, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 10 ng/ml 인터루킨(IL-6) 및 100 ng/ml 표피성장인자(EGF)를 0, 5, 10, 20, 30, 50분 동안 처리하고, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물을 15 uM 농도로 처리하여 6 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분리한 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시키고 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abcam) 및 STAT3(제품번호: ab32500, Abcam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 2차 항체 항-rabbit(제품번호: sc-2004, Santacruz)를 1:1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광(luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 17 및 도 18에 나타낸 바와 같이, 상기 세포에서 인터루킨(IL-6) 자극 20분 후 또는 표피성장인자(EGF) 자극 10분 후 STAT3 인산화 활성이 최고조로 나타나는 것을 확인하였으며, 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때, 두 종류의 자극원에 의한 STAT3의 활성이 완전하게 차단되는 것을 확인하였다(도 17 및 도 18).
<9-6>
MDA
-MB-231 인간 유방암 세포에서
알란토락톤에
의한 특이적
STAT3
인산화 차단 확인
STAT3의 인산화는 상위단계 경로인 JAK1, JAK2 또는 Src의 인산화에 의해서 이루어진다. 따라서, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4>에서 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 JAK1, JAK2 또는 Src의 인산화에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM 농도로 처리하여 4 시간 동안 배양하거나, 알란토락톤을 15 uM 농도로 처리하여 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분리한 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시키고 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 p-JAK1(제품번호: ab138005, Abcam), JAK1(제품번호: ab133666, Abcam), p-JAK2(제품번호: ab32101, Abcam), JAK2(제품번호: ab108596, Abcam), p-Src(제품번호: ab32078, Abcam) 및 Src(제품번호: ab32102, Abcam), 또는 SHP-1(제품번호: GTX102864, Genetex), SHP-2(제품번호: GTX101062, Genetex) 및 PTEN(제품번호: GTX101025, Genetex)을 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 2차 항체 항-rabbit(제품번호: sc-2004, Santacruz)를 1:1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광(luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 19 및 도 20에 나타낸 바와 같이, 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 상기 세포에서 JAK1, JAK2 또는 Src 인산화에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으며, STAT3의 인산화는 억제하는 것을 확인하였다. 또한, STAT3의 대표적 인산가수분해효소인 SHP-1, SHP-2 및 PTEN 등의 발현 증가에도 영향을 미치지 않는 것을 확인함으로써, 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 STAT3 인산화만 특이적으로 차단하는 것을 확인하였다(도 19 및 도 20).
<9-7>
알란토락톤
및 항암제인
독소루비신(doxorubicin)의
병용 투여에 의한 세포 성장 및
STAT3
인산화 및 단백질 발현 억제 효과 비교
알란토락톤 및 항암제인 독소루비신의 병용 투여에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 배양하였다. 그런 다음, 세포 성장 억제 효과는 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 96웰 프레이트(well plate)에 1×104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 알란토락톤(15 uM) 및 독소루비신(0, 1 및 2 uM)을 처리하고 4시간 동안 배양한 후, 상기 <실험예 6>과 동일한 방법으로 MTT를 수행하였고, 540 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 알란토락톤을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율(%)을 계산하였다.
또한, STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과는 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실험예 6>과 동일한 방법으로 1차 항체 p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abcam) 및 STAT3(제품번호: ab32500, Abcam)을 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였고, 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락톤 및 독소루비신을 병용 처리하였을 때, 알란토락톤 또는 독소루비신 단독 처리하였을 때보다 세포 성장을 현저히 억제하는 것을 확인하였고, 독소루비신을 처리하였을 때 과발현되는 STAT3을 알란토락톤과 병용 처리시 억제하는 것을 확인하였다(도 21).
<
실험예
10>
토목향
(
Inula
helenium
)
헥산
분획물에
의한
STAT3
활성 억제 확인
<10-1>
MDA
-MB-231 인간 유방암 세포에서
토목향
헥산
분획물에
의한 특이적
STAT3
인산화 차단 확인
STAT3의 인산화는 상위단계인 JAK1, JAK2의 인산화 및 SHP-1, SHP-2 경로에 의해서 이루어진다. 따라서, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 헥산 분획물을 처리하였을 때 JAK1, JAK2의 인산화 및 SHP-1, SHP-2 경로에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물을 0, 2, 4, 6, 8 ug/ml 농도로 처리하여 1 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분리한 다음, 상기 실험예 <9-6>과 동일한 방법으로 1차 항체 p-JAK1(제품번호: ab138005, Abcam), JAK1(제품번호: ab133666, Abcam), p-JAK2(제품번호: ab32101, Abcam), JAK2(제품번호: ab108596, Abcam), p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abcam), p-STAT3 Serine 727(제품번호: ab32143, Abcam) 및 STAT3(제품번호: ab32500, Abcam), 또는 SHP-1(제품번호: GTX102864, Genetex) 및 SHP-2(제품번호: GTX101062, Genetex)를 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, 상기 헥산 분획물을 처리한 상기 세포에서 JAK1 및 JAK2 인산화에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으며, STAT3의 인산화는 억제하는 것을 확인하였다. 또한, STAT3의 대표적 인산가수분해효소인 SHP-1 및 SHP-2의 발현 증가에도 영향을 미치지 않는 것을 확인함으로써, 상기 헥산 분획물은 STAT3 인산화만 특이적으로 차단하는 것을 확인하였다(도 22).
<10-2>
MDA
-MB-231 인간 유방암 세포에서
토목향
헥산
분획물에
의한 DNA 분절화(fragmented) 확인
세포사멸이 증가하면 DNA 분절화가 증가하게된다. 따라서, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 헥산 분획물을 처리하였을 때 DNA 분절화 및 이의 경로에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물을 0, 2, 4, 6, 8 ug/ml 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, DNA 분절 분석은 각 시간마다 물질이 처리된 세포를 수확하여 PBS로 2회 세척하고 10분간 15,000 rpm에서 원심분리하였다. 세포는 Triton X-100 용해 버퍼(50 mM Tris-Cl buffer [pH 8.0], 0.2 M EDTA, 5% Triton X-100)를 처리하여 세포 용해물을 수득하였다. DNA는 25:24:1(v/v/v) 중성 페놀(neutral phenol):클로로포름(chloroform):이소아밀알코올(isoamyl alcohol) 시약을 사용하여 추출하였고, 아세트산암모늄(ammonium acetate) 및 100% 에탄올을 이용하여 DNA를 침전시켰다. 불순물 및 RNA를 제거하기 위하여 70% 에탄올로 씻어주고, 공기 중에서 완전히 건조시킨 뒤, 에티디움브로마이드(EtBr)를 포함하는 2% 아가로스 겔로 1시간 동안 전기영동하여, UV transilluminator에서 관찰하였다.
또한, 경로 확인은 외적인(extrinsic) 경로를 대표하는 caspase 8 및 고유한(intrinsic) 경로를 대표하는 procaspase 9, 두 경로가 만나는 하위단계인 caspase 3 및 cleaved PARP1을 이용하여 확인하였다. 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물을 0, 2, 4, 6, 8 ug/ml 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분리한 다음, 상기 실험예 <9-6>과 동일한 방법으로 1차 항체 PARP-1(제품번호: sc-7150, Santacruz), procaspase 3(제품번호: sc-7148, Santacruz), active caspase 3(제품번호: ab32042, Abcam), procaspase 9(제품번호: sc-7885, Santacruz), procaspase 8(제품번호: sc-7890, Santacruz), active caspase 8(제품번호: ab32397, Abcam)을 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, 상기 헥산 분획물을 처리한 상기 세포에서 DNA 분절화가 농도 의존적으로 증가함으로써 세포사멸이 증가하는 것을 확인하였고, 토목향 헥산 분획물로 인해 유도되는 세포사멸은 세포사멸의 대표적인 경로인 extrinsic 경로를 대표하는 caspase 8의 증가 및 intrinsic 경로를 대표하는 procaspase 9의 감소, 두 경로가 만나는 하위단계인 caspase 3 및 cleaved PARP1의 증가를 확인함으로써 두 경로 모두 경유하는 것을 확인하였다(도 23).
<10-3>
토목향
헥산
분획물
구성성분의 구조 및
STAT3
활성 억제 확인
토목향 헥산 분획물에 포함된 세스퀴테르펜락톤 계열 성분인 알란토락톤, 이소알란토락토, 이가란(igalan) 및 디구시알락톤(degusialactone), 알로안토락톤(alloantolactone)의 혼합물의 존재 여부, 구조 및 STAT3 활성 억제를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 제조한 헥산 분획물을 HPLC로 확인하여 화합물의 존재 여부 및 구조를 확인하였고, 또한, STAT3 활성 억제 효과는 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실험예 5>와 동일한 방법으로 1차 항체 p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abcam) 및 STAT3(제품번호: ab32500, Abcam)을 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였고, 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, 상기 토목향 헥산 분획물에 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 각각 40% 이상 존재하였으며, 미량성분으로 이가란, 디구시알락톤, 알로안토락톤이 존재하는 것을 확인하였고, 토목향 헥산 분획물의 모든 화합물에서 뛰어난 STAT3 타이로신 인산화 발현 억제 효능을 확인하였다(도 24).
<
실험예
11> 인간 폐암 세포, 인간 췌장암 세포 및 위암 세포에서
토목향
분획물로부터 분리된
알란토락톤에
의한
STAT3
활성 억제 확인
<11-1> 세포 배양
A549 인간 폐암 세포는 ATCC로부터 구입하였고, Panc-1 인간 췌장암 세포는 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, AGS 위암 세포는 한국 세포주 은행으로부터 구입하여, A549 인간 폐암 세포는 10% FBS, 100ug/ml 페니실린 및 스트렙토마이신의 항생제를 함유하는 RPMI 1640을 사용하였고, Panc-1 인간 췌장암 세포는 10% FBS, 100ug/ml 페니실린 및 스트렙토마이신의 항생제를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 각기 다른 상기 세포를 96웰 프레이트(well plate)에 1×104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 상기 <실시예 4>에서 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 ug/ml 농도로 처리하고 6시간 및 24시간 동안 배양하였다.
<11-2> 각기 다른 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서
토목향
분획물로부터
분리된
알란토락톤에
의한
STAT3
활성 억제 확인
상기 실험예 <11-1>과 동일한 방법으로 배양한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서 상기 <실시예 3>에서 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 STAT3 활성 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <11-1>과 동일한 방법으로 배양한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포 전체 단백질 분리는 용해 버퍼(20 mM HEPES [pH 7.6], 350 mM NaCl, 20% 글리세롤, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1% NP-40, 50 mM NaF, 0.1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail))를 사용하여 세포 용해물을 수득하였다. 또한, 세포 핵 단백질은 순차적 방법에 따라서 수행하였다. 먼저 세포에 세포질 용해 버퍼(10 mM HEPES [pH 7.9], 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)와 NP-40을 처리하여 세포막을 터뜨려준 후, 원심분리하여 세포질 용해물을 제거하였다. 남아있는 핵 단백질은 핵 용해 버퍼(20 mM HEPES [pH 7.9], 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제(protease inhibitor cocktail)를 사용하여 세포내 핵 용해물을 수득하였다. 전체 단백질 또는 핵 단백질은 Bradford 시약 (Bio-rad)을 사용하여 단백질의 농도를 계산하였다. 아울러, 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 상기 세포의 단백질을 분리하고, 웨스턴 블랏을 수행하여 p-STAT3(Tyr705) 및 STAT 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포에서 STAT3의 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동을 차단하여 전사인자로서의 역활을 무력화시키는 것을 확인하였다(도 25).
<11-3> 각기 다른 세포의 핵 단백질에서
토목향
분획물로부터
분리된
알
란토락톤에 의한 DNA 결합 활성 억제 확인
상기 실험예 <11-1>과 동일한 방법으로 배양한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서 상기 <실시예 4>에서 기재된 방법으로 분리된 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 STAT3 전사인자의 DNA에 대한 결합 능력을 확인하기 위하여 Electophoretic mobility shift assay(EMSA)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <11-1>과 동일한 방법으로 배양한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 헥산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-2>와 동일한 방법으로 상기 세포로부터 분리된 핵 단백질은 서열번호 1로 기재된 염기서열을 가진 P-end-labeled 이중-가닥 STAT3 consensus oligonucleotide(Santa Cruz)와 37°C에서 30분 동안 배양하였다. 경쟁적 반응을 확인하기 위해서, 100배 농도의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 STAT3 항체를 배양 10분 전에 첨가하였다. 30분간 배양한 후, 결합된 DNA와 핵 단백질은 6% native PAGE를 이용하여 100 V에서 2시간 동안 전기영동하였다. 젤 드라이어를 이용하여 젤을 건조시켰고, BAS-1500(푸지필름)을 이용하여, 방사능 표지 밴드를 검출하였다.
그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 매우 효과적으로 차단하는 것을 확인하였다(도 26).
<
실험예
12>
토목향
(
Inula
helenium
)
분획물로부터
분리된
알란토락톤의
세포 이동 억제 효과 확인
토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포 이동 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 12-웰 배양판에 분주하여 37℃에서 80 내지 90%로 가득 찰 때까지 배양하였다. 세포는 200 ㎕ 팁으로 긁어내었고, 상처입은 세포들을 시료에 노출시켰다. 그런 다음, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 5, 10 및 15 uM 농도로 처리한 다음, 24 시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 세포들을 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고 현미경하에 분석하였다.
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 각기 다른 농도로 알란토락톤을 처리하였을 때, 세포의 이동이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 27).
<
실험예
13>
토목향
(
Inula
helenium
)
분획물로부터
분리된
알란토락톤의
세포 부착 억제 효과 확인
토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포부착 억제 효과를 확인하기 위하여, CytoSelect™ 48-well 세포 부착 분석(Cell Biolabs, 미국)을 사용하여 측정하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 5, 10 및 15 uM 농도로 24시간 동안 처리하였다. 트립신-EDTA로 세포를 회수하고 냉각시킨 PBS로 2회 세척하여 3000 rpm로 5분 동안 원심분리하였다. 또한, 동일한 개수의 세포를 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐 타입 I(collagen type I), 콜라겐 타입 IV(collagen type IV), 라미닌(laminin), 피브리노겐(fibrinogen) 또는, BSA로 기질이 코팅된 웰에 첨가하고 90분 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착시켰다. 비-부착성 세포는 PBS로 세척하여 제거하였다. 부착성 세포는 세포 염색 용액을 처리하고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 정량하였다.
그 결과, 도 28에 나타낸 바와 같이, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포 부착률이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 28).
<
실험예
14>
토목향
(
Inula
helenium
)
분획물로부터
분리된
알란토락톤의
세포 침윤 억제 효과 확인
토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포 침윤 억제 효과를 확인하기 위하여, 24-웰 트랜스웰 챔버(SPL, 한국)를 사용하여 폴리카보네이트 막(8 μM pore size, Corning, NY, NY)을 통과하는 세포를 측정함으로써 평가하였다.
구체적으로, 상부 챔버 웰의 폴리카보네이트 막은 Matrigel(1 mg/㎖, BD, 미국)으로 코팅하고 37℃에서 30분 동안 건조시켰다. 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 5, 10 및 15 uM 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 트립신-EDTA로 상기 세포를 회수하고 냉각시킨 PBS로 2회 세척하여 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상부 챔버 웰 당 5 × 104 농도로 세포를 첨가하고 37℃에서 24 시간 동안 배양한 후에, 막의 상부에서 침윤되지 않은 세포들을 면봉으로 닦아내고, 막을 통과하여 침윤한 세포들을 고정한 후에 2% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하였다. 상기 염색된 세포들은 광학현미경하에 무작위로 선택된 곳에서 계수하였다.
그 결과, 도 29에 나타낸 바와 같이, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포 침윤이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 29).
<
실험예
15>
토목향
(
Inula
helenium
)
분획물로부터
분리된
알란토락톤의
균집 형성 억제 효과 확인
토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 처리하여 장기간의 효과를 확인하기 위하여, 균집 형성 억제 효과를 하기와 같은 방법을 수행하여 측정하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 24-웰 배양판에 웰 당 500 세포 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 5, 10 및 15 uM 농도로 24시간 동안 처리하고, 깨끗한 배지로 교체해 주었다. 균집이 형성될 때까지 상기 세포를 10일 내지 14일 동안 키우고, 균집이 형성되었을 때, 상기 세포를 고정하여 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 사용하여 염색시킨 후 현미경에서 관찰하였다.
그 결과, 도 30에 나타낸 바와 같이, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포의 균집 형성이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 30).
<
실험예
16> 유방암 세포에서
토목향
(
Inula
helenium
)
분획물로부터
분리된
알란토락톤에
대한
MMP
-9의 활성 억제 확인
STAT3 표적 유전자의 하나인 MMP-9는 세포외 기질 단백질을 분해시키는 대표적인 효소로써, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 처리하여 MMP-9 활성 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 수행하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 2 × 105 세포/웰로 희석하여 12-웰 배양판에 분주하고 24시간 동안 배양한 다음, 세럼(serum)이 포함되지 않은 배지로 교체하였다. 그런 다음, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 5, 10 및 15 uM 농도로 24시간 동안 처리하였다. 배양 배지를 모아서, 농축한 다음 0.1％ 젤라틴을 포함하는 8％ SDS-PAGE상에 로딩하고, 전기영동을 수행하였다. 젤을 2.5％ Triton X-100 용액으로 30 분 동안 2회 세척하고, 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.6)로 30분간 세척하여 SDS를 제거한 후, 젤을 10 mM CaCl2 및 200 mM NaCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl(pH 7.6)를 사용하여 37℃에서 24 시간 동안 배양하여 젤라틴을 분해시켰다. 활성화된 젤을 45％ 메탄올 및 10％ 아세트산에서 0.11％ 쿠마씨 블루(Coomassie Blue) R-250으로 염색한 후, 45％ 메탄올 및 10％ 아세트산 용액으로 탈염색 하였다. 각 젤라티나아제의 젤라틴 분해 활성은 파란색 배경에 대한 깨끗한 밴드를 확인하여 검출하였다.
그 결과, 도 31에 나타낸 바와 같이, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포에서 MMP-9의 분해 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 31).
<
실험예
17> 유방암 세포에서
STAT3
조절 하위단계 유전자 발현 억제 확인
STAT3 활성은 세포 증식(cell proliferation), 생존(survival), 혈관 신생(angiogenesis), 세포 주기 진행(cell cycle progression) 및 세포 예정 사(programmed cell death)를 포함하는 여러 유전자의 활성을 조절한다고 보고되고 있다. 따라서, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 처리하여 STAT3 표적 유전자의 발현을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 상기 <실시예 4>와 동일한 방법으로 세포 단백질을 수득하여 전기영동 하고, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 c-Myc(제품번호: ab, Abcam), COX-2(제품번호: sc-1745, Santacruz), Cyclin D1(제품번호: ab40754, Abcam), VEGF(제품번호: ab51745, Abcam) 및 CXCR4(제품번호: ab2074, Abcam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 2차 항체 항-rabbit(제품번호: sc-2004, Santacruz)를 1:1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광(luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 32에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 c-Myc, COX-2, Cyclin D1, VEGF 및 CXCR4 유전자의 발현이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 32).
<
실험예
18>
생체내(
in vivo
)에서
토목향(
Inula helenium
)으로부터
분리된
알란토락톤에
의한 유방암 세포 성장 억제 확인
<18-1> 동물 사육
동물 사육과 모든 실험 절차는 서울대학교 동물실험윤리위원회의 승인과 절차에 따라서 진행되었다 (승인번호: 130417-5). 실험 동물실 온도 23±3 ℃, 습도 55±5 % 및 명암주기는 12시간으로 유지하고, 모든 실험동물은 실험동물실에서 1주일 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
<18-2>
토목향(
Inula helenium
)으로부터
분리된
알란토락톤에
의한 유방암 종양 억제 확인
생체내(in vivo)에서 토목향으로부터 분리된 알란토락톤의 항종양 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 트립신-EDTA 용액을 이용하여 배양판 바닥으로부터 떼어낸 다음, DMEM에 상기 세포를 1 × 107 세포/ml 농도가 되도록 희석하였다. 그런 다음, (주)나라바이오텍에서 구입한 암컷 BALB/c 면역 결핍 마우스 6주령((주)나라바이오텍, 한국) 우측 옆구리에 상기 세포를 약 200 ul 씩 피하주사하였다. 종양이 형성되도록 1 주일가량 유지시킨 후, 그룹당 개체수 6마리로 분리하여, 대조군 및 처리 군으로 나누었다. 대조군은 PBS로 처리하였고, 처리군은 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 2.5 mg/kg 및 10 mg/kg 농도로 이틀에 한번 씩 복강 투여하였다. 상기 마우스의 무게 및 암의 크기는 이틀마다 캘리퍼를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 33에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 군과 대조군에서 종양 부피 및 종양 무게를 비교하였을 때, 상기 알란토락톤을 처리한 군에서 종양부피 및 종양 평균 무게가 유의적으로 낮은 것을 확인하였으며, 상기 마우스의 체중은 변화가 없는 것을 확인함으로써, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 독성을 가지고있지 않는 것을 확인하였다(도 33).
<18-3> 유방암 종양 조직에서
토목향(
Inula helenium
)으로부터
분리된
알
란토락톤에 의한 p-
STAT3
및
Cyclind
D1
발현 억제 확인
상기 실험예 <18-2>에 기재된 방법으로 유방암 세포를 이식한 마우스에 상기 <실시예 4>와 동일한 방법으로 제조한 토목향으로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 유방암 조직에서 상기 알란토락톤에 의해 p-STAT3 및 Cyclind D1 발현 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <18-2>에 기재된 방법으로 유방암 세포를 이식한 마우스의 조직을 적출하여 상기 <실험예 4>와 동일한 방법으로 조직 단백질을 수득하여 전기영동 하고, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 Cyclin D1(제품번호: ab40754, Abcam) 및 p-STAT3 Tyrosine 705 (제품번호: ab76315, Abcam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 2차 항체 항-rabbit(제품번호: sc-2004, Santacruz)를 1:1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광(luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항-β-액틴(actin)(제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 34에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 처리 군과 대조군의 조직에서 Cyclin D1 및 p-STAT3의 발현을 확인하였을 때, 상기 알란토락톤을 처리한 군의 조직에서 Cyclin D1 및 p-STAT3의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 34).
<110> SNU R&DB FOUNDATION
<120> The pharmaceutical composition Inula helenium hexane fractions
thereof or compound isolated from the fraction comprising
inhibitory activity of STAT3 for prevention or treatment of
breast cancer
<130> 2015P-02-022
<150> KR 10-2014-0021913
<151> 2014-02-25
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-end-labeled double strand STAT3 consensus oligonucleotide
<400> 1
gatccttctg ggatttccta gatc 24
Claims (22)
- 토목향(Inula helenium) 분획물을 유효성분으로 함유하는 삼중음성유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 분획물은 토목향 추출물로부터 헥산(hexane), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 부탄올(butanol) 또는 물로 순차적으로 분획하여 얻은 헥산 분획물, 메틸렌 클로라이드 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 추출물은 토목향을 물, C1 내지 C2 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 토목향 분획물은 STAT3 억제활성을 갖는 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 하기 화학식 1로 표시되는 알란토락톤(Alantolactone, C15H20O2) 또는 화학식 2로 표시되는 이소알란토락톤(Isoalantolactone, C15H20O2)을 유효성분으로 함유하는 삼중음성유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]
; 및
[화학식 2]
.
- 제 6항에 있어서, 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 토목향 분획물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 6항에 있어서, 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 STAT3 억제 활성을 하는 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중음성유방암은 STAT3 과발현 삼중음성유방암인 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 삼중음성유방암 전이 억제용 약학적 조성물.
- 알란토락톤 또는 이소 알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 삼중음성유방암 전이 억제용 약학적 조성물.
- 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 삼중음성유방암 예방 및 개선용 건강기능식품.
- 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 삼중음성유방암 예방 및 개선용 건강기능식품.
- 삭제
- 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 삼중음성유방암 전이 억제용 건강기능식품.
- 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 삼중음성유방암 전이 억제용 건강기능식품.
- 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 삼중음성유방암에 대한 항암 보조제.
- 제 18항에 있어서, 상기 토목향 분획물은 항암제와 병용 처리되는 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암에 대한 항암 보조제.
- 제 19항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 캄포테신 (camptothecin), 플루오로우라실(fluorouracil), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이마티닙(imatinib), 제피티님(gefitinib), 베바시주맙(bevacizumab), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 허셉틴(herceptin), 독소루비신(doxorubicin) 및 에토포사이드(etoposide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암에 대한 항암 보조제.
- 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 삼중음성유방암에 대한 항암 보조제.
- 제 21항에 있어서, 상기 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 항암제와 병용 처리되는 것을 특징으로 하는 삼중음성유방암에 대한 항암 보조제.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2015/001831 WO2015130081A1 (ko) | 2014-02-25 | 2015-02-25 | Ｓｔａｔ３ 저해활성을 갖는 토목향 헥산 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물 |
Applications Claiming Priority (2)
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2015
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Non-Patent Citations (1)
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| Phytotherapy Research. 2006. Vol.20, pp.970-980.* |
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