KR102615763B1 - 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 및 유효 펩타이드 서열을 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 흑염소육골즙으로 효소분해하여 수득한 저분자 흑염소골즙 효소분해물과 이로부터 분리된 유효 펩타이드를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 흑염소육골을 열수 추출하여 수득한 흑염소육골즙을 최적의 효소 구성으로 효소분해하여 효소분해물을 수득하고, 이로부터 서열번호 1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 유효 펩타이드를 분리하는 방법을 제공한다. 상기와 같이 수득한 본 발명의 흑염소육골즙 가수분해물 및 이로부터 분리된 유효 펩타이드는 산화질소 및 프로스타글란딘 E2 생성 억제를 통한 높은 항염 효과를 발휘하여 항염용 기능성 식품, 기능성 화장품이나, 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 기능성 약품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

저분자 흑염소육골즙 효소분해물 및 유효 펩타이드 서열을 함유하는 조성물{Composition containing small molecular weight enzyme hydrolysates of black goat extracts and effective peptide sequence}
본 발명은 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 및 유효 펩타이드 서열을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 흑염소육골즙으로 효소분해하여 수득한 저분자 흑염소골즙 효소분해물과 이로부터 분리된 유효 펩타이드를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
최근 현대인들은 바쁜 일상으로 인해 규칙적인 운동, 균형 잡힌 식사, 충분한 휴식이 부족하고 환경 오염원과 스트레스에 쉽게 노출되어 있어 면역력이 약해지기가 쉽다. 이에 건강기능식품, 화장품, 약품에 대한 관심이 증가하였으며, 이에 따른 세계 시장 규모도 꾸준히 증가하는 추세이다. 특히 건강기능식품 중 기능성 내용별 점유율에서는 '면역기능개선'이 39%로 1위를 차지하여 소비자들은 면역력 증진에 큰 관심을 가지고 있다.
면역이란 외부에 침입에 방어하는 생체 시스템으로 적응면역과 선천면역 시스템으로 나누어진다. 면역 반응 중 하나인 염증(inflammation)은 상처나 세균 감염과 같은 물리적, 화학적 자극이 있을 때 손상 부위를 회복시키는 중요한 신체 방어 기전 가운데 하나이다. 하지만 과도하거나 지속적인 염증반응이 일어나면 점막 손상을 촉진시켜 결과적으로 부종, 통증, 발열 등을 유발하며, 심혈관 질환 류마티스 관절염, 및 암과 같은 질병을 야기할 수 있다. 염증 질환을 치료하기 위한 항염증제로 스테로이드성과 비스테로이드성으로 구분되며, 이들은 대부분 합성 항염증제로 치료 효과 이외에도 다양한 부작용을 수반하는 경우가 많다. 따라서 효과가 높고 부작용이 적은 항염증제에 대한 개발이 필요한 실정이다.
대식세포는 염증반응에 관여하는 주요 면역세포로 알려져 있으며, 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)나 IFN-γ, TNF-α와 같은 사이토카인 자극에 의해 다양한 MAPKs 인자들(JNK, ERK, p38)이 인산화로 활성화되고, 이는 핵 내의 activator protein-1의 전사를 활성화시켜 염증성 싸이토카인의 발현을 증가시킨다. 또한 세포질의 NF-κB를 핵내로 이동시켜 염증반응을 활성화시키고 염증성 싸이토카인을 생성하고, 질소산화물 합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS), 사이클로옥시제나제(cycloozygenase; COX-2) 발현을 통한 염증성 단백질 생성 증가시키는 것으로 알려져 있다.
산화질소(nitric oxide; NO)는 반응성이 큰 물질로 LPS, IFN-γ, TNF-α와 같은 염증성 자극을 받게되면 다양한 세포에서 iNOS에 의해 생성된다. 소량의 NO은 염증반응에 있어서 혈관확장, 신경전달, 병원체에 대한 세포파괴 등과 같은 긍정적인 생리기능을 담당하지만, 과도하게 생성된 NO은 염증과 암을 포함한 다양한 질병 생성 과정에 관여하며 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 일으켜 만성질환으로의 진행에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
프로스타글란딘(prostaglandin; PG)은 여러 다양한 조직에서 물질대사를 조절하는 물질로 혈관의 수축과 확장, 혈압, 발열, 염증 조절과 같은 다양한 기능에 관여한다. 특히 염증 반응에 관여하는 PGE2는 arachidonic acid로부터 COX-2에 의하여 산화되어 생성된다. 이는 조직의 염증 및 통증을 유발한다. 따라서, 상기 산화질소(NO)와 프로스타글란딘 E2의 생성을 억제하는 물질을 탐색함으로써 효과적인 항염증성 물질을 판단할 수 있다.
흑염소는 '3저 4고 식품'으로 불리는데, 3저는 저지방, 저콜레스테롤, 저오염(친환경 식품)을 뜻하고, 4고는 고단백, 고칼슘, 고철분, 고비타민을 말한다. 옛날부터 아이들 성장, 골다공증 에방, 빈혈, 정력증진, 피부질환 증상 완화, 성인병(동맥경화, 고혈압, 심장병) 완화 등 다양한 효능이 있다고 알려져 보양식, 건강식으로 이용되고 있다. 특히, 비타민 E의 함량이 높고, 적색육 중에서 티아민(thiamin)이 0.1 mg/100 g, 리보플라빈(riboflavin)이 0.56 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 가지고 있다고 알려져 있다. 또한, 흑염소는 다른 식육(소, 돼지, 닭)에 비해 칼슘과 철의 함량이 높고 포화지방산과 콜레스테롤 함유량이 적다. 우리나라는 흑염소를 주로 육골즙의 형태로 섭취하고 있으며 흑염소육골즙 또한 환자 노약자, 임산부의 기력회복 및 원기회복에 좋다고 알려져 있다. 하지만 흑염소육골즙의 면역증진 및 항염증 효과에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다.
따라서 본 발명자들은 부작용이 없는 천연 소재인 흑염소육골즙으로 효소 분해하여 수득한 효소 분해물로부터 항염증 효능이 있는 유효 펩타이드를 개발하고자 하였다.
대한민국 공개특허 제10-2012-0049047호(공개일자: 2012.05.16.)는, 굴 단백질 가수분해물로부터 분리된 펩티드와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항염증 조성물 및 굴 단백질 가수분해물의 제조방법과 상기 가수분해물로부터 펩티드를 분리 정제하는 방법에 대해 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1536215호(등록일자: 2015.07.07.)는, 해파리 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염, 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에 대해 기재되어 있다.
본 발명은 흑염소육골즙을 효소분해하여 저분자 흑염소육골즙 효소분해물을 수득하고, 이로부터 분리한 유효 펩타이드를 개발함으로써 이를 함유하여 뛰어난 항염 효과를 발휘하는 식품 조성물, 화장료 조성물 및 약학 조성물을 제공하고자한다.
본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 흑염소육골즙 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 식품 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 흑염소육골즙 효소분해물은, 바람직하게 알칼라제(alcalase), 프로테 에이엑스(proteAX) 및 트립신(trypsin)을 처리하여 제조된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 흑염소육골즙 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 화장료 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 흑염소육골즙 효소분해물은, 바람직하게 알칼라제(alcalase), 프로테 에이엑스(proteAX) 및 트립신(trypsin)을 처리하여 제조된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 흑염소육골즙 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 흑염소육골즙 효소분해물은, 바람직하게 알칼라제(alcalase), 프로테 에이엑스(proteAX) 및 트립신(trypsin)을 처리하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명은 흑염소육골을 열수 추출하여 수득한 흑염소육골즙을 최적의 효소 구성으로 효소분해하여 효소분해물을 수득하고, 이로부터 서열번호 1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 유효 펩타이드를 분리하는 방법을 제공한다. 상기와 같이 수득한 본 발명의 흑염소육골즙 가수분해물 및 이로부터 분리된 유효 펩타이드는 산화질소 및 프로스타글란딘 E2 생성 억제를 통한 높은 항염 효과를 발휘하여 항염용 기능성 식품, 기능성 화장품이나, 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 기능성 약품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물을 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 처리에 따른 마우스 대식세포의 생존율을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 처리에 따른 마우스 대식세포의 산화질소(NO) 생성량을 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 처리에 따른 마우스 대식세포의 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성량을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물로부터 분배크로마토그래피를 이용한 유효 펩타이드 분획(F1~F5)의 크로마토그램 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물로부터의 유효 펩타이드 분획의 항산화 활성(ORAC)을 분석한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물로부터의 유효 펩타이드 분획의 산화질소, 프로스타글란딘 E2 생성량을 측정한 결과 그래프이다.
옛날부터 흑염소는 아이들 성장, 골다공증 에방, 빈혈, 정력증진, 피부질환 증상 완화, 성인병(동맥경화, 고혈압, 심장병) 완화 등 다양한 효능이 있다고 알려져 보양식, 건강식으로 이용되고 있다. 또한, 흑염소는 다른 식육(소, 돼지, 닭)에 비해 칼슘과 철의 함량이 높고 포화지방산과 콜레스테롤 함유량이 적다. 우리나라는 흑염소를 주로 육골즙의 형태로 섭취하고 있으며 흑염소육골즙 또한 환자 노약자, 임산부의 기력회복 및 원기회복에 좋다고 알려져 있다. 하지만 흑염소육골즙의 면역증진 및 항염증 효과에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 따라서 본 발명은 면역증진 및 항염증 효과를 발휘하기 위한 소재로 흑염소를 이용하여 최적의 방법을 찾고자 예의 노력하였다.
이에 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 식품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 흑염소육골즙 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 식품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 흑염소육골즙 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 흑염소육골즙 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 흑염소육골즙은, 당 업계에서 추출에 사용하는 방법이라면 어느 것이든 제한되지 않으나, 바람직하게 흑염수육골 무게 대비 2~4배의 물을 첨가하여 열수 추출하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 110~130℃에서 8~12시간 열수 추출하는 것이 좋다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 흑염소육골즙 효소분해물은, 효소분해를 수행하기 전 지방을 제거하는 것이 좋으며, 바람직하게 서로 다른 종류의 가수분해효소를 사용하여 여러 번 수행하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 알칼라제(alcalase), 프로테 에이엑스(proteAX) 및 트립신(trypsin)의 3가지 종류의 효소를 사용하되 이들을 알칼라제, 프로테 에이엑스, 트립신 순서대로 각각 1~3시간씩 처리하는 것이 좋다. 이때, 프로테 에이엑스(proteAX)는 프로테아제의 일종이다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 흑염소육골즙 효소분해물은, 효소처리한 후 저분자(3kDa 이하)로 분리하는 것이 좋다.
한편, 하기 실험에 의하면, 본 발명에서 개시하는 저분자 흑염소육골즙 효소분해물은 세포 독성을 나타내지 않아 안전한 조성물로 이용될 수 있었고, 산화질소 생성 억제 및 프로스타글란딘 E2 생성 억제를 통해 항염 효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 또한, 상기 저분자 흑염소육골즙 효소분해물로부터 분리된 유효 펩타이드 분획은 우수한 항산화 활성을 나타내면서, 상기 저분자 흑염소육골즙 효소분해물에 비해서도 훨씬 개선된 항염 활성(산화질소 생성 억제, 프로스타글란딘 E2 생성 억제)을 나타내는 것을 확인하였다. 이를 통해 분리된 유효 펩타이드 분획으로부터 가장 뛰어난 항염 활성을 나타냈던 펩타이드에 대한 서열을 규명한 결과, 서열번호 1(Gly-Ala-Xaa-Gly-Phe-Xaa-Gly-Ala-Arg)의 아미노산 서열을 가지고 서열번호 2(Val-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Xaa-Gly-Pro-Xaa-Gly-Pro-Ala)의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 3(Gly-Val-Xaa-Gly-Pro-Xaa-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala)의 아미노산 서열을 가지는 것을 확인하였다. 이와 같이 본 발명의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 및 이로부터 분리한 유효 펩타이드는 뛰어난 항염 효과를 발휘하여 기능성 식품, 화장품 및 약품의 소재로 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명에 있어서, 서열목록을 작성할 시, 서열번호 1 내지 3에서 'Xaa'라고 기재한 부분은 '4Hyp(4-Hydroxyproline)'이며 이와 같은 사항은 각 서열번호의 특징 부분에 기재되어 있다.
한편, 본 발명의 식품 조성물은 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것인 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 일 예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초 화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 30 중량% 이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 일 예로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로탄/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 계면활성제 함유 클렌저인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 계면활성제 함유 클렌저 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌저 제형 또는 비누일 경우에는, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 일례로, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 젤이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태로 제조될 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITIORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여 가능하다. 다만, 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태와 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는 일 예로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 예방 및 치료제가 약제인 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
이하, 본 발명에 대해 하기 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 모두 포함한다.
[실시예 1 : 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 제조]
흑염소육골 무게에 3배의 물 첨가후 121℃에서 10시간 추출하였으며, 추출된 육골즙을 동결건조하였다. 흑염소육골즙 추출물 내 지방은 Floch 방법을 이용해 제거 후 0.67% Alcalase(pH 8.0, 50℃), 0.67% ProteAX(pH 7.0, 50℃)와 0.67% Trypsin(pH 8.0, 37℃)를 순서대로 첨가하여 각각 2시간씩 총 6시간 분해하여 효소분해물을 제조하였다. 이후 centrifugal filter device(Millipore, USA)를 이용하여 저분자(3kDa 이하)로 분리하였다. 도 1은 본 발명의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물을 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
[실험예 1 : 저분자 흑염소육골즙 효소분해물의 아미노산 조성 분석]
본 실험예에서는 상기 실시예 1의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물의 아미노산 조성을 분석하였다.
아미노산 조성은 시료(저분자 흑염소육골즙 효소분해물) 0.5 g과 6N HCl 10 mL를 삼각플라스크에 넣고 혼합한 다음 110℃에서 24시간 가수분해하였다. 가수분해물을 0.2N sodium citrate buffer(pH 2.2)에 희석시키고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하였다. 시스테인(cysteine)과 메티오닌(methionine)은 과산화포름산(perfomic acid)으로 가수분해한 후 6N HCl로 가수분해하였다. 여과한 시료는 아미노산 분석기(SYKAM S433, Sykam GmbH, Eresing, Germany)를 이용하여 분석하였다.
실험결과, 하기 표 1과 같이 저분자 흑염소육골즙 효소분해물의 아미노산 조성을 확인할 수 있었다. 주요 아미노산은 글루탐산(glutamic acid)과 글리신(glycine)으로 각각 13.23%, 9.94%를 나타냈다. 또한, 필수아미노산의 비율은 35%, 항산화 및 소수성 아미노산의 비율은 각각 41.24%, 49.55%를 나타냈다.
아미노산 %
Aspartic acid 6.01
Threonine 3.19
Serine 3.08
Glutamic acid 13.23
Proline 6.04
Glycine 9.94
Alanine 6.32
Valine 3.66
Isoleucine 2.88
Leucine 6.06
Tyrosine 2.13
Phenylalanine 3.08
Histidine 2.49
Lysine 5.40
Arginine 6.64
Cysteine 0.48
Methionine 3.88
Total 84.51
필수아미노산 비율(%) 35.00
항산화성 아미노산 비율(%) 41.24
소수성 아미노산 비율(%) 49.55
[실험예 2 : 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 처리에 따른 세포 독성 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 처리에 따른 마우스 대식세포에 대한 세포독성을 측정하기 위해 MTT 방법(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
마우스 대식세포(RAW264.7 cell)를 48 well cell culture plate에 5 x 104 cells/well의 농도로 배양한 후 저분자 흑염소육골즙 효소분해물을 10~500 ㎍/mL 농도로 처리하였다. 24시간 배양 후 PBS로 세척한 다음 MTT(5 mg/mL) 용액을 세포에 4시간 동안 처리하여 염색시켰다. 염색된 세포에 DMSO를 넣어 세포를 녹여낸 후 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이후 하기 수학식 1을 이용하여 세포 생존율을 산출하였다.
Figure 112020143911296-pat00001
실험결과, 도 2와 같이 저분자 흑염소육골즙 효소분해물은 최고 농도 500 ㎍/mL 처리시에도 세포 생존율을 감소시키지 않았으며, 오히려 대식세포 생존율을 증가시켰다. 이와 같은 결과로부터 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 세포 독성을 나타내지 않아 안전한 조성물로 이용될 수 있음을 확인하였다.
[실험예 3 : 저분자 흑염소육골즙 효소분해물의 산화질소 및 프로스타글란딘 E 2 생성 억제 효과 분석]
본 실험예에서는 상기 실시예 1의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물의 항염증 활성을 확인하기 위해 지질다당류(LPS)로 염증을 유도한 마우스 대식세포 내 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성 억제 효과를 분석하였다.
1) 산화질소(N0) 생성 억제 효과 분석
마우스 대식세포(RAW264.7 cell)를 48 well cell culture plate에 4 x 105 cells/well의 농도로 배양한 후 저분자 흑염소육골즙 효소분해물을 10~500 ㎍/mL 농도로 처리하였다. 1시간 배양 후 LPS(1 ㎍/mL)로 자극하여 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 배양액을 취하여 원심분리(10,000 rpm, 10분)하여 상등액을 분석에 이용하였다. 50 ㎕의 배양을 취하여 동일부피의 그리에스(Griess) 시약과 혼합한 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 아질산나트륨(sodium nitrite) 표준 곡선을 이용하여 정량하였다.
실험결과, 도 3과 같이 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 100, 250, 500 ㎍/mL의 농도에서 NO 생성을 각각 7.82, 6.98, 10.65% 억제시키는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과로부터 염증성 인자 중 산화질소 억제 효과로부터 저분자 흑염소육골즙 효소분해물의 항염증 효과를 확인하였다.
2) 프로스타글란딘 E 2 (PGE 2 ) 생성 억제 효과 분석
마우스 대식세포(RAW264.7 cell)를 48 well cell culture plate에 4 x 105 cells/well의 농도로 배양한 후 저분자 흑염소육골즙 효소분해물을 10~500 ㎍/mL 농도로 처리하였다. 1시간 배양 후 LPS(1 ㎍/mL)로 자극하여 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 배양액을 취하여 원심분리(10,000 rpm, 10분)하여 상등액을 분석에 이용하였다. PGE2의 농도는 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다.
실험결과, 도 4와 같이 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 250, 500 ㎍/mL의 농도에서 PGE2 생성을 각각 17.13, 29.86% 억제시키는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과로부터 염증성 인자 중 프로스타글란딘 E2 억제 효과로부터 저분자 흑염소육골즙 효소분해물의 항염증 효과를 확인하였다.
[실시예 2 : 저분자 흑염소육골즙 효소분해물로부터 유효 펩타이드 분리]
실시예 1의 저분자 흑염소육골즙 효소분해물을 200 mg/mL로 증류수에 녹인 후 0.22 ㎛ 필터하여 분배크로마토그래피법을 이용하여 정제하였다. 정제에 이용된 컬럼은 Superdex Peptide 30/100GL (10 x 300 mm)을 이용하였으며, 유속은 0.5 mL/min으로 증류수를 60분 동안 일정한 유속으로 흘려주며 215 nm에서 검출하였다. 검출된 크로마토그램을 기준으로 5개의 유효 펩타이드 분획(F1~F5)를 분리하였으며, 그 결과는 도 5와 같았다.
[실험예 4 : 유효 펩타이드의 항산화 활성 분석]
본 실험예에서는 상기 실시예 2의 유효 펩타이드 분획(F1~F5)의 항산화 활성은 ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity) 활성 측정을 통해 확인하였다.
ORAC 활성은 black 96 well plate에 25 ㎕ 표준시약(trolox) 또는 시료(저분자 흑염소육골즙 효소분해물, 유효 펩타이드 분획(F1~F5))를 넣고, 150 ㎕ fluorescein (80 nM)을 넣어 혼합한 뒤 37℃ 인큐베이터에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이후 25 ㎕ AAPH(150 mM)을 넣고 혼합한 뒤 형광분광광도계를 사용하여 37℃에서 285~520 nm 파장으로 60분 동안 1분 간격으로 형광도의 감소율을 측정하였다. 표준시약(trolox)과 시료의 area under the curve(AUC)를 측정하였으며, 표준시약 농도와 AUC 간의 회귀곡선을 이용하여 μmol trolox equivalent(TE)/g으로 나타내었다.
실험결과, 도 6과 같이 F3, F4, F5가 각각 690.18, 824.64, 979.88 μmol TE/g으로 원물(저분자 흑염소육골즙 효소분해물) 247.44 μmol TE/g보다 최소 2.8배 증가시켰으며, 특히 F5가 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다.
[실험예 5: 유효 펩타이드의 산화질소 및 프로스타글란딘 E 2 생성량 분석 및 펩타이드 서열 규명]
본 실험예에서는 상기 실시예 2의 유효 펩타이드 분획(F1~F5)의 항염증 활성을 확인하기 위해 지질다당류(LPS)로 염증을 유도한 마우스 대식세포 내 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성 억제 효과를 분석하였다.
마우스 대식세포(RAW264.7 cell)를 48 well cell culture plate에 4 x 105 cells/well의 농도로 배양한 후 유효 펩타이드 분획 F1~F5을 250 ㎍/mL 농도로 처리하였다. 1시간 배양 후 LPS(1 ㎍/mL)로 자극하여 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 배양액을 취하여 원심분리(10,000 rpm, 10분)하여 상등액을 분석에 이용하였다. 실험예 3과 같이 NO는 그리에스(Griess) 시약을 이용하여 분석하였으며, PGE2는 ELISA 키트를 이용하여 분석하였다. 실험결과는 LPS 처리구 내 생산량을 100%로 하여 계산하였다.
실험결과, 도 7의 A)와 같이 F2, F4, F5가 각각 86.26, 90.90, 83.94%로 원물(저분자 흑염소육골즙 효소분해물) 93.02%보다 감소시켰으며, 특히 F5가 가장 낮은 NO 생성량을 나타내었다. 또한, 도 7의 B)와 같이 F2, F4, F5가 각각 33.07, 57.99, 27.79%로 원물(저분자 흑염소육골즙 효소분해물) 82.87%보다 감소시켰으며, 특히 F5가 가장 낮은 PGE2 생성량을 나타내었다.
최종적으로 유효 펩타이드 F5를 선정하여 Triple TOF 5600 Q-TOF LC-MS/MS system을 이용하여 서열을 분석하였다. 그 결과, 대식세포에 대해 항염증 효과를 갖는 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 조성물 내에 서열번호 1(Gly-Ala-Xaa-Gly-Phe-Xaa-Gly-Ala-Arg), 서열번호 2(Val-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Xaa-Gly-Pro-Xaa-Gly-Pro-Ala) 및 서열번호 3(Gly-Val-Xaa-Gly-Pro-Xaa-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala)의 아미노산 서열을 가지는 항염증성 유효 펩타이드를 확인하였다. 이때, 상기 서열번호 1 내지 3의 'Xaa'로 표시된 부분은 각각 '4Hyp(4-Hydroxyproline)'이다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Composition containing small molecular weight enzyme hydrolysates of black goat extracts and effective peptide sequence <130> YP-20-218 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Capra hircus <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> 4Hyp(4-Hydroxyproline) <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> 4Hyp(4-Hydroxyproline) <400> 1 Gly Ala Xaa Gly Phe Xaa Gly Ala Arg 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Capra hircus <220> <221> UNSURE <222> (10) <223> 4Hyp(4-Hydroxyproline) <220> <221> UNSURE <222> (13) <223> 4Hyp(4-Hydroxyproline) <400> 2 Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Ala 1 5 10 15 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Capra hircus <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> 4Hyp(4-Hydroxyproline) <220> <221> UNSURE <222> (6) <223> 4Hyp(4-Hydroxyproline) <400> 3 Gly Val Xaa Gly Pro Xaa Gly Ala Val Gly Pro Ala 1 5 10

Claims (9)

  1. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 식품 조성물.
  2. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 화장료 조성물.
  3. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 흑염소육골즙 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 흑염소육골즙 효소분해물은,
    알칼라제(alcalase), 프로테 에이엑스(proteAX) 및 트립신(trypsin)을 처리하여 제조된 것을 특징으로 하는 항염용 식품 조성물.
  6. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 흑염소육골즙 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염용 화장료 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 흑염소육골즙 효소분해물은,
    알칼라제(alcalase), 프로테 에이엑스(proteAX) 및 트립신(trypsin)을 처리하여 제조된 것을 특징으로 하는 항염용 화장료 조성물.
  8. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 흑염소육골즙 효소분해물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 흑염소육골즙 효소분해물은,
    알칼라제(alcalase), 프로테 에이엑스(proteAX) 및 트립신(trypsin)을 처리하여 제조된 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.



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