KR20200103564A - 톳 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항알러지용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항알러지용 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 예방, 치료, 개선을 위한 약제학적 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 및 사료첨가제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 톳 효소 추출물은 세포 내에서 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 자극된 산화질소(NO) 형성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 다양한 염증성 사이토 카인(GM-CSF, iNOS, VEGF, COX-2)의 발현을 억제시킬 뿐 아니라, 염증 및 알레르기 질병 신호 관련된 전사인자의 단백질 발현을 효과적으로 억제시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 톳 효소 추출물은 알레르기 비염 마우스 모델에서 비강 조직 내에 호산구와 같은 염증세포의 침윤을 감소시키며, 배상세포의 과증식을 억제시킬 수 있는 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 톳 효소 추출물은 항염증 및 항알러지 활성을 갖는바, 염증질환이나 알러지 질환의 예방, 개선, 치료를 위한 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

톳 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항알러지용 조성물{Composition comprising extracts of Hizikia fusiforme for anti-inflammation or anti-allergy}

본 발명은 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항알러지용 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 예방, 치료, 개선을 위한 약제학적 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 및 사료첨가제 조성물에 관한 것이다.

산화질소(Nitric oxide, NO)와 프로스타글란딘 E2 (PGE2)는 면역세포의 대표적인 염증인자로서 NO는 세포 내 항상성 유지, 신경전달 물질 운반, 항암작용 및 세포독성 등에 관여하는 신호전달인자이며, 과량 존재할 경우 세포손상 및 염증반응으로 이어지게 된다(김민석과 노정두, 2010; Yoon et al. , 2013).

최근 많은 연구들이 피부의 항노화와 피부 진정, 자극완화, 알레르기에 효능이 있는 항염증 작용에 초점을 맞추고 있으며, 그 활성 성분으로서 기존의 합성물보다 상대적으로 피부에 부작용이 적은 천연 성분에 대한 관심이 증대되고 있는 실정이다.

본 연구에서는 톳 효소 추출물의 항염증 실험을 통해 알레르기 증상 완화 및 면역 기능을 강화할 수 있는 식품 소재로서의 가능성을 검토하고자 하였으며, 관련 단백질의 발현 억제를 통하여 면역 증강을 통한 비염 알레르기 반응에 대한 완화 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1630801호

따라서 본 발명의 목적은 염증질환 또는 알러지 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 염증질환 또는 알러지 질환을 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 염증질환 또는 알러지 질환을 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 항염증 또는 항알러지 용도를 갖는 사료첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 염증질환 또는 알러지 질환을 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품을 제공한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 톳 효소 추출물은 톳 분말에 효소를 첨가하여 혼합한 후 반응시켜 효소 가수분해물을 제조하는 단계; 상기 효소 가수분해물을 고온에서 가열하여 효소를 불활성시키는 단계; 및 상기 효소가 불활성화된 가수분해물을 원심분리를 진행한 후 상등액을 수득하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 효소는 비스코자임(Viscozyme), 셀룰클라스트(Celluclast) 또는 알칼레이스(Alcalase)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증질환은 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 동맥경화, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 알츠하이머병, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상 및 췌장염으로부터 구성된 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 알러지 질환은 알러지성 비염(allergic rhinitis)일 수 있다.

또한, 본 발명은 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형일 수 있다.

또한, 본 발명은 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항알러지용 사료첨가제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 톳 효소 추출물은 세포 내에서 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 자극된 산화질소(NO) 형성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 다양한 염증성 사이토 카인(GM-CSF, iNOS, VEGF, COX-2)의 발현을 억제시킬 뿐 아니라, 염증 및 알레르기 질병 신호 관련된 전사인자의 단백질 발현을 효과적으로 억제시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 톳 효소 추출물은 알레르기 비염 마우스 모델에서 비강 조직 내에 호산구와 같은 염증세포의 침윤을 감소시키며, 배상세포의 과증식을 억제시킬 수 있는 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 톳 효소 추출물은 항염증 및 항알러지 활성을 갖는바, 염증질환이나 알러지 질환의 예방, 개선, 치료를 위한 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 톳 효소 추출물의 크로마토그램을 나타낸 것이다((A) Viscozyme, (B) Celluclast, (C) Alcalase).
도 2는 톳 효소 추출물의 한외여과 후 분자량 분포의 변화 (pore size: 3,000 Da)를 나타낸 것이다.
도 3은 톳 효소 추출물의 FT-IR 스펙트럼를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 톳 효소 추출물의 농도별 세포 독성을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명의 톳 효소 추출물의 탐식 작용을 실험한 결과이다.
도 6은 본 발명의 톳 효소 추출물의 LPS 자극으로 유도된 NO 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명의 톳 효소 추출물의 항산화 작용 실험 결과이다.
도 8은 본 발명의 톳 효소 추출물의 다양한 염증성 사이토 카인(GM-CSF, iNOS, VEGF, COX-2) 유전자의 mRNA 발현 억제 정도를 나타낸 결과이다.
도 9는 본 발명의 톳 효소 추출물의 농도별 처리에 따른 COX-2 단백의 발현 정도를 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명의 톳 효소 추출물의 처리에 따른 염증 및 알레르기 질병 신호 관련된 전사인자의 단백질 발현 정도를 평가한 결과이다.
도 11은 오브알부민을 이용한 알레르기 비염 마우스 모델 제조를 위한 실험 프로토콜이다.
도 12는 음성대조군(A), 알레르기 비염 마우스 모델(B) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(C, D)에 따른 알레르기 증상 점수를 나타낸 결과이다.
도 13은 음성대조군(A), 알레르기 비염 마우스 모델(B) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(C, D)에 따른 혈청 내 OVA-specific IgE, IgG₁, IgG_2a 농도를 나타낸 것이다.
도 14는 음성대조군(A), 알레르기 비염 마우스 모델(B) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(C, D)에 따른 비장세포 배양액 내 Th1, 2 사이토카인의 농도 변화를 나타낸 것이다.
도 15 및 16은 음성대조군(A), 알레르기 비염 마우스 모델(B) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(C, D)에 따른 비장에서 조절 T 세포의 군집을 나타낸 것이다.
도 17은 음성대조군(A), 알레르기 비염 마우스 모델(B) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(C, D)에 따른 비강 조직내 IL-5, IL-13, IFN-γ, FOXP3 mRNA 발현량 비교한 결과이다.
도 18은 음성대조군(A), 알레르기 비염 마우스 모델(B) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(C, D)에 따른 비강 상피하조직에의 호산구성 세포 침윤 정도를 나타낸 것이다.
도 19는 음성대조군(A), 알레르기 비염 마우스 모델(B) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(C, D)에 따른 비강 조직 염색 결과이다(Sirus 염색, ×400배율).
도 20은 음성대조군(A), 알레르기 비염 마우스 모델(B) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(C, D)에 따른 비강 상피내 배상세포(goblet cell) 과증식을 나타낸 결과이다.
도 21은 음성대조군(A), 알레르기 비염 마우스 모델(B) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(C, D)에 따른 비강 상피내 배상세포(goblet cell) 과증식을 나타낸 염색 결과이다(PAS 염색, ×400배율).
도 22는 음성대조군(Ⅰ), 알레르기 비염 마우스 모델(Ⅱ), 톳 열수 추출물 치료 마우스 모델(Ⅲ), 톳 에틸아세테이트 추출물 치료 마우스 모델(Ⅳ) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(Ⅴ)에 따른 알레르기 증상 점수를 나타낸 결과이다.
도 23은 음성대조군(Ⅰ), 알레르기 비염 마우스 모델(Ⅱ), 톳 열수 추출물 치료 마우스 모델(Ⅲ), 톳 에틸아세테이트 추출물 치료 마우스 모델(Ⅳ) 및 톳 효소 추출물 치료 마우스 모델(Ⅴ)에 따른 혈청 내 OVA-specific IgE 농도를 나타낸 것이다.

본 발명은 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명에서 ‘톳 효소 추출물’은 톳 분말에 효소를 첨가하여 혼합한 후 반응시켜 효소 가수분해물을 제조하는 단계; 상기 효소 가수분해물을 고온에서 가열하여 효소를 불활성시키는 단계; 및 상기 효소가 불활성화된 가수분해물을 원심분리를 진행한 후 상등액을 수득하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

본 발명에서 상기 효소는 비스코자임(Viscozyme), 셀룰클라스트(Celluclast) 또는 알칼레이스(Alcalase)를 예시할 수 있으며, 바람직하게는 비스코자임(Viscozyme)일 수 있다.

본 발명의 조성물은 항염증 또는 항알러지 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 의약품, 화장품, 식품 및 동물 사료 등 다양한 산업분야에서 적용되는 물품에 항산화 활성을 부여할 수 있는 기능성 소재로 사용할 수 있으며, 또한 의약품 보존제, 화장품 보존제, 식품 보존제, 의약품 첨가제, 화장품 첨가제, 식품첨가제 및 사료첨가제 등의 소재로도 사용될 수 있다.

아래에서는 본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 의약품, 식품, 화장품, 사료 형태로 자세히 살펴보았다.

본 발명의 조성물은 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 톳 효소 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 ~ 99.9 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 있어서, 본 발명의 톳 효소 추출물은 조성물에 대해 0.1 내지 1000Oμg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 염증관련 질환으로는, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 동맥경화, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 알츠하이머병, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상 또는 췌장염 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 알러지 질환의 종류로는 부종(edema), 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 알러지성 천식(allergic asthma), 고초열(hay fever), 퀸케부종(Quincke's edema), 알러지성 결막염(allergic conjunctivitis), 알러지성 각막염(allergic keratitis), 알러지성 피부염(allergic dermatitis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 두드러기(hives), 소양증(pruritus), 곤충 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 알러지성 비염(allergic rhinitis)이다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 염증질환 또는 알러지 질환이 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 염증질환 또는 알러지 질환의 의심 개체는 염증질환 또는 알러지 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 톳 효소 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 염증질환 또는 알러지 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 염증질환 또는 알러지 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 염증질환 또는 알러지 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 치료 방법은 톳 효소 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한, 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 상기 제조방법으로 제조된 톳 효소 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 본 발명의 톳 효소 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 본 발명의 유효성분인 톳 효소 추출물은 식용 가능한 식물로부터 추출된 물질로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 항산화, 항염, 항알러지 기능성 부여를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 제조방법으로 제조된 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 톳 효소 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톳 효소 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톳 효소 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이 우수한 항염증 및 항알러지 효과를 실험적으로 입증하였는바, 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선에 효과적이다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물 또는 식품 조성물 외에 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 상기 제조방법으로 제조된 톳 효소 추출물은 항염증 및 항알러지 활성이 탁월함으로, 이러한 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인간 세포의 손상을 야기하여 노화를 촉진하고 산화 관련 질환을 매개하는 활성산소종(ROS)으로부터 피부보호 및 피부치료에도 효과적이며, 이와 더불어 알러지 질환을 개선시킬 수 있으므로 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 톳 효소 추출물 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 톳 효소 추출물 이외에, 톳 효소 추출물과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 항산화제 또는 항염증제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액, 샴푸 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

또한 본 발명의 조성물은 사료첨가제 조성물일 수 있다.

본 발명의 유효성분인 톳 효소 추출물은 항염증 또는 항알러지 활성을 부여할 수 있다.

상기 가축은 소, 돼지, 닭, 오리, 염소, 양 및 말로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종의 가축일 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

톳 추출물 제조

<1-1> 톳 및 효소 준비

본 연구에 사용된 톳은 일반성분 분석 결과 지역별 및 양식산의 차이가 거의 없어 가장 생산량이 많은 전남 완도군 완도읍 정도리에서 채취한 자연산 톳을 수세 후 동결건조 (SFDSM06, SAMWON)하여 분쇄한 시료를 사용하였다. 효소는 노보자임(Novozyme, Denmark)에서 구입한 비스코자임(Viscozyme), 셀룰클라스트(Celluclast), 알칼레이스(Alcalase)를 사용하였다.

<1-2> 산 추출물 제조

산 추출물은 톳 분말시료 300 mg에 0.1 N HCl 30 mL를 첨가하여 150 rpm으로 진탕하면서 3시간 추출하고 원심분리기를 사용하여 상등액을 모아 동결건조하여 제조하였다

<1-3> 알칼리 추출물 제조

알칼리 추출물은 톳 분말시료 300 mg에 0.1 N NaOH 30 mL를 첨가하여 150 rpm으로 진탕하면서 3시간 추출하고 원심분리기를 사용하여 상등액을 모아 동결건조하여 제조하였다.

<1-4> 열수 추출물 제조

열수 추출물은 톳 분말시료 300 mg에 증류수 30 mL을 첨가하여 고압멸균기(autoclave)를 이용하여 100℃로 1시간 추출하고 원심분리기를 사용하여 상등액을 모아 동결건조하여 제조하였다.

<1-5> 효소 추출물 제조

효소를 이용한 추출방법은 표 1에 따라 수행하였다.

톳 분말시료 2 g에 버퍼 100 mL을 넣고 각각의 효소를 100μL를 첨가하여 혼합한 후 150 rpm, 50℃에서 3, 6, 9, 12, 24시간 반응시켰다. 효소 가수분해물은 100℃에서 15분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후, 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 시료로 사용하였다.

실험에 사용한 효소별 처리조건

효소	버퍼	pH	온도 (℃)	효소 특징
비스코자임 (Viscozyme)	0.1 M Sodium acetate	4.5	50	cellulase glucanase hemi-cellulase xylanase
셀룰클라스트 (Celluclast)	0.1 M Sodium acetate	4.5	50	cellulase
알칼레이스 (Alcalase)	0.1 M Sodium phosphate	8.0	50	endoprotease

<실시예 2>

톳 추출물의 추출 조건에 따른 화학적 조성 분석

<2-1> 추출 조건별 환원당 함량 측정

다양한 추출방법에 따른 환원당 함량을 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) 방법으로 측정하였다. 탄수화물은 그 결합수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 나뉘며 단당류와 이당류 중 알데하이드기 (R-CHO) 및 케톤기 (R-CO-R’)의 존재에 따라 환원성이 있는 환원당과 환원성이 없는 비환원당으로 나뉜다. 환원당의 종류는 글루코스, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 갈락토오스 등이 있으며 이 환원당과 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid)을 알칼리 조건에서 반응시켜 발색하는 원리를 이용하여 환원당을 측정한다. 분석은 시료 250 μl에 DNS 용액 750 μl을 첨가한 후, 100℃에서 10분간 반응시켰다. 상온에서 20분 냉각시킨 후 환원당을 570 nm에서 분광광도계로 측정하였다. 표준물질은 글루코스를 사용하였으며 검량선에 대입하여 얻은 결과 값으로 추출물의 환원당 함량을 계산하였다.

그 결과, 산, 알칼리, 열수 추출물 각각 환원당이 0.5402 g/L, 0.6634 g/L, 0.2893 g/L로 검출되는 것을 확인하였다. 열수 추출에 비해 산, 알칼리 추출에서 많은 환원당이 검출되었다. 추출 용매가 증류수일 때 보다 알칼리를 이용했을 때 2배 이상의 환원당이 검출되는 것으로 나타났다.

한편, 효소를 이용한 톳 추출물로부터 환원당 함량을 측정한 결과 환원당 함량은 다당류 분해 효소인 비스코자임, 셀룰클라스트와 단백질 분해 효소인 알칼레이스 모두 반응 시간에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 6시간 기준으로 비스코자임, 셀룰클라스트 각각 1.1868 g/L, 1.1080 g/L의 환원당 함량을 나타냈고 단백질 분해 효소인 알칼레이스 또한 1.0811 g/L로 높은 환원당 함량을 나타내었다.

<2-2> 추출 조건별 단백질 함량 분석

다양한 추출방법에 따른 단백질 함량을 Bradford 방법으로 측정하였다. UV-Visible spectrophotometer를 이용해 흡광도를 측정하여 표준물질인 BSA (Bovine Serum Albumin)을 기준으로 시료의 단백질 함량을 측정하였다. Bradford 용액과 시료를 각각 30:1 비율로 혼합한 후, 상온에서 5분간 반응시켰다. 분광광도계를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 BSA를 사용하였으며 검량선에 대입하여 얻은 결과값으로 추출물의 단백질 함량을 계산하였다.

그 결과 산 추출물, 알칼리 추출물 및 열수 추출물 각각 0.5241 g/L, 0.7446 g/L, 0.5566 g/L로 확인되었으며, 알칼리 추출물에서 가장 많은 단백질을 얻었다. 알칼리 추출물의 경우 산 추출물보다 더 많은 함량을 나타내었기 때문에 알칼리 처리와 열처리를 동시에 한다면 단백질 함량을 더 높일 수 있을 것으로 판단되었다. 한편, 효소 처리 시 6시간 기준으로 비스코자임, 셀룰클라스트 및 알칼레이스가 각각 0.5440 g/L, 0.5840 g/L, 0.5887 g/L로 비슷한 양의 단백질이 검출되지만 시간이 경과할수록 단백질 분해 효소인 알칼레이스에서 더 많은 양의 단백질이 검출되었다. 효소 처리 시 알칼리 추출보다 적은 단백질 양을 나타내지만 산 추출, 열수 추출과는 비슷하거나 높은 단백질 함량을 나타내었다.

<2-3> 효소 추출물의 GPC(Gel Permeation Chomatography)를 이용한 분자량 분포 측정

상기 실험을 통해 환원당 함량과 단백질 함량 결과로 효소를 이용한 추출이 산, 알칼리, 열수 추출과 비슷한 효과를 가짐을 확인하였다. 효소를 이용한 톳의 추출물 제조가 적합하며, 비스코자임, 셀룰클라스트, 알칼레이스 처리를 통해 저분자화된 톳의 다당류 추출물을 GPC를 통해 분자량 분포를 확인하였다.

톳 추출물의 분자량 분포를 확인하기 위해 HPLC (LC-20AD, Shimadzu, Japan)을 사용하였다. HPLC 분석조건은 Column Suprema 1,000Å (8 x 300mm, PSS, USA) 을 사용하여 0.05% NaN₃용액으로 1.0 mL/min으로 용출시켰으며 RI (Refractive Index) 검출기를 통하여 분석하였다. 추출물을 일정량 희석하여 시료로 사용하였으며, 시린지 필터(0.2 μm, Whatman, Germany)를 사용하여 정제하였다. 표준물질로 덱스트란(670, 150, 50, 2, 5 kDa, Sigma, USA)을 사용하여 상대적인 분자량을 측정하였다. 표준물질의 분자량을 기준으로 얻은 검량선을 통해 추출물의 분자량을 측정하였다.

그 결과 다당류 분해 효소인 비스코자임과 셀룰클라스트 처리 시 비슷한 분자량 분포를 나타내었고 단백질 분해 효소인 알칼레이스는 다양한 분자량 분포를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

자세하게는, 추출물은 약 7분대의 피크는 분자량 약 1,856 kDa의 고분자가 검출되는 시간으로 비스코자임이 가장 작은 피크를 나타내고 있음으로 보아 고분자 다당류가 다량 분해된 것을 확인할 수 있었다. 약 10분에 셀룰클라스트와 함께 약 7,756 Da의 분자량을 가진 반면, 알칼레이스는 그보다 큰 약 57,655 Da의 분자량을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 비스코자임으로 처리할 시 고분자 형태의 다당류 분포가 가장 적은 반면 저분자량 물질을 다량 함유하는 것이 확인할 수 있었다. 이는 고분자량의 다당류가 올리고당의 형태로 전환됨을 알 수 있다. 또한 비스코자임 처리 시 환원당 함량이 높은 결과와 일치하여 톳 유래 다당류 분해 시 비스코자임이 탁월한 것으로 확인되었다.

<2-4> 효소 추출물의 PMP-라벨링을 이용한 분획물의 구성 당 성분 분석

단당류는 자외선을 흡수하지 않기 때문에 HPLC를 이용해 단당류를 검출하기 위해서는 형광물질인 1-페닐-3-메틸-5-피라졸론(PMP)을 첨가하여 효소를 이용한 톳 추출물의 구성 당 성분을 분석하였다. 추출물을 동결건조한 시료에 2.0 M TFA를 처리하여 100℃에서 24시간 반응시켰다. 시료 100 μl, 1 mM PMP 100 μl, 0.3 M NaOH 100 μl를 1.5 mL Eppendorf tube에 넣고 30분간 70℃에서 가열하였다. 가열한 혼합물을 상온에서 식힌 후 0.3 N HCl 100 μl를 첨가하여 중화시켰다. 혼합물에 클로로포름 1 mL을 넣어 상층액을 3회 분리하였다. 상층액을 증류수로 일정량 희석하여 HPLC로 분석하였으며 만노오스, 람노오스, 글루쿠론산, 락토오스, 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 푸코오스를 표준 당으로 사용하였다. 하기 표 2는 HPLC 분석 조건을 나타낸다.

PMP-라벨링 시료의 HPLC 분석 조건

	Conditions
Instruct	Shimadzy LC-10AD
Column	Eclips XDB-C8 (4.6x150nm)
Mobile phase	Sol A : 20 mM Ammonium acetate Sol B : acetonitrile
Flow rate	0.5 mL/min
Detector	UV (254nm)

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 비스코자임, 셀룰클라스트, 알칼레에스 추출물 모두 일반적인 다당류와 복합 당류로 구성되어 있음을 확인하였다. 비스코자임과 셀룰클라스트의 경우 글루코스, 푸코오스및 갈락토스가 주로 추출되었고, 알칼레이스 사용 시 갈락토스와 푸코오스가 추출되었다. 만노오스, 자일로스, 글루쿠론산은 세 효소 추출물에서 동일하게 확인되었다. 톳의 화학성분이 푸코오스, 갈락토스, 만노오스, 자일로스, 글루쿠론산, 설페이트(sulfate)와 비교해보았을 때 본 연구에서도 위와 같은 성분으로 분석되었다.

<2-5> 효소 추출물의 황산기 함량 분석

푸코이단은 산성의 수용성 다당류로 이를 가수분해하면, 푸코오스, 갈락토스, 만노오스, 자일로스, 글루쿠론산 등 당류와 황산기를 가지고 있는 것이 특징이다. 본 실험에서는 톳 효소 추출물의 황산기 함량을 분석하기 위해 BaCl₂-gelatin 방법을 사용하였다. 증류수 300 mL에 염화바듐 10 g, 소듐 클로라이드 10 g 및 젤라틴 0.25 g을 첨가하여 완전히 녹인 후 HCl 5 mL을 첨가하고 증류수로 희석하여 침전용액(precipitating solution)을 제조하였다. 세 가지 효소 추출물을 동결건조한 후 20 mg을 증류수에 녹여 시료를 제조하였다. 시료 용액에 상기 침전용액(precipitating solution)을 혼합한 후 실온에서 5분 방치하였다. 분광광도계를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 비스코자임, 셀룰클라스트, 알칼레이스 추출물은 20 mg 당 각각 0.9310 mg/L, 2.1180 mg/L, 2.7570 mg/L의 설페이트(sulfate) 함량을 나타내었다. 세 효소 중 복합 효소인 알칼레이스 추출물에서 가장 많은 황산기 함량을 확인할 수 있으며 추출된 푸코이단에 의해 항비만 저해 활성을 가질 것으로 확인하였다.

본 연구에서는 효소를 이용하여 가수분해된 톳 추출물의 분자량 분포를 측정하고 PMP-라벨링을 통해 구성당 성분을 분석한 후 추출물의 황산기 함량을 측정하였다. 그 결과 비스코자임 추출물이 높은 황산기 함량을 나타내진 않지만, 환원당, 단백질 함량 분석 결과와 같이 다량의 저분자 물질이 확인되었고 구성 당 성분으로 글루코스, 갈락토스, 푸코오스 등 다당류를 포함하므로 효소를 이용한 톳의 추출물 제조에 가장 적합한 효소로 확인되었다.

<2-6> 효소 추출물의 분자량 측정

한외여과는 압력 또는 농도 차를 이용하여 반투막을 통해 분리하는 막분리법으로, 막 세공과 용질 간의 크기 차에 의해 특정 물질을 분리할 수 있다. 물과 저분자량의 용질이 막을 통과하는 동안 고분자량의 용질은 잔류하게 된다. 추출물의 저분자 유효성분을 분리, 농축하기 위해 한외여과를 이용한다. 효소 처리 후 불활성화시킨 추출물을 pump (EMP-650IP, Masterflex, Korea)를 이용하여 적절한 유속으로 한외여과막 (Vivaflow 50, MWCO 3,000 Da, Sartorius, Germany)으로 주입되며, 3,000 Da 이상의 물질은 저장조 (Retentate)에 모여 농축되고 3,000 Da 이하의 물질은 한외여과막을 통과하여 여과조 (Permeate)로 수집된다. 여과조의 시료는 5회 반복하여 분리하여 동결건조 후 시료로 사용하였다. 분리된 여과조 시료의 분자량을 한국고분자연구소 (KOPTRI)을 통해 분석하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 피크 1은 수평균 분자량 (Mn) 약 41,296 Da을 나타내었고 피크 2는 약 1,386 Da, 피크 3은 약 547 Da, 피크 4는 약 163 Da을 나타냄. 시료 전체의 수평균 분자량은 2,642 Da를 나타내어 한외여과를 통해 비스코자임 추출물의 저분자량 물질을 분리하였다.

<2-7> FT-IR을 이용한 구조 분석

한외여과에 의해 분리된 시료의 구조적 특성을 분석하기 위해 적외선분광법 (Fourier-transform infrared spectroscopy)을 사용하였다. 시료는 약 1 mg의 동결건조 분말과 KBr을 혼합하여 제조하였고 FT-IR (Win, FTS 1165, Bio-Rad)을 이용하였다.

한외여과 3,000 Da 이하의 분획물의 구조를 분석하기 위해 FT-IR 분석하였다. 그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 3360.62 cm^-1의 넓은 피크는 당 고리의 전형적인 O-H의 streching 진동을 보였고 2918.76 cm^-1과 2849.99 cm^-1의 작은 피크는 C-H의 streching 진동을 나타낸다. 또한 2114.77 cm^-1과 1638.53 cm^-1은 C=O의 카보닐 그룹(carbonyl group)을 나타내며, 1269.06 cm^-1에서는 S=O streching 진동을 나타내는데, 이것은 푸코이단이 갖는 특성적인 흡수 밴드이며 설페이트 그룹(sulfate group)을 확인하였다. 1158.63 cm^-1은 C-H와 C-O streching 진동이 나타낸다.

상기와 같은 결과를 통해 한외여과 후 비스코자임 추출물 분획이 상업용 푸코이단과 구조적으로 유사함을 알 수 있으며, 이를 통해 비스코자임 처리한 톳 추출물에 수용성 다당류인 푸코이단이 함유되어 있음을 확인할 수 있다.

<실시예 3>

비스코자임 처리된 톳 추출물의 세포 독성 평가

대사 과정이 온전한 세포의 미토콘드리아 내의 탈수소효소가 노란색 수용성 테트라졸리움솔트[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2-5-디페닐테르라졸리움 브로마이드] (MTT)를 비수용성의 짙은 자주색 MTT 포르마잔 결정으로 환원시키는 원리를 이용한 것으로 적절한 파장 (주로 500 ~ 600 nm)에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하였다. 대식 세포주 (Raw 264.7 cell)를 24 웰 플레이트에 각각 1×10⁵ cells/well 으로 접종하고 24 hr 동안 배양한 후, 농도별로 시료를 처리하고 24 시간 배양 이후, 세포에 MTT stock용액 (2 mg/mL)을 500 uL 씩 처리하고 1시간 후 배지를 제거하고, DMSO를 200 ul씩 첨가하여 세포에서 생성된 MTT-포르마잔 결정체를 용해시킨 후 96 웰(well)에 100 uL 씩 취해서 ELISA reader기로 550 nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 비스코자임 처리된 톳 추출물의 경우 100 ug/mL 이하의 범위에서 세포 독성이 나타나지 않는 것으로 확인하였다.

<실시예 4>

비스코자임 처리된 톳 추출물의 탐식 작용

뉴트럴 레드(Neutral red)는 비확산에 의해 세포막을 통과하여 리소좀 안에 축적되는 양이온성 염색 시약으로 온전한 세포는 식세포작용(phagocytosis)에 의해 뉴크럴 레드 염료를 리소좀에 누적시키며, 이 누적되는 양으로 식세포 효과를 평가한다.

본 실험을 위해 톳 추출물의 비스코자임 성분을 (viscozyme fraction of H. fusiformis) RAW 264.7 세포에 아래 그림에 표기된 농도로 24시간 처리한 후, 뉴트럴 레드 용액을 2시간 동안 37℃, 5%, CO₂ 인큐베이터에서 반응시켰다.

그 결과는 도 5에서 나타내었다. LPS (lipopolysaccharides)는 양성대조군으로 사용하였으며, RAW 264.7 세포에 LPS 단독 처리시 식세포작용(phagocytosis) 기능을 증가시키는 것을 확인하였다. 한편, 본 발명의 비스코자임 처리된 톳 추출물을 농도별로 처리한 경우, 양성대조군인 LPS 단독 처리구보다 높은 수준의 식세포작용이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 톳 성분에 면역 증강 기능이 있는 것을 의미한다.

<실시예 5>

비스코자임 처리된 톳 추출물의 NO 감소 효과

체내의 염증 반응은 미생물 감염, 내독소, 조직 손상과 같은 위해성 자극에 대한 방어기능으로, 이는 조직의 구조와 기능을 정상적으로 회복하기 위해 필수적으로 일어나는 반응이다. 정상적인 염증반응의 경우 시간이 지남에 따라 염증 촉진성 매개체 (proinflammatory mediators)의 생성은 감소되고, 항염증성 매개체 (anti-inflammatory mediators)는 증가됨으로써 스스로 염증반응이 제한되는 조절과정을 가지고 있다(Lawrence et al.,2002).

체내의 염증반응에 관여하는 세포 중 하나인 대식세포(macrophages)는 이러한 염증반응에 중요한 역할을 한다. 대식세포는 인터페론-γ (IFN-γ), 인터루킨 (IL)-1β, IL-6, TNF-α(tumor necrosis factor-α)와 같은 염증 촉진성 사이토카인, 그리고 세균 세포막 성분인 LPS 등의 자극에 노출됨으로써 활성화된다. 활성화된 대식세포는 염증 촉진성 사이토카인 이외에 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)와 같은 효소의 발현을 통해 NO(nitric oxide) 및 PGE2(prostaglandin E2)와 같은 다양한 염증매개 분자들을 생성하게 되고, 이들 매개체들의 과도한 생성은 다양한 만성염증성 질환의 발병에 기여하고 있는 것으로 알려져 있다.

본 실험에서 LPS를 처리하기 전 여러 농도의 비스코자임 처리된 톳 추출물을 (1, 2, 5, 10 ug/mL) RAW 264.7 대식세포에 처리하였으며, 본 발명의 톳 추출물 처리 농도에 따른 NO 생성 정도를 측정하였다.

그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 톳 추출물 처리 농도에 의존적으로 NO 생성이 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 고농도에서는 통계적으로 유의한 감소가 확인되었다(P<0.05).

<실시예 6>

비스코자임 처리된 톳 추출물의 항산화 작용

생체 내에서 유해활성산소는 산소를 사용하는 과정에서 자연히 생성되는데, 산소는 전자를 획득하기 쉬운 상태가 되어 강력한 산화제가 될 수 있다. 이 산소분자는 호흡 과정에서 4개의 전자에 의해 환원되어 물로 바뀌며, 불완전하게 환원되는 것을 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)라고 하며, 이러한 ROS 발생 정도를 DCFH-DA (dichlorofluorescin diacetate) 염색 방법을 이용하여 측정 가능하다.

본 실험에서는 비스코자임 처리된 톳 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위하여 ROS 발생 정도를 DCFH-DA (dichlorofluorescin diacetate) 염색 방법을 이용하여 측정하였다. 자세하게는, H₂0₂, LPS 양성 대조군, 여러 농도의 비스코자임 톳 추출물 전처리 후 LPS를 처리하고, 추가 23시간 배양 후에, DCF-DA를 포함하는 배지를 만들어 45분간 처리하고, 형광 리더기로 excitation 499 nm, emission 522 nm에서 형광의 세기를 측정하였다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, H₂0₂, LPS 처리시 증가한 ROS는 톳 추출물을 전처리 시에 감소하는 것으로 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 비스코자임 처리된 톳 추출물이 항산화 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

<실시예 7>

비스코자임 처리된 톳 추출물의 mRNA 발현 실험 결과

RAW 264.7 세포(1×10⁶ cells/well)를 본 발명의 비스코자임 처리된 톳 추출물 1, 2, 5, 10 μg/mL의 농도로 1시간 동안 처리한 후, LPS를 100 ng/mL의 농도로 23시간 동안 자극시켰다. 이후 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA로부터 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석에 의한 mRNA 발현양의 분석은 이전의 보고(Kim et al., 2009)에서 사용한 방법을 이용하였고, 유전자 발현량의 상대적인 비교를 위해서 하우스키핑 유전자인 GAPDH(glyceraldehye-3-phosphate dehydrogenase)를 함께 분석하였다. PCR 반응에 이용된 각각의 프라이머는 하기 표 3에 자세히 나타내었다.

유전자 증폭에 사용된 프라이머 서열

유전자	프라이머 서열
iNOS	포워드: 5’-ACATTGATCAGAAGCTGTCCCAC-3’ 리버스: 5’-CAAAGGCTGTGAGTCCTGCAC -3’
GM-CSF	포워드: 5’-CCTTGACCATGATGGCCAG-3’ 리버스: 5’-TGGAGGGCAGTGCTGTTTG-3’
VEGF	포워드: 5′-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3′ 리버스R: 5′-GCAGTAGCTGCGCTGATAGA-3′
COX-2	포워드: 5′-TGTATGCTACCATCTGGCTTCGG-3′ 리버스: 5′-GTTTGGAACAGTCGCTCGTCATC-3′
GAPDH	포워드: 5’-ATCATCCCTGCCTCTACTGG-3’ 리버스: 5’-GTCAGGTCCACCACTGACAC-3’

그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, iNOS, GM-CSF, VEGF, COX-2와 같은 염증 관련, 산화 질소 생성 관련 유전자들의 mRNA 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (P<0.05).

<실시예 8>

비스코자임 처리된 톳 추출물의 관련 단백질 발현 분석

질병은 대부분 염증과 관련되어 있으며, 염증세포들이 염증을 유도시키는 물질을 분비하게된다. 이때 분비되는 것을 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)이라 하며, 환경유해인자, 바이러스, 약물 등이 체내에 들어오게 되면 증가한다. LPS 및 다양한 농도의 톳 추출물을 RAW 264. 7 세포에 23시간 처리 후 RNA를 추출하여, 여러 염증 관련 유전자 발현을 실시간 중합효소 연쇄 반응(real-time PCR)을 통해 확인하였다. 다양한 농도의 톳 추출물을 RAW 264.7 에 처리한 결과, iNOS, GM-CSF, VEGF, COX-2 와 같은 염증 및 산화 질소 생성 관련 유전자들의 발현이 억제 되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 유전자 발현의 변화가 단백질 발현 수준의 변화를 야기하는지 확인하기 위해 웨스턴 블럿 실험을 시행하였다.

RAW 264.7 cell 을 1×10⁵ cells/well 으로 접종하고 24시간 동안 배양한 후 본 발명의 시료를 농도별(1, 2, 5, 10 μg/mL)로 처리하고 1시간 후 LPS(100 ng/mL)를 23시간 동안 자극시켰다. 이후 용해버퍼를 첨가하여 세포를 용해시킨 후 13,000 ×g에서 10분간 원심분리를 진행하였다. 이후, 상등액 100 μL을 취하여 96-웰 플레이트로 옮긴 후, Bradford 법을 이용해 단백질을 정량하였다. 20 μg/mL의 단백질을 10-12% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드(SDS-PAGE)로 변성 분리하고, 이를 PVDF(polyvinyildene difluoride) 멤브레인에 이동시켰다. 멤브레인을 차단시킨 후, 2.5% 탈지분유(nonfat dry milk)가 함유된 트리스 완충 식염수(Tris-buffered saline)에 1차 항체를 넣고 4℃에서 하룻밤동안(14시간) 반응시켰다. 1차 항체와 반응시킨 멤브레인을 PBS-T 로 3회 세척하고, 2차 항체와 상온에서 2시간 반응시킨 뒤에 PBS-T로 3회 세척하여 Imagequant detection system (LAS 4000 mini)으로 각 밴드의 양상을 확인하였다.

그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 톳 추출물을 처리한 실험군에서 처리 농도에 위존적으로 COX-2(cyclooxygenase-2) 단백질 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 참고로, COX-2는 염증지표로 프로스타글란딘을 생성하고 각종 염증반응에서 증대되는 효소이다.

<실시예 9>

비스코자임 처리된 톳 추출물의 염증 관련 전사 인자의 억제 효과

본 실험에서는 LPS를 처리에 따른 염증 및 알레르기 인자의 과발현에 있어서, 본 발명의 톳 추출물의 전처리가 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다.

P-Pikka, P-PNF-Kb 65는 염증, 알레르기 질병 신호 관련에 가장 중요한 요소인 NF-KB 경로를 보기 위한 핵내 단백질이며(intranuclea protein), P-P38, P-P44/42 는 MAPK(mitogen activated protein kinase)로 염증 및 항산화, 알레르기 염증 반응의 상위층의 신호 전달 매개 효소이다.

염증 및 알레르기 관련 단백질 발현 정도는 상기 <실시예 7>과 동일한 방식의 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다.

그 결과 도 10에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 톳 추출물의 전처리로 인해서 염증 및 알레르기 전사인자들의 단백 발현이 감소되는 것을 확인하였다.

<실시예 10>

비스코자임 처리된 톳 추출물의 항알레르기 활성

알레르기 비염은 비강 점막의 알레르기성 염증으로 인하여 재채기, 콧물, 가려움증, 코막힘등의 증상이 나타나는 질환이다. 알레르기 비염은 천식 및 아토피 피부염과 함께 3대 알레르기 질환에 해당한다. 이러한 알레르기 질환은 유전적인 요인과 환경적인 요인의 상호작용에 의해 발생하며, 특히 유전적인 요소가 크므로 대개 가족력이 많이 있다. 환경 오염에 의한 다양한 항원이 대두 되는 것이 알레르기 질환의 유병률 증가의 큰 원인으로 사료된다. 기존의 알레르기 비염 치료법은 단지 증상을 조절하는 치료법으로 이 질환의 근본 적인 면역 이상을 조절하는 것은 아니며, 평생 약물 치료에 의존해야하는 단점이 있다.

본 실험에서는 알레르기 비염 마우스 모델을 이용 비스코자임 처리된 톳 추출물의 항 알레르기 활성을 조사하였다.

<10-1> 알레르기 비염 마우스 모델 (Allergic Rhinitis Mouse Model) 준비

알레르기 비염 마우스 모델 준비와 분류: 4-5주령의 야생형 Balb/c 마우스 40마리를 10마리씩 4군으로 나누어 (A, B, C 및 D군) 실험을 진행하였다. A군은 음성대조군, B군은 양성대조군, C, D군은 톳 추출물 치료군으로 정의하였다.

알레르기 비염 마우스 모델 제작: 양성 대조군 및 톳 추출물 치료군은 실험 0일, 7일, 14일에 각각 오브알부민 (Ovalbumin, Grade V, St. Louis, MO) 25㎍과 수산화알루미늄 젤(aluminum hydroxide gel, Alum) 1㎎을 300㎕ 인산 완충 식염수(PBS, 생리 식염수)에 섞어 복강 내에 주사하여 전신 감작(systemic sensitization)을 유도하였다. 음성 대조군은 동량의 PBS로 전신감작 및 비강 국소 자극을 시행하였다.

톳 추출물 치료 모델 제작: 4-5주령의 야생형 Balb/c 마우스 20마리를 10마리씩 C, D군으로 배분하였다. 두 군은 톳 추출물의 용량과 시기를 다르게 하여 주입하였다. 0일, 7일, 14일에 총 3번의 전신감작을 유도한 후, C군의 경우 톳 추출물 (Viscozyme fraction) 을 300mg/kg 의 농도로 총 볼륨이 300㎕되도록 ddH₂O (증류수)에 섞어 총 5차례 비강 항원 챌린지 기간에만 3시간 전에 복강 내로 주사하였다. D군은 톳 효소 추출물을 600mg/kg 의 농도로 총량이 300㎕되도록 ddH₂O(증류수)에 섞어 총 3차례 전신 감작 기간(0, 7, 14일 째) 3시간 전에 복강 내로 주사하며, 추가로 비강 항원 챌린지 기간에도 3시간 전에 복강 300mg/kg의 농도로 총 볼륨이 300㎕되도록 ddH₂O(증류수)에 섞어 총 5차례 주사하였다.

도 11에서는 오브알부민을 이용한 알레르기 비염 마우스 모델의 제조를 위한 실험 프로토콜을 나타내었다.

<10-2> 비스코자임 처리된 톳 추출물의 알레르기 비염 증상에 미치는 영향 조사

마지막 비강 내 항원 챌린지 후 (실험 27일 째) 마우스가 일으키는 재채기(sneezing) 횟수와 코비빔 동작 (nasal rubbing) 의 횟수를 합하여 알레르기 증상 점수로 표현하고, 10분 동안 관찰하여 각 실험군의 점수를 비교하였다.

그 결과 도 12에서 나타낸 바와 같이, 톳 추출물을 투여한 C군과 D군의 알레르기 증상 점수는 B군 보다 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다(p < 0.05).

<10-3> 알레르기 비염 마우스의 혈청 내 면역 글로불린의 (OVA-specific IgE，IgG ₁ , IgG _2a ) 측정

마지막 비강 내 항원 챌린지 24시간 후 (실험 28일째)에 마우스의 후안구정맥 (retro-orbital vein) 에서 혈액을 채취한 후 실온에서 3시간 가량 지난 후 원심 분리 (3000rpm, 15분) 하여 통해 혈청을 얻어 총 IgE, 오브알부민-특이적 IgE 항체, 오브알부민-특이적 IgG 아형 (subtype) 중 Th2 면역반응과 관련된 IgG₁, 그리고 Th1 면역반응과 관련된 IgG_2a의 농도를 측정하였다.

OVA를 10ug/m,L 의 농도로 카보네이트 버퍼(carbonate buffer)에 희석하여 96-웰 이뮤노플레이트에 100 uL/well 로 코팅한 후 4℃, 밤새도록 반응시켰다. 다음날, 비특이적 결합을 막기 위해 3% BSA 트윈-20-PBS 용액 300 uL/well로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 측정하고자 하는 항체에 따라서 혈청을 적정한 비율로 희석한 후, 각 웰(well)에 50 uL씩 분주하여 상온에서 2시간 인큐베이션을 시행하였다. 0.05% 트윈-20-PBS로 3회 세척 후 비오틴화된 항-마우스 IgE, IG1, IgG_2a Ab (BD　Pharmingen, San Jose, CA, USA)를 희석버퍼(dilution buffer)로 희석하여 100 uL/well씩 분주한 후 2시간 동안 상온에서 반응시킨 후, 0.05% 트윔-20-PBS로 3회 세척하였다. HRP(Pharmingen, 13047E)를 희석버퍼로 1:1000으로 희석한 후 100 uL/well씩 분주하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 세척 시행하였다. TMB reagent (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)를 각 웰(well)당 100 uL씩 분주한 후 30분간 반응시켰다. 2N 농도의 H₂SO₄ 을 50 uL/well씩 분주하여 반응을 중지시킨 후 490 nm 에서 흡광도를 측정하였다 (Microplate Leader, Epoch, Bio Tek, VT, USA).

그 결과 도 13에서 나타낸 바와 같이, 알레르기 비염군에서 정상 마우스 군에 비해 오브알부민-특이적 IgE가 유의하게 증가하였고, 톳 추출물을 투여함으로써 알레르기 비염 군인 B군 보다 C와 D 군에서 IgE 항체 농도가 감소하는 것으로 확인되었다(P <0.05). 그리고 이러한 경향은 D군에서 더욱 현저하게 나타났다. 또한, 혈청 면역글로불린 IgG 아형의 경우, IgG₁과 IG_2a 의 두 경우 모두, C군보다 D군에서 통계적으로 유의하게 감소하는 것으로 확인하였다(P <0.05).

<10-4> 비장 조직 배양액 내의 사이토 카인 발현 분석

실험 동물에서 비장을 채취한 후 단세포(single cell)로 단핵구를 분리하였다. 분리된 단핵구를 1×10⁵ cells/mL의 세포 숫자로 96-웰 플레이트에 3반복하여 깔고, 한 쪽에는 오브알부민-에멀젼을 넣고, 다른 한쪽에는 오브알부민을 넣지 않고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 72시간 배양하였다. 72시간 경과 후 비장세포 배양상층액으로부터 여러가지 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IFN-γ, TNF-alpha) 수준을 ELISA kit 으로 측정하였다.

그 결과 도 14에서 나타낸 바와 같이, 알레르기 비염 마우스 군에서 정상 마우스 군보다 Th2 염증성 사이토 카인인 IL-4, 5, 13 의 분비가 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 반면에, 이러한 증가는 톳 추출물에 의해 감소되었는데, C군의 경우 감소하는 경향성만을 확인할 수 있었고, D군의 경우 통계적 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(P < 0.05). Th1 사이토카인인 TNF-alpha 의 경우에도 알레르기 비염 마우스에서 보다 톳 추출물의 투여한 C군과 D군에서 감소하여, D군의 경우 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(P < 0.05).

또한 톳 추출물을 투여한 C, D 군에서 염증성 사이토 카인 분비를 억제하는 조절성 및 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현 정도는 비장 세포를 OVA로 자극 했을 때와 그렇지 않았을 때의 현저한 발현의 차이가 관찰되었다. 비장세포에서 OVA 자극이 없을 때(basal state) 알레르기 비염 마우스 군보다 C군에서 통계적으로 IL-10의 농도가 높았다(P < 0.05).

이상의 결과를 미루어 볼 때, 알레르기 비염 마우스 모델에서 톳 추출물의 투여는 비장세포에서 항염증성 사이토카인의 발현량을 조절하여 알레르기 염증을 조절하는 것으로 생각되었다.

또한, OVA를 자극 했을 때 알레르기 비염 마우스 군과 C군의 경우 IL-10 농도가 증가 했는데, D군의 경우 농도변화가 관찰되지 않았다. C군과 D군의 오브알부민 자극에 대한 IL-10 반응이 다른 이유는 두 군간의 톳 추출물의 투여시기가 다름에 기인했을 것이라고 판단되었다.

<10-5> 비장 조직 세포의 조절 T 세포 군집도 확인

C군과 D군에서 IL-10 사이토카인의 반응이 다르게 나타나는 것을 확인하기 위해 비장 세포 군집에서 조절 T 세포의 증가 여부를 관찰하기로 하였다.

각 실험군과 대조군 및 오브알부민 자극 유무(+/-)로 나뉘어 72시간 동안 배양된 비장세포(splenocyte)에서 상층액을 걷어낸 후, 각 군별로 1×10⁶개 세포를 정량하여 조절 T 세포 표지 염색을 시행하였다. 우선 비특이적 표지반응을 방지하기 위해, 항-CD 16/CD32 항체를 20분 동안 반응시켰다. 이후 FITC-라벨된 항-CD4 항체, APC-라벨된 항-CD25 항체(eBioescience, San Diego, CA, USA)로 30분간 아이스 위에서 염색하였다. 표면 염색이 끝난 세포들은 고정/투과 작업(fixation/permeabilization working) 용액에서 4℃, 밤새도록 반응시킨 후, 마지막 PE-Cy5-컨쥬게이티드 항-FOXP3+(eBioscience) 항체로 세포내 염색을 1시간 시행하였다. 준비된 검체를 FACS Calibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 이용하여 조절 T 세포의 발달을 비교 분석하였다.

그 결과 도 15 및 도 16에서 나타낸 바와 같이, 유세포분석기 측정 결과 CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T세포(regulatory T cell) 개수는 IL-10 사이토카인의 발현양상에 상응하여 나타났으며, OVA 자극이 있을 때 비장 세포 군집 내에서 B군과 D군 사이에 CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T세포 수의 유의한 차이를 확인할 수 있었다. C군과 D군의 세포수의 차이는 톳 추출물을 처리하는 시기와의 관계가 있을 것으로 생각되었다.

<10-6> 국소 비강 조직내의 유전자 발현

각 군별 마우스의 비강 점막 조직에서 총 RNA를 추출하였다(using Trizol reagent, Invitrogen, CA, USA이용). cDNA를 제작한 후 qPCR(Real-Time quantitative PCR)을 이용하여 비점막의 IL-5, IL-13, IFN-γ, FOXP3 mRNA 발현량을 확인하였다.

그 결과 도 17에서 나타낸 바와 같이, 다른 유전자들은 군간에 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았으나, IL-13 mRNA의 경우 알레르기 비염 마우스인 B군과 비교하여 C, D군에서 현저히 감소하는 것으로 확인하였다.

<10-7> 비강 조직의 병리학적 소견 및 염증 세포 침윤 관찰

마우스의 머리 부분을 10% NBF(netral buffered formaldehyde) 용액에 1일 동안 담근후, 다음날 흐르는 물에 4시간 관류 시킨 후에 Calci-Clear Rapid® (Nantioanl Diagnostics, Atlanta, GA, USA) 용액 추가로 1일 담가 탈석회화 과정을 진행하였다. 이 과정이 완성된 조직을 파라핀 블락(paraffin block)으로 제작한 후에, 마이크로톰(microtome)을 이용하여 원하는 비중격 점막-연골 단면 부분을 관상면으로 4um 두께로 잘라서 스테인용 유리 슬라이드에 올렸다. 시리우스레드(sirius red) 염색을 시행하여 400배 광학 현미경 (Laborlux K, Leica, Stgallen. Switzerian) 하에서 비중격 전장의 점막하층을 관찰하여 조직내 호산구 침윤정도를 측정하였다.

그 결과 도 18 및 도 19에서 나타낸 바와 같이, 톳 추출물을 투여한 C군과 D군에서 비강 조직 내에 전체적인 면역세포(ex. 림프구)와 호산구 침윤 정도가 눈에 띄게 감소하였으며 통계적으로 유의하였다(P <0.05).

참고로, 호산구는 Th2 사이토카인의 표적 세포일 뿐만 아니라, 스스로 염증 반응과 연관하여 여러 성장인자(TGF-alpha, TBF-beta, VEGF) 와 사이토카인(IL-13) 및 케모카인의 생성 기능을 나타내며, eotaxin-1, RANTES, IL-4, 5, 13 등의 의 조절을 받아 염증부위로 이동한다. 호산구의 면역 조절 기능은 크게 항원 제시 세포로의 기능, 비만세포의 조절자, 기도 염증 및 기도 리모델링에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 알레르기 비염 병태 생리에서 매우 중요하게 다루어지는 세포이다.

톳 추출물의 전처리가 마우스 비강 조직에서 호산구 침윤을 감소시키는 현상은 이를 조절함으로써 다양한 질환의 치료에 응용될 수 있음을 시사한다.

한편, IL-13 사이토 카인은 알레르기 염증반응에서 매우 중요한 Th2 사이토 카인으로 호흡 기도의 점액 생성 증가와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 결과를 바탕으로 호흡상피내의 점액을 분비하는 배상세포의 염색 (PAS stain) 을 실시하였다.

그 결과 도 20 및 도 21에서 나타낸 바와 같이, 알레르기 마우스에서 유의하게 증가한 배상세포의 과증식이 톳 추출물의 투여로 인해 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(P <0.05).

<실시예 11>

톳 추출물의 종류별 항알레르기 활성

본 실험에서는 다양한 추출 방식을 통해 제조한 톳 추출물의 항 알레르기 활성을 비교하기 위하여, 알레르기 비염 마우스 모델을 이용하였다.

<11-1> 톳 열수 추출물 준비

톳 열수 추출물은 톳 분말시료 300 mg에 증류수 30 mL을 첨가하여 고압멸균기(autoclave)를 이용하여 100℃로 1시간 추출하고 원심분리기를 사용하여 상등액을 모아 동결건조하여 제조하였다.

<11-2> 톳 에틸아세테이트 추출물 준비

톳 분말시료 10g에 80% 에탄올을 첨가하여 100 mL의 80% 에탄올에 침지하여 실온에서 24시간 주기로 3일 동안 추출하였다. 에탄올을 사용한 톳 추출물은 여과지로 여과한 후, 증발기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 상기 에탄올 추출물은 n-헥산, 에틸 아세테이트를 이용하여 순차 추출하였으며, 각 단계별 추출물 중 최종적으로 수득한 톳 에틸아세테이트 추출물은 증발기를 이용하여 건조시켜 시료로 사용하였다.

<11-3> 톳 효소 추출물 준비

톳 분말시료 2 g에 버퍼 100 mL을 넣고 비스코자임 효소를 100μL를 첨가하여 혼합한 후 150 rpm, 50℃에서 6시간 반응시켰다. 효소 가수분해물은 100℃에서 15분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨 후, 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 시료로 사용하였다.

<11-4> 알레르기 비염 마우스 모델 (Allergic Rhinitis Mouse Model) 준비

알레르기 비염 마우스 모델 준비와 분류: 4-5주령의 야생형 Balb/c 마우스 50마리를 10마리씩 5군으로 나누어 (Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ군) 실험을 진행하였다. Ⅰ군은 음성대조군, Ⅱ군은 양성대조군, Ⅲ군은 톳 열수 추출물 치료군, Ⅳ군은 톳 에틸아세테이트 추출물 치료군, Ⅴ군은 톳 효소 추출물 치료군으로 정의하였다.

알레르기 비염 마우스 모델 제작: 양성 대조군 및 톳 추출물 치료군은 실험 0일, 7일, 14일에 각각 오브알부민 (Ovalbumin, Grade V, St. Louis, MO) 25㎍과 수산화알루미늄 젤(aluminum hydroxide gel, Alum) 1㎎을 300㎕ 인산 완충 식염수(PBS, 생리 식염수) 에 섞어 복강 내에 주사하여 전신 감작(systemic sensitization)을 유도하였다. 음성 대조군은 동량의 PBS로 전신감작 및 비강 국소 자극을 시행하였다.

톳 추출물 치료 모델 제작: 4-5주령의 야생형 Balb/c 마우스 30마리를 10마리씩 Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ군으로 배분하였다. 각각의 실험군은 톳 추출물(열수 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 효소 추출물)을 600mg/kg 의 농도로 총량이 300㎕되도록 ddH₂O(증류수)에 섞어 총 3차례 전신 감작 기간(0, 7, 14일 째) 3시간 전에 복강 내로 주사하며, 추가로 비강 항원 챌린지 기간에도 3시간 전에 복강 300mg/kg의 농도로 총 볼륨이 300㎕되도록 ddH₂O(증류수)에 섞어 총 5차례 주사하였다.

<11-5> 톳 추출물의 종류별 알레르기 비염 증상에 미치는 영향 조사

마지막 비강 내 항원 챌린지 후 (실험 27일 째) 마우스가 일으키는 재채기(sneezing) 횟수와 코비빔 동작 (nasal rubbing) 의 횟수를 합하여 알레르기 증상 점수로 표현하고, 10분 동안 관찰하여 각 실험군의 점수를 비교하였다.

그 결과 도 22에서 나타낸 바와 같이, 톳 효소 추출물을 투여한 Ⅴ군의 알레르기 증상 점수가 Ⅲ, Ⅳ군 대비 두드러지게 낮은 것을 확인할 수 있었다(p < 0.05).

이러한 결과를 통해, 톳 추출물의 종류에 따라 알레르기 비염의 치료 효과에 있어서 차이를 보이며, 특히, 톳 효소 추출물의 경우 톳 열수 추출물이나 유기용매 추출물 대비 알레르기 비염의 치료에 효과적인 것을 알 수 있었다.

<11-6> 알레르기 비염 마우스의 혈청 내 면역 글로불린의 (OVA-specific IgE) 측정

마지막 비강 내 항원 챌린지 24시간 후 (실험 28일째)에 마우스의 후안구정맥 (retro-orbital vein) 에서 혈액을 채취한 후 실온에서 3시간 가량 지난 후 원심 분리 (3000rpm, 15분) 하여 통해 혈청을 얻어 오브알부민-특이적 IgE 항체의 농도를 측정하였다.

측정방법은 상기 실시예 <10-3>과 동일한 방식으로 진행하였다.

그 결과 도 23에서 나타낸 바와 같이, 톳 효소 추출물을 투여한 Ⅴ군의 오브알부민-특이적 IgE 항체 농도가 Ⅲ, Ⅳ군 대비 두드러지게 낮은 것을 확인할 수 있었다(P <0.05).

이러한 결과는 상기 실시예 <11-5>와 일치하는 결과로서, 톳 효소 추출물의 경우 열수 추출물이나 유기용매 추출물 대비 알레르기 비염의 치료에 효과적인 것을 알 수 있었다.

이상의 동물 실험 결과를 종합하여, 톳 추출물은 CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T세포수의 변화를 유도하여 항염증성 사이토카인인 IL-10 의 발현 농도를 증가시킴으로써 면역학적으로 의미있는 조절 반응을 나타낸다. 뿐만 아니라, 알레르기 비염 마우스 모델에서 톳 추출물은 비강 조직 내에 호산구와 같은 염증세포의 침윤을 감소시키며, 배상세포의 과증식을 억제하는 것으로 확인된다. 전신 감작기에 복강내 투여한 톳 추출물 다당체는 복강내로 투입된 오브알브민의 항원성을 감소하여 알레르기 염증 반응 자체를 일으키는 것을 저해하는 방법으로 알레르기 염증반응을 억제하는 것으로 생각되며 (early phase response 감소), 비강 항원 챌린지 시기에 복강내 투여된 톳 추출물 다당체는 전신 감작기에 투여되는 톳 다당체와는 달리 조절 T 세포의 군집도를 증가시켜 항염증 작용을 강화하는 방향 (late phase response 감소)으로 항 알레르기 기전을 나타내는 것을 생각된다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

1. 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 톳 효소 추출물은 톳 분말에 효소를 첨가하여 혼합한 후 반응시켜 효소 가수분해물을 제조하는 단계; 상기 효소 가수분해물을 고온에서 가열하여 효소를 불활성시키는 단계; 및 상기 효소가 불활성화된 가수분해물을 원심분리를 진행한 후 상등액을 수득하는 단계를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 효소는 비스코자임(Viscozyme), 셀룰클라스트(Celluclast) 또는 알칼레이스(Alcalase)인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 염증질환은 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 동맥경화, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 알츠하이머병, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상 및 췌장염으로부터 구성된 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 알러지 질환은 알러지성 비염(allergic rhinitis)인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
7. 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 개선용 화장료 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항알러지용 사료첨가제 조성물.
10. 톳 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
11. 제10항에 있어서,
    상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.

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