EP1945046A1 - Procede d'obtention d'un extrait vegetal de fruits a pepins, extrait vegetal ainsi obtenu et ses utilisations - Google Patents

Procede d'obtention d'un extrait vegetal de fruits a pepins, extrait vegetal ainsi obtenu et ses utilisations

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EP1945046A1
EP1945046A1 EP06808263A EP06808263A EP1945046A1 EP 1945046 A1 EP1945046 A1 EP 1945046A1 EP 06808263 A EP06808263 A EP 06808263A EP 06808263 A EP06808263 A EP 06808263A EP 1945046 A1 EP1945046 A1 EP 1945046A1
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EP
European Patent Office
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weight
extract
fraction
apple
enriched
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06808263A
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German (de)
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Inventor
Tibogo Sanogo
Philippe Sanoner
Romuald Eude
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Diana Ingredients SAS
Original Assignee
COOPERATIVE AGRICOLE ELLE ET V
Elle et Vire SCA
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Publication date
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Application filed by COOPERATIVE AGRICOLE ELLE ET V, Elle et Vire SCA filed Critical COOPERATIVE AGRICOLE ELLE ET V
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to the field of extracting plant substances of interest from pome fruits, in particular from apples.
  • the invention relates in particular to the use of these vegetable substances extracted from pome fruits in various fields of industry, and in particular in the fields of cosmetics, food, nutraceutical, dietetic or even in the field of dyes.
  • the whole micronized marc is used as raw fibers for incorporation in human nutrition.
  • the major disadvantages of this type of product are the characteristic taste and color, as well as an unpleasant sandy sensation in the mouth.
  • the current extracts from the apple market are obtained from processes using the whole fruit or its industrial by-products, often very heterogeneous, such as whole marc. Therefore, these extracts, if obtained using water or a solvent such as ethanol, contain all the phytoactives present in the raw material. To obtain extracts particularly rich in a particular active, it is then necessary to use very selective extraction or separation solvents. liquid / liquid often incompatible with food use. Only certain homogeneous, but rarer, by-products such as peels resulting from industrial processes requiring prior peeling of the apples, can make it possible relatively easily to obtain extracts strongly enriched in certain compounds (quercetin, waxes).
  • EP-A-0 657 169 discloses a process for extracting polyphenols from immature apples of 3 to 10 grams.
  • the polyphenolic fraction is obtained from the pressing juice of crushed apples and thus contains essentially the water-soluble compounds which pass easily in the juice, namely those of the group of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, p-coumaric) and of the group flavanols (catechins and their polymers).
  • Quercetin and the glycosylated derivatives of phloretin (phloridzine) are present in small proportions.
  • the apple is the most consumed fruit in the world and is an important source of beneficial substances such as fiber, polyphenols or triterpenoids. Many studies have shown that plant polyphenols, especially those present in apple, have various nutritional and physiological properties including antioxidant, anti-carcinogenic, anti-arteriosclerotic, anti-bacterial, anti-viral, lipidemia and glycemia . Polyphenols are also able to activate endogenous intracellular anti-oxidants, inhibit the formation of pro-carcinogens, inhibit the proliferation of cancer cells, block angiogenesis, activate and enhance immune activate tissue remodeling.
  • quercetin and phloridzine polyphenolic compounds strongly present in the apple (phloridzin is specific to this fruit), are known for their ability to regulate the transmembrane absorption of sugars and therefore their favorable effects on lipid and carbohydrate metabolism. These two molecules have proven preventive actions against diabetes, obesity, lipogenesis. They exhibit properties similar to those of isoflavones and may act favorably against osteoporosis and the adverse effects of menopause.
  • the phenolic compounds of the apple are very studied for their multiple beneficial effects and their anti-aging, anti-diabetic, slimming, anti-cellulite applications ...
  • the apple extracts rich in polyphenols are more and more present in so-called functional or health foods, food supplements and cosmetics.
  • compositions enriched in polyphenols from plants, and in particular from apples.
  • French patent FR 2,822,466 describes a phenolic fraction of apple rich in phloridzine and its use as a cosmetic, food or nutraceutical agent.
  • European Patent EP 0 657 169 describes a polyphenolic extract obtained from immature apples of the order of 3 to 10 grams. The extract thus obtained can be used in cosmetics and nutraceuticals.
  • French patent FR 2 836 336-A1 and US US 0,161,900 A1 describe the use in a cosmetic treatment of a phenolic fraction rich in dihydrochalcones.
  • US Pat. No. 5,587,174 describes a cosmetic composition for the treatment of skin and hair, containing extracts of apple wax and their manufacturing processes.
  • 2,808,442 describes a process for extracting an active ingredient from apple teguments, the active ingredient obtained and composition adapted to combat the consequences of oxidative stress of the skin.
  • the said active principle is obtained by enzymatic hydrolysis of the seed powder in aqueous solution, sterilizing filtration and optionally concentration. This principle is characterized by a strong presence of apple sugars, oligosaccharides released by enzymatic hydrolysis and polyphenols in a smaller proportion.
  • the French patent 0688 FR presents new macromolecular complexes derived from the apple, their method of preparation and their use as a cholesterol-lowering agent.
  • the molecular complexes obtained are characterized in that they contain 5 to 25% of cationic polysaccharides, 5 to 15% of hemicellulose, 0 to 50% of cellulose and 25 to 55% of quinone pigments (polyphenols and polymerized derivatives).
  • US Pat. No. 6,630,163 proposes a method for treating dermatological disorders with extracts of various fruits including apples, apricots, peaches, pears, pineapples, papayas, pomegranates, kiwis, mandarins and oranges.
  • the French patent FR 2 799 121 relates to a process for obtaining polyphenolic extracts, rich in phloridzin, from apple branches and their cosmetic uses.
  • U.S. Patent No. 6,528,053 discloses compositions and methods for reducing serum oxysterols using extracts of various fruits including apple.
  • apple patents generally claim a single type of polyphenol-rich extract and applications based on the particular polyphenol composition. Extracts rich in procyanidols (tannins) highlight the properties specifically related to these compounds, namely the antioxidant power. Those claiming a richness in dihydrochalcones (phloridzine) put forward the peculiarity of these molecules to regulate the cellular absorption of sugars. This is the case for example for French patents FR 2 836 336 and US US 0.161, 900 A1 claiming the use of an apple extract rich in dihydrochalcones.
  • transmembrane glucose transport is inhibited when a human uterine cell line is treated with apple extract.
  • French patent FR 2 799 121 claims an apple extract rich in phlorizine obtained from apple branches.
  • the authors of the invention claim the synergistic action of all the active ingredients of the extract to explain the ability of the latter to inhibit the differentiation of preadipocytes into adipocytes.
  • the chemical nature, in particular the polyphenolic profile, of these other components as well as their modes of action are not specified.
  • the test used consisted of studying the effect of apple extract on the differentiation of preadipocyte cells into adipocytes as well as on the accumulation of intracellular lipids in differentiated cells.
  • the invention relates to a method for obtaining a plant extract of pome fruits enriched in one or more vegetable substances of interest, characterized in that it comprises the following steps: a) separating, from the fruits to starting glitches, or a starting marc obtained from said pome fruits, in the dry state, respectively the following fractions:
  • the invention also relates to the fractions enriched with fruit pulp, fruit skins and fruit seeds that can be obtained by the process described above.
  • the invention also relates to extracts obtained from the various fractions enriched with pulp, skins or pips above, as well as to food, nutraceutical, cosmeceutical, dietetic, cosmetic or pharmaceutical compositions comprising such extracts.
  • the present invention also provides plant extracts, including apple extracts, usable as such and for the manufacture of food compositions, nutraceutical, cosmeceutical, dietary, cosmetic or pharmaceutical.
  • an improved process for obtaining plant extracts of industrial interest from pome fruits which comprises firstly one or more steps of separation of the plant raw material into different enriched fractions. in each of its main constituents, respectively skin, pulp, pips, and even in fractions enriched in each of the main constituents of the pips, respectively hulls and kernels of pips.
  • the subject of the invention is a process for obtaining a plant extract of pome fruits enriched in one or more vegetable substances of interest, characterized in that it comprises the following stages: (a) separating, from the starting pomes, or from a starting pomace obtained from those pome fruits, in the dry state, respectively the following fractions:
  • step b) preparing, from at least one of fractions (i), (ii), (iii), (iii-1) and (iii) iii-2) obtained in step a), an extract enriched in one or more vegetable substances of interest.
  • step b) since it comprises a first step a) of separating the starting raw material into fractions enriched in its various main constituents, makes it possible, in step b), to prepare extracts selectively. enriched with various vegetable substances of industrial interest.
  • the method according to the invention therefore provides technical advantages over prior processes not comprising a prior separation step.
  • the seeds comprise on average 25% by weight of lipids, relative to the total weight of the seeds and a large amount of protein, sometimes greater than 25% by weight.
  • the seed oil comprises 80% by weight of unsaturated linoleic and oleic fatty acids, based on the total weight of the acids that the seeds contain.
  • the fraction enriched in skins comprises a large amount of waxes, one of the components of which is ursolic acid which is used in the cosmetic, food and pharmaceutical fields.
  • the process of the invention it is now possible to prepare a phloridzin-rich extract from the seed-enriched fractions, including a reduced amount of other polyphenols.
  • extracts selectively rich in only some of the polyphenols present in the whole fruit For example, the fraction enriched in pulp allows the preparation of extracts mainly comprising polyphenols of the catechin type, procyanidin polymers or hydroxycinnamic acids.
  • the fraction enriched with skins makes it possible to prepare extracts mainly comprising flavonols, in particular quercetin.
  • extracts rich in phloridzin can be prepared from the seed rich fractions.
  • the extracts obtained from the various fractions enriched in step a) can be easily prepared using simple and inexpensive extraction methods which reduce, or even do not require the use of solvents or chemical reagents selective for certain substances of interest, but which would be incompatible with the regulations governing the placing on the market of food or cosmetic products.
  • extracts of industrial interest for example extracts rich in polyphenols
  • step a the process according to the invention makes it possible, in step a), to effectively perform the physical fractionation of the starting raw material, preferably a pomace fruit pomace, in order to carry out step b). extracted by extraction processes that are soft, non-denaturing and compatible with the regulations governing the placing on the market of products intended for human use.
  • the extracts obtainable by the process of the invention are particularly suitable for use in the food or cosmetic field.
  • the raw material is then depleted.
  • some polyphenols such as procyanidins and hydroxycinnamic acids, and therefore proportionally richer in other polyphenols of interest.
  • plant particles of close physical characteristics such as vegetable particles contained in a dried mash of pome fruit, or a dried pomace of pome fruits, in particular apples, in particular apples with cider, could be effectively separated at least into their main constituents derived respectively from the skin, pulp and seeds. It has also been shown that pips can be effectively separated into their main constituents, respectively kernel of seeds and hulls of pips.
  • step a) of the process the fractions (i), (ii), (iii), (iii-1) and (iii-2) are obtained as a result of one or more steps of separation of the constituents of the starting material according to at least one of the following:
  • US Patent No. 1,030,042 discloses a particle separation device according to the form of said particles which comprises a chute provided with a rotating disk in its middle, which is in this patent applied to the separation of particles of different ores.
  • the charcoal of more or less spherical form is easily separated from more or less flat slate shale fragments.
  • the Spherical coal falls easily into the chute as flat rock accumulates on the disk and is evacuated.
  • No. 1,190,926 discloses a device of the same type but without chute. The mixture is directly placed on an inclined rotating disc. The coal continues to descend in its original direction. On the other hand, flat rock accumulates on the disk.
  • No. 1,474,967 is based on the friction difference obtained by increasing the gravitational force by applying an electrostatic force. This process takes advantage of the fact that flat particles create a stronger electrostatic field than that created by spherical particles.
  • step a) of the process according to the invention it is also possible to use the technique described in French patent FR 2,635,475.
  • This French patent describes an apparatus for separating the different constituents of a mixture of discrete particles.
  • the apparatus comprises devices for transferring and distributing the mixture on a rotating disc on which it slides.
  • the different constituents can thus be collected at different radial locations.
  • the separation is effected according to the friction conditions of the particles.
  • any dried residue of the fruit industry which contains a part or all the organs of the fruit: skins, pulp, pips, tails, stumps.
  • co-products of the cider industry are used.
  • grading differences are used for table apples. These table apples are often in an advanced state of ripening and provide much more crushed, soft, pasty and hard to process pulps on unadjuvanted industrial presses. In addition, the seeds are usually crushed and mixed with the pulp.
  • cider apple varieties have much firmer structures and give well-differentiated particles of varying sizes with generally intact pips.
  • the starting raw material is a dry matter in the form of a heterogeneous set of particles, which is obtained from whole pip fruits or is obtained from the pressing residues of pome fruits.
  • the starting dry matter may consist of a dry residue of ground or crushed pomace fruits.
  • the starting raw material may consist of a dried pomace, that is to say a dry residue from the pressing of pome fruits for obtaining fruit juice.
  • the starting raw material may advantageously consist of a dried pomace of apples intended for human consumption or a dried pomace of apple cider.
  • the starting raw material consists of a set of dry particles having various shapes and sizes and similar densities.
  • Step a) above is particularly advantageous when the starting raw material, preferably a pomace fruit marc, is in dry form and consists of a set of dry particles.
  • Step a) above is particularly advantageous when the starting raw material is a dried marc obtained from residues of apple juice or cider manufacture.
  • grape marc comprises constituents which are easily differentiated in size, shape and density, which is not the case for the constituents contained in apple pomace.
  • the grape seeds can be separated from the other constituents of the grape marc by simple flotation, which is not possible with the apple pomace.
  • grape marc essentially contains dandruff (skins), stalks and seeds.
  • dandruff silk
  • stalks and seeds we do not find well-differentiated pieces of pulp, of different sizes and densities, which remain intact and complicate the separation.
  • the grape seeds are very small and light. They can easily float on the surface of a liquid such as water.
  • skins and grape stalks decant by gravity towards the bottom of the liquid.
  • apple marc is much more heterogeneous.
  • seeds that are much larger and heavier than grapes.
  • apple pomace contains pieces of pulp of different sizes, some of which are the same size and very similar in density to seeds.
  • apple marc is dispersed in water, it is found that the seeds and a good part of the pulps and skins settle at the bottom. This makes it difficult, if not impossible, to separate the apple seeds by the simple phenomenon of floating (flotation) on the surface.
  • the process according to the invention advantageously exploits the slight differences in shape, density and size.
  • the mixtures of particles which constitute the raw material of departure are first subjected to sorting operations by successive sieving, selections on air flow or any other operation making it possible to obtain groups of particles that are more homogeneous in terms of density and of size.
  • the particles present in these homogeneous fractions are then separated individually by one or other of the appropriate technologies to effectively achieve these objectives.
  • relatively homogeneous particles can be contact with a surface on which the constituents have differences of movement.
  • the said surface on which the materials are separated may constitute a part of the apparatus in which vibratory movements combined with angles of inclination are applied to the materials so as to cause differences in displacement related to the shape, density and surface texture.
  • This apparatus may have any suitable configuration for reproducing such separation effects.
  • the apparatus may comprise vibrating platters, vibrating and / or rotating cylinders, vibrating tables, suction systems, suction machines or blowers.
  • a system which comprises (i) means for bringing the materials to be separated on the separation device, (ii) means for transporting the materials being fractionated between the different elements of the separating device, (iii) means for applying the forces intended to cause the movements of materials between the apparatus and in the apparatus as well as (iv) means for collecting the separated particles.
  • the starting raw material to be separated is introduced by means of a feed system.
  • dry pomace or any other mixture of pome fruit vegetable particles is introduced from a hopper onto a vibratory three-stage screening device. This first screening makes it possible to obtain three fractions.
  • the intermediate fraction, previously enriched in seeds, is passed through a tapered Tarare type airflow selector or any other apparatus allowing the elimination operation of the elements of same size as seed but lower density. This step is essentially used to separate the skin of the same size as the seeds.
  • the thus doubly enriched fraction may undergo an additional sorting step to obtain a highly enriched fraction.
  • This last operation can be carried out on a densimetric table or any other separation / sorting / selection device making it possible to achieve this objective, that is to say obtain different displacements between seeds and pulp particles of the same size and density. very close.
  • step a) comprises the following step: a1) separation of three fractions by sieving with double sieves, respectively:
  • a first screen having a mesh size of 3.5 mm and a second screen having a mesh size of 5 mm are preferably used.
  • a fraction (F1) having a particle size greater than 5 mm which consists essentially of skins respectively (i) a fraction (F1) having a particle size greater than 5 mm which consists essentially of skins, (ii) a fraction (F2) having a size of particles less than 3.5 mm which consists essentially of pulp and (iii) a fraction (F3) having a particle size of between 3.5 mm and 5 mm which includes seeds, mixed with particles of pulp and skins of the same size.
  • step a1) a conventional two-stage vibrating screen equipped with two screens is advantageously used, for example a vibrating screen sold by SWECO (Belgium).
  • fraction (F1) when dry pomace of apple, in particular cider apple, is used as starting raw material, about 200 kg of fraction (F1), about 600 kg of fraction (F2) and about 200 kg of product are obtained.
  • fraction (F3) starting from 1000 kg of raw material.
  • the seed-enriched fraction (F3) which also comprises particles of pulp and skin, may be subjected to an additional separation step in order to obtain a fraction (F5). still richer in seed particles, and a fraction (F4) essentially comprising particles of pulp and skin.
  • the fraction enriched in seeds obtained at the end of step a1) is subjected to the following additional separation step: a1a) separation of constituents according to their density, to obtain the following fractions:
  • the separation step a1a) can be carried out using a separation device consisting of a conventional air flow densimetric table, for example a densimetric table marketed by SDE (France) a densimetric table marketed by the Vauche Company (France).
  • a separation device consisting of a conventional air flow densimetric table, for example a densimetric table marketed by SDE (France) a densimetric table marketed by the Vauche Company (France).
  • the separation step a1a) can also be carried out using a separating device consisting of a conical air-flow separator of a conventional Tarare type, for example a FAVINI brand air-flow separator. ® marketed by Guillot Process (France).
  • a separating device consisting of a conical air-flow separator of a conventional Tarare type, for example a FAVINI brand air-flow separator. ® marketed by Guillot Process (France).
  • the separation step a1a) can also be carried out using a separation device consisting of a conventional air-flow separator, for example an air-flow separator marketed by the Alpine Company (France), including a model Zig-Zag® type marketed by the Alpine Company.
  • a conventional air-flow separator for example an air-flow separator marketed by the Alpine Company (France), including a model Zig-Zag® type marketed by the Alpine Company.
  • the fraction (F5) enriched in seeds obtained at the end of step a1a) of the process comprises at least 60% by weight of pips, preferably at least 65% by weight of pips, relative to the total weight of said fraction.
  • the seed-enriched fraction (F5) may be further enriched in seeds by the addition of an additional separation step following step a1a) to obtain a fraction (F6). comprising essentially seeds and a fraction (F7) essentially comprising skin and pulp particles.
  • step a1a) is followed by an additional step a1a1) of separating the constituents according to their density, in order to obtain:
  • Step a1a1) is advantageously carried out using any device for separating particles by densimetry.
  • Step a1a1) can thus be performed using a densimetric table of a known type.
  • step a1a1) it is also possible to carry out step a1a1) using a separator device of the air flow selector type marketed by the Alpine Company (France), including a Zig-Zag® type model marketed by the Alpine Company. .
  • the fraction (F6) enriched in seeds obtained at the end of step a1a) of the process comprises at least 80% by weight of pips, preferably at least 85% by weight of pips, relative to the total weight of said seed enriched fraction.
  • the fraction (F7) enriched in skin and pulp particles comprises less than 10% by weight of seeds, preferably less than 5% by weight of seeds, relative to the total weight of said fraction.
  • any one of the enriched fractions obtained at the end of any one of the stages a1), a1a) and a1a1) can be subjected to an additional step at during which the seeds are peeled to separate seed kernels and seed shells.
  • the step of separating seed kernels and seed shells is carried out on a fraction substantially enriched with seeds, and quite preferably on the fraction seed-enriched product obtained at the end of step a1a1) of the process, which has been designated fraction (F6) above.
  • the seed-rich fraction is subjected to a separation step in the following two fractions:
  • the separation step into a fraction enriched with seed kernels and a seed shell enriched fraction is carried out according to the following steps:
  • the peeling of the seeds can be carried out with a device of the hammer mill type, for example a hammer mill marketed by the company ELECTRA (France).
  • the separation of the hulls and almonds can be carried out with a device of the airflow selector type, for example a Favini® tapered wedge sold by the company GUILLOT PROCESS (France) or a Zig-Zag® selector marketed by the company. ALPINE Company (France).
  • a Favini® tapered wedge sold by the company GUILLOT PROCESS (France) or a Zig-Zag® selector marketed by the company. ALPINE Company (France).
  • the grinding chamber of the hammer mill may be equipped with a screen having a suitable mesh size.
  • a sieve with a mesh size of 3.5 mm is advantageously used, which makes it possible to retain the whole unshelled seeds.
  • the peels can also be dehulled using a double-roll dehulling device of a known type, for example a double-roll dehulling device marketed by Colombini (Italy).
  • the spacing distance between the two cylinders of the device is adapted so as to allow the dissociation of the shells and almonds without generating fine powder.
  • the shelling of seeds can also be carried out using a sheller and separator device marketed by the company Electra (France), or the brand FAVINI marketed by the company Guillot Process (France).
  • a screen device for example a vibrating screen, having a suitable mesh size.
  • a sieve having a mesh size of 0.4 mm can be used, which makes it possible to retain the coarse particles and to eliminate the fines.
  • step b) of the process of the invention at least one of the fractions (i) enriched with skins is prepared, (ii) enriched in pulp, (iii) enriched in whole seeds, (iii-1) enriched in seed kernels and (iii-2) enriched in pork shells, which were obtained in step a), an extract enriched in one or several plant substances of interest contained in at least one of said fractions, by extraction of said substance or substances from said fraction (s).
  • the plant substances of interest contained in at least one of said fractions include polyphenols, waxes, sugars, oils or fatty acids.
  • Polyphenols are secondary metabolites of plants with many biological properties including anti-tumor, anti-inflammatory, anti-aging, anti-oxidant, anti-aging and anti-aging activities. allergic, anti-bacterial.
  • dihydrochalcones, and especially rosaceae-specific phloridzine exhibit biological properties similar to those of soy isoflavones.
  • Phloridzine also exhibits good anti-diabetic activity by competitively inhibiting sodium-dependent transmembrane transport of sugars. Similarly, this molecule can block the growth of tumor cells by inhibiting protein kinase C activity. Phloridzin also influences melanogenesis through its use as a tyrosinase substrate. The result of this last action is better protection against UV radiation.
  • step b) the extraction of the polyphenols can be carried out using any polyphenol extraction process known to those skilled in the art, in particular the techniques for extracting polyphenols by chromatography, for example by purification on adsorbent resins, such as those described in European Patent Application No. EP-657 169 or in US Pat. Nos. 6,238,673 and 6,620,452.
  • Those skilled in the art may also refer to the polyphenol extraction methods described by Lu and Foo (1997, Food Chemistry, Vol 59: 187-194), Foo and Lu (1998, Food Chemistry, Vol 64: 511 -518) or by Schieber et al. (2003, Innovative Food Science and Emerging Technologies, 4: 99-107).
  • styrene-divinylbenzene or polyvinylpyrrolidone-type resins are preferably used.
  • the various fractions obtained in step a) of the process are used as starting materials to obtain polyphenolic extracts rich in procyanidols, quercetin or phloridzine. Almonds are readily usable for extracting oil by conventional cold pressing or hexane solvent extraction processes. The oil can then undergo different refining operations.
  • the skins also serve as a substrate for obtaining crude waxes or ursolic acid concentrates.
  • the polyphenols, the waxes or the ursolic acid are extracted from the various fractions of marc by the implementation of solvents.
  • the solvents used may be water, ethanol, methanol, acetone or isopropanol. Water and / or agricultural ethanol are preferably used because the latter is compatible with food use. In order to obtain extracts compatible with the regulations governing the placing on the market of food and cosmetic ingredients, water is preferably used as extraction solvent. Water is the most used solvent in traditional food technologies, including cooking, decoction, diffusion or brewing.
  • the low yields of the water extraction stages are offset by the preservation of the qualities, the naturalness, the preservation of the qualitative and quantitative ratios of the substances present in the traditional water technologies and the good acceptability of the extracts of this type. by the consumer.
  • the use of water also reduces the cost of alcohol.
  • the liquid extracts obtained are clarified by filtration, centrifugation, decantation or any other technical means to achieve this objective.
  • the saccharide and proteinaceous polymers present in the clarified liquid are then removed by any means of physical filtration treatment, microfiltration, ultrafiltration, precipitation / flocculation or enzymatic treatment to achieve this goal.
  • non-denaturing processes comprising a filtration step, a microfiltration step, an ultrafiltration step, or a combination of such steps, or one or several enzymatic treatment steps to eliminate the polymers while preserving the natural qualities of polyphenols.
  • Filtration / ultrafiltration techniques are preferably used because, according to the legislation of certain countries, in particular France, the use of an enzyme preparation in a new process requires the obtaining of a specific authorization for this application.
  • the clear liquid phase free of its high molecular weight polymers is passed on an adsorbent support which retains the polyphenols.
  • the polyphenols are eluted with an ethanolic solution of 40 to 75% (w / w).
  • w / w ethanolic solution
  • 70-75% (w / w) agricultural alcohol is used to maintain the naturalness of the extracts.
  • the alcoholic eluate is distilled and the plant substances of interest retained in the aqueous phase are concentrated and then dried by any known technique, including freeze-drying, spray-drying or any other drying process to obtain a powder without denaturing the vegetable substances of interest.
  • step a) of separation or dry sorting of apple pomace is the essential step for influencing in a decisive way the qualitative and quantitative profile of vegetable substances of interest contained in the final products.
  • step b) consists of an extraction of the polyphenols by chromatography
  • the adsorbent support chromatography step b) has the sole objective of obtaining an extract rich in total polyphenols. . That is to say, this step comes down to a simple desuggling operation of the extracts. In no case is it a question of using this means to favor concentration in one polyphenolic group with respect to another.
  • step b) the polyphenols are extracted from one of the following fractions obtained in step a):
  • oil is extracted from one of the following fractions: - the fraction enriched with seeds,
  • wax is prepared from the fraction enriched with skins.
  • an extract enriched in polyphenols can be prepared from fraction (ii) enriched with pulp.
  • the pulp-enriched fraction (F2) previously described in the present description can be used as the starting material.
  • the polyphenols can be obtained by a process comprising the following steps: b1) at least one extraction step with hot water and recovery of the extraction liquid; b2) from the extraction liquid, separation of the liquid fraction comprising the polyphenols from the solid fraction comprising colloids of proteins and polysaccharides; b3) passage of the liquid fraction on an adsorbent resin support retaining the polyphenols; b4) elution of immobilized polyphenols on the adsorbent resin support; b5) concentration of the eluate to obtain a concentrated liquid fraction enriched in polyphenols; b6) optionally, drying the concentrated fraction obtained at the end of step b5).
  • the hot water used for the extraction is advantageously at a temperature ranging from 50 ° C. to 90 ° C., preferably from 60 ° C. to 80 ° C. and better still about 70 ° C.
  • step b1) the amount of hot water used is set in a weight ratio dry fraction / water ranging from 6% to 10%, and more preferably about 8%.
  • step b1) as many extraction steps with water as necessary to recover almost all the polyphenols contained in the fraction enriched pulp used as starting material.
  • a number of extraction steps with water ranging from 3 to 10, optionally 6, are carried out.
  • step b2) the extraction liquid is filtered and then clarified before carrying out step b3).
  • the clarification is advantageously carried out by centrifugation of the filtrate.
  • the centrifugation supernatant can be subjected to a step of removing the colloids present in this clarified liquid fraction, for example by ultrafiltration, advantageously by ultrafiltration with a filter membrane having a cutoff threshold of 50 KDa.
  • the colloids are retained by the filter membrane and constitute the ultrafiltration retentate.
  • the ultrafiltration permeate is a clarified liquid fraction comprising polyphenols.
  • the clarified liquid fraction is brought into contact with the adsorbent resin support, in step b3) of the process.
  • adsorbent resin of the XAD type sold by the company Rhom and Haas (France) may be used.
  • step b4) the polyphenols are eluted with an ethanol solution, for example a 60% (w / w) ethanol solution.
  • step b5) the concentration of the eluate can be carried out by distillation in order to obtain a concentrated liquid fraction enriched in polyphenols.
  • step b6) the concentrated liquid fraction obtained at the end of step b5) can be dried by any technique known to those skilled in the art, such as by atomization or lyophilization.
  • step b) above is the subject of Example 7.
  • colorimetric analysis by the Folin-Ciaucalteu technique, and using catechin as the standard compound it was determined that the final powder comprises 41 % by weight of polyphenols, relative to the total weight of said powder.
  • thiolysis, followed by a HPLC chromatography step it was determined that the final powder comprises: - 15% by weight of flavanols (catechins and procyanidic polymers)
  • an extract enriched in polyphenols can be prepared from fraction (i) enriched with pulp.
  • the fraction (F1) or the fraction (F5) enriched in pulp described previously in the present description can be used as starting material.
  • step b1) is advantageously carried out with a quantity of hot water which is fixed in a dry weight / water weight ratio ranging from 3% to 5%, and better by about 4%.
  • step b) above is the subject of example 8.
  • colorimetric analysis by the Folin-Ciaucalteu technique, and using catechin as the standard compound it was determined that the final powder comprises % by weight of polyphenols, relative to the total weight of said powder.
  • catechin as the standard compound
  • an apple seed oil or an extract enriched in polyphenols can be prepared from a fraction (iii) enriched in whole seeds obtained in step a) of the process .
  • step b) of the process it is possible to use, for example, a fraction (iii) enriched with whole seeds such as the fraction (F3), the fraction (F5) or the fraction (F6) which are described previously in the present description.
  • a fraction (iii) enriched with whole seeds such as the fraction (F3), the fraction (F5) or the fraction (F6) which are described previously in the present description.
  • the fraction (F7) enriched in whole seeds is used.
  • this step b) comprises the following steps: b1) obtaining a fine powder from the fraction enriched with whole seeds, preferably by grinding and sieving; b2) suspending the powder in an extraction solvent, preferably hexane. b3) the suspension is filtered through a sieve having a mesh size ranging from 50 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably about 75 ⁇ m, and (i) the filtrate, which is a filtered extract, and (ii) the retentate, which is a residue, are recovered. extraction solid.
  • the filtered extract obtained at the end of step b3) is centrifuged to remove the insoluble particles, in order to obtain a clarified liquid fraction; b5) the clarified liquid fraction is distilled to remove hexane and obtain a liquid fraction of seed oil.
  • the solid extraction residue obtained at the end of step b3), which is a deoiled dry powder is subjected to an extraction step with ethanol to obtain a liquid extraction fraction; b7) the liquid extraction fraction obtained at the end of step b6) is filtered and the filtrate is recovered.
  • the filtrate is clarified, for example by centrifugation and then distilled to remove the ethanol, to obtain an aqueous extract fraction comprising a small proportion of dry matter.
  • step b9) the aqueous extract fraction obtained at the end of step b8) is contacted with a polyphenol-adsorbing resin carrier; b10) the polyphenols retained on the resin support are eluted, preferably with an ethanol solution. b11) the eluate is concentrated. b12) where appropriate, the eluate is then dried, for example by lyophilization.
  • the sieving is carried out with a sieve having a mesh size of less than 500 ⁇ m.
  • a screen having a mesh size of about 100 ⁇ m is used.
  • step b2) when hexane is used, hexane is used in a powder / hexane weight ratio of 5% to 15%, preferably about 10%.
  • the suspension is preferably stirred for a period of between 30 minutes and 2 hours, preferably about 1 hour.
  • the filter retentate is again incubated with hexane to continue the extraction.
  • the method may comprise a number of step cycles b2) then b3) ranging from 2 to 5, preferably 3.
  • step b6) use is advantageously made of a weight ratio of solid residue / ethanol ranging from 5% to 15%, preferably about 10%.
  • step b8) the dry matter contained in the aqueous extract fraction does not exceed 10% by weight, and most often does not exceed 4% by weight, relative to the total weight of said fraction. of aqueous extract.
  • step b10) it is advantageous to use a solution of ethanol containing 70% by weight of ethanol, relative to the total weight of the elution solution.
  • step b) above is the subject of example 9.
  • colorimetric analysis by Folin-Ciaucalteu technique and using catechin as a standard compound, it was determined that the final powder comprises 43% by weight of polyphenols, relative to the total weight of said powder.
  • catechin as a standard compound
  • the final powder comprises 35% by weight of phloridzin, relative to the total weight of said powder, ie 81% by weight of phloridzin, relative to the total weight of polyphenols contained in said powder.
  • an enriched polyphenol extract can be prepared from a seed shell enriched fraction (iii-2) obtained in step a) of the process.
  • step b) of the process it is possible to use, for example, a fraction (iii-2) enriched with whole seeds such as the fraction (F9) which is described previously in the present description.
  • step b) of the process is essentially identical to the embodiments of step b) making it possible to obtain an extract enriched in polyphenols from a fraction (i) enriched with hides or skins. a pulp-enriched fraction (ii) which has previously been described.
  • An illustration of step b) above is the subject of example 10.
  • step b) of the process according to the invention it is possible to prepare a virgin seed oil from a fraction (iii-1) enriched with seed kernels, for example from the fraction (F8). ) previously described in the present description.
  • this step b) comprises the following steps: b1) cold pressing of the fraction enriched with seed kernels, in order to obtain a crude oil; b2) centrifugation of the crude oil to obtain a virgin seed oil.
  • step b) above is the subject of Example 11. It is shown that 1.5 kg of virgin oil is obtained from 10 kg of seed kernels.
  • step b) of the process according to the invention it is possible to prepare vegetable wax compositions from a skin-enriched fraction (i), for example from the fraction (F1) described previously in FIG. this description.
  • step b) comprises the following steps: b1) extraction of the fraction enriched with skins with hot water; b2) from the extraction liquid, separation of the liquid fraction comprising the polyphenols from the solid fraction comprising colloids of proteins and polysaccharides; b3) passage of the liquid fraction on an adsorbent resin support retaining the polyphenols; b4) elution of immobilized polyphenols on the adsorbent resin support; b5) concentration of the eluate to obtain a concentrated liquid fraction enriched in polyphenols; b6) optionally, drying the concentrated fraction obtained at the end of step b5).
  • step b1) the hot water is advantageously at a temperature ranging from 30 ° C. to 70 ° C., more preferably from 40 ° C. to 60 ° C., preferably at about 50 ° C.
  • step b1) it is possible to carry out several successive extraction steps with hot water, and then the liquid extraction fractions are combined for the rest of the process.
  • step b1) the amount of hot water used is set in a weight ratio dry fraction / water ranging from 6% to 10%, and more preferably about 8%.
  • step b1) as many extraction steps with water as necessary to recover almost all the polyphenols contained in the fraction enriched pulp used as starting material.
  • a number of extraction steps with water ranging from 3 to 10, optionally 6, are carried out.
  • step b2) the extraction liquid is filtered and then clarified before carrying out step b3).
  • the clarification is advantageously carried out by centrifugation of the filtrate.
  • the centrifugation supernatant can be subjected to a step of removing the colloids present in this clarified liquid fraction, for example by ultrafiltration, advantageously by ultrafiltration with a filter membrane having a cutoff threshold of 50 KDa.
  • the colloids are retained by the filter membrane and constitute the ultrafiltration retentate.
  • the ultrafiltration permeate is a clarified liquid fraction comprising polyphenols.
  • the clarified liquid fraction is brought into contact with the adsorbent resin support, in step b3) of the process.
  • adsorbent resin of the XAD type sold by the company Rhom and Haas (France) may be used.
  • step b4) the polyphenols are eluted with an ethanol solution, for example a 60% (w / w) ethanol solution.
  • step b5) the concentration of the eluate can be carried out by distillation in order to obtain a concentrated liquid fraction enriched in polyphenols.
  • step b6) the concentrated liquid fraction obtained at the end of step b5) can be spray-dried.
  • step b) above is the subject of Example 12, where 48 grams of polyphenol-enriched powder are obtained from 5 kg of apple skins.
  • the skin residues resulting from the aqueous extraction in step b1) can be treated according to a process comprising the following steps: b10) resuspension of the residues skins obtained at the end of step b1) in order to obtain a heterogeneous liquid / solid aqueous mixture; b11) incubating the liquid / solid heterogeneous aqueous mixture obtained at the end of step b10) with one or more enzymes digesting the plant cell walls, and recovering the residual solid fraction. b12) performing one or more washes of the residual solid fraction obtained at the end of step b11); b13) drying of the residual solid fraction obtained at the end of step b12). b14) grinding the dry solid fraction obtained at the end of step b13) to obtain a powder. ;
  • step b10) the resuspension is advantageously carried out in hot water, preferably at a temperature ranging from 30 ° C. to 60 ° C., better still ranging from 40 ° C. to 50 ° C., preferably about 45 ° C. ° C.
  • step b11) is advantageously used one or more cellulases or pectinases, such as cellulases and / or pectinases marketed by NOVOZYMES (Denmark), LYVEN (France) or SPINDAL (France).
  • NOVOZYMES Denmark
  • LYVEN France
  • SPINDAL SPINDAL
  • the liquid / solid heterogeneous aqueous mixture is incubated with the enzyme or the enzymes, in step b11), during a duration ranging from 1 hour to 10 hours, better from 3 hours to 6 hours, preferably about 4 hours.
  • step b11 the residual solid fraction is recovered by filtration and recovery of the retentate filtration.
  • the filtration retentate consists essentially of the cuticular structures of the apple, since the structures of the cell walls have been digested by the enzyme (s).
  • Step b12 which may comprise from 1 to 5 successive washes, preferably with water, aims at removing all the solubilized elements as well as the lignocellulosic fine particles which are undesirable.
  • the residual solid fraction may be dried in a ventilated oven, for example at a temperature ranging from 30 ° C. to 50 ° C., preferably about 40 ° C.
  • step b14 when step b) is carried out from a fraction enriched with apple skins, a light powder of gray to off-white color is obtained.
  • Step b14) can be followed by the following steps: b15) resuspension of the powder obtained at the end of step b14) in a vegetable oil, in order to give a liquid of creamy consistency.
  • the liquid of creamy consistency obtained at the end of step b15) can be used for the preparation of cosmetic compositions, especially as a source of vegetable waxes or of vegetable substances of interest present in waxes, such as ursolic acid .
  • step b) of the process according to the invention it is possible to prepare other compositions of vegetable waxes from a skin-enriched fraction (i), for example from the fraction (F1) described above. in the present description.
  • step b) comprises the following steps: b1) dissolving and mixing the fraction enriched with skins in hot water; b2) filtration of the solid / liquid heterogeneous liquid obtained at the end of step b1) and recovery (i) of the filtration retentate and (ii) filtration permeate.
  • step b1) the fraction enriched in skins is advantageously dissolved in hot water at a temperature ranging from 30 ° C. to 70 ° C., better still from 40 ° C. to 60 ° C., preferably at about 50 ° C. vs.
  • the weight ratio solid fraction / water is advantageously from 5% to 15%, preferably about 5%.
  • step b1) the liquid / solid heterogeneous mixture is slowly kneaded continuously for a period of from 2 hours to 20 hours, more preferably from 5 hours to 15 hours, preferably for about 10 hours.
  • step b1) resuspension and kneading cause the dispersion of the pulp layers consisting of parenchymal cells located under the cuticle and solubilize the polyphenols contained in the skins.
  • the filtration retentate obtained at the end of step b2) can then be treated according to the following steps: b10) resuspension of the filtration retentate obtained at the end of step b2); b11) filtration of the liquid obtained at the end of step b10) and recovery of the filtrate; b12) clarifying the filtrate, for example by centrifugation to obtain a clarified liquid fraction; b13) ultrafiltration of the clarified liquid fraction and recovery of the ultrafiltration permeate; b14) passage of the ultrafiltration permeate on a resin adsorbing polyphenols; b15) elution of polyphenols and recovery of an extract enriched in polyphenols.
  • step b10) the filtration retentate is advantageously resuspended in water.
  • steps b10) and b11) can be repeated several times, advantageously from 2 to 5 times. Then the permeates from each repetition cycle of steps b10) and b11) are combined at the end of step b11) and constitute the filtrate which is recovered.
  • the ultrafiltration step b13) is carried out with a filter membrane having a cutoff threshold of 10 KDa.
  • the polyphenol-enriched extract obtained at the end of step b15) can then be concentrated and optionally dried in powder form, according to any of the concentration and drying techniques of polyphenol extracts previously described herein. description.
  • the filtration retentate obtained at the end of step b2) which consists of cuticles of the skins, can then be treated according to the following steps: b20) resuspension of the skin residues obtained at the end of step b2 ) to obtain a heterogeneous liquid / solid aqueous mixture; b21) incubating the liquid / solid heterogeneous aqueous mixture obtained at the end of step b20) with one or more enzymes digesting the plant cell walls, and recovering the residual solid fraction. b22) performing one or more washes of the residual solid fraction obtained at the end of step b21); b23) drying the residual solid fraction obtained at the end of step b22). b24) grinding the dry solid fraction obtained at the end of step b13) to obtain a powder. ;
  • step b20) the resuspension is advantageously carried out in hot water, preferably at a temperature ranging from 30 ° C. to 60 ° C., better still ranging from 40 ° C. to 50 ° C., preferably about 45 ° C. ° C.
  • step b21) is advantageously used one or more cellulases or pectinases, such as cellulases and / or pectinases marketed by NOVOZYMES (Denmark), LYVEN (France) or SPINDAL (France)
  • the liquid / solid heterogeneous aqueous mixture is incubated with the enzyme (s) in step b21) for a period ranging from 1 hour to 10 hours, preferably from 3 hours to 6 hours, preferably approximately 4 hours. .
  • step b21 the residual solid fraction is recovered by filtration and recovery of the filtration retentate.
  • the filtration retentate consists essentially of the cuticular structures of the apple, since the structures of the cell walls have been digested by the enzyme (s).
  • Step b22 which may comprise from 1 to 5 successive washes, preferably with water, aims at removing all the solubilized elements as well as the lignocellulosic fine particles which are undesirable.
  • the residual solid fraction may be dried in a ventilated oven, for example at a temperature ranging from 30 ° C. to 50 ° C., preferably about 40 ° C.
  • step b24 when step b) is carried out from a fraction enriched with apple skins, a light powder of gray to off-white color is obtained.
  • Step b24) can be followed by the following steps: b25) resuspension of the powder obtained at the end of step b14) in a vegetable oil, in order to give a liquid of creamy consistency.
  • the liquid of creamy consistency obtained at the end of step b25) can be used for the preparation of cosmetic compositions, especially as a source of vegetable waxes or of vegetable substances of interest present in the waxes, such as ursolic acid .
  • the method of the invention can be carried out from any pome fruit.
  • the process of the invention is carried out using pome fruits chosen from apples, quinces, loquels, pears, corms and kiwis.
  • the process of the invention is made from apples, and even more preferably from cider apples.
  • Cider apples are preferentially chosen from the varieties currently exploited in western France, mainly in Normandy and Brittany. Vegetable fractions and extracts
  • the present invention also relates to the different plant fractions that can be obtained by the implementation of the method described above.
  • the subject of the present invention is also a fraction enriched in pome fruit pulp characterized in that it comprises at least 60% by weight of pulp, and preferably at least 80% by weight of pulp, relative to the total weight of said fraction.
  • the invention also relates to a fraction enriched with pome fruit skins, characterized in that it comprises at least 50% by weight of skins, and preferably at least 70% by weight of skins, relative to the total weight of said skins. fraction.
  • the invention also relates to a fraction enriched with pips of pome fruits, characterized in that it comprises at least 50% by weight of pips, and preferably at least 90% by weight of pips, relative to the total weight of said fraction.
  • the subject of the invention is also a fraction enriched in pome fruit seed shells, characterized in that it comprises at least 70% by weight of shells, and preferably at least 90% by weight of shells, with respect to total weight of said fraction.
  • the invention also relates to a fraction enriched with pome fruit seed kernels, characterized in that it comprises at least 80% by weight of almonds, and preferably at least 90% by weight of almonds, by ratio to the total weight of said fraction.
  • the subject of the present invention is also plant extracts which may be obtained from one or more of the fractions prepared by means of the process of the invention described previously in the present description.
  • the invention also relates to an extract obtained from the fraction enriched in pulp as defined above, characterized in that it comprises at least 10% by weight of total polyphenols, and preferably at least 40% by weight of total polyphenols, based on the total weight of said extract.
  • the invention also relates to an extract obtained from the fraction enriched in pulp of the above type, characterized in that it comprises:
  • catechins and catechin polymers from 5% to 10% by weight of catechins and catechin polymers (procyanidols)
  • the subject of the invention is also an extract obtained from the fraction enriched in hides as defined above, characterized in that it comprises at least 10% by weight of total polyphenols, and preferably at least 40% by weight. weight of total polyphenols, based on the total weight of said extract.
  • the invention also relates to an extract obtained from the fraction enriched in skins of the above type, characterized in that it comprises:
  • quercetin 5 to 20% by weight of flavonols (quercetin), more preferably 15 to 20% of quercetin
  • the invention also relates to an extract obtained from the fraction enriched in skins of the above type, characterized in that it comprises:
  • ursolic acid at least 5% by weight of ursolic acid, preferably at least 20% of ursolic acid, relative to the total weight of said extract.
  • the invention also relates to an extract obtained from the fraction enriched in skins of the above type, characterized in that it comprises: at least 60% by weight, and preferably at least 80% by weight, of wax fraction;
  • ursolic acid at least 50% by weight of ursolic acid, relative to the total weight of said extract.
  • the invention also relates to an extract obtained from the fraction enriched in seed shells as defined above, characterized in that it comprises at least 10% by weight of total polyphenols, preferably at least 40% by weight of total polyphenols, based on the total weight of said extract.
  • the invention also relates to an extract obtained from the fraction enriched in seed shells as defined above, characterized in that it comprises at least 15% by weight, preferably at least 35% by weight, phloridzin, based on the total weight of said extract.
  • the invention also relates to an extract obtained from the enriched fraction of pome fruit seed kernels as defined above, characterized in that it comprises at least 5% by weight, preferably at least 20% by weight. % by weight of virgin oil essentially comprising unsaturated fatty acids, relative to the total weight of said extract.
  • an extract is preferentially characterized in that the unsaturated fatty acids are essentially linoleic acid and oleic acid
  • said extracts are in the form of a powder.
  • the subject of the invention is also a food, nutraceutical or dietary composition, characterized in that it comprises an extract as defined in the present description.
  • composition a composition constituting a food composition or a dietary supplement that does not have the characteristics of a drug.
  • a food, nutraceutical or dietetic composition according to the invention is preferably suitable for oral administration.
  • a food, nutraceutical or dietetic composition according to the invention is a dietary food used for the maintenance of a good health of the man or the animal that ingests it.
  • a nutritional composition is also commonly referred to as "functional food", which is intended to be consumed, either as an integral part of the diet or as a dietary supplement, but whose extract content according to the invention implies a physiological role ranging from beyond the provision of basic nutrient requirements.
  • a dietary, nutraceutical or dietetic composition according to the invention is characterized in that it comprises an extract according to the invention, as an active compound, and is in a wide variety of forms of food compositions and beverages, including including juices (fruit or vegetables), oils, butters, margarines, vegetable fats, preserves (eg tuna in oil), soups, milk-based preparations (yogurts, cottage cheese), ices, cheeses ( eg cheeses preserved in oil), cooked products (such as bread, biscuits and cakes), desserts, confectionery products, cereal bars, breakfast cereals, condiments, seasoning products foods (including spices and sauces).
  • a food, nutraceutical or dietetic composition according to the invention is in any of the forms described in the present description, and in particular the foods based on fat (butter, oil, margarine), bread, cakes, or food products preserved in oil, such as cheeses, fish, meats, vegetables, salads) or in the form of a product for seasoning foods, such as condiments.
  • the invention also relates to a cosmetic composition characterized in that it comprises an extract as defined in the present description.
  • Such cosmetic compositions can be prepared, for example, as described in French patent applications FR 2 822 466 and FR 2 799 121.
  • the invention also relates to substrates for obtaining natural and water-soluble yellow dyes, characterized in that it comprises an extract as defined in the present description.
  • an extract comprising phloridzine which is an ideal substrate for obtaining natural and highly water-soluble yellow pigments, is used, as described in particular in the PCT application filed under No. PCT / FR. 04/02927.
  • the process of the invention differs from previous processes, especially since dried pomace is used and not the juice of pressed fruit, for example the juice of pressed apples and that the whole marc is not previously exhausted with water before carrying out the extraction of the vegetable substances of interest on the diffusion residue.
  • dried pomace is used and not the juice of pressed fruit, for example the juice of pressed apples and that the whole marc is not previously exhausted with water before carrying out the extraction of the vegetable substances of interest on the diffusion residue.
  • the process of the invention in particular from apples, there is the advantage of a high availability of raw material (apple pomace cider varieties rich in polyphenols).
  • the mastery of the technology for separating the various dried tissues of the fruit and in particular the seeds makes it possible to have substrates naturally rich in certain compounds, for example dihydrochalcones (phloridzine).
  • the process according to the invention is rendered even more efficient by the fact that, in some of its embodiments, the seeds are peeled and the shells are separated from the almonds. Thanks to this characteristic, it avoids the presence of undesirable compounds in the extraction medium such as: apple sugars, organic acids, lipids, amygdalin ... Thanks to the step a) separation of the apple seeds with a rate With a purity of up to 95%, it is possible to obtain polyphenolic extracts of pips highly enriched in dihydrochalcones. The phloridzin level can reach 70 to 90% of the total polyphenols.
  • the process according to the present invention also makes it possible to obtain polyphenol extracts containing different polyphenols in a balanced manner from the pulp, highly enriched quercetin extracts by the use of the enriched skin fraction.
  • This fraction enriched with skins also makes it possible to obtain apple waxes or extracts highly concentrated in ursolic acid without going through a prior stage of enzymatic depectinisation.
  • Cosmeceutical concerns foods and ingredients whose oral consumption contributes to improving the external appearance: beauty of the skin, hair or nails, preparation for tanning, anti-cellulite. Most often, the products are consumed in the form of capsules, capsules, tablets, ampoules.
  • the present invention also relates to a cosmeceutical composition characterized in that it comprises an extract as defined in the present description.
  • a cosmeceutical composition according to the invention has an ingredient constitution, even identical to a food, nutraceutical or dietetic composition which has been described above.
  • the present invention also relates to various apple extracts enriched in certain polyphenols, which are obtainable by the implementation of the process for obtaining a plant extract of pome fruits which is described above in the description, and more particularly by implementing certain particular embodiments of this method.
  • the apple extracts according to the invention are derived from 100% of the apple, the polyphenols and / or waxes and / or ursolic acid representing only about half of the dry matter, the other constituents of the fruit, even if they are present in small quantities, participate in their beneficial action for the body.
  • constituents include oligosaccharides, peptides, amino acids, malic acid, other terpenoids, minerals, trace elements and lipid constituents.
  • an apple extract rich in dihydrochalcones shows a direct action on lipogenesis.
  • An important originality of the present invention is that, for example concerning the anti-lipogenic and anti-osteoporosis properties, it is possible, thanks to the general process for obtaining a plant extract described above, to have two types of extracts to play or not on the synergy quercetin / phloridzin ,.
  • the present invention effectively confirms that these extracts exhibit an anti-oxidative, anti-aging and also act favorably on tissue remodeling.
  • the apple extracts according to the invention rich in quercetin and / or phloridzin are capable of significantly inhibiting the differentiation of preadipocytes and adipocytes and the accumulation of intracellular lipids.
  • said apple extracts act favorably on the expression of genetic markers of lipogenesis and osteogenesis.
  • Preadipocytes are not yet differentiated cells that under certain conditions are capable of differentiating into bone cells (osteoblasts) and not into adipocytes. It has been shown according to the invention that the same effects of differentiation of the preadipocytes into osteoblasts under the influence of apple extracts obtained by the process for obtaining a plant extract described in the present description. This favorable action property of apple extracts on osteogenesis has never been shown in the prior art.
  • apple extracts obtained by the process for obtaining a plant extract according to the invention are capable of reinforcing the endogenous Redox system in the body and therefore exhibit a strong anti-oxidative anti-stress activity. age, anti aging. This activity is observed up to the level of genetic markers.
  • Cell culture tests confirm that polyphenols have antioxidant properties. These activities play a significant role in the preventive effects of foods rich in polyphenols.
  • polyphenols can be taken for xenobiotics by animal cells and treated as such. As a result, the presence of polyphenols can modulate the expression of many genes including those involved in antioxidant defense.
  • senescent elderly fibroblasts treated with apple extracts show favorable over-expressions or favorable repressions of the marker genes of many enzymatic and non-enzymatic molecules involved in cellular antioxidant defense.
  • the present invention demonstrates that said apple extracts are capable of regulating the expression of a number of genes of molecules involved in the cellular process and tissue remodeling such as growth factors, receptors, cytokines or chemokines.
  • an object of the present invention is their use in cosmetic, dietary, nutraceutical and food compositions for the control of weight, obesity, oxidative stress, tissue aging, skin and bone remodeling.
  • apple extracts are particularly indicated in cosmetic compositions, nutraceuticals, food supplements for the well being, beauty and health thanks to their anti-aging, anti-aging, slimming, anti-wrinkle anticellulite, anti-osteoporosis effects.
  • the subject of the invention is also cosmetic processes comprising a step of applying to the skin an apple extract, or a composition containing such an extract, as defined in the present description, for one or more of the applications. cosmetics described for said extract or for said composition.
  • the subject of the present invention is an apple extract comprising from 20% to 60% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract, and comprising:
  • flavan-3-ol (catechin and procyanidols);
  • the contents of each of the polyphenols of dihydrochalcone, flavonol, flavanol and hydroxycinnamic acid types are determined by the conventional technique of high pressure liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • the HFV apple extract according to the invention is characterized in particular by its high content of flavonols (quercetin) and the important contents of dihydrochalcones (phloridzin) as well as flavanols (catechins and procyanidols).
  • the apple extract according to the invention comprises at least 20%, and better still at least 25% by weight of dihydrochalcones (phloridzine), relative to the total weight of the polyphenols contained in said extract.
  • dihydrochalcones prhloridzine
  • the HFV apple extract according to the invention comprises at least 30%, better still at least 35% and even more preferably at least 40% by weight of flavonols (quercetin), relative to the total weight of the polyphenols contained in said extract.
  • flavonols quercetin
  • the qualitative and quantitative polyphenol composition of the above extract makes it particularly suitable for use in many applications in the food, cosmetic and pharmaceutical fields, including in the following applications:
  • the HFV apple extract according to the invention is practically non-irritating to ocular tissue, as measured according to the HET-CAM ("Hen's Egg Test - Chorio-Allantoic Membrane") test well known to the human of the art, with respect to a reference product such as lauryl-sulfo-betaine. Also, the HFV apple extract according to the invention is devoid of skin irritation properties, as measured in a viability test of human skin cells in culture.
  • the HFV apple extract according to the invention induces no skin irritation in humans, even after application of a duration of 24 hours on the skin.
  • the HFV apple extract according to the invention has been shown to possess properties against oxidative stress in the body, cellular aging and inflammatory reactions. It has also been shown that the apple extract according to the invention has inhibitory effects on lipogenesis and on the absorption of sugars by the body. It has also been shown that the apple extract according to the invention has an effect of inducing osteogenesis.
  • the HFV apple extract according to the invention induces over-expression of genes encoding proteins involved in the defense of cells against oxidative stress, such as the genes encoding superoxide dismutase 2 (SOD2), glutaredoxins (GRX) and metalothioneins (MTS).
  • SOD2 superoxide dismutase 2
  • GRX glutaredoxins
  • MTS metalothioneins
  • the apple extract according to the invention induces the repression of genes encoding prooxidant proteins such as the genes encoding Heme oxygenase 1 (HMOX1), Iipoxigenase-15B (ALOX15B), the synthase 1 of the nitric oxide (NOS1) or the heat-shock protein B ("Heat-shock protein B").
  • HMOX1 Heme oxygenase 1
  • ALOX15B Iipoxigenase-15B
  • NOS1 synthase 1 of the nitric oxide
  • the HFV apple extract according to the invention causes the rapid induction of the expression of genes encoding proteins, including cytokines, involved in the defense mechanisms against an inflammatory reaction, involved in the reactions. immune system, or involved in tissue remodeling, especially in bone remodeling.
  • the above apple extract induces overexpression of genes encoding proteins involved in the inflammatory reaction and / or in the immune response, such as the genes encoding IL-6, monocyte chemotactic protein 1 (MCP1 ), the “Tumor Necrosis-Related Apoptosis Inducing Ligand (TNFSF10 or TRAIL).
  • the above apple extract induces a repression of the expression of genes encoding prostaglandin receptors, including the prostaglandin E receptor (PGE).
  • the above apple extract also induces the expression of genes encoding proteins involved in tissue remodeling, such as the genes encoding collagen Vl a2; collagen III ai or integrin a7b (ITGA7B).
  • the above apple extract induces a repression of the expression of genes encoding proteins that play a role in tissue remodeling, such as the genes encoding collagen XV ⁇ 1, collagen XVIII ⁇ 1 and collagen I ⁇ 1.
  • the HFV apple extract according to the invention induces over-expression of the decorin gene, which plays an important role in the formation of connective tissues, mineralization and cutaneous aging.
  • the above apple extract has also been shown to induce over-expression of the telomerase encoding gene, which plays an important role in the fight against cell senescence.
  • the HFV apple extract according to the invention modulates the expression of certain metalloproteinases involved in tissue remodeling.
  • the above apple extract induces overexpression of metalloproteinase 1 (MMP-1).
  • Said extract induces at first a repression of the expression of the gene coding for metalloproteinase 3 (MMP-3), then, after a period of contact of several hours with the cells, an over-expression of MMP-3.
  • the HFV apple extract according to the invention also inhibits overexpression of the genes encoding thrombospondin-2 (TSP-2), vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) ⁇ 7 B integrin (ITGA7), the Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF), Placenta Growth Factors 1 and 2, or PLGF1 and PLGF2 ), pleitropin ("Osteoblast specifies Growth Factor” or PTN) or Transforming Growth Factor beta (TGF ⁇ ).
  • TSP-2 thrombospondin-2
  • VEGF-C vascular endothelial growth factor-C
  • ITGA7 B integrin IGA7 B integrin
  • MIF Macrophage Migration Inhibitory Factor
  • Placenta Growth Factors 1 and 2 or PLGF1 and PLGF2
  • pleitropin pleitropin
  • Ostoblast specifies Growth Factor” or PTN
  • TGF ⁇ Transforming Growth Factor beta
  • the above apple extract also induces a repression of the expression of the genes encoding proteins such as the apoptosis regulator ("Apoptosis Regulator” or BAX), the “Procollagen-C Proteinase” Enhancer “(PCPEP), Prostaglandin E receptor 1 (" Prostaglandin E Receptor 1 "or PTGER1),” Apoptosis Inhibitor Survivin “(BIRC5), Caveolin 1 (" Caveolin 1 "or CAV1) or Lamine A (LMNA).
  • ALP alkaline phosphatase
  • HFV apple extract induces the differentiation of human mesenchymal poietic stem cells (hMSC) into mature adipocytes in a suitable culture medium.
  • hMSC human mesenchymal poietic stem cells
  • the HFV apple extract according to the invention induces the differentiation of human mesenchymal po ⁇ etic stem cells (hMSC) into osteoblasts, in a suitable culture medium.
  • hMSC human mesenchymal po ⁇ etic stem cells
  • HFV apple extract according to the invention inhibits the intracellular accumulation of lipids and causes repression of the PPARG gene.
  • HFV apple extract according to the invention induces a general increase in cellular metabolism, as illustrated by the increase in protein synthesis and the induction of overexpression of the G3PDH gene.
  • apple extract HFV can be used, either as such, or as a component of a composition, as a biologically active substance for the food field, including nutraceutical, cosmetic, including dermo-cosmetic, and pharmaceutical.
  • the HFV apple extract according to the invention is particularly suitable for use as an active substance for (i) the prevention or treatment of oxidative stress, (ii) the prevention or treatment of cellular aging, in particular skin aging, (iii) regulation of carbohydrate metabolism, (iv) regulation of lipid metabolism, (v) prevention or treatment of inflammatory reactions, and (vi) stimulation of certain cell responses. of the immune system.
  • the HFV apple extract according to the invention comprises from 8% to 15%, better still from 10% to 15% by weight of dihydrochalcones (phloridzine), based on the total weight of dry matter of said extract.
  • the HFV apple extract according to the invention comprises from 10% to 20%, better still from 15% to 20% by weight of flavonols (quercetin), relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • said apple extract comprises from 15% to 18% by weight of flavonols (quercetin), and more preferably from 16% to 18% by weight of flavonols (quercetin), based on the total weight of dry matter of said extract.
  • the HFV apple extract according to the invention comprises from 3% to 15%, better still from 4% to 7%, by weight of flavan-3-ols (catechin and procyanidols), relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • said apple extract comprises from 5% to 7% by weight of flavan-3-ols (catechin and procyanidols), and more preferably from 5% to 6.8% by weight of flavan-3.
  • -ols catechin and procyanidols
  • the HFV apple extract according to the invention comprises from 2% to 8% by weight of hydroxycinnamic acids, relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • it comprises from 3% to 8% by weight of hydroxycinnamic acids, and more preferably from 3% to 7.5% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of dry matter said extract.
  • the HFV apple extract according to the invention comprises from 30% to 50% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the HFV apple extract according to the invention comprises from 35% to 45% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract. In certain embodiments of said apple extract, it comprises from 38% to 42% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract. In certain preferred embodiments of said apple extract, it comprises from 39% to 41% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the present invention encompasses an HFV apple extract comprising (i) from 10% to 11% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) from 15.5% to 16.5% by weight of flavonols (quercetin) ); (iii) from 5% to 6% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and (iv) from 3% to 3.5% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of dry matter of said extract.
  • dihydrochalcones prhloridzin
  • flavonols quercetin
  • flavan-3-ol catechin and procyanidols
  • hydroxycinnamic acids based on the total weight of dry matter of said extract.
  • the present invention encompasses an HFV apple extract comprising (i) from 13% to 14% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) from 16.5% to 17.5% by weight of flavonols (quercetin) ); from 5.5% to 6.5% by weight of flavan-3-ols (catechin and procyanidols); and from 7% to 8% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of dry matter of said extract.
  • dihydrochalcones prhloridzin
  • flavonols quercetin
  • flavan-3-ols catechin and procyanidols
  • hydroxycinnamic acids based on the total weight of dry matter of said extract.
  • an HFV apple extract according to the invention it comprises (i) 10.9% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) 16% by weight of flavonols (quercetin); 5.5% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and 3.2% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of dry matter of said extract.
  • Such an apple extract comprises (i) 27.3% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) 40% by weight of flavonols (quercetin); 13.8% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and 8% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of polyphenols contained in said extract.
  • an HFV apple extract in another particular embodiment, it comprises (i) 13.2% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) 17% by weight of flavonols (quercetin); 6% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and 7.5% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of dry matter of said extract.
  • Such an apple extract comprises (i) 33% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) 42.4% by weight of flavonols (quercetin); 15% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and 18.6% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of polyphenols contained in said extract.
  • the polyphenol content of the apple extract HFV according to the invention, as well as a qualitative and quantitative composition of said extract in dihydrochalcones, flavonols, flavanols and hydroxycinnamic acids is preferably obtained by implementing the method of obtaining a plant extract of pome fruits whose characteristics are described in the present description.
  • the HFV apple extract as defined above is prepared according to a process comprising the following steps: a) separating, from the starting apples, or from a starting marc obtained from said apples, in the dry state, respectively the following fractions:
  • step b) preparing, from the fraction (i) enriched in skin obtained in step a), an apple extract enriched in polyphenols according to the invention.
  • the HFV apple extract according to the invention is prepared from the fraction (F1) consisting essentially of skin, the production process of which has been described previously in the present description.
  • the HFV apple extract according to the invention is obtained by using cider apples as starting material.
  • cider apples of a variety chosen from the following varieties are used: Bitter New, Armagnac (sour), Sweet Corier, Marseigna, Normandy White, Apple of the Orchard, Blanquette, DeIIo, Doudazin, Germaine, Mother LiIi , White Normandy; Pass Queen, Peaud'Ane, Apple orchard, Pear, President or even Red Roguet., Judor, Little Yellow, Red Binet, Juliana, Clozette, Avrolles, Dous Moen, Antoinette, Bedan, Dabinett, Sweet Lined Coat, Yellow Knight, Jeanne Renard, Kermerrien.
  • the subject of the present invention is also a food, dietary or cosmetic composition comprising an HFV apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a cosmetic composition against aging of the skin comprising an HFV apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a cosmetic composition for protecting the skin against solar radiation, comprising an HFV apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a slimming or anti-cellulite food or cosmetic composition, comprising an HFV apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to an anti-wrinkle cosmetic composition, comprising an HFV apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an HFV apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to an HFV apple extract as defined above for its use as a medicament.
  • the invention also relates to the use of an apple extract HFV as defined above, for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of osteoporosis.
  • the invention also relates to the use of an HFV apple extract as defined above, for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of inflammatory conditions.
  • the invention also relates to the use of an HFV apple extract as defined above, for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of excess weight.
  • HDH Dihydrochaicone rich apple extracts
  • the subject of the present invention is an apple extract comprising from 20% to 60% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract, and comprising:
  • flavan-3-ol catechin and procyanidols
  • the contents of each of the polyphenols of the dihydrochaicone, flavonol, flavanol and hydroxycinnamic acid types are determined by the conventional high pressure liquid chromatography (HPLC) technique.
  • the HDH apple extract according to the invention is characterized by its high content of dihydrochaicones (phloridzine).
  • the HDH apple extract according to the invention comprises at least 70% by weight of dihydrochaicones (phloridzine), relative to the total weight of the polyphenols contained in said extract.
  • the HDH apple extract according to the invention comprises at least 75% by weight, and better still at least 80% by weight of dihydrochaicones (phloridzine), relative to the total weight of the polyphenols contained in said extract.
  • dihydrochaicones prhloridzine
  • the qualitative and quantitative polyphenol composition of the above extract makes it particularly suitable for use in many applications in the food, cosmetic and pharmaceutical fields, including in the following applications:
  • HDH apple extract according to the invention can be used safely in humans and animals.
  • the HDH apple extract according to the invention is practically non-irritating to the ocular tissue, as measured according to the HET-CAM ("Hen's Egg Test - Chorio-Allantoic Membrane") test well known to humans. of the art, with respect to a reference product such as lauryl-sulfo-betaine.
  • the HDH apple extract according to the invention is devoid of skin irritation properties, as measured in a viability test of human skin cells in culture.
  • the HDH apple extract according to the invention induces no skin irritation in humans, even after application of a duration of 24 hours on the skin.
  • the HDH apple extract according to the invention has been shown to possess properties against oxidative stress in the body, cellular aging and inflammatory reactions. It has also been shown that the apple extract according to the invention has inhibitory effects on lipogenesis and on the absorption of sugars by the body. It has also been shown that the apple extract according to the invention has an effect of inducing osteogenesis.
  • the above apple extract also induces an over-expression of genes encoding alkaline phosphatase (ALP). It has also been shown that the HDH apple extract according to the invention induces the differentiation of human mesenchymal po ⁇ etic stem cells (hMSC) into mature adipocytes in a suitable culture medium.
  • ALP alkaline phosphatase
  • the HDH apple extract according to the invention induces the differentiation of human mesenchymal po ⁇ etic stem cells (hMSC) into osteoblasts, in a suitable culture medium.
  • hMSC human mesenchymal po ⁇ etic stem cells
  • HDH apple extract according to the invention inhibits the intracellular accumulation of lipids and causes repression of the PPARG gene.
  • HDH apple extract according to the invention induces a general increase in cell metabolism as illustrated by the increase in protein synthesis and the induction of overexpression of the G3PDH gene.
  • apple extract HDH can be used, either as such, or as a component of a composition, as a biologically active substance for the food field, including nutraceutical, cosmetic, including dermo-cosmetic, and pharmaceutical.
  • the HDH apple extract according to the invention is particularly suitable for use as an active substance intended for (i) the prevention or treatment of oxidative stress, (ii) the prevention or treatment of cell aging, in particular skin aging, (iii) regulation of carbohydrate metabolism, (iv) regulation of lipid metabolism, (v) prevention or treatment of inflammatory reactions, and (vi) stimulation of certain cell responses. of the immune system.
  • the HDH apple extract according to the invention comprises from 25% to 40%, better still from 27% to 35% by weight of dihydrochalcones (phloridzine), relative to the total weight of dry matter of said extract. In certain embodiments of said extract, it comprises from 28% to 35% by weight of dihydrochalcones (phloridzine), relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the HDH apple extract according to the invention comprises from 0.2% to 5%, better still from 0.5% to 5% by weight of flavonols (quercetin), relative to the total weight of dry matter of said extract. In certain embodiments of said extract, this comprises from 0.7% to 1.6%, and better still from 0.8% to 1.5% by weight of flavonols (quercetin), relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the HDH apple extract according to the invention comprises from 0.2% to 5%, better still from 0.5% to 5% by weight of flavan-3-ols (catechin and procyanidols), relative to the total weight dry matter of said extract.
  • said extract comprises from 0.9% to 2.5% and better still from 1% to 2.1% by weight of flavan-3 ols (catechin and procyanidols), based on the weight total dry matter of said extract.
  • the HDH apple extract according to the invention comprises from 0.2% to 5%, better still from 0.5% to 5% by weight of hydroxycinnamic acids, relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • said extract comprises from 0.5% to 2%, and more preferably from 0.7% to 1% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of dry matter of said extract.
  • the HDH apple extract according to the invention comprises from 30% to 50% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the HDH apple extract according to the invention comprises from 30% to 45% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • this comprises from 33% to 43%, and more preferably from 35% to 42% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the present invention encompasses an HDH apple extract comprising (i) from 27% to 29% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) from 0.5% to 1% by weight of flavonols (quercetin); from 0.5% to 1.5% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and from 0.5% to 1% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of dry matter of said extract.
  • dihydrochalcones phloridzin
  • flavonols quercetin
  • flavan-3-ol catechin and procyanidols
  • hydroxycinnamic acids based on the total weight of dry matter of said extract.
  • the present invention encompasses an HDH apple extract comprising (i) from 32% to 37% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) from 1% to 2% by weight of flavonols (quercetin); from 1.5% to 2.5% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and from 0.5% to 1.5% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of dry matter of said extract.
  • dihydrochalcones phloridzin
  • flavonols quercetin
  • flavan-3-ol catechin and procyanidols
  • hydroxycinnamic acids based on the total weight of dry matter of said extract.
  • an HDH apple extract in a particular embodiment of an HDH apple extract according to the invention it comprises (i) 28.1% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) 0.8% by weight of flavonols (quercetin) ; 1% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and 0.7% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of dry matter of said extract.
  • dihydrochalcones prhloridzin
  • flavonols quercetin
  • flavan-3-ol catechin and procyanidols
  • hydroxycinnamic acids based on the total weight of dry matter of said extract.
  • Such an apple extract comprises (i) 80.3% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) 2.3% by weight of flavonols (quercetin); 2.9% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and 2% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of polyphenols contained in said extract.
  • an HDH apple extract in another particular embodiment, it comprises (i) 35% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) 1.5% by weight of flavonols (quercetin); 2.1% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and 1% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of dry matter of said extract.
  • Such an apple extract comprises (i) 83.3% by weight of dihydrochalcones (phloridzin), (ii) 3.6% by weight of flavonols (quercetin); 5% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols); and 2.4% by weight of hydroxycinnamic acids, based on the total weight of polyphenols contained in said extract.
  • the polyphenol content of the HFV apple extract according to the invention, as well as the qualitative and quantitative composition of said extract in dihydrochalcones, flavonols, flavanols and hydroxycinnamic acids is preferably obtained by implementing the process for obtaining a plant extract of pome fruits whose characteristics are described in the present description.
  • the HFV apple extract as defined above is prepared according to a process comprising the following steps: (a) separate, from the starting apples, or a starting mark obtained from the said apples, in the dry state, respectively the following fractions:
  • step b) preparing, from the fraction (iii-2) enriched in seed shells obtained in step a), an apple extract enriched in polyphenols according to the invention.
  • the HDH apple extract according to the invention is prepared from the fraction (F9) enriched in seed shells, the production process of which has been described previously in the present description.
  • the HFV apple extract according to the invention is obtained by using cider apples as starting material.
  • cider apples of a variety chosen from the following varieties are used: Bitter New, Armagnac (sour), Sweet Corier, Marseigna, Normandy White, Apple of the Orchard, Blanquette, DeIIo, Doudazin, Germaine, Mother LiIi , White Normandy; Pass Reine, Peaud'Ane, Apple orchard, Pear, President or Roguet Rouge. Judor, Little Yellow, Red Binet, Juliana, Clozette, Avrolles, Dous Moen, Antoinette, Bedan, Dabinett, Sweet Lined Coat, Yellow Knight, Jeanne Renard, Kermerrien.
  • the present invention also relates to a food composition, dietary or cosmetic comprising an apple extract HDH as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a dietary or cosmetic slimming or anti-cellulite composition, comprising an apple extract HDH as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an apple extract HDH as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to an apple extract HDH as defined above for its use as a medicament.
  • the invention also relates to the use of an apple extract HDH as defined above, for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of osteoporosis.
  • the invention also relates to the use of an apple extract HDH as defined above, for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of excess weight.
  • WAP Apple extracts rich in polyphenols
  • the subject of the present invention is also an apple extract comprising from 20% to 60% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract, and comprising:
  • flavan-3-ol catechin and procyanidols
  • the above apple extract is also referred to as "WAP" (for “Whole Apple Polyphenols”) throughout this specification.
  • the overall contents of polyphenols are determined according to the conventional FoNn Ciocalteu technique.
  • the contents of each of the polyphenols of dihydrochalcone, flavonol, flavanol and hydroxycinnamic acid types are determined by the conventional technique of high pressure liquid chromatography (HPLC).
  • the balanced qualitative and quantitative polyphenol composition of the above extract makes it particularly suitable for use in many applications in the food, cosmetic and pharmaceutical fields, including in the following applications:
  • WAP apple extract according to the invention can be used safely in humans and animals.
  • the WAP apple extract according to the invention is practically non-irritating to the ocular tissue, as measured according to the HET-CAM ("Hen's Egg Test - Chorio-Allantoic Membrane") test well known to humans. of the art, with respect to a reference product such as lauryl-sulfo-betaine.
  • the WAP apple extract according to the invention is devoid of skin irritation properties, as measured in a viability test of human skin cells in culture.
  • the WAP apple extract according to the invention induces no skin irritation in humans, even after application of a duration of 24 hours on the skin.
  • the WAP apple extract according to the invention comprises from 12% to 18% and better still from 14% to 16% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols), relative to the total weight of dry matter. said extract.
  • flavan-3-ol catechin and procyanidols
  • the WAP apple extract according to the invention comprises from 2% to 8% by weight, and better still from 3% to 7% by weight of flavonols (quercetin), relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the WAP apple extract according to the invention comprises from 6% to 9% and better still from 6% to 8% by weight of hydroxycinnamic acids, relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the WAP apple extract according to the invention comprises from 3% to 8% and better still from 4% to 6% by weight of dihydrochalcones (phloridzine), relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the WAP apple extract according to the invention comprises from 30% to 50% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the WAP apple extract according to the invention comprises from 35% to 45% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract. In certain embodiments of said apple extract, it comprises from 38% to 42% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract. In certain preferred embodiments of said apple extract, it comprises from 39% to 41% by weight of polyphenols relative to the total weight of dry matter of said extract.
  • the present invention encompasses a WAP apple extract comprising (i) from 14% to 16% by weight of flavan-3-ols (catechin and procyanidols), (ii) from 4% to 6% by weight of flavonols (Quercetin), (iii) from 6% to 8% by weight of hydroxycinnamic acids and (iv) from 4% to 6% by weight of dihydrochalcones (phloridzine), based on the total weight of dry matter of said extract.
  • a WAP apple extract according to the invention it comprises (i) 15% by weight of flavan-3-ol (catechin and procyanidols), (ii) 5% by weight of flavonols ( quercetin), (iii) 7% by weight of hydroxycinnamic acids and (iv) 5% by weight of dihydrochalcones (phloridzine), based on the total weight of dry matter of said extract.
  • the polyphenol content of the WAP apple extract according to the invention, as well as the qualitative and quantitative composition of said extract in dihydrochalcones, flavonols, flavanols and hydroxycinnamic acids is preferably obtained by implementing the process for obtaining a plant extract of pome fruits whose characteristics are described in the present description.
  • the WAP apple extract as defined above is prepared according to a process comprising the following steps: a) separating, from the starting apples, or from a starting marc obtained from said apples, in the dry state, respectively the following fractions:
  • the WAP apple extract according to the invention is prepared from the fraction (F2) consisting essentially of pulp, the production process of which has been described previously in the present description.
  • the WAP apple extract according to the invention is obtained using apple cider as starting material.
  • cider apples of a variety chosen from the following varieties are used: Bitter New, Armagnac (sour), Sweet Corier, Marseigna, Normandy White, Apple of the Orchard, Blanquette, DeIIo, Doudazin, Germaine, Mother LiIi , White Normandy; Pass Queen, Peaud'Ane, Apple orchard, Pear, President or Red Roguet, Judor, Little Yellow, Red Binet, Juliana, Clozette, Avrolles, Moen Dous, Antoinette, Bedan, Dabinett, Sweet Coet Lined, Yellow Knight, Jeanne Renard, Kermerrien.
  • the present invention also relates to a food composition, dietary or cosmetic comprising a WAP apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a cosmetic composition against aging of the skin comprising a WAP apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a cosmetic composition for protecting the skin against solar radiation, comprising a WAP apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a cosmetic composition for hair treatment, comprising a WAP apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a WAP apple extract as defined above, in combination with one or more physiologically compatible vehicles.
  • the invention also relates to a WAP apple extract as defined above for its use as a medicament.
  • compositions according to the invention can be combined with other known compositions, such as sunscreen, to effectively manage the condition of the skin.
  • the dermatological compositions produced according to the present invention comprise at least one of the apple extracts, obtained according to the invention presented in the French patent application No. 0552642, at a concentration sufficient to obtain the desired effects.
  • extracts rich in polyphenols and / or ursolic acid it will be necessary to provide sufficient amounts to neutralize free radicals and observe an anti-oxidative stress, anti-aging, anti-aging effect.
  • compositions can provide sufficient amounts to obtain beneficial effects in terms of the regulation of lipid and carbohydrate metabolism, thinness, anti-cellulite action and anti-osteoporosis action.
  • the compositions according to the present invention may comprise carriers / vectors, texturizing agents, colorants, flavorings, sanitary and pharmaceutically acceptable preservatives, known to those skilled in the art.
  • compositions according to the present invention are used alone or in combination with other beneficial agents, at concentrations sufficient to obtain the desired effects against, as an indication, the body aging condition, osteoporosis, obesity, excess weight.
  • the desired effects may be the neutralization of free radicals, the restoration or increase of the (potential) antioxidant plasma status, the reduction of oxidative stress, the improvement of tissue remodeling, particularly the dermal remodeling, weight reduction, prevention of osteoporosis and adverse effects of menopause, prevention or reduction of cellulite.
  • the apple extract or extracts are incorporated at physiologically effective levels of between 0.01 and 50%, preferably between 0.1 and 10%, more preferably between 0 and 2 and 5%.
  • Any vector and / or formulation medium, texturizer, colorant, stabilizer, flavor, preservative, in accordance with the use and regulation of the products intended for consumption or topical application can be used in the production of the compositions.
  • the topical compositions according to the present invention may comprise one or more moisturizing agents commonly used to facilitate hydration of the skin and to inhibit or prevent skin loss in water.
  • the topical composition may also comprise exfoliating acidic components usually used by those skilled in the art, for example fruit acids.
  • physiologically effective rate here means the amount of apple active ingredients that can achieve the expected benefits in the management of the dermatological state or the general condition of the body. It is understood by those skilled in the art that this amount of active ingredients may vary depending on the individual and his skin condition. The importance of the doses of active ingredients or the number of daily uses of a given composition will depend on the sensitivity of the persons and the route of administration. Doses and their frequency may also be a function of the age, weight, health status and response of each individual. For oral administration, the incorporation rates of the apple active ingredients will be between 5 mg and 1000 mg, preferably between 25 and 500 mg and more preferably between 50 and 400 mg.
  • the routes of administration of apple actives are those generally recommended by those skilled in the art.
  • the topical and oral routes are used.
  • the forms of presentation of the compositions may be, as an indication but without limitation, tablets, capsules, capsules, ampoules, dispersions, suspensions, aerosol solutions, spray, sponges, applicator cottons, patches, pastes, gels, lotions, syrups, ointments , powders, granules, creams.
  • compositions according to the invention can be prepared by one or other of the methods known to those skilled in the art. These methods include the combination of a carrier / vector with apple actives, as well as other ingredients, additives and processing aids necessary to achieve stable formulas adapted to the intended mode of use.
  • the active ingredients and other ingredients are formulated with the apparatus and in the usual orders of blends, agitation, texturing, emulsification, expansion, packaging, etc. known to those skilled in the art.
  • compositions according to the invention can be produced in particular formulations adapted for protection of the active ingredients, their transport in the body and their gradual release and controlled over time at the level of the target area, as described for example in US Patents 6,630,163; US 5,591,767; US 3,536,809; US 4,008,719; US 5,354,556.
  • the particular forms of formulation may comprise a step of encapsulation, trapping in another macromolecule or a structure of molecular complexes of the cyclodextrin, liposome, lipoprotein globule or gelled micro-bead types.
  • the particular forms of stabilized formulation may also include a covalent bonding step between the active ingredients of the apple extract and another protective or transport molecule such as a fatty acid ester or proteinaceous linkage.
  • the intermediate fraction F3 is passed over a densimetric airflow table to obtain 160 kg of a fraction F4 of pulp and skins and 40 kg of a fraction rich in seeds P5.
  • the analysis of the proportion of pips in the F5 fraction gives 65% w / w.
  • the intermediate fraction F3 (230 Kg) is passed over a tapered Tarare airflow separator to obtain 120 Kg of light F4 fraction consisting essentially of skins and containing 0.8% P / P seeds.
  • the heavy fraction F5 (110) Kg is highly enriched in seeds.
  • This fraction F5 is passed on the densimetric table as in Example 1 to obtain 30 kg of fraction F6 enriched at 85% w / w of seeds.
  • the F7 fraction (80 Kg) consisted essentially of pulp and contained only 3.5% pips.
  • fraction F6 (42 Kg) is passed on a model air flow pilot model Zig-Zag Alpine. 30 kg of fraction F7 containing 95% w / w of seeds and 12 kg of pulp fraction containing 8% w / w of seeds are obtained.
  • 30 kg of seeds (fraction F7 of Example 3) are passed on a hammer mill equipped with a speed variator. The speed is minimal so as not to spray the seeds (almonds and shells).
  • the grinding chamber is equipped with a 3.5 mm perforation screen so as to retain whole seeds.
  • the crushed seeds are passed through a vibrating screen equipped with a 0.4 mm sieve to remove fines.
  • 100 Kg of pips obtained as in Example 3 are passed on a double cylinder dehuller whose spacing between cylinders is set to dissociate hulls and almonds without reducing the last fine powder.
  • the crushed product is screened on a 0.4 mm vibrating screen to remove 5 kg of fines and recover 95 kg of fraction retained by the sieve.
  • the mixture, shells and almonds, retained by the sieve is passed on a densimetric table to recover 77 kg of almonds and 16 kg of shells.
  • 35 kg of seeds obtained as in Example 2 are subjected to the action of an Electra pilot dehuller / separator to recover 8 kg of shells and 26 kg of almonds.
  • Example 1 50 kg of pulp fraction obtained from sieving as in Example 1 are subjected to successive extractions with hot water 70 ° C. until the last extract no longer contains detectable polyphenols by measurement of optical density at 280 nm. centrifugation supernatant at 2000 rpm for 10 minutes.
  • the 50 Kg are introduced into a tank of 1000 liters equipped at its base with a filter of 1, 5 mm diameter perforations. 550 liters of hot water are added at 70 ° C. to give a 8.3% water / water ratio. After 20 minutes of slow stirring, 450 liters of liquid phase are recovered by opening the valve located at the bottom of the tank and withdrawing with a centrifugal pump. A filtrate sample is taken and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes. The optical density is measured at 280 nm against water as a reference. 450 liters of hot water 70 ° C. are then added to the extraction tank, stirring is resumed for 20 minutes and the mixture is withdrawn again. The polypenolic richness of the filtrate is evaluated at 280 nm. This diffusion-racking operation is repeated 6 times.
  • a total of 2700 Kg of liquid extract is obtained which is clarified on a WESFALIA SB7 centrifuge / pilot debaucher to obtain 2484 Kg clarified phase.
  • the colloids, protein polymers and polysaccharides present in the clarified liquid are separated on an ultrafiltration pilot unit equipped with 6.8 m2 of Techsep tubular mineral membranes with a cutoff threshold of 50,000 daltons.
  • the ultrafiltration permeate is passed through a 60-liter column filled with XAD RHOM and HAAS adsorbent resin support. After washing the column with 1.5 volumes of water, the polyphenols are recovered by passing 1.5 volumes of a solution of ethanol diluted to 60% in water. Elution with 60% ethanol is followed by washing with 1.5 volumes of water. In total, 180 liters of ethanolic eluate containing about 30% of alcohol and containing the polyphenols are recovered. The ethanolic solution is distilled on a Rotavapor Buchi equipped with a distillation flask of 20 liters. 20 liters of concentrated polyphenols are recovered which are dried on pilot atomizer NIRO To obtain 890 grams of beige powder.
  • Example 2 25 kg of skins obtained in the sieving step as in Example 1 are subjected to the same extraction conditions as in Example 6, but with a skin: hot water ratio of 4.2%. After 6 extractions, 3150 kg of filtrate are obtained.
  • the filtrate is clarified on SB7 debubber centrifuge to obtain 2995 Kg of clarified liquid.
  • the clarified phase is passed directly onto the adsorbent resin column.
  • the resin is washed with 2 volumes of water heated to 50 0 C and then subjected to another washing by uprisings and fluidizations from below.
  • the residual alcohol of the column is recovered by passing 1.5 liters of water heated to 50 ° C.
  • Example 6 180 liters are recovered which are distilled and concentrated as in Example 6 to obtain 1, 2 liter of polyphenol concentrate.
  • the concentrate is spray-dried on BUCHI 90 laboratory atomizer. This gives 260 grams of powder.
  • Example 3 500 grams of whole seeds obtained as in Example 3 are directly milled on a hammer mill provided with a 100 micron sieve to obtain a relatively fine powder.
  • the powder is suspended in hexane in a powder: hexane ratio of 10%, ie a final volume of 5 liters.
  • the suspension is stirred for 1 hour and then filtered through a sieve of 75 microns.
  • the filtration residue is resuspended in a new solution of hexane so as to have the ⁇ litres of mixture. After stirring for 1 hour, the suspension is filtered and the operation repeated a third time. A total of 12.75 liters of hexane extract is recovered. All of this extract is centrifuged to remove insoluble particles.
  • the clarified liquid is distilled to remove hexane and recover 99.8 grams of apple seed oil.
  • the hexane extraction residues are dried at 40 ° C. in a ventilated oven to eliminate any trace of residual solvent.
  • Preliminary tests have shown that according to the ethanol / water ratio, the polyphenol composition of the extracts of whole seed varies greatly. In particular, it is found that concentrated alcohol (96%) promotes the solubilization of dihydrochalcones (phloridzine).
  • the deoiled and dried powder is dispersed in a solution of ethanol 50% in water and in a ratio of powder to solvent of 10%. After stirring for 1 hour, the suspension is filtered and the residue is taken up in a new 50% alcohol solution. After stirring for 1 hour, the mixture is filtered again and the operation repeated a third time. The whole filtrate is clarified by centrifugation and distilled to remove the ethanol. Thus, 1.9 liters of aqueous extract containing 4% of dry matter are recovered.
  • the aqueous extract is passed through an adsorbent resin carrier and washed with water to remove carbohydrate and protein elements.
  • the resin is washed with 70% ethanol to recover the polyphenols.
  • the ethanolic extract containing the polyphenols is distilled and concentrated on rotavapor. The concentrate is frozen and lyophilized to obtain 17.5 grams of powder.
  • the clarified extract is passed through a column of 20 liters of adsorbent resin. After washing, lifting and stabilizing each time with 2 volumes of water, the polyphenols are eluted by passing 40 liters of 70% ethanol, followed by 40 liters of water. Thus 80 liters of polyphenol extract are recovered in a solution of about 35% ethanol.
  • the extract is distilled and concentrated to obtain 25 kg of concentrate at 4.2% dry matter.
  • the concentrate is spray-dried (NIRO MINOR production tower) to obtain 1.05 kg of powder.
  • Example 7 The aqueous solutions are combined and treated as in Example 7 to obtain 48 grams of freeze-dried polyphenol powder.
  • the skin residues resulting from the aqueous extraction are resuspended in hot water 45 ° C.
  • This skin suspension is provided with a mixture of enzymes for liquefying the structures of plant cell walls (NOVO cellulase and Pectinex NOVO).
  • the enzymatic hydrolysis is allowed to proceed for 4 hours and then filtered to recover 1.9 kg of fraction. residual consisting essentially of cuticular structures of apple.
  • This residue is washed three times with water to remove all the solubilized elements and other contaminating fine lignocellulosic particles.
  • This fraction containing 8% of dry matter is dried at 40 0 C in a ventilated oven to recover 152 grams of product at 7% moisture.
  • This cuticle preparation is finely ground to obtain a very light gray to off-white powder.
  • the powder thus obtained can be resuspended in vegetable oil to give a creamy structure. This shows that it is easily used in cosmetic formulations as a source of vegetable waxes and actives present in waxes (ursolic acid).
  • Example 2 5 kg of skins obtained as in Example 1 are dissolved in hot water at 50 ° C.
  • the skin: water ratio is set at 10%.
  • the whole is subjected to slow and continuous kneading for 10 hours so as to cause the dispersion of the pulp layers (parenchymal cells) located under the cuticle and to solubilize the polyphenols. After 10 hours of mixing, the mixture is diluted and filtered.
  • the filter residue is resuspended in water, stirred for 5 minutes and filtered. This washing operation is repeated 2 more times.
  • the liquid washing phases are combined, clarified by centrifugation and ultrafiltered over 0.2 m 2 of 10,000 dalton tubular mineral membranes.
  • the permeate obtained is passed over an adsorbent resin support to purify the polyphenols as in Examples 6 and 7.
  • the cuticle fractions resulting from the washings are dried and treated as in Example 10 to recover 50.2 grams of light powder of crude waxes.
  • the light powder thus obtained is suspended in 500 ml of 96% ethanol and stirred for 4 hours.
  • the suspension is filtered through a 75 ⁇ m sieve and the residue is extracted two more times with 500 ml of 96% ethanol.
  • the filtrates are combined and centrifuged at 2000 rpm to recover 1260 ml of clarified liquid.
  • the clarified extract is distilled and concentrated on BUCHI rotavapor.
  • the concentrate is frozen and freeze-dried to recover 4.7 g of very light cream colored wax powder.
  • Example 14 Evaluation of the ocular irritant potential of apple extracts.
  • POMACTIV WAP Extract in powder containing 41% of total polyphenols assayed by the FoNn method of which by HPLC chromatography:
  • Flavonols (quercetin and quercetin derivatives)
  • POMACTIV HDH HDH for hight dihydrochalcons: Powdered extract containing 42% of total polyphenols assayed by the FoNn method of which, by HPLC chromatography, 35% of dihydrochalcones (phloridzine)
  • the tests are performed according to the standard procedure. Egg embryonated eggs of about 60 grams were incubated, air pocket upward, at 37.5 ° C for 10 days. The pure product to be tested is sprinkled on the surface of the chorioallantoic membrane. After 20 seconds of contact, the membrane is rinsed with 0.9% NaCl solution.
  • Example 15 Evaluation of the cutaneous irritant potential of apple extracts on human dermal tissue in culture.
  • the apple extracts tested are those described in Example 14.
  • the most widely used method for assessing the skin irritant potential was to apply the skin surface of rabbits to the skin. product to be tested pure or diluted. Reactions of erythema and edema were noted and quantified according to a scale defined in the protocol. The tested products were then classified from mildly irritating to very irritating according to a calculated irritation index. Many protocols have been developed to replace the skin test in rabbits. None of the tests studied have so far produced sufficiently reliable results, enough to constitute a safety record.
  • Explants of human skin 8 mm in diameter were prepared from an abdominal biopsy taken from a healthy subject during a plastic surgery procedure. After removal of adipose tissue, the skin samples are taken to life in the appropriate culture medium. A volume of 20 ⁇ l of apple extract diluted to 2% and 0.2% (20 and 2 mg / ml) is deposited on the surface of a pad and applied to the skin explant and then left in contact for 20 minutes. hours. Sodium dodecyl sulfate (SDS) at 20 mg / ml was used as the reference irritant. Each condition of the test is performed in hexaplicate.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the tested apple extracts are classified as follows compared to the SDS control:
  • Example 16 Acute cutaneous tolerance of apple extracts in adult human volunteers.
  • the apple extracts tested are those described in Example 14.
  • Cutaneous microscopic examinations were carried out rigorously under the same conditions, in particular at the level of the lighting (daylight lamp, 30 minutes after the removal of the patches posed for 48 hours.) In the absence of any cutaneous reaction After 30 minutes after removal of the dressing, the test was stopped and, in the case of a visible cutaneous reaction, the subject had to return to the study center, readings were performed until reversibility of the cutaneous reactions.
  • apple extracts (POMACTIV) tested under dermatologist control applied diluted to 25% in paraffin oil and locally under occlusive dressing for 48 hours, on the skin of 10 adult volunteers. , are rated "non-irritating" at 30-minute and 24-hour readings, according to IIM scoring (average irritation index).
  • Example 17 Effects of hard apple extracts the expression of genes marking oxidative stress and cellular aging A. Materials and Methods
  • Flavans catechins and polymers of procyanidols
  • Flavonols flavonols (quercetins and derivatives)
  • Fibroblasts The predominantly cellular population of the dermis consists of fibroblasts. These cells derive from the mesenchymal cells and synthesize the precursors of the intercellular substance of the connective tissue. Fibroblasts produce and secrete most of the molecules that make up the extracellular matrix, including collagens, elastin, structural glycoproteins and proteoglycans, as well as proteases capable of degrading and remodeling this matrix, such as matrix metalloproteases (MMPs). . Fibroblasts also produce many mediators, chemokines, cytokines and growth factors necessary for initiation, and the formation of new tissue.
  • MMPs matrix metalloproteases
  • the analyzes are done on the cultures at 6 o'clock and at 24 o'clock.
  • the results are expressed in relative units of expression (ER). It is arbitrarily considered that a gene is expressed significantly when the ER is greater than 2. Arbitrarily too, the significance limit is set at + 180% of the untreated control for a stimulating effect and at -65% of the control for a repressor effect.
  • GSH glutathione
  • GRX glutaredoxin
  • MTS metallothioneins
  • HMOX1 Heme oxygenase 1
  • CO carbon monoxide
  • lipoxygenase-B ALOX15B
  • Iipoxygenase-15B catalyzes the insertion of oxygen molecule on the arachidonic acid backbone at the 15-position carbon.
  • this enzyme is strongly involved in the peroxidative oxidation process of cell membranes.
  • Iipoxygenase-15B and its metabolites have been detected in high proportions in the tissues of the smokers' breathing circuit. Repression of the genetic marker of this enzyme would therefore be favorable against oxidative stress and cellular aging.
  • Nitric oxide (NO) regulates many physiological activities at the cellular level and can also serve as a neurotransmitter. But when it is produced in excess, nitric oxide (NO) can react with superoxide to form peroxynitrite (ONOO) very reactive and potentially more toxic than NO or 02 " separately.Peroxynitrite can also cause nitration of residues tyrosine of proteins
  • the inhibition of the expression of the NOS1 enzyme would be in the direction of a control of the level of NO and thus of a limitation of the rate of peroxynitrite (ONOO)
  • Suppression of the HSPCB Heat-shock protein B
  • HSPCB Heat-shock protein B
  • IL-6 interleukin 6
  • MCP1 monocyte chemotactic protein 1
  • TNFSF10 Tumor Necrosis-Related apoptosis Inducing Ligand
  • the first phase of the so-called "inflammatory phase" preparation has the effect of limiting the physiological disturbances caused by the lesion, whether of mechanical origin , chemical, thermal or immunological.
  • this phase there is a cessation of the eventual bleeding, cleaning of the focus of the disturbance, provision of a provisional matrix for the multiplication and migration of the cells and genesis of the factors involved in the initiation of the formation of the granulation tissue.
  • the repair and tissue remodeling involve changes in the synthesis and fate of collagens and other molecules of the interstitial matrix involved in the process.
  • the different molecules composing the epidermal basement membrane are expressed in an ordered sequence.
  • the study of human skin has shown that, in general, the antigen of bullous pemphigoid (a rare bullous dermatosis) appears first followed by type IV collagen, laminin and type VII collagen.
  • IV alpha2 collagen is indeed the most overexpressed followed by collagen III alphal.
  • the alpha alpha2 and alphal VIII collagens are only marginally overexpressed.
  • the forms XV alphai, XVIII alphai and I alphai are repressed. It is important to note that the collagens XV and XVIII, repressed here, occupy a special place in this family of proteins. They are part of the multiplexine subfamily, characterized by numerous alternating areas of collagen and non-collagen. This proteoglycanic structure makes it possible to classify them in the group of "heparan sulfate proteoglycan" (HSPG). The protein sequences of these two collagens are very close and the C-terminus (termed endostatin) of the form XVIII exhibits aniangiogenic activity. This collagen XVIII is therefore involved in the development of the vascular system.
  • HSPG heparan sulfate proteoglycan
  • HSPG proteins would act in concert with FGF and VEGF factors as well as their receptors to control different aspects of vascular development.
  • the migration of keratinocytes involves their adhesion on a substratum.
  • the receptors for their attachment and migration are the isoforms of integrins.
  • POMACTIV HFV induces overexpression of receptor genes such as the integrin a7b (ITGA7B).
  • the present invention also shows that treatment of aged fibroblasts with POMACTIV HFV results in repression of genes encoding prostaglandin receptors. This would be an indication of the effectiveness of POMACTIV against skin inflammation phenomena.
  • Prostaglandin E PGE
  • PGE Prostaglandin E
  • PGE is a major metabolite of the action of the cyclooxygenase enzyme on arachidonic acid. PGE plays an important vasodilator role and protects against excessive vasoconstriction. It has been shown that the production of PGE in human skin fibroblasts in culture can be induced by the inflammatory stimulant PMA (phorbal myristate acetate). Indeed, PMA is an exogenous stressor inducing oxidative and inflammatory stress responses in cells.
  • PMA phorbal myristate acetate
  • This model is therefore used to stimulate inflammation in vivo, particularly in the context of studies concerning cutaneous inflammation and its treatment with cosmetic compositions.
  • the inflammatory response is measured by the rate of prostaglandin, especially the subtype E2 (PGE sub.2).
  • PGE subtype E2
  • the effectiveness of the cosmetic formula can be evaluated by the rate of decrease of PGE.
  • PGE was not measured in this study. But, it is shown that apple extract suppresses the expression of its receptor.
  • prostaglandins act through their receptors and would be involved in cellular processes such as bone resorption or platelet aggregation. A decrease in the expression of receptors, as shown here, would be a way to counteract the action of prostaglandins at the cellular level and thus fight against cellular inflammation, particularly cutaneous inflammation.
  • telomeres are structures formed at the ends of linear chromosomes by association of repetitive patterns of DNA and specific proteins. The gradual shortening of telomeres during repeated cell divisions is associated with senescence.
  • telomeres a ribonucleoprotein enzyme
  • Telomerase a ribonucleoprotein enzyme
  • Tissue remodeling refers to transient or permanent changes in the architecture of scar tissue. Remodeling occurs during different phases of tissue repair and involves the production and activation of proteinases by connective tissue cells.
  • the extracellular matrix comprises a large variety of macromolecules whose degradation or activation requires the intervention of proteases. As a result, it is not just a basic tissue structure. It also plays an important role in regulating cell proliferation, apoptosis, migration and differentiation. Proteolysis at the level of this extracellular matrix is a mechanism for regulating all these processes.
  • proteases play a major role in remodeling phases such as wound healing, ovulation, bone formation and resorption, remodeling of skin tissue. Similarly, these proteases are involved in a number of pathologies related to cellular dysfunction.
  • MMP-1 extracellular matrix numbered from MMP-1 to MMP-29
  • these metalloproteases are induced in response to growth factors, cytokines and hormones.
  • MMPs are induced by IL-1b, TNF- ⁇ , pDGF, TGF, EGF, FGFb and NGF.
  • the expression of a number of these markers is modified by POMACTIV HFV.
  • MMP-3 is first repressed at 6 hours before being overexpressed at 24 hours. MMP-1 is overexpressed as early as 6 hours and is slightly amplified at 24 hours.
  • collagenases such as MMP-1 are mainly produced by basal keratinocytes of the epidermis. The activity of collagenases is therefore involved in the different stages of healing. Their role would be to promote cell migration.
  • fibroblasts are able to synthesize interstitial collagenase under the stimulating action of factors like PDGF, EGF or TGF.
  • MMP-3 or stromelysin-1 is involved in tissue remodeling prior to the formation of a new basement membrane.
  • this enzyme is involved in the formation and remodeling of granulation tissue and associated processes such as angiogenesis, extravasation.
  • TSP-2 Thrombospondin-2
  • DCN Decorin
  • MCP-1 Monocyte Chemotractant Protein-1
  • TRAIL TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand
  • VEGF-C Vascular Endothelial Growth Factor-C
  • IGA7 Vascular Endothelial Growth Factor-C
  • Telomerase Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF)
  • MIF Macrophage Migration Inhibitory Factor
  • PLGF1, PLGF2 Placenta Growth Factor 1 and 2
  • TGFb transforming growth factor beta
  • telomerase is important in the blockage of cellular aging, the resumption of the metabolic process and therefore the cellular proliferation required for tissue remodeling.
  • BAX Apoptosis Regulator
  • PCPEP Procollagen-C Proteinase Enhancer
  • PTGER1 Prostaglandin E Receptor 1
  • BIRC5 Apoptosis Inhibitor Survivin
  • CAV1 Caveolin 1 genes
  • Example 18 the effects of the apple extracts on (i) lipogenesis, (ii) on the differentiation of pre-adipocytes into adipocytes and (iii) on the differentiation of pre-adipocytes into osteoblasts are shown.
  • the objective of this study is to highlight the properties of the extracts POMACTIV HFV and POMACTIV HDH, as presented in Example 1, on bone metabolism (action on osteoporosis) and on adipocyte metabolism (slimming action, anti cellulite). More specifically, this study aims to:
  • the studied parameters are 1) the morphology of cells (morphological monitoring of differentiation) and 2) the expression of genes coding for PPARG differentiation markers (peroxisome proliferator activated). receptor gamma) and G3PDH (glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase).
  • the studied parameters are 1) the measurement of the alkaline phosphatase activity (PAL) and 2) the expression of genes coding for alkaline phosphatase (PAL) and Transforming Growth Factor B-1 (TGFbI) which are factors of differentiation.
  • PAL alkaline phosphatase activity
  • TGFbI Transforming Growth Factor B-1
  • the cells used here in culture were human mesenchymal po ⁇ etic stem cells (hMSC).
  • Cytotoxicity was performed prior to undifferentiated hMSC cells to select the apple extract concentrations to be tested.
  • the cell mats of the 24-well plates were rinsed in PBS medium and the cells are stored in Tri-Reagent medium at room temperature.
  • RNA required for the quantitative PCR assays (genes coding for the differentiation markers). Morphological differentiation into adipocytes is followed on cell mats using a fluorescent marker specific for intracellular lipids.
  • the culture medium was removed and replaced with osteoblast differentiation medium containing or not (control) the POMACTIV extract under test. Cultures control are performed in growth medium for the duration of the experiment (undifferentiated hMSC).
  • the changes of media are carried out every 3 days For each time (3 days and 11 days), the cell mats of the 24-well plates were rinsed in PBS medium and the cells are stored in Tri-Reagent medium at -80 ° C. These samples are then used for the extraction of the RNA required for the quantitative PCR assays (genes encoding the differentiation markers). The enzymatic activity of alkaline phosphatase was evaluated on cell mats using a dosing kit (Sigma AP-F).
  • POMACTIV show inhibition of intracellular lipid accumulation.
  • POMACTIV HFV or HDH Treatment of human mesenchymal poetic stem cell cultures (hMSC) with POMACTIV HFV or HDH alters the relative expression of PPARG and G3PDH messengers. Concerning the PPARG messenger, we note in particular: ° Early activation of PPARG messenger expression for 3-day cultures, followed by a very significant inhibition of this expression for 11-day cultures. PPARG overexpression at 3 days is greater for POMACTIV HFV (187% compared to 100% control) compared to POMACTIV HDH (142% compared to the control).
  • G3PDH is an important enzyme in cellular energy metabolism and its overexpression can mean a significant increase in general cell metabolism. This is confirmed by the increase in cellular protein content compared to alkaline phosphatase activity.
  • PAL alkaline phosphatase
  • PAL enzyme activity compared to total cellular proteins at 11-day cultures shows a strong decrease (150% for HFV and 96% for HDH) compared to the results at 3 days.
  • ° POMACTIV HFV is more effective than POMACTIV HDH in increasing the activity of alkaline phosphatase, possibly due to the polyphenolic composition, especially the possible synergy between phloridzin and quercetin, or a dose effect.
  • the extracts tested being 100% from the apple and dosed at about 40% of total polyphenols, synergistic participation of other elements, even minor, the fruit is not excluded (oligosaccharides, peptides, amino acids, minerals, terpenoids and elements lipid).
  • POMACTIV HFV (126%).
  • POMACTIV HDH rather causes an inhibition of this expression (67%).
  • the present study shows that, under the experimental conditions used, the apple extracts tested (POMACTIV HFV and HDH) have globally favorable effects in terms of inhibition of the accumulation. intracellular lipids and modification of markers of cell differentiation. In particular, repression of markers of differentiation of preadipocytes into adipocytes and overexpression of preadipocyte differentiation markers towards osteogenesis are noted. It should also be pointed out that the treatment of cell cultures with apple extracts leads to an increased metabolic activity translated by the increase of the total protein matter.
  • PPARG Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma
  • This nuclear receptor is the central regulator of adipose tissue development and the increase of its expression is favorable to lipogenesis and the formation of fatty adipocyte cells. Its repression by apple extracts in cell cultures at 11 days, is one of the mechanisms of inhibition of lipogenesis by the latter.
  • Alkaline phosphatase and its messenger are good markers confirming cell differentiation in the direction of osteogenesis. This enzyme is involved in bone mineralization by calcium deposition. Increasing its expression and activity in cell cultures clearly indicates the orientation of stem cells to osteogenesis.
  • Example 19 Anti-aging dermatological composition, usable as a composition for protection against U.V. radiation
  • the apple extract used is POMACTIV HFV Tel described in Example 14
  • CARBOPOL ULTREZ 10 (NOVEON) 00.20 Xanthan Gum (4%) 04.00
  • the preparation of the cream can be carried out as described below:
  • phase 1 75 ° C in phase 1 heated to 75 ° C. Maintain with vigorous stirring for 5 to 10 minutes.
  • the apple extract used in this formula is POMACTIV WAP as described in Example 14.
  • phase 2 heated to 75 ° C in phase 1 heated to 75 ° C and maintain stirring for 10 minutes
  • the apple extracts used in this example are POMACTIV HFV or POMACTIV HDH as described in Example 14, as well as apple seed oil as obtained by the process for obtaining a plant extract.
  • the apple extract used is POMACTIV HFV as described in Example 1
  • the apple extract used is POMATIV HFV as described in Example 14
  • the apple extract used here is POMACTIV WAP as described in Example 14.
  • Cocoamidopropyl betaine (35%) 15.00
  • the apple extracts used in this formula are POMACTIV WAP as described in Example 14 and apple seed oil as obtained by the process for obtaining a plant extract.
  • the apple extract used is apple seed oil as obtained by the process for obtaining a plant extract.
  • the ingredients are mixed cold in order
  • Example 28 Dietary Supplement Capsules slimming anti-cellulite or anti-osteoporosis
  • the apple extracts used in this formula are POMACTIV HDH or POMACTIV HFV as described in Example 14.
  • Vitamin D (cholecalciferol) 70.00
  • Soy Isoflavones (powder titrated 30%) 60.00 mg
  • the apple extract used is POMACTIV HFV as described in Example 14
  • Vitamin C ascorbic acid powder
  • Vitamin E powder titrated 50%
  • POMELITE LV soluble apple fiber
  • the extract used is POMACTIV HFV as described in Example 14.
  • the extract used is POMACTIV HFV as described in Example 14.
  • EXAMPLE 32 Effervescent Anti-Aging Tablet or Anti-Oxidative Stress
  • the apple extract used is POMACTIV WAP as described in Example 14
  • Vitamin C ascorbic acid powder
  • Vitamin E (powder titrated at 50%) 100 mg
  • EXAMPLE 33 Clinical test for evaluating the anti-wrinkle and anti-cellulite efficacy, the acceptability and the tolerance of a cosmetic cream on the cutaneous relief.
  • the tested apple extract was HFV incorporated into cosmetic formulations as presented in Examples 22 and 23, out of 20 volunteers; Protocol:
  • the formulas were tested on a panel of 20 women, aged 35 to 60, for a month, under the supervision of a dermatologist.
  • Inclusion and non-inclusion criteria are established to select individuals participating in the clinical trial.
  • participant For anti-wrinkle effects, participants made two applications a day in the morning and evening on the entire face. For anti-cellulite effects, participants make two applications a day in the morning and evening on the thighs, buttocks, hips and waist.
  • Evaluations are made during visits to the test center, at the beginning of the test (OJ), after 14 days (D14) and then 28 days (D28) of use of the products.
  • a dermatologist evaluates the condition of the skin on the face and thighs.
  • the evaluated parameters were:

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Abstract

La présente invention se rapporte au domaine de l'extraction de substances végétales d'intérêt à partir de fruits à pépins, en particulier à partir de pommes. L'invention est notamment relative à l'utilisation de ces substances végétales extraites à partir de fruits à pépins dans divers domaines de l'industrie, et en particulier dans les domaines cosmétique, alimentaire, nutraceutique, diététique ou encore dans le domaine des colorants.

Description

Procédé d'obtention d'un extrait végétal de fruits à pépins, extrait végétal ainsi obtenu et ses utilisations.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de l'extraction de substances végétales d'intérêt à partir de fruits à pépins, en particulier à partir de pommes.
L'invention est notamment relative à l'utilisation de ces substances végétales extraites à partir de fruits à pépins dans divers domaines de l'industrie, et en particulier dans les domaines cosmétique, alimentaire, nutraceutique, diététique ou encore dans le domaine des colorants.
ART ANTERIEUR
La production légumière et fruitière génère inévitablement des tonnages importants de co-produits et sous-produits dont l'élimination ou la valorisation pose de plus en plus de problèmes. Les réglementations européennes en matière de gestion des déchets devenant de plus en plus restrictives, il devient urgent de trouver de nouvelles voies de valorisation. Aujourd'hui, les industriels du secteur s'engagent progressivement dans une stratégie de valorisation totale des matières premières agricoles. Cette démarche s'appuie sur l'exploitation du potentiel des technologies innovantes, le développement du marché des produits naturels et surtout, l'émergence plus récente du marché des aliments "santé" et de la cosméceutique. La finalité de cette nouvelle stratégie industrielle est d'intégrer également la protection de l'environnement tout le long des process de transformation depuis le champ, la matière première jusqu'au consommateur. Pour atteindre ces objectifs, différentes voies sont envisageables :
- améliorer les rendements des process existants
- réduire les rejets de sous-produits et eaux résiduaires
- trouver une meilleure valorisation aux co-produits et sous-produits par le développement de nouveaux extraits à haute valeur ajoutée.
- trouver de nouveaux procédés plus performants
Le traitement des pommes en vue de l'élaboration de boissons (jus, cidre, eau de vie de cidre, vinaigre de cidre), de concentrés ou de compotes, s'accompagne de la production d'un certain nombre de résidus dont l'élimination ou la revalorisation n'est pas toujours aisée. Le marc de pomme, co-produit le plus abondant, issu du broyage et du pressurage des pommes représente encore 20 à 30% du poids des fruits de départ. Ce qui rapporté à la production annuelle de pommes d'industrie d'un pays comme la France représente d'énormes tonnages. Pourtant, aujourd'hui, ce co-produit reste un déchet encombrant et peu valorisé. Ses principales utilisations actuelles sont l'alimentation animale et pour une moindre part, l'extraction industrielle des pectines (gélifiants alimentaires). De nombreuses autres voies de valorisation des coproduits et sous-produits de pomme ont été étudiées :
- le marc entier micronisé est utilisé comme fibres brutes pour incorporation en alimentation humaine. Les inconvénients majeurs de ce type de produit sont le goût et la couleur caractéristiques, ainsi qu'une sensation sableuse désagréable en bouche.
- la fermentation en vue de l'obtention de biogaz (méthane) et d'alcools (éthanol, butane...).
- l'extraction de fibres solubles
- la production d'acides organiques par purification (acide malique natif) ou par fermentation (acide citrique)
- l'extraction d'agent hypocholestérolémiant
- la production d'arôme
- l'extraction d'antioxydants
- l'extraction d'huile de pépins
- l'extraction de cires
- la fabrication de compost
- l'utilisation comme combustible
En général, les extraits actuels du marché issus de la pomme sont obtenus à partir de procédés mettant en œuvre le fruit entier ou ses sous-produits industriels, souvent très hétérogènes, comme le marc entier. Par conséquent, ces extraits, s'ils sont obtenus par emploi de l'eau ou d'un solvant comme l'éthanol, renferment la totalité des phytoactifs présents dans la matière première. Pour obtenir des extraits particulièrement riches en un actif particulier, il faut alors mettre en œuvre des solvants d'extraction très sélectifs ou de séparation liquide/liquide souvent incompatibles avec un usage alimentaire. Seuls certains sous-produits homogènes, mais plus rares comme les pelures issues des process industriels nécessitant un épluchage préalable des pommes, peuvent permettre l'obtention relativement aisée d'extraits fortement enrichis en certains composés (quercétine, cires)
De nombreux extraits végétaux revendiquant une richesse en polyphénols existent actuellement sur le marché. Les plus représentatifs sont les extraits de marc de raisin, pellicules de raisin, pépin de raisin, thé, écorce de pin, olive et romarin (FR A2 643 073, FR A2 372 823, US A4 698 360, EP A 348 781 , EP A 283 349, FR A1 427 100, FR A2 092 743).
Les extraits de pomme à usage alimentaire sont beaucoup plus rares. Le brevet EP AO 657 169 présente un procédé d'extraction de polyphénols à partir de pommes non matures de 3 à 10 grammes. La fraction polyphénolique est obtenue à partir du jus de pressurage des pommes broyées et de ce fait renferme essentiellement les composés hydrosolubles qui passent facilement dans le jus, à savoir ceux du groupe des acides hydroxycinnamiques (chlorogénique, caféique, p- coumarique) et du groupe des flavanols (catéchines et leurs polymères). La quercétine et les dérivés glycosylés de la phlorétine (phloridzine) sont présents en faibles proportions.
La pomme est le fruit le plus consommé dans le monde et constitue une source importante de substances bénéfiques comme les fibres, les polyphénols ou les triterpenoïdes. De nombreuses études ont montré que les polyphénols végétaux, notamment ceux présents dans la pomme, manifestent diverses propriétés nutritionnelles et physiologiques dont les effets antioxydants, anti-carcinogènes, anti-artériosclérotiques, anti-bactériens, anti-viraux, régulateurs de lipidémie et de glycidémie. Les polyphénols sont également capables d'activer les anti-oxydants intracellulaires endogènes, d'inhiber la formation de pro-carcinogènes, d'inhiber la prolifération de cellules cancéreuses, de bloquer l'angiogenèse, d'activer et amplifier la défense immunitaire, d'activer le remodelage tissulaire. Par ailleurs, la quercétine et la phloridzine, composés polyphénoliques fortement présents dans la pomme (la phloridzine est spécifique à ce fruit), sont connus pour leur capacité à réguler l'absorption transmembranaire des sucres et par conséquent, leurs effets favorables sur les métabolismes lipidique et glucidique. Ces deux molécules ont des actions préventives démontrées contre le diabète, l'obésité, la lipogenèse. Ils manifestent des propriétés similaires à ceux des isoflavones et peuvent agir favorablement contre l'ostéoporose et les effets indésirables de la ménopause. Aujourd'hui, les composés phénoliques de la pomme sont très étudiés pour leurs multiples effets bénéfiques et leurs applications anti-âge, anti-diabétique, minceur, anti-cellulite... Les extraits de pommes riches en polyphénols sont de plus en plus présents dans les aliments dits fonctionnels ou santé, les compléments alimentaires et les produits cosmétiques.
De nombreux travaux ont déjà été réalisés afin d'obtenir des compositions enrichies en polyphénols à partir de végétaux, et en particulier à partir de pommes.
Le brevet français FR 2 822 466 décrit une fraction phénolique de pomme riche en phloridzine et son utilisation en tant qu'agent cosmétique, alimentaire ou nutraceutique. Le brevet européen EP A 0 657 169 décrit un extrait polyphénolique obtenu à partir de pommes immatures de l'ordre de 3 à 10 grammes. L'extrait ainsi obtenu est utilisable en cosmétique et nutraceutique. Le brevet français FR 2 836 336-A1 et américain US 0,161 ,900 A1 décrivent l'utilisation dans un traitement cosmétique d'une fraction phénolique riche en dihydrochalcones. Le brevet américain US 5,587,174 décrit une composition cosmétique pour le traitement de la peau et des cheveux, contenant des extraits de cire de pomme ainsi que leurs procédés de fabrication. Le brevet français N° 2 808 442 décrit un procédé d'extraction d'un principe actif à partir de téguments de pomme, principe actif obtenu et composition adaptée pour lutter contre les conséquences du stress oxydatif de la peau. Le dit principe actif est obtenu par hydrolyse enzymatique de la poudre de téguments en solution aqueuse, filtration stérilisante et éventuellement concentration. Ce principe se caractérise par une forte présence des sucres de pomme, des oligosaccharides libérés par l'hydrolyse enzymatique et des polyphénols en plus faible proportion. Le brevet français 0688 FR présente de nouveaux complexes macromoléculaires issus de la pomme, leur procédé de préparation et leur utilisation à titre d'agent hypocholestérolémiant. Les complexes moléculaires obtenus sont caractérisés par le fait qu'ils contiennent 5 à 25% de polyosides cationiques, 5 à 15% d'hémicellulose, 0 à 50% de cellulose et 25 à 55% de pigments quinoniques (polyphénols et dérivés polymérisés). Le brevet américain US 6,630,163 propose un procédé de traitement des désordres dermatologiques avec des extraits de différents fruits dont les pommes, abricots, pèches, poires, ananas, papayes, grenades, kiwis, mandarines et oranges. Le brevet français FR 2 799 121 a pour objet un procédé d'obtention d'extraits polyphénoliques, riches en phloridzine, à partir de branches de pommiers ainsi que leurs utilisations cosmétiques. Le brevet US 6,528,053 décrit des compositions et méthodes pour réduire les oxystérols sériques en utilisant des extraits de différents fruits dont la pomme.
De nombreux autres extraits de fruits existent aujourd'hui sur le marché et/ou sont utilisés en alimentation, nutraceutique, compléments alimentaires, cosmétique. Concernant des extraits revendiquant exclusivement, ou en partie, une richesse en polyphénols. On peut citer les demandes de brevet et les brevets ci-après : FR 2 643 073 ; FR 2 372 823 ; US A4 698 360 ; EP A 348 781 ; EP A 283 349 ; FR 1 427 100 ; FR 2 092 743 ; US 6,630,163 ;US 6,800,292 ; US 5,204,105 ; US 5,441 ,740 ; US 5,587,174 ; US 5,891 ,440 ; US 5,290,605.
La plupart de ces brevets concernent l'obtention d'un seul extrait à partir d'un végétal donné. Par exemple, les brevets concernant la pomme revendiquent généralement un seul type d'extrait riche en polyphénols et des applications basées sur la composition particulière en polyphénols. Les extraits riches en procyanidols (tanins) mettent en avant les propriétés spécifiquement liées à ces composés, à savoir le pouvoir antioxydant. Ceux revendiquant une richesse en dihydrochalcones (phloridzine) mettent en avant la particularité de ces molécules à réguler l'absorption cellulaire des sucres. C'est le cas par exemple pour les brevets français FR 2 836 336 et américain US 0,161 ,900 A1 qui revendiquent l'utilisation d'un extrait de pomme riche en dihydrochalcones. Selon ces inventions, le transport transmembranaire du glucose est inhibé lorsqu'une lignée de cellules utérines humaines est traitée avec l'extrait de pomme. Le brevet français FR 2 799 121 revendique un extrait de pomme riche en phlorizine obtenu à partir de branches de pommier. Les auteurs de l'invention revendiquent l'action synergique de l'ensemble des actifs de l'extrait pour expliquer la capacité de ce dernier à inhiber la différenciation de préadipocytes en adipocytes. En revanche, la nature chimique, notamment le profil polyphénolique, de ces autres composants ainsi que leurs modes d'action ne sont pas précisés. Le test utilisé consistait à étudier l'effet de l'extrait de pomme sur la différenciation de cellules préadipocytes en adipocytes ainsi que sur l'accumulation de lipides intracellulaires dans les cellules différenciées.
Il existe un besoin dans l'état de la technique pour des procédés améliorés d'obtention d'extraits végétaux d'intérêt industriel à partir de fruits à pépins, notamment à partir de pommes.
Il existe aussi un besoin pour des extraits végétaux nouveaux, notamment pour de nouveaux extraits végétaux obtenus à partir de pomme, qui soient alternatifs ou améliorés par rapport aux extraits connus.
RESUME DE L'INVENTION
L'invention concerne un procédé pour l'obtention d'un extrait végétal de fruits à pépins enrichi en une ou plusieurs substances végétales d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) séparer, à partir des fruits à pépins de départ, ou d'un marc de départ obtenu à partir desdits fruits à pépins, à l'état sec, respectivement les fractions suivantes :
(i) une fraction de matière enrichie en peaux,
(ii) une fraction de matière enrichie en pulpe,
(iii) une fraction de matière enrichie en pépins entiers, ou une fraction choisie parmi les fractions suivantes :
- (iii-1 ) une fraction de matière enrichie en amandes de pépins,
- (iii-2) une fraction de matière enrichie en coques de pépins, b) préparer, à partir d'au moins l'une des fractions (i), (ii), (iii), (iii- 1 ) et (iii-2) obtenues à l'étape a), un extrait enrichi en une ou plusieurs substances végétales d'intérêt.
L'invention concerne aussi les fractions enrichies en pulpe de fruits, en peaux de fruits et en pépins de fruits susceptibles d'être obtenues par le procédé ci-dessus.
L'invention est aussi relative à des extraits obtenus à partir des diverses fractions enrichies en pulpe, peaux ou pépins ci-dessus, ainsi qu'à des compositions alimentaires, nutraceutiques, cosméceutiques, diététiques, cosmétiques ou pharmaceutiques comprenant de tels extraits.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
II est fourni selon l'invention un procédé amélioré d'obtention d'extraits végétaux d'intérêt industriel à partir de fruits à pépins, notamment à partir de pommes.
La présente invention fournit aussi des extraits végétaux, y compris des extraits de pomme, utilisables tels quels et pour la fabrication de compositions alimentaires, nutraceutiques, cosméceutiques, diététiques, cosmétiques ou pharmaceutiques.
Procédé d'obtention d'extraits végétaux
En particulier, il est fourni selon l'invention un procédé amélioré d'obtention d'extraits végétaux d'intérêt industriel à partir de fruits à pépins qui comprend en premier lieu une ou plusieurs étapes de séparation de la matière première végétale en différentes fractions enrichies en chacun de ses constituants principaux, respectivement peau, pulpe, pépins, et même en fractions enrichies en chacun des constituants principaux des pépins, respectivement coques et amandes des pépins.
L'invention a pour objet un procédé pour l'obtention d'un extrait végétal de fruits à pépins enrichi en une ou plusieurs substances végétales d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) séparer, à partir des fruits à pépins de départ, ou d'un marc de départ obtenu à partir desdits fruits à pépins, à l'état sec, respectivement les fractions suivantes :
(i) une fraction de matière enrichie en peaux,
(ii) une fraction de matière enrichie en pulpe,
(iii) une fraction de matière enrichie en pépins entiers, ou une fraction choisie parmi les fractions suivantes :
- (iii-1 ) une fraction de matière enrichie en amandes de pépins,
- (iii-2) une fraction de matière enrichie en coques de pépins, b) préparer, à partir d'au moins l'une des fractions (i), (ii), (iii), (iii-1 ) et (iii-2) obtenues à l'étape a), un extrait enrichi en une ou plusieurs substances végétales d'intérêt.
Le procédé ci-dessus, du fait qu'il comprend une première étape a) de séparation de la matière première de départ en fractions enrichies en ses différents constituants principaux, rend possible, à l'étape b), la préparation d'extraits sélectivement enrichis en diverses substances végétales d'intérêt industriel.
Le procédé selon l'invention apporte en conséquence des avantages techniques par rapport aux procédés antérieurs ne comprenant pas d'étape préalable de séparation.
Par exemple, pour la pomme, les pépins comprennent en moyenne 25% en poids de lipides, par rapport au poids total des pépins ainsi qu'une forte quantité de protéines, parfois supérieure à 25% en poids. De plus, l'huile des pépins comprend 80% en poids d'acides gras insaturé linoléique et oléiques, par rapport au poids total des acides que les pépins contiennent.
De même, pour la pomme, la fraction enrichie en peaux comprend une forte quantité de cires, dont l'un des composants est l'acide ursolique qui est utilisé dans les domaines cosmétique, alimentaire et pharmaceutique.
Egalement, grâce au procédé de l'invention, il est désormais possible de préparer un extrait riche en phloridzine à partir des fractions enrichies en pépins, comprenant une quantité réduite en d'autres polyphénols. De plus, grâce au procédé de l'invention, il est désormais possible de préparer des extraits sélectivement riches en seulement certains des polyphénols présents dans le fruit entier. Par exemple, la fraction enrichie en pulpe permet la préparation d'extraits comprenant majoritairement des polyphénols du type catéchines, polymères de procyanidine ou encore les acides hydroxycinnamiques. Egalement à titre illustratif, la fraction enrichie en peaux permet la préparation d'extraits comprenant majoritairement des flavonols, en particulier la quercétine. Comme déjà mentionné, des extraits riches en phloridzine peuvent être préparés à partir des fractions riches en pépins.
De plus, grâce au procédé de l'invention, les extraits obtenus à partir des différentes fractions enrichies à l'étape a) peuvent être préparés facilement, à l'aide de procédés d'extraction simples et peu coûteux, qui réduisent, ou même ne nécessitent pas, le recours à des solvants ou à des réactifs chimiques sélectifs pour certaines substances d'intérêt, mais qui seraient incompatibles avec la réglementation régissant la mise sur le marché de produits alimentaires ou cosmétiques.
De plus, grâce au procédé de l'invention, on peut préparer des extraits d'intérêt industriel, par exemple des extraits riches en polyphénols, à partir des seules coques de pépins, après décorticage des pépins, ce qui évite d'extraire simultanément divers composés indésirables ou toxiques contenus dans l'amande des pépins, tels que l'amygdaline.
Comme cela apparaît clairement, le procédé selon l'invention permet, à l'étape a), de réaliser efficacement le fractionnement physique de la matière première de départ, de préférence un marc de fruit à pépins, afin de réaliser l'étape b) d'extraction par des procédés d'extraction doux, non dénaturants et compatibles avec la réglementation régissant la mise sur le marché des produits destinés à l'usage humain.
Ainsi, les extraits susceptibles d'être obtenus par le procédé de l'invention sont particulièrement adaptés à une utilisation dans le domaine alimentaire ou cosmétique.
De plus, si le procédé ci-dessus est mis en œuvre en utilisant du marc de fruits à pépins comme matière première de départ, notamment un marc préalablement séché, la matière première est alors appauvrie en certains polyphénols tels que les procyanidines et les acides hydroxycinnamiques, et donc proportionnellement plus riches en autres polyphénols d'intérêt.
On a montré selon l'invention que les particules végétales de caractéristiques physiques proches, telles que les particules végétales contenues dans un broyât séché de fruits à pépins, ou encore un marc séché de fruits à pépins, en particulier de pommes, notamment de pommes à cidre, pouvaient être efficacement séparées au moins en leurs constituants principaux dérivés respectivement de la peau, de la pulpe et des pépins. On a aussi montré que les pépins pouvaient être efficacement séparés en leurs constituants principaux, respectivement l'amande des pépins et la coque des pépins.
On a montré que la séparation de la matière première sèche de départ sous forme de particules en ses différents constituants principaux peut être réalisée par une combinaison appropriée d'étapes de triage ou de séparation, malgré le peu de différences physiques des divers constituants secs des fruits à pépins.
Préférentiellement, à l'étape a) du procédé, les fractions (i), (ii), (iii), (iii-1 ) et (iii-2) sont obtenues à la suite d'une ou plusieurs étapes de séparation des constituants de la matière de départ selon au moins l'une des caractéristiques suivantes :
- la forme des constituants,
- les propriétés d'adhésion des constituants sur un support,
- la taille des constituants,
- la densité des constituants, ou une combinaison de plusieurs des caractéristiques ci-dessus.
Pour séparer les particules de la matière première à l'état sec selon la forme de ses constituants, on peut par exemple utiliser un dispositif du type de ceux décrits dans les brevets américains n° US 1 ,030,042 ou n° US 1 ,190,926. Le brevet n° US 1 ,030,042 décrit un dispositif de séparation de particules selon la forme desdites particules qui comprend une goulotte munie d'un disque rotatif en son milieu, qui est dans ce brevet appliqué à la séparation des particules de différents minerais. Le charbon de forme plus ou moins sphérique est facilement séparé des fragments de schiste ardoisier plus ou moins plats. Le charbon de forme sphérique tombe facilement dans la goulotte alors que la roche plate s'accumule sur le disque et est évacuée. Le brevet N° US 1 ,190,926 décrit un dispositif du même type mais dépourvu de goulotte. Le mélange est directement placé sur un disque rotatif incliné. Le charbon continu à descendre dans sa direction initiale. Par contre, la roche plate s'accumule sur le disque.
Pour séparer les particules de la matière première à l'état sec selon la forme de ses constituants, on peut aussi utiliser un dispositif du type de ceux décrits dans les brevets américains n° US 4,059,189, n° US 3,485,360 ou n° US 1 ,744,967. uniquement sur la forme des particules. Le brevet n° US 4,059,189 présente une méthode de séparation de particules de composition identique mais de formes différentes. La séparation est basée sur le degré de sphéricité des particules tel qu'il est mis en évidence par leurs différences de coefficient de frottement par roulement ou par glissement. Le brevet n° US 3,485,360 est basé sur le même principe. Il consiste en un disque rotatif alimenté avec un mélange de particules de composition identique soit sphériques, soit non sphériques. Les particules sphériques roulent hors du disque tandis que les irrégulières sont enlevées de force de la surface du disque. Le brevet n° US 1 ,744,967 est basé sur la différence de friction obtenue en augmentant la force gravitationnelle par application d'une force électrostatique. Ce procédé tire parti du fait que des particules plates créent un champ électrostatique plus puissant que celui créé par des particules sphériques.
A l'étape a) du procédé selon l'invention, on peut aussi utiliser la technique décrite dans le brevet français FR 2 635 475. Ce brevet français décrit un appareil pour séparer les différents constituants d'un mélange de particules discrètes. L'appareil comprend des dispositifs de transfert et de répartition du mélange sur un disque rotatif sur lequel il glisse. Les différents constituants peuvent ainsi être collectés à des emplacements radiaux différents. La séparation s'effectue en fonction des conditions de frottement des particules.
Dans le procédé selon la présente invention on peut utiliser tout résidu séché de l'industrie fruitière et renfermant une partie ou l'ensemble des organes du fruit : peaux, pulpe, pépins, queues, trognons. De préférence, on utilise les co-produits de l'industrie cidricole.
En général, dans l'industrie du jus de pomme, on utilise les écarts de triage des pommes de table. Ces pommes de table sont souvent dans un état de maturation avancé et fournissent des pulpes beaucoup plus écrasées, molles, pâteuses et difficiles à traiter sur les presses industrielles sans adjuvant. De plus, les pépins sont généralement concassés et mélangés à la pulpe.
A l'inverse, les variétés de pommes à cidre ont des structures beaucoup plus fermes et donnent des marcs formés de particules bien différenciées de tailles variables avec des pépins généralement intacts.
De préférence, la matière première de départ est une matière sèche sous forme d'un ensemble hétérogène de particules, qui est obtenue à partir des fruits à pépins entiers ou qui est obtenue à partir des résidus de pressage des fruits à pépins.
La matière sèche de départ peut consister en un résidu sec de fruits à pépins broyés ou concassés.
Ainsi, la matière première de départ peut consister en un marc séché, c'est à dire un résidu sec issu du pressage de fruits à pépins destiné à l'obtention de jus de fruit.
La matière première de départ peut avantageusement consister en un marc séché de pommes destinées à la consommation humaine ou en un marc séché de pommes à cidre.
Dans le cas d'un marc de pomme séché, la matière première de départ consiste en un ensemble de particules sèches ayant des formes et des tailles variées et des densités similaires.
L'étape a) ci-dessus est particulièrement avantageuse lorsque la matière première de départ, préférentiellement un marc de fruits à pépins, est sous forme sèche et consiste en un ensemble de particules sèches.
L'étape a) ci-dessus est particulièrement avantageuse lorsque la matière première de départ est un marc séché obtenu à partir de résidus de fabrication de jus de pomme ou de cidre.
En effet, contrairement aux constituants d'autres fruits à pépins, tels que le raisin, les constituants de la pomme sont difficiles à séparer. Par exemple, le marc de raisin comprend des constituants qui se différencient facilement par leur taille, leur forme et leur densité, ce qui n'est pas le cas des constituants contenus dans le marc de pomme. A titre illustratif, les pépins de raisin peuvent être séparés des autres constituants du marc de raisin par simple flottaison, ce qui n'est pas possible avec le marc de pomme.
Ainsi, le marc de raisin renferme essentiellement les pellicules (peaux), les rafles et les pépins. Dans le marc de raisin, on ne retrouve pas de morceaux de pulpes bien différenciés, de différentes tailles et densités, qui restent intacts et compliquent la séparation. Les pépins de raisin sont très petits et légers. Ils peuvent donc facilement flotter à la surface d'un liquide comme l'eau. A l'inverse, les peaux et rafles de raisin (morceaux plus gros et plus denses) décantent par gravité vers le fond du liquide. Ainsi, il est aisé de disperser du marc de raisin dans de l'eau et d'utiliser un système de raclage en surface pour récupérer les pépins.
Contrairement au marc de raisin, le marc de pomme est beaucoup plus hétérogène. On y trouve notamment des pépins beaucoup plus volumineux et plus lourds que ceux du raisin. De plus, le marc de pomme comprend des morceaux de pulpes de différentes tailles, dont certains ont la même taille et une densité très proche de celle des pépins. Ainsi, lorsque du marc de pomme est dispersé dans de l'eau, on constate que les pépins et une bonne partie des pulpes et peaux décantent au fond. Cela rend difficile, voire impossible, la séparation des pépins de pomme par le simple phénomène de flottement (flottation) en surface.
Le procédé selon l'invention exploite avantageusement les légères différences de forme, de densité et de taille.
Les mélanges de particules qui constituent la matière première de départ sont d'abord soumis à des opérations de triage par tamisages successifs, sélections sur flux d'air ou toute autre opération permettant d'obtenir des groupes de particules plus homogènes en termes de densité et de taille.
Les particules présentes dans ces fractions homogènes sont ensuite séparées individuellement par l'une ou l'autre des technologies appropriées permettant d'atteindre efficacement ces objectifs. Par exemple, les particules relativement homogènes peuvent être mises en contact avec une surface sur laquelle les constituants présentent des différences de mouvement. La dite surface sur laquelle les matières sont séparées peut constituer une partie de l'appareil dans lequel des mouvements vibratoires combinés à des angles d'inclinaison sont appliqués aux matières de façon à provoquer des différences de déplacement liées à la forme, la densité et la texture de surface. Cet appareil peut présenter n'importe quelle configuration appropriée permettant de reproduire de tels effets de séparation. A titre indicatif mais non limitatif, l'appareil peut comprendre des plateaux vibrants, des cylindres vibrants et/ou rotatifs, des tables vibrantes, des systèmes d'aspiration, des suceuses ou encore des souffleuses.
Pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention, on utilise avantageusement un système qui comprend (i) des moyens pour amener les matières à séparer sur le dispositif de séparation, (ii) des moyens pour transporter les matières en cours de fractionnement entre les différents éléments du dispositif de séparation, (iii) des moyens pour appliquer les forces destinées à provoquer les mouvements des matières entre les appareils et dans les appareils ainsi que (iv) des moyens pour collecter les particules séparées.
De façon plus détaillée, dans un mode de réalisation particulier d'un système de séparation selon la présente invention, la matière première de départ à séparer est introduite au moyen d'un système d'alimentation. Dans ce système d'alimentation, le marc sec ou tout autre mélange de particules végétales de fruits à pépins est introduit à partir d'une trémie sur un dispositif vibrant de tamisage à trois étages. Ce premier criblage permet d'obtenir trois fractions.
Dans le cas du marc de pomme séché, on obtient une fraction supérieure constituée essentiellement de gros morceaux de peaux, une fraction intermédiaire formée des particules de taille moyenne et enrichie en pépins de pomme, une troisième fraction inférieure constituée de pulpe fine.
La fraction intermédiaire préalablement enrichie en pépins est passée dans un sélecteur à flux d'air de type Tarare conique ou tout autre appareil permettant l'opération d'élimination des éléments de même taille que les pépins mais de densité plus faible. Cette étape sert essentiellement à séparer les peaux de même taille que les pépins.
La fraction ainsi doublement enrichie en pépins peut subir une étape supplémentaire de triage afin d'obtenir une fraction hautement enrichie. Cette dernière opération peut être réalisée sur une table densimétrique ou tout autre dispositif de séparation/triage/sélection permettant d'atteindre cet objectif, c'est-à-dire obtenir des déplacements différents entre pépins et particules de pulpe de même taille et de densité très proche.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, l'étape a) comprend l'étape suivante : ai ) séparation de trois fractions par tamisage avec double tamis de, respectivement :
- une fraction enrichie en peaux ;
- une fraction enrichie en pulpe ;
- une fraction enrichie en pépins
A l'étape ai ), on utilise préférentiellement un premier tamis ayant une ouverture de maille de 3,5 mm et un second tamis ayant une ouverture de maille de 5 mm. On obtient ainsi, à la fin de l'étape ai ), respectivement (i) une fraction (F1 ) ayant une taille de particules supérieure à 5 mm qui est essentiellement constituée de peaux, (ii) une fraction (F2) ayant une taille de particules inférieure à 3,5 mm qui est essentiellement constituée de pulpe et (iii) une fraction (F3) ayant une taille de particules comprise entre 3,5 mm et 5 mm qui comprend les pépins, mélangés à des particules de pulpe et de peaux de même taille.
A l'étape ai ) on utilise avantageusement un tamiseur vibrant classique à deux étages équipé de deux tamis, par exemple un tamiseur vibrant commercialisé par la Société SWECO (Belgique).
A titre illustratif, lorsque du marc sec de pomme, en particulier de pomme à cidre, est utilisé comme matière première de départ, on obtient environ 200 kg de fraction (F1 ), environ 600 kg de fraction (F2) et environ 200 kg de fraction (F3), en partant de 1000 kg de matière première.
Avantageusement, la fraction (F3) enrichie en pépins, qui comprend aussi des particules de pulpe et de peau peut être soumise à une étape additionnelle de séparation afin d'obtenir une fraction (F5) encore plus riche en particules de pépins, et une fraction (F4) comprenant essentiellement des particules de pulpe et de peaux.
Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention, la fraction enrichie en pépins obtenue à la fin de l'étape ai ) est soumise à l'étape de séparation additionnelle suivante : a1a) séparation des constituants selon leur densité, pour obtenir les fractions suivantes :
- une fraction enrichie en pépins,
- une fraction enrichie en peaux et pulpe.
L'étape de séparation a1a) peut être réalisée à l'aide d'un dispositif de séparation consistant en une table densimétrique à flux d'air conventionnelle, par exemple une table densimétrique commercialisée par la Société SDE (France) une table densimétrique commercialisée par la Société Vauche (France).
L'étape de séparation a1a) peut aussi être réalisée à l'aide d'un dispositif de séparation consistant en un séparateur à flux d'air conique d'un type Tarare classique, par exemple un séparateur à flux d'air de marque FAVINI® commercialisé par la Société Guillot Process (France).
L'étape de séparation a1a) peut aussi être réalisée à l'aide d'un dispositif de séparation consistant en un séparateur à flux d'air conventionnel, par exemple un séparateur à flux d'air commercialisé par la Société Alpine (France), y compris un modèle de type Zig-Zag® commercialisé par la Société Alpine.
En général, la fraction (F5) enrichie en pépins obtenue à la fin de l'étape a1a) du procédé comprend au moins 60% en poids de pépins, de préférence au moins 65% en poids de pépins, par rapport au poids total de ladite fraction.
A titre illustratif, lorsque du marc sec de pomme, en particulier de pomme à cidre, est utilisé comme matière première de départ, on obtient environ 160 kg de fraction (F4) et environ 40 kg de fraction (F5), à partir de 200 kg de fraction (F3).
Avantageusement, la fraction (F5) enrichie en pépins peut-être encore plus enrichie en pépins par l'ajout d'une étape de séparation supplémentaire qui suit l'étape a1a), afin d'obtenir une fraction (F6) comprenant essentiellement des pépins et une fraction (F7) comprenant essentiellement des particules de peaux et de pulpe.
Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention, l'étape a1a) est suivie d'une étape additionnelle a1a1 ) de séparation des constituants selon leur densité, afin d'obtenir :
- une fraction enrichie en pépins,
- une fraction enrichie en pulpe.
L'étape a1a1 ) est avantageusement réalisée à l'aide de tout dispositif de séparation de particules par densimétrie.
L'étape a1a1 ) peut ainsi être réalisée à l'aide d'une table densimétrique d'un type connu.
On peut aussi réaliser l'étape a1a1 ) à l'aide d'un dispositif séparateur du type sélecteur à flux d'air commercialisé par la Société Alpine (France), y compris un modèle de type Zig-Zag® commercialisé par la Société Alpine.
En général, la fraction (F6) enrichie en pépins obtenue à la fin de l'étape a1a) du procédé comprend au moins 80% en poids de pépins, de préférence au moins 85% en poids de pépins, par rapport au poids total de ladite fraction enrichie en pépins.
En général, la fraction (F7) enrichie en particules de peaux et de pulpe comprend moins de 10% en poids de pépins, de préférence moins de 5% en poids de pépins, par rapport au poids total de ladite fraction.
A titre illustratif, lorsque du marc sec de pomme, en particulier de pomme à cidre, est utilisé comme matière première de départ, on obtient environ 30 kg de fraction (F6) et environ 80 kg de fraction (F7) à partir de 110 kg de fraction (F5).
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention, l'une quelconque des fractions enrichies en pépins obtenues à la fin de l'une quelconque des étapes ai ), a1a) et a1a1 ) peut être soumise à une étape supplémentaire au cours de laquelle les pépins sont décortiqués afin de séparer les amandes de pépins et les coques de pépins.
Préférentiellement, l'étape de séparation des amandes de pépins et des coques de pépins est réalisée sur une fraction substantiellement enrichie en pépins, et de manière tout à fait préférée sur la fraction enrichie en pépins obtenue à la fin de l'étape a1a1 ) du procédé, qui a été désignée fraction (F6) ci-dessus.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, que la fraction riche en pépins est soumise à une étape de séparation en les deux fractions suivantes :
- une fraction enrichie en amandes de pépins,
- une fraction enrichie en coques de pépins.
De préférence, l'étape de séparation en une fraction enrichie en amandes de pépins et en une fraction enrichie en coques de pépins est réalisée selon les étapes suivantes :
- décorticage des pépins,
- tamisage des pépins décortiqués, pour éliminer les fines,
- séparation des amandes et des coques.
Le décorticage des pépins peut être réalisé avec un dispositif du type broyeur à marteaux, par exemple un broyeur à marteaux commercialisé par la Société ELECTRA (France).
La séparation des coques et des amandes peut être réalisée avec un dispositif du type sélecteur à flux d'air, par exemple un tarare conique de marque Favini® commercialisé par la Société GUILLOT PROCESS (France) ou un sélecteur Zig-Zag® commercialisé par la Société ALPINE (France).
A la fin de cette étape de séparation, on obtient une fraction (F8) enrichie en amandes de pépins et une fraction (F9) enrichie en coques de pépins.
La chambre de broyage du broyeur à marteaux peut être équipée d'un tamis ayant une taille de maille adaptée. A titre illustratif, on utilise avantageusement un tamis ayant une taille de maille de 3,5 mm, ce qui permet de retenir les pépins entiers non décortiqués.
Le décorticage des pépins peut aussi être réalisé à l'aide d'un dispositif décortiqueur à double cylindre d'un type connu, par exemple un dispositif décortiqueur à double cylindre commercialisé par la Société Colombini (Italie).
De préférence, on adapte la distance d'écartement entre les deux cylindres du dispositif de manière à permettre la dissociation des coques et des amandes sans générer de poudre fine. Le décorticage des pépins peut aussi être réalisé à l'aide d'un dispositif décortiqueur et séparateur commercialisé par la société Electra (France), ou de la marque FAVINI commercialisé par la Société Guillot Process (France).
Pour le tamisage, on utilise un dispositif à tamis, par exemple un tamiseur vibrant, ayant une taille de maille adaptée. A titre illustratif, on peut utiliser un tamis ayant une taille de maille de 0,4 mm, ce qui permet de retenir les particules grossières et d'éliminer les fines.
A titre illustratif, lorsque du marc sec de pomme, en particulier de pomme à cidre, est utilisé comme matière première de départ, on obtient à l'issue du décorticage environ 27,5 kg de particules grossières comprenant les amandes et les coques et 2,5 kg de fines, en partant de 30 kg de fraction enrichie en pépins, par exemple en partant de 30 kg de la fraction (F7) enrichie en pépins.
A titre illustratif, lorsque du marc sec de pomme, en particulier de pomme à cidre, est utilisé comme matière première de départ, on obtient à l'issue de l'étape de tamisage environ 21 ,5 kg d'une fraction (F8) enrichie en amandes de pépins et environ 6 kg d'une fraction (F9) enrichie en coques de pépins, en partant de 27,5 kg d'une fraction de particules grossières obtenues après décorticage, tamisage et élimination des fines.
Comme cela a déjà été mentionné précédemment dans la présente description, on prépare, à l'étape b) du procédé de l'invention, à partir d'au moins l'une des fractions (i) enrichie en peaux, (ii) enrichie en pulpe, (iii) enrichie en pépins entiers, (iii-1 ) enrichie en amandes de pépins et (iii-2) enrichie en coques de pépins, qui ont été obtenues à l'étape a), un extrait enrichi en une ou plusieurs substances végétales d'intérêt contenue(s) dans au moins l'une desdites fractions, par extraction de la dite ou lesdites substances à partir de ladite ou lesdites fraction(s). Les substances végétales d'intérêt contenues dans au moins l'une desdites fractions englobent les polyphénols, les cires, les sucres, les huiles ou encore les acides gras.
Les polyphénols sont des métabolites secondaires des végétaux manifestant de nombreuses propriétés biologiques dont les activités antitumorales, anti-inflammatoires, anti-vieillissements, anti-oxydantes, anti- allergiques, anti-bactériennes. En plus des propriétés propres aux polyphénols en général, on sait que les dihydrochalcones et notamment la phloridzine spécifique aux rosaceae manifestent des propriétés biologiques similaires à celles des isoflavones de soja. La phloridzine manifeste également une bonne activité anti-diabétique en inhibant de façon compétitive le transport transmembranaire sodium-dépendant des sucres. De même, cette molécule peut bloquer la croissance de cellules tumorales par inhibition de l'activité protéine-kinase C. La phloridzine a aussi une influence sur la mélanogénèse grâce à son utilisation comme substrat par tyrosinase. La résultante de cette dernière action est une meilleure protection contre les rayonnements UV.
A l'étape b), l'extraction des polyphénols peut être réalisée à l'aide de tout procédé d'extraction des polyphénols connu par l'homme du métier, en particulier les techniques d'extraction des polyphénols par chromatographie, par exemple par purification sur des résines adsorbantes, telles que celles décrites dans la demande de brevet européen n° EP-657 169 ou encore dans les brevets américains n° US 6,238,673 et n° US 6,620,452. L'homme du métier peut aussi se référer aux procédés d'extraction des polyphénols décrits par Lu et Foo (1997, Food Chemistry, vol. 59 : 187-194), Foo et Lu (1998, Food Chemistry, vol. 64: 511-518) ou encore par Schieber et al. (2003, Innovative Food Science and Emerging Technologies, vol. 4: 99-107).
Pour purifier les polyphénols, on utilise de préférence des résines de type styrène-divinylbenzène ou de type polyvinylpyrrolidone.
Selon un aspect important de la présente invention, les diverses fractions obtenues à l'étape a) du procédé sont utilisées comme matières de départ pour obtenir des extraits polyphénoliques riches en procyanidols, quercétine ou phloridzine. Les amandes sont facilement utilisables pour extraire de l'huile par les procédés classiques de pressage à froid ou d'extraction par solvant de type hexane. L'huile peut ensuite subir différentes opérations de raffinage. En plus de l'extraction des polyphénols, les peaux servent également de substrat pour l'obtention de cires brutes ou de concentrés d'acide ursolique.
A l'étape b) du procédé selon l'invention, les polyphénols, les cires ou l'acide ursolique sont extraits des différentes fractions de marc par la mise en œuvre de solvants. Les solvants utilisés peuvent être l'eau, l'éthanol, le méthanol, l'acétone ou l'isopropanol. On utilise de préférence l'eau et/ou l'éthanol agricole parce que ce dernier est compatible avec une utilisation alimentaire. Dans le but d'obtenir des extraits compatibles avec la réglementation régissant la mise sur le marché des ingrédients alimentaires et cosmétiques, on utilise de préférence de l'eau comme solvant d'extraction. L'eau est le solvant le plus utilisé dans les technologies alimentaires traditionnelles, y compris pour la cuisson, la décoction, la diffusion ou encore l'infusion. Les rendements faibles des étapes d'extraction à l'eau sont compensés par la préservation des qualités, la naturalité, la préservation des rapports qualitatifs et quantitatifs des substances présentes dans les technologies traditionnelles à l'eau et la bonne acceptabilité des extraits de ce type par le consommateur. L'utilisation de l'eau permet aussi de réduire le coût de l'alcool. Les extraits liquides obtenus sont clarifiés par filtration, centrifugation, décantation ou tout autre moyen technique permettant d'atteindre cet objectif. Les polymères saccharidiques et protéiniques présents dans le liquide clarifié sont ensuite éliminés par tout moyen de traitement physique de filtration, microfiltration, ultrafiltration, de précipitation/floculation ou de traitement enzymatique permettant d'atteindre cet objectif.
De préférence, à l'étape b) du procédé selon l'invention, on utilise les procédés non dénaturants comprenant une étape de filtration, une étape de microfiltration, une étape d'ultrafiltration, ou encore une combinaison de telles étapes, ou une ou plusieurs étapes de traitement enzymatique permettant d'éliminer les polymères tout en préservant les qualités naturelles des polyphénols. De préférence on utilise les techniques de filtration/ultrafiltration, car selon la législation de certains pays, notamment la France, l'utilisation d'une préparation enzymatique dans un nouveau procédé nécessite l'obtention d'une autorisation spécifique à cette application. Suivant le procédé classique largement utilisé pour la purification de molécules aromatiques, la phase liquide limpide débarrassée de ses polymères de haut poids moléculaire est passée sur un support adsorbant qui retient les polyphénols. Après lavage à l'eau ou à l'eau acidulée pour éliminer les éléments indésirables (sucres, minéraux, acides organiques...), les polyphénols sont élues avec une solution éthanolique de 40 à 75% (poids/poids). De préférence, on utilise de l'alcool agricole à 70-75% (poids/poids) pour conserver la naturalité des extraits. L'éluat alcoolique est distillé et les substances végétales d'intérêt retenues dans la phase aqueuse sont concentrées puis séchées par toute technique connue, y compris par lyophilisation, par atomisation ou par tout autre procédé de séchage permettant d'obtenir une poudre sans dénaturer les substances végétales d'intérêt.
Une originalité du procédé selon la présente invention est que l'étape a) de séparation ou de triage à sec du marc de pomme constitue l'étape essentielle permettant d'influencer de façon déterminante le profil qualitatif et quantitatif en substances végétales d'intérêt contenues dans les produits finals. En effet, dans certains modes de réalisation particulier du procédé dans lesquels l'étape b) consiste en une extraction des polyphénols par chromatographie, l'étape b) de chromatographie sur support adsorbant a pour seul objectif d'obtenir un extrait riche en polyphénols totaux. C'est-à-dire que cette étape revient à une simple opération de désucrage des extraits. En aucun cas, il ne s'agit d'user de ce moyen pour favoriser la concentration en un groupe polyphénolique par rapport à un autre. Le fait de procéder à un fractionnement préalable à sec du marc de pomme et de partir d'une matière première constituée de pulpe, peaux ou de pépins, de faire un décorticage/séparation des coques des derniers permet d'obtenir des extraits soit équilibrés en polyphénols, soit hautement enrichis en quercétine, soit renfermant 70 à 90% de phloridzine par rapport aux polyphénols totaux, soit riches en cires ou acide ursolique.
Selon un premier mode de réalisation de l'étape b), on extrait les polyphénols à partir de l'une des fractions suivantes obtenues à l'étape a) :
- une fraction de matière enrichie en peaux,
- une fraction de matière enrichie en pulpe,
- une fraction de matière enrichie en pépins,
- une fraction de matière enrichie en coques de pépins.
Selon un second mode de réalisation de l'étape b), on extrait de l'huile à partir de l'une des fractions suivantes : - la fraction enrichie en pépins,
- la fraction enrichie en amandes de pépins.
Selon un troisième mode de réalisation de l'étape b), on prépare de la cire à partir de la fraction enrichie en peaux.
Ainsi, à l'étape b) du procédé selon l'invention, on peut préparer un extrait enrichi en polyphénols à partir de la fraction (ii) enrichie en pulpe. On peut utiliser comme matière de départ la fraction (F2) enrichie en pulpe décrite précédemment dans la présente description.
A l'étape b), les polyphénols peuvent être obtenus selon un procédé comprenant les étapes suivantes : b1 ) au moins une étape d'extraction à l'eau chaude puis récupération du liquide d'extraction ; b2) à partir du liquide d'extraction, séparation de la fraction liquide comprenant les polyphénols de la fraction solide comprenant des colloïdes de protéines et de polysaccharides ; b3) passage de la fraction liquide sur un support de résine adsorbante retenant les polyphénols ; b4) élution des polyphénols immobilisés sur le support de résine adsorbante ; b5) concentration de l'éluat afin d'obtenir une fraction liquide concentrée enrichie en polyphénols ; b6) facultativement, séchage de la fraction concentrée obtenue à la fin de l'étape b5).
A l'étape b1 ) l'eau chaude utilisée pour l'extraction est avantageusement à une température allant de 500C à 900C, de préférence de 60°C à 800C et mieux d'environ 70°C.
A l'étape b1 ) la quantité d'eau chaude utilisée est fixée dans un rapport en poids fraction sèche / eau allant de 6% à 10%, et mieux d'environ 8%.
A l'étape b1 ) on procède à autant d'étapes d'extraction à l'eau qu'il est nécessaire afin de récupérer la presque totalité des polyphénols contenus dans la fraction enrichie en pulpe utilisée comme matière de départ. En général, on procède à un nombre d'étapes d'extraction à l'eau allant de 3 à 10, éventuellement 6. Avantageusement, à l'étape b2), le liquide d'extraction est filtré puis clarifié avant la réalisation de l'étape b3). La clarification est avantageusement réalisée par centrifugation du filtrat.
Puis le surnageant de centrifugation peut être soumis à une étape d'élimination des colloïdes présents dans cette fraction liquide clarifiée, par exemple par ultrafiltration , avantageusement par ultrafiltration avec une membrane filtrante ayant un seuil de coupure de 50 KDa, Les colloïdes sont retenus par la membrane filtrante et constituent le rétentat d'ultrafiltration. Le perméat d'ultrafiltration est une fraction liquide clarifiée comprenant les polyphénols.
Puis, la fraction liquide clarifiée est mise en contact avec le support de résine adsorbante, à l'étape b3) du procédé. On peut utiliser par exemple une résine adsorbante du type XAD commercialisée par la société Rhom and Haas (France).
A l'étape b4), les polyphénols sont élues à l'aide d'une solution d'éthanol, par exemple une solution d'éthanol à 60% (poids/poids).
A l'étape b5), la concentration de l'éluat peut être effectuée par distillation, afin d'obtenir une fraction liquide concentrée enrichie en polyphénols.
A l'étape b6), la fraction liquide concentrée obtenue à la fin de l'étape b5) peut être séchée par toute technique connue de l'homme du métier, tels que par atomisation ou lyophilisation.
Une illustration de l'étape b) ci-dessus fait l'objet de l'exemple 7. Par analyse colorimétrique par la technique de Folin-Ciaucalteu, et en utilsant la catéchine comme composé étalon, on a déterminé que la poudre finale comprend 41 % en poids de polyphénols, par rapport au poids total de ladite poudre. Par thiolyse, suivie d'une étape de chromatographie HPLC, on a déterminé que la poudre finale comprend : - 15% en poids de flavanols (catéchines et polymères procyanidiques)
- 5% en poids de quercétines
- 7% en poids d'acides hydroxicinnamiques (chlorogéniques)
- 5% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ladite poudre.
Egalement, à l'étape b) du procédé selon l'invention, on peut préparer un extrait enrichi en polyphénols à partir de la fraction (i) enrichie en pulpe. On peut utiliser comme matière de départ la fraction (F1 ) ou la fraction (F5) enrichie en pulpe décrite précédemment dans la présente description.
Le procédé d'extraction des polyphénols à partir d'une fraction enrichie en pulpe comprend des étapes identiques au procédé ci-dessus où l'on utilise une fraction enrichie en peaux, comme matière de départ. Toutefois, pour le traitement de la fraction enrichie en pulpe, l'étape b1 ) est avantageusement mise en œuvre avec une quantité d'eau chaude qui est fixée dans un rapport en poids fraction sèche / eau allant de 3% à 5%, et mieux d'environ 4%.
Une illustration de l'étape b) ci-dessus fait l'objet de l'exemple 8. Par analyse colorimétrique par la technique de Folin-Ciaucalteu, et en utilisant la catéchine comme composé étalon, on a déterminé que la poudre finale comprend 25% en poids de polyphénols, par rapport au poids total de ladite poudre. Par thiolyse, suivie d'une étape de chromatographie HPLC, on a déterminé que la poudre finale comprend :
- 6,8% en poids de phloridzine - 10% en poids de quercétine
- 3,4% en poids de flavanes
- 2% en poids d'hydroxicinnamiques, par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ladite poudre.
Egalement, à l'étape b) du procédé, on peut préparer une huile de pépins de pomme ou encore un extrait enrichi en polyphénols, à partir d'une fraction (iii) enrichie en pépins entiers obtenue à l'étape a) du procédé.
A l'étape b) du procédé, on peut utiliser par exemple une fraction (iii) enrichie en pépins entiers telle que la fraction (F3), la fraction (F5) ou la fraction (F6) qui sont décrites précédemment dans la présente description. De préférence, on utilise la fraction (F7) enrichie en pépins entiers.
Dans ce mode de réalisation particulier de l'étape b) du procédé, cette étape b) comprend les étapes suivantes : b1 ) obtention d'une poudre fine à partir de la fraction enrichie en pépins entiers, de préférence par broyage et tamisage ; b2) mise en suspension de la poudre dans un solvant d'extraction, de préférence l'hexane. b3) la suspension est filtrée sur un tamis ayant une taille de maille allant de 50 μm à 100 μm, de préférence environ 75 μm et on récupère (i) le filtrat qui est un extrait filtré et (ii) le rétentat qui est un résidu solide d'extraction.. b4) l'extrait filtré obtenu à la fin de l'étape b3) est centrifugé pour éliminer les particules insolubles, afin d'obtenir une fraction liquide clarifiée ; b5) la fraction liquide clarifiée est distillée afin d'éliminer l'hexane et obtenir une fraction liquide d'huile de pépins. b6) le résidu solide d'extraction obtenu à la fin de l'étape b3), qui est une poudre sèche déshuilée, est soumis à une étape d'extraction à l'éthanol afin d'obtenir une fraction liquide d'extraction ; b7) la fraction liquide d'extraction obtenue à la fin de l'étape b6) est filtrée et on récupère le filtrat. b8) le filtrat est clarifié, par exemple par centrifugation puis distillé pour éliminer l'éthanol, afin d'obtenir une fraction d'extrait aqueux comprenant une faible proportion de matière sèche. b9) la fraction d'extrait aqueux obtenue à la fin de l'étape b8) est mise en contact avec un support de résine adsorbant les polyphénols ; b10) les polyphénols retenus sur le support de résine sont élues, de préférence avec une solution d'éthanol. b11) l'éluat est concentré. b12) le cas échéant l'éluat est ensuite séché, par exemple par lyophylisation.
De préférence, à l'étape b1 ), le tamisage est réalisé avec un tamis ayant une taille de maille inférieure à 500 μm. Préférentiellement on utilise un tamis ayant une taille de maille d'environ 100 μm.
A l'étape b2), lorsque l'hexane est mis en œuvre, on utilise l'hexane dans un rapport en poids poudre / hexane allant de 5% à 15%, de préférence environ 10%. A l'étape b2) la suspension est de préférence agitée pendant une durée comprise entre 30 minutes et 2 heures, de préférence environ 1 heure. Eventuellement, le rétentat de filtration est à nouveau incubé avec de l'hexane afin de poursuivre l'extraction. Le procédé peut comprendre un nombre de cycles d'étape b2) puis b3) allant de 2 à 5, de préférence 3.
A l'étape b6) on utilise avantageusement un rapport en poids résidu solide / éthanol allant de 5% à 15%, de préférence environ 10%.
Classiquement, à l'étape b8), la matière sèche contenue dans la fraction d'extrait aqueux n'excède pas 10% en poids, et le plus souvent n'excède pas 4% en poids, par rapport au poids total de ladite fraction d'extrait aqueux.
A l'étape b10), on utilise avantageusement une solution d'éthanol à 70% en poids d'éthanol, par rapport au poids total de la solution d'élution.
Une illustration de l'étape b) ci-dessus fait l'objet de l'exemple 9 Par analyse colorimétrique par la technique de Folin-Ciaucalteu, et en utilisant la catéchine comme composé étalon, on a déterminé que la poudre finale comprend 43% en poids de polyphénols, par rapport au poids total de ladite poudre. Par thiolyse, suivie d'une étape de chromatographie HPLC, on a déterminé que la poudre finale comprend 35% en poids de phloridzine, par rapport au poids total de ladite poudre, soit 81 % en poids de phloridzine, par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ladite poudre.
Egalement, à l'étape b) du procédé, on peut préparer un extrait enrichi en polyphénols, à partir d'une fraction (iii-2) enrichie en coques de pépins obtenue à l'étape a) du procédé.
A l'étape b) du procédé, on peut utiliser par exemple une fraction (iii-2) enrichie en pépins entiers telle que la fraction (F9) qui est décrite précédemment dans la présente description.
Ce mode de réalisation de l'étape b) du procédé est essentiellement identique aux modes de réalisation de l'étape b) permettant l'obtention d'un extrait enrichi en polyphénols à partir d'une fraction (i) enrichie en peaux ou d'une fraction (ii) enrichie en pulpe, qui a été précédemment décrite. Une illustration de l'étape b) ci-dessus fait l'objet de l'exemple 10. Par analyse colorimétrique par la technique de Folin-Ciaucalteu, et en utilsant la catéchine comme composé étalon, on a déterminé que la poudre finale comprend 42% en poids de polyphénols, par rapport au poids total de ladite poudre. Par thiolyse, suivie d'une étape de chromatographie HPLC, on a déterminé que la poudre finale comprend 35% en poids de phloridzine, par rapport au poids total de ladite poudre.
Egalement, à l'étape b) du procédé selon l'invention, on peut préparer une huile vierge de pépins, à partir d'une fraction (iii-1 ) enrichie en amandes de pépins, par exemple à partir de la fraction (F8) décrite précédemment dans la présente description.
Dans ce mode particulier de réalisation de l'étape b) du procédé de l'invention, cette étape b) comprend les étapes suivantes : b1 ) pressage à froid de la fraction enrichie en amandes de pépins, afin d'obtenir une huile brute ; b2) centrifugation de l'huile brute, afin d'obtenir une huile vierge de pépins.
Une illustration de l'étape b) ci-dessus fait l'objet de l'exemple 11. On montre qu'on obtient 1 ,5 kg d'huile vierge à partir de 10 kg d'amandes de pépins.
Egalement, à l'étape b) du procédé selon l'invention, on peut préparer des compositions de cires végétales à partir d'une fraction (i) enrichie en peaux, par exemple à partir de la fraction (F1 ) décrite précédemment dans la présente description.
Selon ce mode de réalisation particulier de l'étape b) du procédé, l'étape b) comprend les étapes suivantes : b1 ) extraction de la fraction enrichie en peaux à l'eau chaude ; b2) à partir du liquide d'extraction, séparation de la fraction liquide comprenant les polyphénols de la fraction solide comprenant des colloïdes de protéines et de polysaccharides ; b3) passage de la fraction liquide sur un support de résine adsorbante retenant les polyphénols ; b4) élution des polyphénols immobilisés sur le support de résine adsorbante ; b5) concentration de l'éluat afin d'obtenir une fraction liquide concentrée enrichie en polyphénols ; b6) facultativement, séchage de la fraction concentrée obtenue à la fin de l'étape b5).
A l'étape b1 ) l'eau chaude est avantageusement à une température allant de 300C à 700C, mieux de 40°C à 600C, de préférence à environ 50°C. A l'étape b1 ) on peut procéder à plusieurs étapes successives d'extraction à l'eau chaude, puis les fractions liquides d'extraction sont réunies pour la suite du procédé.
A l'étape b1 ) la quantité d'eau chaude utilisée est fixée dans un rapport en poids fraction sèche / eau allant de 6% à 10%, et mieux d'environ 8%.
A l'étape b1 ) on procède à autant d'étapes d'extraction à l'eau qu'il est nécessaire afin de récupérer la presque totalité des polyphénols contenus dans la fraction enrichie en pulpe utilisée comme matière de départ. En général, on procède à un nombre d'étapes d'extraction à l'eau allant de 3 à 10, éventuellement 6.
Avantageusement, à l'étape b2), le liquide d'extraction est filtré puis clarifié avant la réalisation de l'étape b3). La clarification est avantageusement réalisée par centrifugation du filtrat.
Puis le surnageant de centrifugation peut être soumis à une étape d'élimination des colloïdes présents dans cette fraction liquide clarifiée, par exemple par ultrafiltration , avantageusement par ultrafiltration avec une membrane filtrante ayant un seuil de coupure de 50 KDa, Les colloïdes sont retenus par la membrane filtrante et constituent le rétentat d'ultrafiltration. Le perméat d'ultrafiltration est une fraction liquide clarifiée comprenant les polyphénols.
Puis, la fraction liquide clarifiée est mise en contact avec le support de résine adsorbante, à l'étape b3) du procédé. On peut utiliser par exemple une résine adsorbante du type XAD commercialisée par la société Rhom and Haas (France).
A l'étape b4), les polyphénols sont élues à l'aide d'une solution d'éthanol, par exemple une solution d'éthanol à 60% (poids/poids). A l'étape b5), la concentration de l'éluat peut être effectuée par distillation, afin d'obtenir une fraction liquide concentrée enrichie en polyphénols.
A l'étape b6), la fraction liquide concentrée obtenue à la fin de l'étape b5) peut être séchée par atomisation.
Une illustration de l'étape b) ci-dessus fait l'objet de l'exemple 12, où on obtient 48 grammes de poudre enrichie en polyphénols à partir de 5 kg de peaux de pomme.
Toujours selon ce mode de réalisation particulier de l'étape b) du procédé, les résidus de peau résultant de l'extraction aqueuse à l'étape b1) peuvent être traités selon un procédé comprenant les étapes suivantes : b10) remise en suspension des résidus de peaux obtenus à la fin de l'étape b1) afin d'obtenir un mélange aqueux hétérogène liquide/solide ; b11 ) incuber le mélange aqueux hétérogène liquide/solide obtenu à la fin de l'étape b10) avec une ou plusieurs enzymes digérant les parois cellulaires végétales, et récupérer la fraction solide résiduelle. b12) réaliser un ou plusieurs lavages de la fraction solide résiduelle obtenue à la fin de l'étape b11 ) ; b13) réaliser un séchage de la fraction solide résiduelle obtenue à la fin de l'étape b12). b14) broyage de la fraction solide sèche obtenue à la fin de l'étape b13) afin d'obtenir une poudre. ;
A l'étape b10) la remise en suspension est avantageusement réalisée dans de l'eau chaude, préférentiellement à une température allant de 300C à 600C, mieux allant de 40°C à 500C, de préférence à environ 45°C.
A l'étape b11) on utilise avantageusement une ou plusieurs cellulases ou pectinases, telles que les cellulases et/ou les pectinases commercialisées par les Sociétés NOVOZYMES (Danemark), LYVEN (France) ou SPINDAL (France)..
Avantageusement, on incube le mélange aqueux hétérogène liquide/solide avec l'enzyme ou les enzymes, à l'étape b11 ), pendant une durée allant de 1 heure à 10 heures, mieux de 3 heures à 6 heures, de préférence environ 4 heures.
A l'étape b11 ) on récupère la fraction solide résiduelle par filtration, puis récupération du rétentat filtration.
A la fin de l'étape b11), le rétentat de filtration est essentiellement constitué des structures cuticulaires de la pomme, puisque les structures des parois cellulaires ont été digérées par la ou les enzyme(s).
L'étape b12), qui peut comprendre de 1 à 5 lavages successifs, de préférence à l'eau, vise à éliminer tous les éléments solubilisés ainsi que les fines particules ligno-cellulosiques qui sont indésirables.
A l'étape b13) la fraction solide résiduelle peut être séchée dans une étuve ventilée, par exemple à une température allant de 300C à 500C, de préférence environ 40°C.
A l'étape b14), lorsque l'étape b) est réalisée à partir d'une fraction enrichie en peaux de pomme, on obtient une poudre légère de couleur grise à blanc cassé.
L'étape b14) peut être suivie des étapes suivantes : b15) remise en suspension de la poudre obtenue à la fin de l'étape b14) dans une huile végétale, afin de donner un liquide de consistance crémeuse.
Le liquide de consistance crémeuse obtenu à la fin de l'étape b15) peut être utilisé pour la préparation de compositions cosmétiques, notamment comme source de cires végétales ou encore de substances végétales d'intérêt présentes dans les cires, tel que l'acide ursolique.
Egalement, à l'étape b) du procédé selon l'invention, on peut préparer d'autres compositions de cires végétales à partir d'une fraction (i) enrichie en peaux, par exemple à partir de la fraction (F1 ) décrite précédemment dans la présente description.
Selon ce mode de réalisation particulier de l'étape b) du procédé, l'étape b) comprend les étapes suivantes : b1 ) mise en solution et malaxage de la fraction enrichie en peaux dans l'eau chaude ; b2) filtration du liquide hétérogène solide/liquide obtenu à la fin de l'étape b1 ) et récupération (i) du rétentat de filtration et (ii) du perméat de filtration. A l'étape b1 ) le fraction enrichie en peaux est avantageusement mise en solution dans l'eau chaude à une température allant de 300C à 700C, mieux de 40°C à 600C, de préférence à environ 50°C.
A l'étape b1 ) le rapport en poids fraction solide / eau est avantageusement de 5% à 15%, de préférence environ 5%.
A l'étape b1 ) le mélange hétérogène liquide/solide est malaxé lentement de manière continue pendant une durée allant de 2 heures à 20 heures, mieux de 5 heures à 15 heures, de préférence pendant environ 10 heures. A l'étape b1 ) la remise en suspension et le malaxage provoquent la dispersion des couches de pulpe constituées des cellules parenchymateuses localisées sous la cuticule et à solubiliser les polyphénols contenus dans les peaux.
Le rétentat de filtration obtenu à la fin de l'étape b2) peut ensuite être traité selon les étapes suivantes : b10) remise en suspension du rétentat de filtration obtenu à la fin de l'étape b2) ; b11) filtration du liquide obtenu à la fin de l'étape b10) et récupération du filtrat ; b12) clarification du filtrat, par exemple par centrifugation afin d'obtenir une fraction liquide clarifiée ; b13) ultrafiltration de la fraction liquide clarifiée et récupération du perméat d'ultrafiltration ; b14) passage du perméat d'ultrafiltration sur une résine adsorbant les polyphénols ; b15) élution des polyphénols et récupération d'un extrait enrichi en polyphénols.
A l'étape b10) le rétentat de filtration est avantageusement remis en suspension dans de l'eau.
La succession des étapes b10) et b11 ) peut être réitérée plusieurs fois, avantageusement de 2 à 5 fois. Puis les perméats issus de chaque cycle de réitération des étapes b10) et b11 ) sont réunis à la fin de l'étape b11 ) et constituent le filtrat qui est récupéré.
Avantageusement, l'étape b13) d'ultrafiltration est réalisée avec une membrane filtrante ayant un seuil de coupure de 10 KDa. L'extrait enrichi en polyphénols obtenu à la fin de l'étape b15) peut ensuite être concentré et éventuellement séché sous forme de poudre, selon l'une quelconque des techniques de concentration et de séchage d'extraits de polyphénols décrits précédemment dans la présente description.
Le rétentat de filtration obtenu à la fin de l'étape b2), qui est constitué des cuticules des peaux , peut ensuite être traité selon les étapes suivantes : b20) remise en suspension des résidus de peaux obtenus à la fin de l'étape b2) afin d'obtenir un mélange aqueux hétérogène liquide/solide ; b21 ) incuber le mélange aqueux hétérogène liquide/solide obtenu à la fin de l'étape b20) avec une ou plusieurs enzymes digérant les parois cellulaires végétales, et récupérer la fraction solide résiduelle. b22) réaliser un ou plusieurs lavages de la fraction solide résiduelle obtenue à la fin de l'étape b21 ) ; b23) réaliser un séchage de la fraction solide résiduelle obtenue à la fin de l'étape b22). b24) broyage de la fraction solide sèche obtenue à la fin de l'étape b13) afin d'obtenir une poudre. ;
A l'étape b20) la remise en suspension est avantageusement réalisée dans de l'eau chaude, préférentiellement à une température allant de 300C à 600C, mieux allant de 40°C à 500C, de préférence à environ 45°C.
A l'étape b21) on utilise avantageusement une ou plusieurs cellulases ou pectinases, telles que les cellulases et/ou les pectinases commercialisées par les Sociétés NOVOZYMES (Danemark), LYVEN (France) ou SPINDAL (France)
Avantageusement, on incube le mélange aqueux hétérogène liquide/solide avec l'enzyme ou les enzymes, à l'étape b21 ), pendant une durée allant de 1 heure à 10 heures, mieux de 3 heures à 6 heures, de préférence environ 4 heures.
A l'étape b21 ) on récupère la fraction solide résiduelle par filtration, puis récupération du rétentat de filtration. A la fin de l'étape b21), le rétentat de filtration est essentiellement constitué des structures cuticulaires de la pomme, puisque les structures des parois cellulaires ont été digérées par la ou les enzyme(s).
L'étape b22), qui peut comprendre de 1 à 5 lavages successifs, de préférence à l'eau, vise à éliminer tous les éléments solubilisés ainsi que les fines particules ligno-cellulosiques qui sont indésirables.
A l'étape b23) la fraction solide résiduelle peut être séchée dans une étuve ventilée, par exemple à une température allant de 300C à 500C, de préférence environ 40°C.
A l'étape b24), lorsque l'étape b) est réalisée à partir d'une fraction enrichie en peaux de pomme, on obtient une poudre légère de couleur grise à blanc cassé.
L'étape b24) peut être suivie des étapes suivantes : b25) remise en suspension de la poudre obtenue à la fin de l'étape b14) dans une huile végétale, afin de donner un liquide de consistance crémeuse.
Le liquide de consistance crémeuse obtenu à la fin de l'étape b25) peut être utilisé pour la préparation de compositions cosmétiques, notamment comme source de cires végétales ou encore de substances végétales d'intérêt présentes dans les cires, tel que l'acide ursolique.
Le procédé de l'invention, tel que défini de manière générale et dans ses divers modes de réalisation ci-dessus, peut être mis en œuvre à partir de tout fruit à pépins.
Préférentiellement, le procédé de l'invention est réalisé à partir de fruits à pépins choisis parmi les pommes, les coings, les nèfles, les poires, les cormes, les kiwis.
De manière tout à fait préférée, le procédé de l'invention est réalisé à partir de pommes, et encore mieux à partir de pommes à cidre.
Les pommes à cidre sont préférentiellement choisies parmi les variétés couramment exploitées dans l'Ouest de la France, principalement en Normandie et en Bretagne. Fractions et extraits végétaux
La présente invention a aussi pour objet les différentes fractions végétales susceptibles d'être obtenues par la mise en œuvre du procédé décrit ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet une fraction enrichie en pulpe de fruits à pépin caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 60 % en poids de pulpe, et de préférence au moins 80 % en poids de pulpe, par rapport au poids total de ladite fraction.
L'invention concerne aussi une fraction enrichie en peaux de fruits à pépins, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 50 % en poids de peaux, et de préférence au moins 70 % en poids de peaux, par rapport au poids total de ladite fraction.
L'invention est aussi relative à une fraction enrichie en pépins de fruits à pépins, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 50 % en poids de pépins, et de préférence au moins 90 % en poids de pépins, par rapport au poids total de ladite fraction.
L'invention a aussi pour objet une fraction enrichie en coques de pépins de fruits à pépins, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 70 % en poids de coques, et de préférence au moins 90 % en poids de coques, par rapport au poids total de ladite fraction.
L'invention a aussi trait à une fraction enrichie en amandes de pépins de fruits à pépins, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 80% en poids d'amandes, et de préférence au moins 90 % en poids d'amandes, par rapport au poids total de ladite fraction.
La présente invention a aussi pour objet des extraits végétaux susceptibles d'être obtenus à partir d'une ou plusieurs des fractions préparées grâce au procédé de l'invention décrit précédemment dans la présente description.
L'invention concerne aussi un extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en pulpe telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10% en poids de polyphénols totaux, et de préférence au moins 40% en poids de polyphénols totaux, par rapport au poids total dudit extrait.. L'invention est aussi relative à un extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en pulpe du type ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend :
- de 5% à 10% en poids de catéchines et polymères catéchiques (procyanidols)
- de 5% à 15% en poids d'acides hydroxycinnamiques (acide chlorogénique)
- de 5% à 10% en poids de dihydrochalcones (phloridzine).
- de 5% à 15% en poids de flavonols (quercétine), par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ledit extrait.
L'invention a aussi pour objet un extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en peaux telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10% en poids de polyphénols totaux, et de préférence au moins 40% en poids de polyphénols totaux, par rapport au poids total dudit extrait.
L'invention concerne également un extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en peaux du type ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend :
- 5 à 20% en poids de flavonols (quercétine), plus préférentiellement de 15 à 20% de quercétine
- de 5 à 20% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), plus préférentiellement 10 à 20% de phloridzine, par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ledit extrait.
L'invention concerne également un extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en peaux du type ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins 10% en poids de cires brutes, de préférence au moins 50 de cires brutes,
- au moins 5% en poids d'acide ursolique, de préférence au moins 20% d'acide ursolique, par rapport au poids total dudit extrait.
L'invention est également relative à un extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en peaux du type ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins 60% en poids, et de préférence au mois 80% en poids, de fraction de cires ;
- au moins 50% en poids d'acide ursolique, par rapport au poids total dudit extrait.
L'invention concerne aussi un extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en coques à pépins telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10% en poids de polyphénols totaux, préférentiellement au moins 40% en poids de polyphénols totaux, par rapport au poids total dudit extrait.
L'invention a également pour objet un extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en coques à pépins telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 15% en poids, de préférence au moins 35% en poids, de phloridzine, par rapport au poids total dudit extrait.
L'invention est aussi relative à un extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en amandes de pépins de fruits à pépins telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 5% en poids, de préférence au moins 20% en poids d'huile vierge comprenant essentiellement des acides gras insaturés, par rapport au poids total dudit extrait. Un tel extrait est préférentiellement caractérisé en ce que les acides gras insaturés sont essentiellement l'acide linoléique et l'acide oléique
Selon certains modes de réalisation des divers extraits définis ci- dessus, lesdits extraits se présentent sous la forme d'une poudre.
L'invention a aussi pour objet une composition alimentaire, nutraceutique ou diététique, caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait tel que défini dans la présente description.
Par « composition alimentaire, nutraceutique ou diététique », on entend selon l'invention, une composition constituant une composition alimentaire ou encore un supplément alimentaire ne possédant pas les caractéristiques d'un médicament.
Les différentes utilisations d'un extrait selon l'invention pour la fabrication d'une composition alimentaire, nutraceutique ou diététique seront définies ci-après en relation avec les caractéristiques techniques de ladite composition nutritionnelle. Une composition alimentaire, nutraceutique ou diététique selon l'invention est préférentiellement adaptée pour une administration orale.
Selon un premier aspect, une composition alimentaire, nutraceutique ou diététique selon l'invention est un aliment diététique utilisé pour le maintien d'une bonne santé de l'homme ou l'animal qui l'ingère. Une telle composition nutritionnelle est également communément désignée « aliment fonctionnel », lequel est destiné à être consommé, soit comme partie intégrante du régime alimentaire, soit comme supplément alimentaire, mais dont le contenu en extrait selon l'invention implique un rôle physiologique allant au-delà de la fourniture des besoins nutritifs de base.
Une composition alimentaire, nutraceutique ou diététique selon l'invention, est caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait selon l'invention, en tant que composé actif, et se présente sous une grande diversité de formes de compositions alimentaires et de boissons, y compris des jus (de fruits ou de légumes), huiles, beurres, margarines, matières grasses végétales, conserves (par exemple thon à l'huile), soupes, préparations à base de lait (yaourts, fromage blanc), glaces, fromages (par exemple des fromages conservés dans de l'huile), produits cuits (tels que le pain, les biscuits et les gâteaux), desserts, produits de confiserie, barres de céréales, céréales pour le petit déjeuner, condiments, produits d'assaisonnement des aliments (notamment épices et sauces).
De manière générale, une composition alimentaire, nutraceutique ou diététique selon l'invention se présente sous l'une quelconque des formes décrites dans la présente description, et en particulier les aliments à base de matière grasses (beurre, huile, margarine), pain, gâteaux, ou encore de produits alimentaires conservés dans de l'huile, tels que des fromages, des poissons, des viandes, des légumes, des salades) ou encore sous la forme de produit pour l'assaisonnement des aliments, tels que les condiments.
L'invention est aussi relative à une composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait tel que défini dans la présente description. De telles compositions cosmétiques peuvent être préparées par exemple comme décrit dans les demandes de brevet français n° FR 2 822 466 et n° FR 2 799 121.
L'invention a également trait à des substrats pour l'obtention de colorants jaunes naturels et hydrosolubles, caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait tel que défini dans la présente description. Préférentiellement, dans cette application particulière, on utilise un extrait comprenant de la phloridzine, qui est un substrat idéal pour l'obtention de pigments jaunes naturels et fortement hydrosolubles, comme cela est décrit notamment dans la demande PCT déposée sous le n° PCT/FR 04/02927.
Comme cela apparaît clairement au vu de la présente description, le procédé de l'invention se différencie des procédés antérieurs, notamment du fait qu'on utilise du marc séché et non le jus des fruits pressés, par exemple le jus des pommes pressées et que le marc entier n'est pas préalablement épuisé à l'eau avant de réaliser l'extraction des substances végétales d'intérêt sur le résidu de diffusion. Pour le mise en œuvre du procédé de l'invention, en particulier à partir de pommes, on bénéficie de l'avantage d'une disponibilité importante de matière première (marc de pomme variétés à cidre riches en polyphénols). La maîtrise de la technologie de séparation des différents tissus séchés du fruit et notamment des pépins permet de disposer de substrats naturellement riches en certains composés à l'exemple des dihydrochalcones (phloridzine). Le procédé selon l'invention est rendu encore plus performant par le fait que, dans certains de ses modes de réalisation, les pépins sont décortiqués et les coques sont séparées des amandes. Grâce à cette caractéristique, on évite la présence de composés indésirables dans le milieu d'extraction tels que : sucres de pomme, acides organiques, lipides, amygdaline... Grâce à l'étape a) de séparation des pépins de pomme avec un taux de pureté pouvant atteindre 95% on peut obtenir des extraits polyphénoliques de pépins hautement enrichis en dihydrochalcones. Le taux de phloridzine peut atteindre 70 à 90% des polyphénols totaux. Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir également des extraits polyphénoliques contenant différents polyphénols de façon équilibrée à partir de la pulpe, des extraits hautement enrichis en quercétine par l'utilisation de la fraction enrichie en peaux. Cette fraction enrichie en peaux permet également l'obtention de cires de pommes ou d'extraits hautement concentrés en acide ursolique sans passer par une étape préalable de dépectinisation enzymatique.
Ainsi, grâce au procédé selon la présente invention comprenant les deux principales étapes a) de fractionnement physique du marc de pomme et b) d'extraction à partir des fractions homogènes enrichies récupérées à la fin de l'étape a), il est possible d'obtenir très facilement une large gamme d'extraits de pommes utilisables dans différents secteurs de l'alimentation, la nutraceutique, les compléments alimentaires, la cosmétique et la cosméceutique.
La cosméceutique concerne les aliments et ingrédients dont la consommation par voie orale contribue à améliorer l'aspect extérieur : beauté de la peau, des cheveux ou des ongles, préparation au bronzage, anti-cellulite. Le plus souvent, les produits sont consommés sous forme de gélules, capsules, tablettes, ampoules.
La présente invention a aussi pour objet une composition cosméceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait tel que défini dans la présente description. Une composition cosméceutique selon l'invention a une constitution d'ingrédients, voire identique, à une composition alimentaire, neutraceutique ou diététique qui a été décrite précédemment.
La présente invention a aussi pour objet divers extraits de pomme enrichis en certains polyphénols, qui sont susceptibles d'être obtenus par la mise en œuvre du procédé d'obtention d'un extrait végétal de fruits à pépins qui est décrit précédemment dans la description, et plus particulièrement par la mise en œuvre de certains modes de réalisation particuliers de ce procédé.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que les extraits de pomme selon l'invention étant issus à 100% de la pomme, les polyphénols et/ou cires et/ou acide ursolique ne représentant qu'environ la moitié de la matière sèche, les autres constituants du fruit, mêmes s'ils sont présents en faible quantité, participent à leur action bénéfique pour l'organisme. Comme autres constituants, on peut citer notamment les oligosaccharides, les peptides, les acides aminés, l'acide malique, les autres terpenoïdes, les minéraux, les oligoéléments et les constituants lipidiques.
En particulier, grâce au procédé d'obtention d'un extrait végétal tel que défini dans la présente description, on peut préparer des extraits polyphénoliques riches en quercétine et/ou phloridzine. On sait que ces deux substances sont capables d'inhiber le transport transmembranaire des sucres et sont donc capables d'inhiber la lipogenèse. Il a été montré que ces deux substances manifestent également des propriétés de prévention de l'ostéoporose et de prévention des effets indésirables de la ménopause similaires à ceux des isoflavones de soja.
De plus, un extrait de pomme riche en dihydrochalcones (phloridzine) selon l'invention montre une action directe sur la lipogenèse.
Une originalité importante de la présente invention est que, par exemple concernant les propriétés anti-lipogénique et anti-ostéoporose, l'on dispose, grâce au procédé général d'obtention d'un extrait végétal décrit ci-dessus, de deux types d'extraits permettant de jouer ou non sur la synergie quercétine/phloridzine,.
Ainsi, après avoir démontré la non irritabilité oculaire et cutané des extraits polyphénoliques de pommes de l'invention, sur embryon (œuf) de poulet, cultures cellulaire, tissu cutané et in vivo en test clinique chez l'homme (patch test), la présente invention confirme effectivement que ces extraits manifestent un effet anti-stress oxydatif, anti-âge et agissent favorablement aussi sur le remodelage tissulaire. Par ailleurs, les extraits de pomme selon l'invention riches en quercétine et/ou phloridzine sont capables d'inhiber significativement la différenciation préadipocytes- adipocytes et l'accumulation des lipides intracellulaires. En plus de ces effets anti-lipogenèse déjà démontrés, on a montré selon l'invention que lesdits extraits de pomme agissent favorablement sur l'expression de marqueurs génétiques de la lipogenèse et l'ostéogenèse.
Les préadipocytes sont des cellules non encore différenciées qui sous certaines conditions sont capables de se différenciées en cellules osseuses (ostéoblastes) et non en adipocytes. On a montré selon l'invention que l'on peut obtenir les mêmes effets de différenciation des préadipocytes en ostéoblastes sous l'influence des extraits de pommes obtenus par le procédé d'obtention d'un extrait végétal décrit dans la présente description. Cette propriété d'action favorable des extraits de pommes sur l'ostéogenèse n'avait jamais été montrée dans l'art antérieur.
On a aussi montré que des extraits de pommes obtenus par le procédé d'obtention d'un extrait végétal selon l'invention sont capables de renforcer le système Redox endogène à l'organisme et donc manifestent une forte activité anti-stress oxydatif, anti-âge, antivieillissement. Cette activité s'observe jusqu'au niveau des marqueurs génétiques. Les tests sur cultures cellulaires confirment que les polyphénols possèdent des propriétés anti-oxydantes. Ces activités interviennent significativement dans les effets préventifs des aliments riches en polyphénols. Cependant, les polyphénols peuvent être pris pour des xénobiotiques par les cellules animales et traités comme tels. De ce fait, la présence des polyphénols peut moduler l'expression de nombreux gènes dont ceux impliqués dans la défense anti-oxydante. Ainsi, selon la présente invention, des fibroblastes âgés sénescents traités avec les extraits de pommes, montrent des sur-expressions favorables ou répressions favorables des gènes marqueurs de nombreuses molécules enzymatiques et non enzymatiques impliquées dans la défense anti-oxydante cellulaire. De même, la présente invention démontre que lesdits extraits de pomme sont capables de réguler l'expression d'un certain nombre de gènes de molécules impliquées dans le processus cellulaire et le remodelage tissulaire telles que des facteurs de croissance, des récepteurs, des cytokines ou des chimiokines.
Au vu de l'ensemble des propriétés démontrées sur cultures cellulaires et de l'innocuité oculaire et cutané desdits extraits polyphénoliques, un objet de la présente invention est leurs utilisations dans des compositions cosmétiques, diététiques, nutraceutiques et alimentaires pour le contrôle du poids, de l'obésité, du stress oxydatif, du vieillissement tissulaire, du remodelage dermique et osseux. A titre indicatif mais non limitatif, les extraits de pommes sont particulièrement indiqués dans les compositions cosmétiques, nutraceutiques, compléments alimentaires destinés au bien être, la beauté et la santé grâce à leurs effets anti-âge, anti-vieillissement, minceur, anti-rides anticellulite, anti-ostéoporose.
L'invention a également pour objet des procédés cosmétiques comprenant une étape d'application sur la peau d'un extrait de pomme, ou d'une composition contenant un tel extrait, tel que défini dans la présente description, pour une ou plusieurs des applications cosmétiques décrites pour ledit extrait ou pour ladite composition.
Divers extraits de pomme obtenus par le procédé d'obtention d'un extrait végétal selon l'invention, ainsi que leurs propriétés biologiques et leurs applications industrielles, sont décrits ci-dessous.
Extraits de pomme riches en dihydrochalcones et en flavonols (« HFV»)
II est aussi fourni selon l'invention de nouveaux extraits obtenus à partir de pomme, enrichis spécifiquement en certains polyphénols, et notamment enrichis en dihydrochalcones et en flavonols.
La présente invention a pour objet un extrait de pomme comprenant de 20% à 60% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait, et comprenant :
- de 5 à 15% en poids de dihydrochalcones (phloridzine) ;
- de 5 à 20% en poids de flavonols (quercétine) ;
- de 2 à 20% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et
- de 1 à 10% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
L'extrait de pomme ci-dessus est aussi désigné « HFV » (pour « High FlaVonol content ») dans l'ensemble de la présente description.
Dans la présente description les teneurs globales en polyphénols sont déterminées selon la technique conventionnelle de FoNn Ciocalteu.
Dans la présente description, les teneurs en chacun des polyphénols de types dihydrochalcones, flavonols, flavanols et acides hydroxycinnamiques est déterminée par la technique conventionnelle de chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC). L'extrait de pomme HFV selon l'invention se caractérise notamment par sa haute teneur en flavonols (quercétine) et les teneurs importantes en dihydrochalcones (phloridzine) ainsi qu'en flavanols (catéchine et procyanidols).
Préférentiellement, l'extrait de pomme selon l'invention comprend au moins 20%, et mieux au moins 25% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ledit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention comprend au moins 30%, mieux au moins 35% et encore mieux au moins 40% en poids de flavonols (quercétine), par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ledit extrait.
La composition qualitative et quantitative en polyphénols de l'extrait ci-dessus le rend particulièrement adapté à l'utilisation dans de nombreuses applications dans le domaine alimentaire, cosmétique et pharmaceutique, y compris dans les applications suivantes :
- prévenir la photo-dégradation, le stress oxydatif, le vieillissement cutané,
- réduire ou prévenir les effets des rayonnements UV sur la peau,
- aider au remodelage du tissu cutané,
- mieux gérer le métabolisme des lipides et glucides,
- prévenir l'ostéoporose,
- apporter des effets amincissants anti-cellulite,
- - apporter des effets anti-rides ;
- améliorer la qualité des cheveux, et
- bloquer le développement bactérien.
On a montré que l'extrait selon l'invention pouvait être utilisé en toute sécurité chez l'homme et les animaux.
Ainsi, l'extrait de pomme HFV selon l'invention n'est pratiquement pas irritant pour le tissu oculaire, comme mesuré selon le test HET-CAM (pour « Hen's Egg Test - Chorio-Allantoic Membrane ») bien connu de l'homme du métier, par rapport à un produit de référence comme la lauryl-sulfo-bétaïne. Egalement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention est dépourvu de propriétés d'irritation cutanée, comme mesuré dans un test de viabilité de cellules de peau humaine en culture.
De plus, l'extrait de pomme HFV selon l'invention n'induit aucune irritation cutanée chez l'homme, même après une application d'une durée de 24 heures sur la peau.
On a montré que l'extrait de pomme HFV selon l'invention possède des propriétés à rencontre du stress oxydatif de l'organisme, du vieillissement cellulaire et des réactions inflammatoires. On a aussi montré que l'extrait de pomme selon l'invention possède des effets inhibiteurs sur la lipogénèse et sur l'absorption des sucres par l'organisme. On a aussi montré que l'extrait de pomme selon l'invention possède un effet d'induction de l'ostéogénèse.
Plus précisément, l'extrait de pomme HFV selon l'invention induit une sur-expression de gènes codant des protéines impliquées dans la défense des cellules à rencontre d'un stress oxydatif, tels que les gènes codant la superoxyde dismutase 2 (SOD2), les glutaredoxines (GRX) et les métalothionéines (MTS). A l'inverse, l'extrait de pomme selon l'invention induit la répression de gènes codant des protéines prooxydantes tels que les gènes codant la Hème oxygénase 1 (HMOX1 ), la Iipoxigénase-15B (ALOX15B), la synthase 1 de l'oxyde nitrique (NOS1 ) ou encore la protéine B de choc thermique (« Heat-shock protein B »).
Egalement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention provoque l'induction rapide de l'expression de gènes codant des protéines, y compris des cytokines, impliquées dans les mécanismes de défense à rencontre d'une réaction inflammatoire, impliquées dans les réactions immunitaires, ou encore impliquées dans le remodelage tissulaire, notamment dans le remodelage osseux.
Notamment, l'extrait de pomme ci-dessus induit une surexpression de gènes codant des protéines impliquées dans la réaction inflammatoire et/ou dans le réponse immunitaire, tels que les gènes codant l'IL-6, la « monocyte chemotactic protein 1 (MCP1), le « Tumor Necrosis-Related apoptosis Inducing Ligand (TNFSF10 ou TRAIL). L'extrait de pomme ci-dessus induit une répression de l'expression des gènes codant les récepteurs des prostaglandines, notamment le récepteur de la Prostaglandine E (PGE).
L'extrait de pomme ci-dessus induit aussi l'expression de gènes codant des protéines jouant un rôle dans le remodelage tissulaire, tels que les gènes codant le collagène Vl a2 ; le collagène III ai ou encore l'intégrine a7b (ITGA7B). L'extrait de pomme ci-dessus induit une répression de l'expression de gènes codant des protéines jouant un rôle dans le remodelage tissulaire tels que les gènes codant le collagène XVα1 , le collagène XVIII α1 et le collagène I α1.
Egalement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention induit une sur-expression du gène de la décorine, qui joue un rôle important dans la formation des tissus conjonctifs, la minéralisation et le vieillissement cutané
On a aussi montré que l'extrait de pomme ci-dessus induit une sur-expression du gène codant la télomérase , qui joue un rôle important dans la lutte contre la sénescence cellulaire.
L'extrait de pomme HFV selon l'invention module l'expression de certaines métalloprotéinases impliquées dans le remodelage tissulaire. Notamment, l'extrait de pomme ci-dessus induit une sur-expression de la métalloprotéinase 1 (MMP-1). Ledit extrait induit dans un premier temps une répression de l'expression du gène codant la métalloprotéinase 3 (MMP-3), puis, après une durée de mise en contact de plusieurs heures avec les cellules, une sur-expression de MMP-3.
L'extrait de pomme HFV selon l'invention inhibe aussi une surexpression des gènes codant la thrombospondine-2 (TSP-2), le facteur C de croissance endothélial vasculaire (« Vascular endothelial Growth Factor-C » ou VEGF-C), l'intégrine α7 B (ITGA7), le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (« Macrophage Migration Inhibitory Factor » ou MIF), les facteurs 1 et 2 de croissance du placenta (« Placenta Growth factors » 1 et 2, ou PLGF1 et PLGF2), la pleitropine (« Osteoblast spécifie Growth Factor » ou PTN) ou encore le Facteur transformant beta (« Transforming Growth Factor β » ou TGFβ). L'extrait de pomme ci-dessus induit aussi une répression de l'expression des gènes codant des protéines tels que le régulateur d'apoptose (« Apoptosis Regulator » ou BAX), le « Procollagen-C Proteinase Enhancer » (PCPEP), le récepteur 1 de la Prostaglandine E (« Prostaglandin E Receptor 1 » ou PTGER1), le « Apoptosis Inhibitor Survivin » (BIRC5), la cavéoline 1 (« Caveolin 1 » ou CAV1) ou encore la Lamine A (LMNA). L'extrait de pomme ci-dessus induit aussi une surexpression des gènes codant la phosphatase alcaline (PAL).
On a aussi montré que l'extrait de pomme HFV selon l'invention induit la différenciation des cellules souches poïétiques mésenchymiales humaines (hMSC) en adipocytes matures, dans un milieu de culture approprié.
Egalement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention induit la différenciation des cellules souches poïétiques mésenchymiales humaines (hMSC) en ostéoblastes, dans un milieu de culture approprié.
On a aussi montré que l'extrait de pomme HFV selon l'invention inhibe l'accumulation intracellulaire des lipides et provoque une répression du gène PPARG.
Il apparaît que l'extrait de pomme HFV selon l'invention induit une augmentation générale du métabolisme cellulaire, comme cela est illustré par l'augmentation de la synthèse protéique et l'induction d'une surexpression du gène G3PDH.
Il résulte des nombreuses propriétés biologiques de l'extrait de pomme HFV selon l'invention que celui-ci peut être utilisé, soit tel quel, soit en tant que constituant d'une composition, comme substance biologiquement active destinée aux domaines alimentaires, y compris nutraceutique, cosmétique, y compris dermo-cosmétique, et pharmaceutique.
L'extrait de pomme HFV selon l'invention est particulièrement adapté pour son utilisation comme substance active destinée (i) à la prévention ou au traitement d'un stress oxydatif, (ii) à la prévention ou au traitement du vieillissement cellulaire, en particulier du vieillissement cutané, (iii) à la régulation du métabolisme des glucides, (iv) à la régulation du métabolisme des lipides, (v) à la prévention ou au traitement des réactions inflammatoires et (vi) à la stimulation de certaines réponses des cellules du système immunitaire.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention comprend de 8% à 15%, mieux de 10% à 15% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention comprend de 10% à 20%, mieux de 15% à 20% en poids de flavonols (quercétine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation dudit extrait de pomme, celui-ci comprend de 15% à 18% en poids de flavonols (quercétine), et mieux de 16% à 18% en poids de flavonols (quercétine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention comprend de 3% à 15%, mieux de 4% à 7% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation dudit extrait de pomme, celui-ci comprend de 5% à 7% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols), et mieux de 5% à 6,8% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention comprend de 2% à 8% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation dudit extrait, celui-ci comprend de 3% à 8% en poids d'acides hydroxycinnamiques, et mieux de 3% à 7,5% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention comprend de 30% à 50% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention comprend de 35% à 45% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation dudit extrait de pomme, celui-ci comprend de 38% à 42% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation préférés dudit extrait de pomme, celui-ci comprend de 39% à 41% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. A titre illustratif, la présente invention englobe un extrait de pomme HFV comprenant (i) de 10% à 11 % en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) de 15,5% à 16,5% en poids de flavonols (quercétine) ; (iii) de 5% à 6% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et (iv) de 3% à 3,5% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
A titre illustratif, la présente invention englobe un extrait de pomme HFV comprenant (i) de 13% à 14% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) de 16,5% à 17,5% en poids de flavonols (quercétine) ; de 5,5% à 6,5% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et de 7% à 8% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Dans un mode de réalisation particulier d'un extrait de pomme HFV selon l'invention celui-ci comprend (i) 10,9% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) 16% en poids de flavonols (quercétine) ; 5,5% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et 3,2% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Un tel extrait de pomme comprend (i) 27,3% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) 40% en poids de flavonols (quercétine) ; 13,8% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et 8% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de polyphénols contenus dans ledit extrait.
Dans un autre mode de réalisation particulier d'un extrait de pomme HFV selon l'invention celui-ci comprend (i) 13,2% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) 17% en poids de flavonols (quercétine) ; 6% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et 7,5% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Un tel extrait de pomme comprend (i) 33% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) 42,4% en poids de flavonols (quercétine) ; 15% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et 18,6% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de polyphénols contenus dans ledit extrait. La teneur en polyphénols de l'extrait de pomme HFV selon l'invention, ainsi qu'une composition qualitative et quantitative dudit extrait en dihydrochalcones, en flavonols, en flavanols et en acides hydroxycinnamiques est préférentiellement obtenue en mettant en œuvre le procédé d'obtention d'un extrait végétal de fruits à pépins dont les caractéristiques sont décrites dans la présente description.
Ainsi, préférentiellement, l'extrait de pomme HFV tel que défini ci- dessus est préparé selon un procédé comprenant les étapes suivantes : a) séparer, à partir des pommes de départ, ou d'un marc de départ obtenu à partir desdites pommes, à l'état sec, respectivement les fractions suivantes :
(i) une fraction de matière enrichie en peaux,
(ii) une fraction de matière enrichie en pulpe,
(iii) une fraction de matière enrichie en pépins entiers, ou une fraction choisie parmi les fractions suivantes :
- (iii-1 ) une fraction de matière enrichie en amandes de pépins,
- (iii-2) une fraction de matière enrichie en coques de pépins, b) préparer, à partir de la fraction (i) enrichie en peau obtenue à l'étape a), un extrait de pomme enrichi en polyphénols conforme à l'invention.
Les caractéristiques de chacune des étapes du procédé ci-dessus sont décrites ailleurs dans la présente description, et en particulier dans la partie de la description décrivant en détail le procédé d'obtention d'un extrait végétal.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HFV selon l'invention est préparé à partir de la fraction (F1 ) essentiellement constituée de peau, dont le procédé d'obtention a été décrit précédemment dans la présente description.
De manière tout à fait préférée, l'extrait de pomme HFV selon l'invention est obtenu en utilisant comme produit de départ des pommes à cidre. A titre illustratif, on utilise des pommes à cidre d'une variété choisie parmi les variétés suivantes : Amère nouvelle, Armagnac (aigre), Doux Corier, Marseigna, Normandie Blanc, Pomme du Verger, Blanquette, DeIIo, Doudazin, Germaine, Maman LiIi, Normandie Blanc ; Passe Reine, Peaud'Ane, Pomme du Verger, Poire, Président ou encore Roguet Rouge., Judor, Petit Jaune, Binet Rouge, Juliana, Clozette, Avrolles, Dous Moen, Antoinette, Bedan, Dabinett, Douce Coet Ligné, Chevalier Jaune, Jeanne Renard, Kermerrien.
La présente invention a aussi pour objet une composition alimentaire, diététique ou cosmétique comprenant un extrait de pomme HFV tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention est également relative à une composition cosmétique contre le vieillissement de la peau comprenant un extrait de pomme HFV tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention concerne aussi une composition cosmétique pour la protection de la peau contre le rayonnement solaire, comprenant un extrait de pomme HFV tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention a également trait à une composition alimentaire ou cosmétique amincissante ou anti-cellulite, comprenant un extrait de pomme HFV tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention a aussi trait à une composition cosmétique anti-rides, comprenant un extrait de pomme HFV tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant un extrait de pomme HFV tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention est également relative à un extrait de pomme HFV tel que défini ci-dessus, pour son utilisation en tant que médicament.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un extrait de pomme HFV tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de l'ostéoporose.
L'invention a aussi trait à l'utilisation d'un extrait de pomme HFV tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des états inflammatoires. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un extrait de pomme HFV tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un excès pondéral.
Extraits de pomme riches en dihydrochaicones (« HDH »)
II est aussi fourni selon l'invention de nouveaux extraits obtenus à partir de pomme, enrichis spécifiquement en certains polyphénols, et notamment enrichis en dihydrochaicones.
La présente invention a pour objet un extrait de pomme comprenant de 20% à 60% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait, et comprenant :
- de 10 à 40% en poids de dihydrochaicones (phloridzine) ;
- de 0,1 à 10% en poids de flavonols (quercétine) ;
- de 0,1 à 10% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et
- de 0,1 à 10% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
L'extrait de pomme ci-dessus est aussi désigné « HDH » (pour « High Dihdrochalcons ») dans l'ensemble de la présente description.
Dans la présente description les teneurs globales en polyphénols sont déterminées selon la technique conventionnelle de FoNn Ciocalteu.
Dans la présente description, les teneurs en chacun des polyphénols de types dihydrochaicones, flavonols, flavanols et acides hydroxycinnamiques est déterminée par la technique conventionnelle de chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC).
L'extrait de pomme HDH selon l'invention se caractérise par sa haute teneur en dihydrochaicones (phloridzine).
Ainsi, l'extrait de pomme HDH selon l'invention comprend au moins 70% en poids de dihydrochaicones (phloridzine), par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ledit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HDH selon l'invention comprend au moins 75% en poids, et mieux au moins 80% en poids de dihydrochaicones (phloridzine), par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ledit extrait. La composition qualitative et quantitative en polyphénols de l'extrait ci-dessus le rend particulièrement adapté à l'utilisation dans de nombreuses applications dans le domaine alimentaire, cosmétique et pharmaceutique, y compris dans les applications suivantes :
- prévenir la photo-dégradation, le stress oxydatif, le vieillissement cutané,
- réduire ou prévenir les effets des rayonnements UV sur la peau,
- aider au remodelage du tissu cutané,
- mieux gérer le métabolisme des lipides et glucides,
- prévenir l'ostéoporose,
- apporter des effets amincissants anti-cellulite,
- améliorer la qualité des cheveux, et
- bloquer le développement bactérien.
On a montré que l'extrait de pomme HDH selon l'invention pouvait être utilisé en toute sécurité chez l'homme et les animaux.
Ainsi, l'extrait de pomme HDH selon l'invention n'est pratiquement pas irritant pour le tissu oculaire, comme mesuré selon le test HET-CAM (pour « Hen's Egg Test - Chorio-Allantoic Membrane ») bien connu de l'homme du métier, par rapport à un produit de référence comme la lauryl-sulfo-bétaïne.
Egalement, l'extrait de pomme HDH selon l'invention est dépourvu de propriétés d'irritation cutanée, comme mesuré dans un test de viabilité de cellules de peau humaine en culture.
De plus, l'extrait de pomme HDH selon l'invention n'induit aucune irritation cutanée chez l'homme, même après une application d'une durée de 24 heures sur la peau.
On a montré que l'extrait de pomme HDH selon l'invention possède des propriétés à rencontre du stress oxydatif de l'organisme, du vieillissement cellulaire et des réactions inflammatoires. On a aussi montré que l'extrait de pomme selon l'invention possède des effets inhibiteurs sur la lipogénèse et sur l'absorption des sucres par l'organisme. On a aussi montré que l'extrait de pomme selon l'invention possède un effet d'induction de l'ostéogénèse.
L'extrait de pomme ci-dessus induit aussi une sur-expression des gènes codant la phosphatase alcaline (PAL). On a aussi montré que l'extrait de pomme HDH selon l'invention induit la différenciation des cellules souches poïétiques mésenchymiales humaines (hMSC) en adipocytes matures, dans un milieu de culture approprié.
Egalement, l'extrait de pomme HDH selon l'invention induit la différenciation des cellules souches poïétiques mésenchymiales humaines (hMSC) en ostéoblastes, dans un milieu de culture approprié.
On a aussi montré que l'extrait de pomme HDH selon l'invention inhibe l'accumulation intracellulaire des lipides et provoque une répression du gène PPARG.
Il apparaît que l'extrait de pomme HDH selon l'invention induit une augmentation générale du métabolisme cellulaire comme cela est illustré par l'augmentation de la synthèse protéique et l'induction d'une surexpression du gène G3PDH.
Il résulte des nombreuses propriétés biologiques de l'extrait de pomme HDH selon l'invention que celui-ci peut être utilisé, soit tel quel, soit en tant que constituant d'une composition, comme substance biologiquement active destinée aux domaines alimentaires, y compris nutraceutique, cosmétique, y compris dermo-cosmétique, et pharmaceutique.
L'extrait de pomme HDH selon l'invention est particulièrement adapté pour son utilisation comme substance active destinée (i) à la prévention ou au traitement d'un stress oxydatif, (ii) à la prévention ou au traitement du vieillissement cellulaire, en particulier du vieillissement cutané, (iii) à la régulation du métabolisme des glucides, (iv) à la régulation du métabolisme des lipides, (v) à la prévention ou au traitement des réactions inflammatoires et (vi) à la stimulation de certaines réponses des cellules du système immunitaire.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HDH selon l'invention comprend de 25% à 40%, mieux de 27% à 35% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation dudit extrait, celui-ci comprend de 28% à 35% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Préférentiellement, l'extrait de pomme HDH selon l'invention comprend de 0,2% à 5%, mieux de 0,5% à 5% en poids de flavonols (quercétine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation dudit extrait, celui-ci comprend de 0.7% à 1 ,6%, et mieux de 0,8% à 1 ,5% en poids de flavonols (quercétine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HDH selon l'invention comprend de 0,2% à 5%, mieux de 0,5% à 5% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation dudit extrait, celui-ci comprend de 0,9% à 2,5% et mieux de 1% à 2,1% en poids de flavan-3- ols (catéchine et procyanidols), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HDH selon l'invention comprend de 0,2% à 5%, mieux de 0,5% à 5% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation dudit extrait, celui-ci comprend de 0,5% à 2%, et mieux de 0,7% à 1 % en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HDH selon l'invention comprend de 30% à 50% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HDH selon l'invention comprend de 30% à 45% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation dudit extrait de pomme, celui-ci comprend de 33% à 43%, et mieux de 35% à 42% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
A titre illustratif, la présente invention englobe un extrait de pomme HDH comprenant (i) de 27% à 29% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) de 0,5% à 1 % en poids de flavonols (quercétine) ; de 0,5% à 1 ,5% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et de 0,5% à 1 % en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. A titre illustratif, la présente invention englobe un extrait de pomme HDH comprenant (i) de 32% à 37% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) de 1% à 2% en poids de flavonols (quercétine) ; de 1 ,5% à 2,5% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et de 0,5% à 1 ,5% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Dans un mode de réalisation particulier d'un extrait de pomme HDH selon l'invention celui-ci comprend (i) 28,1 % en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) 0,8% en poids de flavonols (quercétine) ; 1 % en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et 0,7% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Un tel extrait de pomme comprend (i) 80,3% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) 2,3% en poids de flavonols (quercétine) ; 2,9% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et 2% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de polyphénols contenus dans ledit extrait.
Dans un autre mode de réalisation particulier d'un extrait de pomme HDH selon l'invention celui-ci comprend (i) 35% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) 1 ,5% en poids de flavonols (quercétine) ; 2,1 % en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et 1 % en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Un tel extrait de pomme comprend (i) 83,3% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), (ii) 3,6% en poids de flavonols (quercétine) ; 5% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et 2,4% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de polyphénols contenus dans ledit extrait.
La teneur en polyphénols de l'extrait de pomme HFV selon l'invention, ainsi que composition qualitative et quantitative dudit extrait en dihydrochalcones, en flavonols, en flavanols et en acides hydroxycinnamiques est préférentiellement obtenue en mettant en œuvre le procédé d'obtention d'un extrait végétal de fruits à pépins dont les caractéristiques sont décrites dans la présente description.
Ainsi, préférentiellement, l'extrait de pomme HFV tel que défini ci- dessus est préparé selon un procédé comprenant les étapes suivantes : a) séparer, à partir des pommes de départ, ou d'un marc de départ obtenu à partir desdites pommes, à l'état sec, respectivement les fractions suivantes :
(i) une fraction de matière enrichie en peaux,
(ii) une fraction de matière enrichie en pulpe,
(iii) une fraction de matière enrichie en pépins entiers, ou une fraction choisie parmi les fractions suivantes :
- (iii-1 ) une fraction de matière enrichie en amandes de pépins,
- (iii-2) une fraction de matière enrichie en coques de pépins, b) préparer, à partir de la fraction (iii-2) enrichie en coques de pépins obtenue à l'étape a), un extrait de pomme enrichi en polyphénols conforme à l'invention.
Les caractéristiques de chacune des étapes du procédé ci-dessus sont décrites ailleurs dans la présente description, et en particulier dans la partie de la description décrivant en détail le procédé d'obtention d'un extrait végétal.
Préférentiellement, l'extrait de pomme HDH selon l'invention est préparé à partir de la fraction (F9) enrichie en coques de pépins, dont le procédé d'obtention a été décrit précédemment dans la présente description.
De manière tout à fait préférée, l'extrait de pomme HFV selon l'invention est obtenu en utilisant comme produit de départ des pommes à cidre. A titre illustratif, on utilise des pommes à cidre d'une variété choisie parmi les variétés suivantes : Amère nouvelle, Armagnac (aigre), Doux Corier, Marseigna, Normandie Blanc, Pomme du Verger, Blanquette, DeIIo, Doudazin, Germaine, Maman LiIi, Normandie Blanc ; Passe Reine, Peaud'Ane, Pomme du Verger, Poire, Président ou encore Roguet Rouge. Judor, Petit Jaune, Binet Rouge, Juliana, Clozette, Avrolles, Dous Moen, Antoinette , Bedan, Dabinett, Douce Coet Ligné, Chevalier Jaune, Jeanne Renard, Kermerrien.
La présente invention a aussi pour objet une composition alimentaire, diététique ou cosmétique comprenant un extrait de pomme HDH tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles. L'invention a également trait à une composition alimentaire ou cosmétique amincissante ou anti-cellulite, comprenant un extrait de pomme HDH tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant un extrait de pomme HDH tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention est également relative à un extrait de pomme HDH tel que défini ci-dessus, pour son utilisation en tant que médicament.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un extrait de pomme HDH tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de l'ostéoporose.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un extrait de pomme HDH tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un excès pondéral.
Extraits de pomme riches en polyphénols (« WAP »)
II est aussi fourni selon l'invention de nouveaux extraits obtenus à partir de pomme, enrichis simultanément en de multiples polyphénols, y compris simultanément en flavanols, flavonols, en acides hydroxycinnamiques et en dihydrochalcones.
La présente invention a aussi pour objet un extrait de pomme comprenant de 20% à 60% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait, et comprenant :
- de 10% à 20% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ;
- de 2% à 10% en poids de flavonols (quercétine) ;
- de 5% à 10% en poids d'acides hydroxycinnamiques ; et
- de 2% à 10% en poids de dihydrochalcones (phloridzine) par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
L'extrait de pomme ci-dessus est aussi désigné « WAP » (pour « Whole Apple Polyphénols ») dans l'ensemble de la présente description.
Dans la présente description les teneurs globales en polyphénols sont déterminées selon la technique conventionnelle de FoNn Ciocalteu. Dans la présente description, les teneurs en chacun des polyphénols de types dihydrochalcones, flavonols, flavanols et acides hydroxycinnamiques est déterminée par la technique conventionnelle de chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC).
La composition qualitative et quantitative équilibrée en polyphénols de l'extrait ci-dessus le rend particulièrement adapté à l'utilisation dans de nombreuses applications dans le domaine alimentaire, cosmétique et pharmaceutique, y compris dans les applications suivantes :
- prévenir la photo-dégradation, le stress oxydatif, le vieillissement cutané,
- réduire ou prévenir les effets des rayonnements UV sur la peau, et
- améliorer la qualité des cheveux,
On a montré que l'extrait de pomme WAP selon l'invention pouvait être utilisé en toute sécurité chez l'homme et les animaux.
Ainsi, l'extrait de pomme WAP selon l'invention n'est pratiquement pas irritant pour le tissu oculaire, comme mesuré selon le test HET-CAM (pour « Hen's Egg Test - Chorio-Allantoic Membrane ») bien connu de l'homme du métier, par rapport à un produit de référence comme la lauryl-sulfo-bétaïne.
Egalement, l'extrait de pomme WAP selon l'invention est dépourvu de propriétés d'irritation cutanée, comme mesuré dans un test de viabilité de cellules de peau humaine en culture.
De plus, l'extrait de pomme WAP selon l'invention n'induit aucune irritation cutanée chez l'homme, même après une application d'une durée de 24 heures sur la peau.
Préférentiellement, l'extrait de pomme WAP selon l'invention comprend de 12% à 18%, et mieux de 14% à 16% en poids de flavan-3- ols (catéchine et procyanidols), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme WAP selon l'invention comprend de 2% à 8% en poids, et mieux de 3% à 7% en poids de flavonols (quercétine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Préférentiellement, l'extrait de pomme WAP selon l'invention comprend de 6% à 9%, et mieux de 6% à 8% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme WAP selon l'invention comprend de 3% à 8%, et mieux de 4% à 6% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme WAP selon l'invention comprend de 30% à 50% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Préférentiellement, l'extrait de pomme WAP selon l'invention comprend de 35% à 45% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation dudit extrait de pomme, celui-ci comprend de 38% à 42% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait. Dans certains modes de réalisation préférés dudit extrait de pomme, celui-ci comprend de 39% à 41% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
A titre illustratif, la présente invention englobe un extrait de pomme WAP comprenant (i) de 14% à 16% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols), (ii) de 4% à 6% en poids de flavonols (quercétine), (iii) de 6% à 8% en poids d'acides hydroxycinnamiques et (iv) de 4% à 6% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
Dans un mode de réalisation particulier d'un extrait de pomme WAP selon l'invention celui-ci comprend (i) 15% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols), (ii) 5% en poids de flavonols (quercétine), (iii) 7% en poids d'acides hydroxycinnamiques et (iv) 5% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
La teneur en polyphénols de l'extrait de pomme WAP selon l'invention, ainsi que composition qualitative et quantitative dudit extrait en dihydrochalcones, en flavonols, en flavanols et en acides hydroxycinnamiques est préférentiellement obtenue en mettant en œuvre le procédé d'obtention d'un extrait végétal de fruits à pépins dont les caractéristiques sont décrites dans la présente description.
Ainsi, préférentiellement, l'extrait de pomme WAP tel que défini ci- dessus est préparé selon un procédé comprenant les étapes suivantes : a) séparer, à partir des pommes de départ, ou d'un marc de départ obtenu à partir desdites pommes, à l'état sec, respectivement les fractions suivantes :
(i) une fraction de matière enrichie en peaux,
(ii) une fraction de matière enrichie en pulpe,
(iii) une fraction de matière enrichie en pépins entiers, ou une fraction choisie parmi les fractions suivantes :
- (iii-1 ) une fraction de matière enrichie en amandes de pépins,
- (iii-2) une fraction de matière enrichie en coques de pépins, b) préparer, à partir de la fraction (ii) enrichie en pulpe obtenue à l'étape a), un extrait de pomme enrichi en polyphénols conforme à l'invention.
Les caractéristiques de chacune des étapes du procédé ci-dessus sont décrites ailleurs dans la présente description, et en particulier dans la partie de la description décrivant en détail le procédé d'obtention d'un extrait végétal.
Préférentiellement, l'extrait de pomme WAP selon l'invention est préparé à partir de la fraction (F2) essentiellement constituée de pulpe, dont le procédé d'obtention a été décrit précédemment dans la présente description.
De manière tout à fait préférée, l'extrait de pomme WAP selon l'invention est obtenu en utilisant comme produit de départ des pommes à cidre. A titre illustratif, on utilise des pommes à cidre d'une variété choisie parmi les variétés suivantes : Amère nouvelle, Armagnac (aigre), Doux Corier, Marseigna, Normandie Blanc, Pomme du Verger, Blanquette, DeIIo, Doudazin, Germaine, Maman LiIi, Normandie Blanc ; Passe Reine, Peaud'Ane, Pomme du Verger, Poire, Président ou encore Roguet Rouge, Judor, Petit Jaune, Binet Rouge, Juliana, Clozette, Avrolles, Dous Moen, Antoinette , Bedan, Dabinett, Douce Coet Ligné, Chevalier Jaune, Jeanne Renard, Kermerrien. La présente invention a aussi pour objet une composition alimentaire, diététique ou cosmétique comprenant un extrait de pomme WAP tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention est également relative à une composition cosmétique contre le vieillissement de la peau comprenant un extrait de pomme WAP tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention concerne aussi une composition cosmétique pour la protection de la peau contre le rayonnement solaire, comprenant un extrait de pomme WAP tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention a également trait à une composition cosmétique pour le traitement capillaire, comprenant un extrait de pomme WAP tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant un extrait de pomme WAP tel que défini ci-dessus, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
L'invention est également relative à un extrait de pomme WAP tel que défini ci-dessus, pour son utilisation en tant que médicament.
Caractéristiques des compositions comprenant un extrait végétai
Dans le cas des applications dermatologiques, les compositions selon l'invention peuvent être combinées avec d'autres compositions connues, du type écran solaire, pour gérer efficacement l'état de la peau. Les compositions dermatologiques réalisées selon la présente invention comprennent au moins l'un des extraits de pommes, obtenus selon l'invention présentée dans la demande de brevet français N° 0552642, à une concentration suffisante permettant d'obtenir les effets recherchés. Pour les extraits riches en polyphénols et/ou acide ursolique, il s'agira d'apporter les quantités suffisantes permettant de neutraliser les radicaux libres et d'observer un effet anti-stress oxydatif, anti-âge, antivieillissement. Pour les extraits polyphénoliques particulièrement riches en quercétine et/ou phloridzine, en plus de l'action contre les radicaux libres, les compositions pourront apporter les quantités suffisantes pour obtenir des effets bénéfiques au niveau de la régulation des métabolismes lipidique et glucidique, la minceur, l'action anti-cellulite et l'action anti-ostéoporose. En plus des actifs de pomme, les compositions selon la présente invention peuvent comprendre les supports/vecteurs, texturants, colorants, arômes, conservateurs sanitairement et pharmaceutiquement acceptables, connus du professionnel de l'art.
Dans le cas des applications nutraceutiques, alimentaires, compléments alimentaires, cosméceutiques, les compositions selon la présente invention sont utilisées seules ou en combinaison avec d'autres actifs bénéfiques, à des concentrations suffisantes pour obtenir les effets recherchés contre, à titre indicatif, l'état de vieillissement du corps, l'ostéoporose, l'obésité, l'excès de poids. A titre indicatif mais non limitatif, les effets recherchés peuvent être la neutralisation des radicaux libres, le rétablissement ou l'augmentation du statut (potentiel) antioxydant plasmatique, la diminution du stress oxydatif, l'amélioration du remodelage tissulaire, particulièrement le remodelage dermique, la diminution de poids, la prévention de l'ostéoporose et des effets indésirables de la ménopause, la prévention ou la diminution de la cellulite.
Dans les compositions topiques et/ou orales, selon la présente invention, le ou les extraits de pomme sont incorporés à des taux physiologiquement efficaces compris entre 0,01 et 50%, de préférence entre 0,1 et 10% plus préférentiellement entre 0,2 et 5%. Tout vecteur et/ou support de formulation, texturant, colorant, stabilisant, arôme, conservateur, conformes à l'usage et la réglementation des produits destinés à la consommation ou à l'application topique peut être utilisé dans la réalisation des compositions. Les compositions topiques selon la présente invention peuvent comprendre un ou plusieurs agents hydratants habituellement utilisés pour faciliter l'hydratation de la peau et inhiber ou prévenir la perte cutanée en eau. La composition topique peut aussi comprendre des composants acides exfoliants habituellement utilisés par l'homme de l'art comme par exemple les acides de fruits. Le terme « taux physiologiquement efficace » signifie ici la quantité d'actifs de pomme permettant d'obtenir les bénéfices escomptés dans le management de l'état dermatologique ou l'état général de l'organisme. Il est entendu pour le spécialiste de l'art que cette quantité d'actifs peut varier en fonction de l'individu et de son état cutané. L'importance des doses d'actifs ou le nombre d'utilisations journalières d'une composition donnée dépendra de la sensibilité des personnes et de la voie d'administration. Les doses et leur fréquence peuvent être aussi fonction de l'âge, du poids, de l'état de santé et de la réponse de chaque individu. Pour une administration par voie orale, les taux d'incorporation des actifs de pomme seront entre 5 mg et 1 000 mg, de préférence entre 25 et 500 mg et plus préférentiellement entre 50 et 400 mg.
Les voies d'administration des actifs de pomme sont celles généralement recommandées par l'homme de l'art. De préférence, on utilise les voies topique et orale. Les formes de présentation des compositions peuvent être, à titre indicatif mais non limitatif, des tablettes, gélules, capsules, ampoules, dispersions, suspensions, solutions aérosols, spray, éponges, cotons applicateurs, patches, pâtes, gels, lotions, sirops, onguents, poudres, granules, crèmes.
Les compositions, selon l'invention, peuvent être préparées par l'une ou l'autre des méthodes connues par le spécialiste de l'art. Ces méthodes incluent l'association d'un support/vecteur avec les actifs de pomme, ainsi que les autres ingrédients, additifs et auxiliaires technologiques nécessaires à la réalisation des formules stables adaptées au mode d'utilisation envisagé. Les actifs et autres ingrédients sont formulés grâce aux appareils et dans les ordres habituels de mélanges, agitations, texturation, émulsification, foisonnement, conditionnement... connus du professionnel de l'art. En plus des formes habituelles de formulation et conditionnement, les compositions selon l'invention peuvent être réalisées dans les formulations particulières adaptées pour une protection des actifs, leur transport dans l'organisme et leur libération progressive et contrôlée dans le temps au niveau de la zone cible, telles décrites par exemple dans les brevets US 6,630,163 ;US 5,591 ,767 ; US 3,536,809 ; US 4,008,719 ; US 5,354,556. Les formes particulières de formulation peuvent comprendre une étape d'encapsulation, de piégeage dans une autre macromolécule ou une structure de complexes moléculaires des types cyclodextrine, liposomes, globule lipoprotéique ou micro-bille gélifiée. Les formes particulières de formulation stabilisée peuvent aussi comprendre une étape de liaison covalente entre les actifs de l'extrait de pomme et une autre molécule de protection ou de transport type ester d'acide gras ou liaison protéique.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples qui suivent.
EXEMPLES
Exemples 1 à 6 : Etape a) du procédé
Exemple 1
1000 Kg de marc séché issu de la cidrerie locale sont passés sur un tamiseur vibrant équipé de deux tamis de 3,5 et 5 mm de perforations. On obtient 200 Kg d'une fraction F1 supérieure à 5 mm et essentiellement constituée de peaux ; 600Kg d'une fraction fine F2 inférieure à 3,5 mm et essentiellement formée de pulpe ; 200 Kg d'une fraction intermédiaire F3 comprise entre 3,5 et 5 mm et comprenant les pépins ainsi que des morceaux de pulpe et peaux de même taille.
La fraction intermédiaire F3 est passée sur une table densimétrique à flux d'air pour obtenir 160 Kg d'une fraction F4 de pulpe et peaux et 40 Kg d'une fraction F5 riche en pépins. L'analyse de la proportion de pépins dans la fraction F5 donne 65% P/P.
Exemple 2
1000 Kg de marc sec de cidrerie sont traités sur le tamiseur comme dans l'exemple 1.
La fraction intermédiaire F3 (230 Kg) est passée sur un séparateur à flux d'air Tarare conique pour obtenir 120 Kg de fraction légère F4 constituée essentiellement de peaux et renfermant 0,8% de pépins P/P. La fraction lourde F5 (110) Kg est fortement enrichie en pépins. Cette fraction F5 est passée sur la table densimétrique comme dans l'exemple 1 pour obtenir 30 Kg de fraction F6 enrichie à 85% P/P de pépins. La fraction F7 (80 Kg) étaient constituée essentiellement de pulpe et ne contenait que 3,5% de pépins.
Exemple 3
1000 Kg de marc sec de cidrerie sont traités sur tamiseur comme dans l'exemple 1 pour obtenir 225 Kg de fraction peaux F1 ; 545 Kg de fraction pulpe F2 et 230 Kg de fraction F3 intermédiaire pré-enrichie en pépins.
La fraction intermédiaire F3 et passée sur une table densimétrique comme dans l'exemple 1 pour obtenir 188 Kg de fraction F5 formée de peaux et pulpe ainsi que 42 Kg de fraction F6 fortement enrichie en pépins.
Cette dernière fraction F6 (42 Kg) est passée sur un sélecteur pilote à flux d'air modèle Zig-Zag Alpine. On obtient 30 Kg de fraction F7 contenant 95% P/P de pépins et 12 Kg de fraction pulpe renfermant 8% P/P de pépins.
Exemple 4
30 Kg de pépins (fraction F7 de l'exemple 3) sont passés sur un broyeur à marteaux muni d'un variateur de vitesse. La vitesse est mise au minimum pour ne pas pulvériser les pépins (amandes et coques). La chambre de broyage est munie d'un tamis de 3,5 mm de perforation de façon à retenir les pépins entiers. Les pépins concassés sont passés sur un tamiseur vibrant équipé d'un tamis de 0,4 mm pour éliminer les fines.
On obtient ainsi 2,5 Kg de fines et 27,5 Kg de fraction grossière retenue par le tamis. La fraction supérieure à 0,4 mm est passée sur un sélecteur pilote modèle Zig-Zag Alpine pour récupérer 6 Kg de coques et 21 ,5 Kg d'amandes.
Exemple 5
100 Kg de pépins obtenus comme dans l'exemple 3 sont passés sur un décortiqueur à double cylindre dont l'écartement entre les cylindres est réglé de façon à dissocier les coques et amandes sans réduire les dernières en poudre fine.
Le produit concassé est tamisé sur tamis vibrant 0,4 mm pour éliminer 5 Kg de fines et récupérer 95 Kg de fraction retenue par le tamis. Le mélange, coques et amandes, retenu par le tamis est passé sur une table densimétrique pour récupérer 77 Kg d'amandes et 16 Kg de coques.
Exemple 6
35 Kg de pépins obtenus comme dans l'exemple 2 sont soumis à l'action d'un décortiqueur/séparateur pilote Electra pour récupérer 8 Kg de coques et 26 Kg d'amandes
Exemples 7 à 9 : Etape b) du procédé
Exemple 7
50 Kg de fraction pulpe issu du tamisage comme dans l'exemple 1 sont soumis à des extractions successives à l'eau chaude 70 0C jusqu'à ce que le dernier extrait ne contienne plus de polyphénols détectables par mesure de densité optique à 280 nm du surnageant de centrifugation à 2000 tours/minute pendant 10 minutes.
Pour cela, les 50 Kg sont introduits dans une cuve de 1000 litres équipée à sa base d'un filtre de 1 ,5 mm de diamètre de perforations. On ajoute 550 lires d'eau chaude 70 0C pour avoir un rapport marc:eau de 8,3%. Après 20 minutes d'agitation lente, 450 litres de phase liquide sont récupérés en ouvrant la vanne située à la base de cuve et en soutirant avec une pompe centrifuge. Un échantillon de filtrat est prélevé et centrifugé à 2000 trs/min pendant 10 minutes. La densité optique est mesurée à 280 nm contre de l'eau comme référence. On ajoute ensuite 450 litres d'eau chaude 70 0C dans la cuve d'extraction, on remet l'agitation 20 minutes et on soutire de nouveau. La richesse polypénolique du filtrat est évalué à 280 nm. Cette opération de diffusion- soutirage est répétée ainsi 6 fois.
On obtient au total 2700 Kg d'extrait liquide qui est clarifié sur une centrifugeuse/débourbeuse pilote WESFALIA SB7 pour obtenir 2484 Kg de phase clarifiée. Les colloïdes, polymères de protéines et polysaccharides présents dans le liquide clarifié sont séparés sur une unité pilote d'ultrafiltration équipée de 6,8 m2 de membranes minérales tubulaires Techsep de seuil de coupure 50 000 daltons.
On obtient 2385 Kg de perméat et 99 Kg de rétentat. Ce retentat est séché par atomisation sur pilote NIRO MINOR PRODUCTION pour récupérer 1 Kg de fibres solubles de pomme utilisables en formulations alimentaires, compléments alimentaires, nutraceutique,
Le permeat d'ultrafiltration est passé sur une colonne de 60 litres remplie d'un support de résine adsorbante XAD RHOM and HAAS. Après lavage de la colonne avec 1 ,5 volumes d'eau, on récupère les polyphénols par passage de 1 ,5 volume d'une solution d'éthanol dilué à 60% dans de l'eau. L'élution à l'éthanol 60% est suivie d'un lavage avec 1 ,5 volumes d'eau. Au total, on récupère 180 litres d'éluat éthanolique à environ 30 % d'alcool et contenant les polyphénols. La solution éthanolique est distillée sur un Rotavapor Buchi équipé d'un ballon de distillation de 20 litres. On récupère 20 litres de concentré polyphénols qui sont séchés sur atomiseur pilote NIRO Pour obtenir 890 grammes de poudre beige.
Le dosage par colorimétrique par Folin-Ciaucalteu, avec la catéchine comme étalon, donne 41 % de polyphénols dont par thiolyse suivie de chromatographie HPLC : - 15% de flavanols (catéchines et polymères procyanidiques)
- 5% de quercétines
- 7% d'acides hydroxicinnamiques (chlorogéniques)
- 5% de dihydrochalcones (phloridzine)
Exemple 8
25 Kg d peaux obtenues dans l'étape de tamisage comme dans l'exemple 1 sont soumis aux mêmes conditions d'extractions que dans l'exemple 6, mais avec un rapport peaux:eau chaude de 4,2%. Au bout de 6 extractions on obtient 3150 Kg de filtrat.
Le filtrat est clarifié sur centrifugeuse débourbeuse SB7 pour obtenir 2995 Kg de liquide clarifié. La phase clarifiée est passée directement sur la colonne de résine adsorbante. La résine est lavée avec 2 volumes d'eau chauffée à 50 0C, puis soumise à un autre lavage par soulèvements et fluidisations par le bas. Après stabilisation de la colonne par passage d'un volume d'eau par le haut, les polyphénols sont élues avec 1 ,5 volumes d'éthanol 70%. L'alcool résiduel de la colonne est récupéré par passage de 1 ,5 litres d'eau chauffée à 50 0C.
On récupère 180 litres qui sont distillées et concentrés comme dans l'exemple 6 pour obtenir 1 ,2 litre de concentré polyphénols. Le concentré est séché par atomisation sur atomiseur de laboratoire BUCHI 90. On obtient ainsi 260 grammes de poudre.
Les dosages effectués comme dans l'exemple 6 donnent 25% de polyphénols totaux dont :
- 6,8% de phloridzine
- 10% de quercétine
- 3,4% de flavanes
- 2% d'hydroxicinnamiques
Exemple 9
500 grammes de pépins entiers obtenus comme dans l'exemple 3 sont directement broyés sur un broyeur à marteau muni d'un tamis de 100 microns pour obtenir une poudre relativement fine.
La poudre est mise en suspension dans de l'hexane dans un rapport poudre:hexane de 10%, soit un volume final de 5 litres. La suspension est agitée 1 heure puis filtrée sur un tamis de 75 microns.
Le résidu de filtration est remis en suspension dans une nouvelle solution d'hexane de façon à avoir les δlitres de mélange. Après 1 heure d'agitation, la suspension est filtrée et l'opération répétée une troisième fois. On récupère au total 12,75 litres d'extrait à l'hexane. L'ensemble de cet extrait est centrifugé pour éliminer les particules insolubles.
Le liquide clarifié est distillé pour éliminer l'hexane et récupérer 99,8 grammes d'huile de pépins de pomme. Les résidus d'extraction à l'hexane sont séchés à 40 0C en étuve ventilée pour éliminer toute trace de solvant résiduel. Des essais préliminaires ont montré que suivant le rapport éthanol/eau, la composition polyphénolique des extraits de pépins entiers varie fortement. On constate en particulier que l'alcool concentré (96%) favorise la solubilisation des dihydrochalcones (phloridzine).
On peut ainsi obtenir des extraits à plus de 95% de phloridzine par rapport aux polyphénols totaux. Par contre, la dilution progressive de l'éthanol entraîne une solubilisation progressive des autres composés phénoliques (procyanidols, hydoxycinnammiques, quercétine). Dans le cas présent, la poudre déshuilée et séchée est dispersée dans une solution d'éthanol 50% dans l'eau et dans un rapport poudre:solvant de 10%. Après 1 heure d'agitation, la suspension est filtrée et le résidu est repris dans une nouvelle solution alcool 50%. Après 1 heure d'agitation, le mélange est filtré à nouveau et l'opération répétée une troisième fois. L'ensemble du filtrat est clarifié par centrifugation et distillé pour éliminer l'éthanol. On récupère ainsi 1 ,9 litres d'extrait aqueux à 4% de matière sèche.
L'analyse de la matière sèche par chromatographie HPLC phase inverse après thiolyse montre qu'elle contient 9,8% de polyphénols totaux dont 7,9% de dihydrochalcones (phloridzine) ; 1 % d'acides hydroxycinnammiques et 0,5% de flavanols (catéchine et polymères de procyanidols).
L'extrait aqueux est passé sur un support de résine adsorbante et lavé avec de l'eau pour éliminer les éléments glucidiques et protéiniques. La résine est lavée à l'éthanol 70% pour récupérer les polyphénols. L'extrait éthanolique contenant les polyphénols est distillé et concentré sur rotavapor. Le concentré est congelé et lyophilisé pour obtenir 17,5 grammes de poudre.
L'analyse par thiolyse suivie de chromatographie HPLC phase inverse donne une poudre à 43% de polyphénols totaux dont 35% de phloridzine, soit 81% de phloridzine par rapport aux polyphénols totaux.
Exemple 10
25 Kg de coques (enveloppes de pépins) obtenues comme dans les exemples 4 et 5 sont soumis aux mêmes procédures d'extraction à l'eau chaude, soutirage, clarification comme dans l'exemple 7 pour obtenir 349 Kg de liquide clarifié.
L'extrait clarifié est passé sur une colonne de 20 litres de résine adsorbante. Après lavage, soulèvement et stabilisation avec à chaque fois 2 volumes d'eau, les polyphénols sont élues par passage de 40 litres d'éthanol 70%, suivi de 40 litres d'eau. On récupère ainsi 80 litres d'extrait polyphénolique dans une solution à environ 35% d'éthanol. L'extrait est distillé et concentré pour obtenir 25 Kg de concentré à 4,2% de matière sèche. Le concentré est séché par atomisation (tour pilote NIRO MINOR production) pour obtenir 1 ,05 Kg de poudre.
Les dosages colorimétriques par la méthode Folin-Ciaucalteu et par chromatographie HPLC donnent la composition polyphénolique suivante :
- 42% de polyphénols totaux par FoNn
- 35% de phloridzine par HPLC.
Exemple 11
10 Kg d'amandes de pépins de pomme obtenues comme dans les exemples 4 et 5 sont directement pressées à froid sur une presse à vis pilote (MECANIQUE MODERNE) pour obtenir 1 ,7 Kg d'extrait brut. L'huile brute est centrifugée sur une centrifugeuse JOUAN de laboratoire pour obtenir 1 ,5 Kg d'huile vierge.
Exemple 12
5 Kg de peaux de pommes obtenues comme dans l'exemple 1 sont extraits plusieurs fois à l'eau chaude 50 0C.
Les solutions aqueuses sont réunies et traitées comme dans l'exemple 7 pour obtenir 48 grammes de poudre polyphénolique lyophilisée. Les résidus de peaux résultant de l'extraction aqueuse sont remis en suspension dans de l'eau chaude 45 0C.
A cette suspension de peau, on apporte un mélange d'enzymes permettant de liquéfier les structures des parois cellulaires végétales (cellulase NOVO et Pectinex NOVO). On laisse l'hydrolyse enzymatique se dérouler 4 heures puis on filtre pour récupérer 1 ,9 Kg de fraction résiduelle constituée essentiellement des structures cuticulaires de pomme.
Ce résidu est lavé trois fois à l'eau pour éliminer tous les éléments solubilisés et autres fines particules ligno-cellulosiques contaminantes. Cette fraction contenant 8% de matière sèche est séchée à 40 0C en étuve ventilée pour récupérer 152 grammes de produit à 7% d'humidité.
Cette préparation de cuticule est finement broyée pour obtenir une poudre très légère de couleur grise à blanc cassé. La poudre ainsi obtenue peut être remise en suspension dans de l'huile végétale pour donner une structure crémeuse. Cela montre qu'elle est facilement utilisable dans des formulations cosmétiques comme source de cires végétales et d'actifs présents dans les cires (acide ursolique).
Exemple 13
5 Kg de peaux obtenues comme dans l'exemple 1 sont mis en solution dans de l'eau chaude 50 0C. Le rapport peaux:eau est fixé à 10%. L'ensemble est soumis à un malaxage lent et continu pendant 10 heures de façon à provoquer la dispersion des couches de pulpes (cellules parenchymateuses) situées sous la cuticule et à solubiliser les polyphénols. Au bout de 10 heures de malaxage, le mélange est dilué et filtré.
Le résidu de filtration est remis en suspension dans de l'eau, agité 5 minutes et filtré. Cette opération de lavage est répétée 2 autres fois. Les phases liquides de lavage sont réunies, clarifiées par centrifugation et ultrafiltrées sur 0,2 m2 de membranes minérales tubulaires 10 000 daltons. Le permeat obtenu est passé sur un support de résine adsorbante pour purifier les polyphénols comme dans les exemples 6 et 7.
Les fractions de cuticule résultant des lavages sont séchées et traitées comme dans l'exemple 10 pour récupérer 50,2 grammes de poudre légère de cires brutes. La poudre légère ainsi obtenue est mise en suspension dans 500 ml d'éthanol 96% et agitée pendant 4 heures. La suspension est filtrée sur un tamis75 μm et le résidu est extrait deux autres fois avec 500 ml d'éthanol 96%. Les filtrats sont réunis et centrifugés à 2000 trs/min pour récupérer 1260 ml de liquide clarifié. L'extrait clarifié est distillé et concentré sur rotavapor BUCHI. Le concentré est congelé et lyophilisé pour récupérer 4,7 g de poudre de cire très légère couleur crème.
Exemple 14 : Evaluation du potentiel irritant oculaire des extraits de pomme.
Le potentiel irritant oculaire des extraits riches en polyphénols de pomme a été évalué selon le test du HET-CAM. Cette méthode est aujourd'hui reconnue officiellement comme un test in vitro d'alternative à l'expérimentation animale (Journal Officiel du 26/12/96).
A. Matériel et Méthodes
Trois extraits polyphénoliques de pomme ont été testés sous la dénomination générale POMACTIV :
1 ) POMACTIV WAP (WAP pour whole apple polyphénols) : Extrait en poudre contenant 41 % de polyphénols totaux dosés par la méthode FoNn dont par chromatographie HPLC :
- 15% de Flavanols
- 5% de Flavonols
- 7% d'acides Hydroxycinnamiques
- 5% de Dihydrochalcones
2) POMACTIV HFV (HFV pour hight flavonols) :
Extrait en poudre contenant 43% de polyphénols totaux dosés par la méthode FoNn dont par chromatographie HPLC :
- 11 ,5% de Flavanols (catéchine et polymères de procyanidols)
- 9% de Flavonols (quercétine et dérivés de quercétine)
- 4,5% Hydroxycinnamiques (acide chlorogénique)
- 7,5% Dihydrochalcones (phloridzine et autres dérivés de phlorétine)
3) POMACTIV HDH (HDH pour hight dihydrochalcons): Extrait en poudre contenant 42% de polyphénols totaux dosés par la méthode FoNn dont, par chromatographie HPLC, 35% de dihydrochalcones (phloridzine)
En résumé, les essais sont réalisés selon la procédure standard. Des œufs embryonnés de poule d'environ 60 grammes ont été incubés, poche d'air vers le haut, à 37,5°C pendant 10 jours. Le produit pur à tester est saupoudré à la surface de la membrane chorioallantoïdienne. Après 20 secondes de contact, la membrane est rincée avec une solution de NaCI 0,9%.
B. Résultats
L'apparition des phénomènes d'injection, d'hémorragie et de coagulation a été recherchée pendant 5 minutes. La cotation a été établie selon un barème de délai d'apparition. La somme des cotations permet d'établir le score pour chaque œuf. L'échantillon testé peut être ainsi classé, comparativement à un témoin lauryl-sulfo-bétaine, en « pratiquement non irritant », « légèrement irritant », « modérément irritant » ou « irritant ». La moyenne des scores obtenus sur 4 œufs par échantillon testé permet le classement des extraits de pomme comme ci- après :
- POMACTIV WAP pur : pratiquement non irritant
- POMACTIV HFV pur : légèrement irritant
- POMACTIV HDH pur : pratiquement non irritant
Ces résultats d'évaluation du potentiel irritant oculaire par la méthode HET-CAM montrent que les extraits polyphénoliques testés directement à l'état pur sous forme de poudres, sont très peu irritants comparativement au témoin. Lauryl-sulfo-bétaïne.
Exemple 15 : Evaluation du potentiel irritant cutané des extraits de pomme sur du tissu dermique humain en culture. A. Matériel et Méthodes
Les extraits de pomme testés sont ceux décrits dans l'exemple 14.
La méthode la plus utilisée mondialement pour évaluer le potentiel irritant cutané consistait à appliquer, à la surface de la peau de lapins, le produit à tester pur ou dilué. Les réactions d'érythèmes et d'œdème étaient relevées et quantifiées selon un barème défini dans le protocole. Les produits testés étaient ensuite classés de faiblement irritant à très irritant selon un indice d'irritation calculé. De nombreux protocoles ont été développés afin de remplacer le test cutané chez le lapin. Aucun des tests étudiés n'a, à ce jour, donné des résultats suffisamment fiables, pour suffire à constituer un dossier de sécurité.
Un test simple, applicable à tout type de produit a été sélectionné pour cette étude. Il montre une prédictibilité suffisante en tant que test préalable à un essai clinique sur volontaires. Ce test n'est qu'indicatif de la présence ou l'absence d'un potentiel irritant. Les résultats obtenus ne sont utilisables qu'au titre de pré-requis pour une étude clinique.
Des explants de peau humaine de 8 mm de diamètre ont été préparés à partir d'une biopsie abdominale prélevée sur un sujet sain au cours d'une intervention de chirurgie plastique. Après élimination du tissu adipeux, les échantillons de peau sont mis en survie dans le milieu de culture approprié. Un volume de 20μl d'extrait de pomme dilué à 2% et à 0,2% (20 et 2 mg/ml) est déposé à la surface d'un pad et appliqué sur l'expiant de peau puis laissé en contact durant 20 heures. Le dodecyl sulfate de sodium (SDS) à 20mg/ml a été utilisé comme témoin irritant de référence. Chaque condition de l'essai est réalisée en hexaplicate.
Après 20 heures de contact avec les produits à tester, la surface de l'épiderme est rincée et le milieu nutritif est remplacé par du milieu de culture contenant du MTT (3-(4,5-diméthyl thiazol-2-yl)-2,5 diphényl- tétrazolium bromide). La transformation du MTT incolore en cristaux bleus de formazan, solubles dans l'isopropanol acide, est proportionnelle à l'activité de la succinate déshydrogénase (une enzyme mitochondriale). Par conséquent, plus l'expiant contiendra de cellules vivantes, plus importante sera la transformation du MTT en cristaux de Formazan par la succinate déshydrogénase. Les cellules sont ensuite lysées et les cristaux de formazan sont solubilisés. La densité optique (DO) à 540 nm, représentative du nombre de cellules vivantes, est mesurée. La viabilité cellulaire est calculée par rapport aux explants témoins. B. Résultats
Selon le taux de viabilité cellulaire, les extraits de pomme testés sont classés comme ci-après comparativement au témoin SDS :
- Témoin Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) à 2% : modérément irritant
- POMACTIV WAP à 2% et 0,2% : non irritant
- POMACTIV HFV à 2% et 0,2% : non irritant
- POMACTIV HDH à 2% et 0,2% : non irritant
Le témoin de référence (SDS), à une concentration de 20 mg/ml, est classé comme « modérément irritant ». Ce résultat était attendu et permet de valider l'étude. Ainsi, selon le test du MTT sur explants de peau humaine, les extraits POMACTIV testés dilués à 2% et 0,2% sont classés « non irritant ».
Exemple 16 : Tolérance cutanée aiguë des extraits de pomme chez des volontaires humains adultes. A. Matériel et Méthodes
L'étude est réalisée selon le patch-test 48 heures occlusif sous contrôle dermatologue, conformément au mode opérationnel référencé « patch test simple ». 1. Volontaires Caractéristiques des sujets inclus
° Dix sujets masculins et féminins âgés de 19 à 57 ans sont inclus dans l'essai
° Signature d'un consentement éclairé de participation
° Aucun antécédent d'intolérance ou d'allergie à une matière première
° Sujets de phototype I à III
Critères de non inclusion
° Femme enceinte ou qui allaite ou prévoyant un début de grossesse en cours d'étude ° Pathologie cutanée sur la zone d'expérience (psoriasis, eczéma, vitiligo, pityriasis, versicolore, acné, etc ..)
° Présence d'un traitement médicamenteux per os
° Début, arrêt ou changement de traitement hormonal < 5 semaines
° Exposition au soleil ou aux UV < 1 mois au niveau du dos
° Peau hyper irritable
° Pilosité importante, taches de rousseur, grains de beauté, tatouage au niveau du dos
° Maladie grave ou évolutive
° Usage immodéré de tabac et/ou d'alcool.
2. Méthodologie de l'essai
Matériel, dose, durée
Les extraits de pomme testés sont ceux décrits dans l'exemple 14.
Ils sont appliqués dans les conditions suivantes :
° Zone : zone scapulaire
° Type de patch tests : Finn Chambers 8 mm (50 mm2), occlusif
° Dose : 25 μl (conditionnée par la capacité de la cupule)
° Conditions d'application : dilué à 25% dans l'huile de paraffine
° Durée d'application : 48 heures
° Contrôle (témoin) : patch sans extrait de pomme
Lectures
Les examens microscopiques cutanés ont été réalisés rigoureusement dans les mêmes conditions, en particulier au niveau de l'éclairage (lampe « lumière du jour », 30 minutes après l'enlèvement des patchs posés depuis 48 heures. En l'absence de toute réaction cutanée locale à la lecture des 30 minutes après enlèvement du pansement, l'essai est arrêté. Dans le cas d'une réaction cutanée visible, le sujet devait revenir au centre d'étude, des lectures étaient effectuées jusqu'à réversibilité des réactions cutanées.
Les cotations des éventuelles réactions d'irritation sur chaque site ayant reçu l'extrait de pomme sur l'expression POMACTIV étudié ont été réalisées comparativement au site sans extrait de pomme POMACTIV. L'analyse et l'interprétation des résultats sont descriptives et complétées par le calcul d'un indice d'irritation moyen (I. I. M.) à chaque temps de lecture. Cet indice permet de classer arbitrairement les extraits selon le barème suivant :
- Non irritant : I.I.M. < 0,20
- Légèrement irritant : 0,20 < I.I.M. < 0,50
- Moyennement irritant : 0,50 < I.I.M. < 1 ,00
- Irritant : I.I.M. > 1 ,00
B. Résultats
Les lectures effectuées 30 minutes et 24 heures après le retrait des patch-tests ont donné les résultats ci-après :
- POMACTIV WAP à 30 minutes et 24 heures de contact : non irritant
- POMACTIV HFV à 30 minutes et 24 heures de contact : non irritant
- POMACTIV HDH à 30 minutes et 24 heures de contact : non irritant
Dans les conditions expérimentales retenues, on peut conclure que les extraits de pomme (POMACTIV) testés sous contrôle de dermatologue, appliqués dilués à 25% dans l'huile de paraffine et localement sous pansement occlusif pendant 48 heures, sur la peau de 10 volontaires adultes, sont classés « non irritant » aux lectures 30 minutes et 24 heures, selon la cotation de l'I.I.M. (indice d'irritation moyen).
Exemple 17 : Effets des extraits de pomme dur l'expression de gènes marqueurs du stress oxydatif et du vieillissement cellulaire A. Matériel et Méthodes
L'extrait de pomme testé est POMACTIV HFV dont les principales caractéristiques sont les suivantes :
Poudre contenant 43% de polyphénols totaux dont, en dosage par chromatographie HPLC :
11 ,5% Flavanes (catéchines et polymères de procyanidols) - 9% Flavonols (quercétines et dérivés)
- 4,5% Hydroxycinnamiques (chlorogénique)
- 7,5% Dihydrochalcones (phloridzine et autres dérivés de phlorétine)
L'étude a été réalisée sur culture de fibroblastes dermiques humains normaux âgés. La population cellulaire largement majoritaire du derme est constituée de fibroblastes. Ces cellules dérivent des cellules mésenchymateuses et synthétisent les précurseurs de la substance intercellulaire du tissu conjonctif. Les fibroblastes produisent et sécrètent la majorité des molécules constituant la matrice extracellulaire dont les collagènes, l'élastine, les glycoprotéines de structure et les protéoglycanes, mais aussi des protéases capables de dégrader et de remodeler cette matrice, telles que les métalloprotéases matricielles (MMPs). Les fibroblastes produisent aussi de nombreux médiateurs, des chimiokines, cytokines et facteurs de croissance nécessaires à l'initiation, et la formation d'un nouveau tissu.
Dans cette étude, la méthode des DNA arrays simplifiés « à thème anti-âge » a été utilisée. 141 gènes cibles d'intérêt majeur ont été sélectionnés pour leur potentiel ou implication importante dans le domaine du vieillissement dermique. L'étude a également pour but de mettre en évidence l'effet de l'extrait de pomme POMACTIV HFV sur l'expression des gènes de fibroblastes âgés ou sénescents.
Une cytotoxicité préalable a été réalisée pour déterminer les doses d'extrait POMACTIV HFV tolérables et utilisables pour le test d'efficacité.
Les analyses sont faites sur les cultures à 6 heures et à 24 heures. Les résultats sont exprimés en unités relatives d'expression (RE). On considère de façon arbitraire qu'un gène est exprimé significativement lorsque le RE est supérieur à 2. Arbitrairement aussi, la limite de significativité est fixée à +180% du témoin non traité pour un effet stimulant et à -65% du contrôle pour un effet répresseur.
B. Résultats
II est important de souligner que cette étude est réalisée sur une culture de fibroblastes âgés presque sénescents. Le résultat espéré est donc que l'extrait de pomme agisse contre ce vieillissement accéléré et restaure l'activité métabolique des cellules dans le sens de la reprise de la prolifération cellulaire, la reconstitution et le remodelage tissulaire. Les résultats montrent effectivement que l'extrait de pomme POMACTIV HFV modifie significativement l'expression d'un nombre élevé de gènes. Parmi les 141 gènes sélectionnés pour leurs implications dans les mécanismes de lutte contre le stress oxydatif et le vieillissement cellulaire, on constate que près du tiers est nettement modifié par POMACTIV HFV. De façon globale, les gènes sont favorablement surexprimés ou réprimés par rapport aux thèmes suivants :
B.1. L'amplification du système Redox de défense anti-stress oxydatif, anti-vieillissement
Le traitement des fibroblastes avec POMACTIV entraîne la surexpression d'un certain nombre de gènes de molécules enzymatiques et non enzymatiques impliquées dans la chaîne de défense antioxydante. On note notamment : la surexpression du marqueur surerpoxyde dismutase 2 (SOD2), enzyme neutralisant les radicaux libres oxygénés pour générer de l'eau oxygénée et de l'oxygène.
- La surexpression des glutaredoxines (GRX) impliquées dans la catalyse de la réduction des disulfites mixtes protéine-S-S- glutathion. Pour maintenir le statut Redox thiol-disulfite cellulaire sous forme réduite, l'un des deux systèmes majeurs utilisés par les cellules est le système glutathion (GSH)/glutarédoxine (GRX).
- La surexpression des metallothionéines (MTS), protéines capables de fixer les métaux potentiellement prooxydants, mais également induites par de nombreuses hormones et cytokines dont les glucocorticoïdes, l'interleukine 1 (I L- 1 ),l'interleukine 6 (IL-6), l'interféron...
La répression du gène Hème oxygénase 1 (HMOX1 ) qui est induite par le stress oxydatif et génère le monoxyde de carbone (CO). Sa répression par l'extrait de pomme signifierait une diminution de l'état de stress oxydatif des fibroblastes en présence de l'extrait de pomme.
La répression de la lipoxygénase-15 B (ALOX15B), enzyme dioxygénase pouvant catalyser l'hydroperoxydation des acides gras poly-insaturés. Plus précisément, la Iipoxygénase-15B catalyse l'insertion de molécule oxygène sur le squelette acide arachidonique au niveau du carbone en position 15. Ainsi, cette enzyme est fortement impliquée dans le processus d'oxydation peroxydative des membranes cellulaires. Par exemple, la Iipoxygénase-15B et ses métabolites ont été détectés en fortes proportions dans les tissus du circuit respiratoire des fumeurs. La répression du marqueur génétique de cette enzyme serait donc favorable contre le stress oxydatif et le vieillissement cellulaire.
La répression de la synthétase 1 de l'oxyde nitrique (NOS1 ). L'oxyde nitrique (NO) régule de nombreuses activités physiologiques au niveau cellulaire et peut également servir de neurotransmetteur. Mais lorsqu'il est produit en excès, l'oxyde nitrique (NO) peut réagir avec un superoxyde pour former du peroxynitrite (ONOO) très réactif et potentiellement plus toxique que NO ou 02" séparément. Le peroxynitrite peut également provoquer la nitration des résidus tyrosine des protéines. L'inhibition de l'expression de l'enzyme NOS1 irait dans le sens d'un contrôle du taux de NO et donc d'une limitation du taux de peroxynitrite (ONOO) Répression de la HSPCB (Heat-shock protein B), généralement exprimée par les cellules en réponse à un choc thermique, mécanique ou chimique. Elle peut être également exprimée par les cellules suite à un déclenchement inflammatoire. Sa répression par Pomactiv signifierait que l'extrait de pomme contribue à atténuer l'effet de choc ou l'action pro-inflammatoire du milieu de culture cellulaire. B.2. L'induction de cytokines
Le traitement des fibroblastes avec POMACTIV HFV entraîne l'induction rapide et forte d'un certain nombre de cytokines et leurs antagonistes impliqués dans les mécanismes de défenses inflammatoires, immunitaires et de remodelage tissulaire, notamment osseux. C'est le cas par exemple pour l'interleukine 6 (IL-6), le monocyte chemotactic protein 1 (MCP1 ) ou le Tumor Necrosis-Related apoptosis Inducing Ligand (TNFSF10 ou TRAIL). Le déclenchement du processus inflammatoire implique l'expression d'une vingtaine de cytokines. De plus, parmi les cytokines, les interleukines 1 (IL-1 ) et le TNF-alpha sont ceux qui jouent un rôle primordial dans le déclenchement de cette réaction inflammatoire. Il est intéressant de noter que ces deux interleukines ne sont pas induites par l'extrait de pomme.
Globalement, les résultats observés ici sur les cytokines sont relativement logiques dans la mesure où les tests visant à démontrer un effet anti-âge ou remodelage tissulaire, type osseux, à partir de cultures cellulaires montrent souvent des effets pro-inflammatoires dans les premières heures. Le traitement de la culture cellulaire sur plusieurs jours montre alors une atténuation progressive des effets proinflammatoires dans le temps. Cela a été confirmé ici par la forte diminution de l'expression de certains gènes cytokines au bout de 24 heures comparativement aux résultats 6 heures.
Il est important de souligner aussi que dans le processus de réparation tissulaire, par exemple cutanée, la première phase de la préparation dite « phase inflammatoire » a pour effets de limiter les perturbations physiologiques provoquées par la lésion, qu'elle soit d'origine mécanique, chimique, thermique ou immunologique. Au cours de cette phase, il y a arrêt de l'éventuel hémorragie, nettoyage du foyer de la perturbation, fourniture d'une matrice provisoire pour la multiplication et la migration des cellules et genèse des facteurs participant à l'initiation de la formation du tissu de granulation.
Il est à souligner aussi que les interleukines dites proinflammatoires sont également impliquées dans le processus du remodelage osseux à travers leurs actions sur les ostéoblastes et ostéoclastes. B.3. Régulation de l'expression des collagènes et autres molécules matricielles
La réparation et le remodelage tissulaire, notamment cutané, impliquent des modifications au niveau de la synthèse et du devenir des collagènes et autres molécules de la matrice interstitielle intervenant dans le processus. Par exemple, les différentes molécules composant la membrane basale épidermique sont exprimées selon une séquence ordonnée. Ainsi, l'étude de peau humaine a montré qu'en général l'antigène de la pemphigoïde bulleuse (une dermatose bulleuse rare) apparaît en premier suivi par le collagène de type IV, la laminine et le collagène de type VII. Il est intéressant de noter que parmi les gènes de collagènes sélectionnés dans la présente étude et testés sur une courte durée de culture (6 et 24 heures), le collagène IV alpha2 est effectivement le plus surexprimé suivi du collagène III alphai . Les collagènes Vl alpha2 et VIII alphai ne sont que très faiblement surexprimés. Par contre, les formes XV alphai , XVIII alphai et I alphai sont réprimées. Il est important de noter que les collagènes XV et XVIII, réprimés ici, occupent une place particulière dans cette famille de protéines. Ils font partie de la sous-famille des multiplexines, caractérisées par de nombreuses zones alternées de collagènes et non- collagènes. Cette structure protéoglycanique permet de les classer dans le groupe des « heparan sulfate proteoglycan » (HSPG). Les séquences protéiques de ces deux collagènes sont très proches et la partie C- terminale (nommée endostatine) de la forme XVIII manifeste une activité ani-angiogénique. Ce collagène XVIII est donc impliqué dans le développement du système vasculaire. En effet, les protéines HSPG agiraient de concert avec les facteurs FGF et VEGF ainsi que leurs récepteurs pour contrôler les différents aspects du développement vasculaire. Une déficience en collagènes précurseurs de l'endostatine, telle qu'observée ici sous l'influence de POMACTIV HFV, serait donc plus favorable au remodelage tissulaire. La migration des kératinocytes implique leur adhésion sur un substratum. Les récepteurs permettant leur fixation et leur migration sont les isoformes d'intégrines. En plus de favoriser l'expression de certains collagènes, substratum de migration, POMACTIV HFV induit une surexpression de gènes récepteurs comme l'intégrine a7b (ITGA7B).
BA. Expression de pênes marqueurs anti-rides et anti-inflammatoires
Dans la présente étude, le traitement des fibroblastes humains âgés avec POMACTIV HFV montre une surexpression significative favorable du gène de la décorine. La décorine est associée à l'amélioration de l'état et l'apparence de la peau. Cette molécule fait partie des petites protéines à leucine jouant un important rôle dans la formation des tissus conjonctifs et la minéralisation. Le taux de décorine est donc considéré comme un bon marqueur de l'état de la peau, notamment du potentiel de formation ou de disparition des rides. En effet, l'augmentation du taux de décorine dans la peau est très importante pour le contrôle et la formation correcte du collagène. Les bénéfices de cette formation correcte du collagène cutané sont nombreux : diminution ou disparition des rides, réparation dermique des peaux photo-âgées. Ainsi, des brevets, visant à diminuer les rides et améliorer l'état de la peau, utilisent la surexpression du gène de la décorine comme marqueur d'efficacité des formulations cosmétiques testées.
La présente invention montre également que le traitement des fibroblastes âgés avec POMACTIV HFV entraîne la répression de gènes codant pour les récepteurs de prostaglandines. Ce qui serait un indice de l'efficacité de POMACTIV contre les phénomènes d'inflammation cutanée. La prostaglandine E (PGE) est un métabolite majeur de l'action de l'enzyme cyclooxygenase sur l'acide arachidonique. PGE joue un rôle important de vasodilatateur et protège contre les vasoconstrictions excessives. Il a été montré que la production de PGE dans les fibroblastes de peau humaine en culture peut être induite par le stimulant inflammatoire PMA (phorbal myristate acétate). En effet, PMA est un stresseur exogène induisant des réponses stress oxydatives et inflammatoires dans les cellules. Ce modèle est donc utilisé pour stimuler l'inflammation in vivo, notamment dans le cadre des études concernant l'inflammation cutanée et son traitement par des compositions cosmétiques. La réponse inflammatoire est mesurée par le taux de prostaglandine, notamment le sub-type E2 (PGE. sub.2). L'efficacité de la formule cosmétique peut être évaluée par le taux de diminution de PGE. La PGE n'a pas été dosée dans la présente étude. Mais, on montre que l'extrait de pomme réprime l'expression de son récepteur. En général, les prostaglandines agissent par l'intermédiaire de leurs récepteurs et seraient impliquées dans des processus cellulaires tels que la résorption osseuse ou l'agrégation plaquettaire. Une diminution de l'expression des récepteurs, telle que montrée ici, serait une voie pour contrer l'action des prostaglandines au niveau cellulaire et donc lutter contre l'inflammation cellulaire, notamment cutanée.
B.5. Expression du pêne télomerase, contrôle du vieillissement et de la sénescence cellulaire.
La présente étude montre que POMACTIV HFV induit la surexpression du gène télomerase. Ce qui irait dans le sens d'une défense des cellules contre le vieillissement et la sénescence. La sénescence réplicative in vitro est caractérisée par un ralentissement puis un arrêt irréversible de la multiplication des types cellulaires prolifératifs. Les stress sub-létaux utilisés pour accélérer le vieillissement cellulaire entraînent l'apparition des principaux marqueurs de vieillissement que sont l'altération morphologique, le raccourcissement des télomères et la perte du processus prolifératif. Les télomères sont des structures formées à l'extrémité des chromosomes linéaires par association de motifs répétitifs d'ADN et de protéines spécifiques. Le raccourcissement progressif des télomères au cours des divisions cellulaires répétées est associé à la sénescence. Ces structures ont donc une importante fonction protectrice des chromosomes. Le mode de réplication de l'ADN conduit à une diminution de la longueur des télomères au cours du temps. L'atteinte d'une taille minimale critique des télomères provoque l'entrée des cellules en sénescence, caractérisée par un arrêt de la division cellulaire. La télomerase, enzyme ribonucléoprotéique, est seule capable de maintenir, voir d'allonger, la taille des télomères. Cela a été montré expérimentalement par introduction de la télomerase humaine dans des fibroblastes ou des kératinocytes humains et la constatation d'un retardement de la sénescence, comparativement à des cultures témoins.
B.6. Expression des métalloprotéases de la matrice extracellulaire et remodelape tissulaire
Par remodelage tissulaire, on entend les modifications transitoires ou permanentes de l'architecture du tissu cicatriciel. Le remodelage se produit lors des différentes phases de la réparation tissulaire et implique la production et l'activation de protéinases par les cellules du tissu conjonctif. La matrice extracellulaire comprend une grande variété de macromolécules dont la dégradation ou l'activation nécessite l'intervention des protéases. De ce fait, elle n'est pas seulement une structure de base des tissus. Elle joue également un important rôle de régulation de la prolifération cellulaire, de l'apoptose, de la migration et de la différenciation. Les protéolyses au niveau de cette matrice extracellulaire constituent un mécanisme de régulation de tous ces processus. Ainsi, les protéases jouent un rôle majeur dans les phases de remodelage telles que la cicatrisation de blessures, l'ovulation, la formation et la résorption osseuse, le remodelage du tissu cutané. De même, ces protéases sont impliquées dans un certain nombre de pathologies liées au dysfonctionnement cellulaire. Chez l'homme, on connaît plus de 20 protéases de la matrice extracellulaire numérotées de MMP-1 à MMP-29 suivant leur spécificité. En général, ces métalloprotéases sont induites en réponse à des facteurs de croissance, cytokines et hormones. La plupart des MMPs sont induites par IL-I b, TNF-a, pDGF, TGF, EGF, FGFb et NGF. L'expression d'un certain nombre de ces marqueurs est modifiée par POMACTIV HFV.
Quatre marqueurs de protéases ont été sélectionnés et recherchés dans le cadre de cette étude. Seules les deux MMP-1 et MMP-3 sont significativement modifiées par l'extrait de Pomme POMACTIV HFV. MMP-3 est d'abord réprimée à 6 heures avant d'être surexprimée à 24 heures. MMP-1 est surexprimée dès 6 heures et est légèrement amplifiée à 24 heures. Durant la cicatrisation, les collagenases comme MMP-1 sont principalement produites par les kératinocytes basaux de l'épiderme. L'activité des collagenases est donc impliquée dans les différentes étapes de la cicatrisation. Leur rôle serait de promouvoir la migration cellulaire. In vitro, les fibroblastes sont capables de synthétiser de la collagénase interstitielle sous l'action stimulante de facteurs comme PDGF, EGF ou TGF. La MMP-3 ou stromélysine-1 , fortement surexprimée ici, est impliquée dans le remodelage tissulaire précédent la formation d'une nouvelle membrane basale. Au niveau du derme, cette enzyme intervient dans la formation et le remodelage du tissu de granulation et dans les processus qui y sont associés tels que l'angiogénèse, l'extravasation.
B.7. Surexpression ou répression des pênes de molécules sipnales, facteurs de croissance, récepteurs et inhibiteur impliqués dans le renouvellement tissulaire, l'anpiopenèse et l'apoptose.
On peut notamment souligner la surexpression favorable des Thrombospondine-2 (TSP-2), décorine (DCN), Monocyte Chemotractant Protein-1 (MCP-1 ), TNF-Related Apoptosis lnducing Ligand (TRAIL), Vascular Endothelial Growth Factor-C (VEGF-C), Integrin Alpha 7 B (ITGA7), Télomerase, Macrophage Migration lnhibitory Factor (MIF), Placenta Growth Factor 1 et 2 (PLGF1 , PLGF2), Pleiotrophin ou Osteoblast Spécifie Factor (PTN), TGFb (transforming growth factor beta). Il est intéressant de rappeler le fait que des facteurs comme la décorine (DCN) et TGFb sont utilisés dans la recherche cosmétique comme marqueurs génétiques de l'efficacité anti-ride ou de remodelage tissulaire. De même, la prostaglandine E2 (PGE. sub.2) est utilisée comme marqueur de l'état inflammatoire dermique (brevets américains N°0,254,252 et N°6,551 ,602). On notera aussi que la télomerase, surexprimée ici, est importante dans le blocage du vieillissement cellulaire, la reprise du processus métabolique et donc la prolifération cellulaire nécessaire au remodelage tissulaire.
Parallèlement à ces surexpressions favorables, on notera la répression tout aussi souvent favorable des gènes Apoptosis Regulator (BAX), Procollagen-C Proteinase Enhancer (PCPEP), Prostaglandin E Receptor 1 (PTGER1 ), Apoptosis Inhibitor Survivin (BIRC5), Caveolin 1 (CAV1 ), LAMINE A (LMNA). De façon générale, et par rapport au thème « anti-âge » de cette étude sur culture de fibroblastes âgés et sénescents, on peut conclure que les phytoactifs présents dans POMACTIV HFV induisent, dans un sens plutôt favorable, l'expression ou la répression de nombreux gènes fortement engagés dans la défense anti-stress oxydatif et antivieillissement, le remodelage tissulaire, l'apoptose et l'angiogenèse.
Exemple 18 : Essai multiparamétrique des effets des extraits de pomme au niveau osseux et adipocvtaire
Dans l'exemple 18, on montre les effets des extraits de pomme sur (i) la lipogénèse, (ii) sur la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes et (iii) sur la différenciation des pré-adipocytes en ostéoblastes
A. Matériel et Méthodes
A l Objectifs de l'essai
Les données bibliographiques indiquent que les polyphénols présents dans les extraits de pomme POMACTIV, notamment la quercétine et surtout la phloridzine (spécifique à la pomme), peuvent manifester diverses activités dont :
- la régulation de l'absorption des sucres
- la régulation de la lipogénèse
- une action favorable sur le remodelage osseux et donc préventive contre l'ostéoporose.
L'objectif de cette étude est de mettre en évidence les propriétés des extraits POMACTIV HFV et POMACTIV HDH, tels que présentés dans l'exemple 1 , sur le métabolisme osseux (action sur l'ostéoporose) et sur le métabolisme adipocytaire (action amincissante, anti-cellulite). Plus précisément, cette étude a pour but :
- d'évaluer les effets des extraits POMACTIV HFV et POMACTIV HDH sur la différenciation de cellules souches en adipocytes. Les paramètres étudiés sont 1 ) la morphologie des cellules (suivi morphologique de la différenciation) et 2) l'expression de gènes codant pour les marqueurs de différenciation PPARG (peroxisome proliferator activated receptor gamma) et G3PDH (glycéraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase).
- D'évaluer les effets des deux extraits POMACTIV sur la différenciation des cellules souches en ostéoblastes. Les paramètres étudiés sont 1 ) la mesure de l'activité de la phosphatase alcaline (PAL) et 2) l'expression de gènes codant pour la phosphatase alcaline (PAL) et le Transforming Growth Factor B-1 (TGFbI ) qui sont des facteurs de différenciation.
A.2. Protocoles
Les cellules utilisées ici en culture étaient des cellules souches poïétiques mésenchymiales humaines (hMSC).
Une cytotoxicité a été réalisée préalable sur les cellules hMSC non différenciées afin de sélectionner les concentrations d'extraits de pomme à tester.
A 2.1 Différenciation des cellules souches hMSC en adipocytes
Après incubation pendant 3 jours à 37°C, le milieu de culture a été éliminé et remplacé par du milieu de différenciation en adipocytes contenant ou non (témoin) l'extrait de pomme à l'essai. Des cultures contrôles ont été réalisées en milieu de maintenance en préadipocytes pendant toute la durée de l'expérience (hMSC non différenciées).
Pour chaque temps de culture (3 jours et 11 jours), les tapis cellulaires des plaques de 24 puits ont été rincés en milieu PBS et les cellules sont conservées en milieu Tri-Reagent à
-800C. Ces échantillons sont ensuite utilisés pour l'extraction de l'ARN nécessaire aux essais de PCR quantitative (gènes codant pour les marqueurs de différenciation). La différenciation morphologique en adipocytes est suivie sur les tapis cellulaires à l'aide d'un marqueur fluorescent spécifique aux lipides intracellulaires.
A.2.2. Différenciation des hMSC en ostéoblastes
Après incubation 24 heures à 37°C, le milieu de culture a été éliminé et remplacé par du milieu de différenciation en ostéoblastes contenant ou non (témoin) l'extrait POMACTIV à l'essai. Des cultures contrôle sont réalisées en milieu de croissance pendant toute la durée de l'expérience (hMSC non différenciées).
Les changements de milieux sont effectués tous les 3 jours Pour chaque temps (3 jours et 11 jours), les tapis cellulaires des plaques de 24 puits ont été rincés en milieu PBS et les cellules sont conservées en milieu Tri-Reagent à -800C. Ces échantillons sont ensuite utilisés pour l'extraction de l'ARN nécessaire aux essais de PCR quantitative (gènes codant pour les marqueurs de différenciation). L'activité enzymatique de la phosphatase alcaline a été évaluée sur les tapis cellulaires à l'aide d'un kit de dosage (Sigma AP-F).
B. Résultats
B.1. Cytotoxicité préalable
Les résultats de cytotoxicité MTT et l'observation morphologique des cellules ont conduit à la sélection des concentrations suivantes à tester :
POMACTIV HFV : 0,04 mg/ml
POMACTIV HDH : 0,02 mg/ml
B.2.Adipopenèse
L'observation des cellules hMSC différenciées ou non, en présence (ou non) d'extrait POMACTIV, après 3 jours et 11 jours de culture donne les résultats ci-après :
° Dans les cultures non traitées avec l'un des extraits de pomme
POMACTIV, on observe une augmentation progressive, dans le temps, de l'accumulation des lipides intracellulaires. Les cultures cellulaires à 11 jours montrent une forte accumulation comparativement aux cultures 3 jours.
° Les cultures cellulaires en présence des extraits de pomme
POMACTIV montrent une inhibition de l'accumulation lipidique intracellulaire.
° La diminution des lipides intracellulaires est beaucoup plus significative dans les cultures à 11 jours en présence des extraits
POMACTIV. ° POMACTIV HFV à 0,04 mg/ml est plus efficace que POMACTIV HDH 0,02 mg/ml pour inhiber l'accumulation lipidique dans les cellules. Cela peut être dû à la différence de composition des deux extraits ou à un effet dose.
Le traitement des cultures de cellules souches poïétiques mésenchymiales humaines (hMSC) avec POMACTIV HFV ou HDH modifie l'expression relative des messagers PPARG et G3PDH. Concernant le messager PPARG, on note en particulier : ° Une activation précoce de l'expression du messager PPARG pour les cultures 3 jours, suivie d'une inhibition très significative de cette expression pour les cultures à 11 jours. ° La surexpression du messager PPARG à 3 jours est plus importante pour POMACTIV HFV (187% par rapport au témoin 100%) comparativement à POMACTIV HDH (142% par rapport au témoin).
° Malgré une concentration moitié moindre, l'inhibition de l'expression du messager PPARG à 11 jours a tendance à être plus marquée pour POMACTIV HDH (75% du témoin ou -25% d'expression par rapport au témoin) comparativement à POMACTIV HFV (86% du témoin ou -14% d'expression par rapport à ce témoin). Ce résultat peut s'expliquer par la différence de composition des deux extraits, notamment la richesse de POMACTIV HDH en phloridzine. Cette molécule est connue pour ses effets similaires à ceux des isoflavones de soja. Or, ces derniers sont efficaces pour réprimer l'expression du messager PPARG.
Concernant le messager G3PDH, on note :
° Une activation relativement forte de l'expression du messager
G3PDH pour les cultures 3 jours (306% pour HFV et 182% pour
HDH comparativement au témoin 100%).
° Ce messager G3PDH reste surexprimé après 11 jours de cultures (254% pour HFV 149% pour HDH), mais à un degré moindre comparativement aux cultures 3 jours
° POMACTIV HFV provoque les surexpressions les plus fortes. La G3PDH est une enzyme importante du métabolisme énergétique cellulaire et sa surexpression peut signifier une importante augmentation du métabolisme cellulaire général. Cela est confirmé par l'augmentation de la matière protéique cellulaire comparativement à l'activité phosphatase alcaline.
B.3. Ostéopenèse
Parallèlement à l'inhibition globale de l'adipogenèse, on constate une nette modification des marqueurs de différenciation testés indiquant une orientation des cellules souches vers l'ostéogenèse. On note notamment une forte augmentation de l'activité phosphatase alcaline ainsi que la surexpression de son messager sous l'effet des extraits de pomme. Par contre, le messager TGFbI n'est que faiblement modifié par les extraits de pomme, avec notamment une tendance à la surexpression.
De façon plus détaillée, concernant l'activité enzymatique, on note que :
° L'activité enzymatique de la phosphatase alcaline (PAL) est fortement augmentée par le traitement des cultures cellulaires avec POMACTIV HFV ou POMACTIV HDH et ce dès 3 jours de culture (208% d'activité pour POMACTIV HFV et 152% pour POMACTIV HDH comparativement au témoin 100%). ° Cette activité enzymatique PAL n'est que modérément amplifiée aux cultures 11 jours comparativement à celles de 3 jours (216% pour HFV et 170% pour HDH)
° L'activité PAL à 3 jours, rapportée à la quantité de protéines totales cellulaire confirme clairement cette augmentation (260% pour HFV et 190% pour HDH).
° Par contre l'activité enzymatique PAL rapportée aux protéines totales cellulaires aux cultures 11 jours montre une forte diminution (150% pour HFV et 96% pour HDH) comparativement aux résultats à 3 jours. Cela indique une forte augmentation de la matière protéique cellulaire autre que celle de la phosphatase alcaline, traduisant une activité métabolique accrue, notamment de synthèses protéiques, dans les cellules. ° POMACTIV HFV est plus efficace que POMACTIV HDH pour augmenter l'activité de la phosphatase alcaline, peut-être du fait de la composition polyphénolique, notamment la synergie possible entre phloridzine et quercétine, ou d'un effet dose. Les extraits testés étant 100% issus de la pomme et dosés à environ 40% de polyphénols totaux, une participation synergique des autres éléments, même mineurs, du fruit n'est pas exclu (oligosaccharides, peptides, acides aminés, minéraux, terpénoïdes et éléments lipidiques).
Concernant l'expression des messagers marqueurs de différenciation, on constate que :
° A trois jours de cultures cellulaires, seul POMACTIV HFV provoque une surexpression du messager phosphatase alcaline
(219% par rapport au témoin 100%). POMACTIV HDH ne provoque quasiment pas de modification.
0 A 11 jours de cultures cellulaires, les deux extraits provoquent une nette surexpression du messager phosphatase alcaline avec
318% pour POMACTIV HFV et 179% pour POMACTIV HDH.
° A 3 jours de cultures cellulaires, on ne note qu'une faible surexpression du messager TGFbI sous l'influence de
POMACTIV HFV (126%). Par contre POMACTIV HDH provoque plutôt une inhibition de cette expression (67%).
A 11 jours de cultures, on observe très peu de modifications de l'expression du messager TGFbI par les extraits de pomme comparativement au témoin avec 80% pour POMACTIV HFV et
83% pour HDH.
Il est intéressant de noter que la surexpression du marqueur TGFb par l'extrait de pomme POMACTIV HFV a été également montré sur les cultures de fibroblastes âgés de l'exemple 4.
La présente étude montre que, dans les conditions expérimentales utilisées, les extraits de pomme testés (POMACTIV HFV et HDH) ont des effets globalement favorables en termes d'inhibition de l'accumulation des lipides intracellulaires et de modification des marqueurs de différenciation cellulaire. On note notamment une répression des marqueurs de différenciation des préadipocytes en adipocytes et une surexpression des marqueurs de différenciation préadipocytes vers l'ostéogenèse. A souligner aussi que le traitement des cultures cellulaires avec les extraits de pomme entraîne une activité métabolique accrue traduite par l'augmentation de la matière protéique totale.
Au niveau de l'organisme, plusieurs facteurs transcriptionnels contrôlent l'engagement et/ou le maintien de la différenciation terminale des adipocytes. Ces facteurs peuvent agir de façon autonome ou coopérative. Le PPARG (peroxisome proliferator activated receptor gamma) est un facteur transcriptionnel très important dans la lipogenèse. Ce récepteur nucléaire est le régulateur central du développement du tissu adipeux et l'augmentation de son expression est favorable à la lipogenèse et la formation des cellules adipocytes graisseuses. Sa répression par les extraits de pommes, dans les cultures cellulaires à 11 jours, serait l'un des mécanismes d'inhibition de la lipogenèse par ces derniers. La phosphatase alcaline et son messager constituent de bons marqueurs confirmant la différenciation cellulaire dans le sens de l'ostéogenèse. Cette enzyme est impliquée dans la minéralisation osseuse par le dépôt de calcium. L'augmentation de son expression et de son activité dans les cultures cellulaires indique clairement l'orientation des cellules souches vers l'ostéogenèse.
Exemple 19 : Composition dermatologique anti-âge, utilisable en tant que composition pour la protection contre les rayons U.V.
L'extrait de pomme utilisé est POMACTIV HFV Tel décrit dans l'exemple 14
INGREDIENTS PROPORTIONS
(% en poids)
Phase 1
Eau déminéralisée 57,30
CARBOPOL ULTREZ 10 (NOVEON) 00,20 Gomme Xanthane (4%) 04,00
Phase 2
Dimethicone 04,50
Octyl méthoxycinnamate 04,00
Benzophénone-3 00,50
Ethoxy diglycol oléate 05,00
Tocophéryl acétate 00,60
Cétyl alcool 02,00
Stéaryl alcohol 02,00
EMULFREE P (Gattefossé) 07,00
Phase 3
Aluminium starch octényl succinate 03,00
Glycérine 01 ,50
Butylène 01 ,50
Phase 4
Dimethicone 02,50
Phase 5
Fragrance 00,20
PHENONIP (NIPA) 00,60
YELLOW 6 (LCW) 00,35
POMACTIV HFV 01 ,50
Eau déminéralisée 01 ,50
Phase 6
Aminométhyl propanol 00,25
Préparation de la composition
La préparation de la crème peut être réalisée telle que décrite ci-après :
- saupoudrer le CARBOPOL dans l'eau déminéralisée et laisser reposer
- préparer la solution de gomme xanthane
- préparer les phases 1 , 2, 3 et 5 sous agitation vive (3000 trs/min) ajouter la phase 2 chauffée à
75°C dans la phase 1 chauffée à 75°C. Maintenir sous agitation vive pendant 5 à 10 minutes.
Refroidir à 45°C sous agitation lente (1000 trs/min)
Ajouter les phases 3 et 4
Refroidir à 30 - 35°C
Ajouter les phases 5 et 6
Laisser en agitation encore 20 minutes
Exemple 20 : Composition dermatologique pour la protection solaire
L'extrait de pomme utilisé dans cette formule est POMACTIV WAP tel que décrit dans l'exemple 14.
INGREDIENTS PROPORTIONS
(% en poids)
Phase 1
Eau déminéralisée 42,75
Amidon modifié (solution 12%) 16,00
Gomme xanthane (solution 4%) 12,00
Glycérine 01 ,50
Disodium EDTA 00,05
Phase 2
Octyl méthoxy cinnamate 05,00
Butyl méthoxydibenzoil méthane 00,50
Octocrylène 00,40
4-Méthylbenzilidene Camphor 01 ,00
SEDEFOS 75 (Gattefossé) 04,00
Isostéaryl isostéarate 03,00
Cétyl diméthicone 01 ,00
Cétostéaryl alcool 00,50
Tocophéryl acétate 01 ,00
Cyclométhicone 02,00 Phase 3
POMACTIV WAP 02,00
Eau déminéralisée 06,00
PHENONIP (NIPA) 00,70
Fragrance 00,20
Phase 4
YELLOW 6 (LCW) 00,50
Préparation de la composition
- Préparer le gel d'amidon dans l'eau à 800C sous agitation forte pendant 30 minutes. Laisser reposer
- Préparer la solution de gomme xanthane dans l'eau sous agitation. Laisser reposer
- Préparer les phases 1 , 2 et 3
- Sous agitation forte (3000 trs/min) ajouter la phase 2 chauffée à 75°C dans la phase 1 chauffée à 75°C et maintenir l'agitation pendant 10 minutes
- Refroidir à 300C sous agitation modérée (1000 trs/min)
- Ajouter la phase 3 et 4 et laisser encore en agitation 10 minutes
- Terminer le refroidissement
Exemple 21 : Gel dermatologique amincissant anti-cellulite
Les extraits de pomme utilisés dans cet exemple sont POMACTIV HFV ou POMACTIV HDH tels que décrits dans l'exemple 14, ainsi que l'huile de pépins de pomme telle qu'obtenue par le procédé d'obtention d'un extrait végétal.
INGREDIENTS PROPORTIONS
(% en poids)
Phase 1 Eau déminéralisée 65,33
CARBOPOL ULTREZ 21 00,50
Sodium hydroxyde (solution 20%) 00,04
Phase 2
Ethoxydiglycol oleate 16,00
PHENONIP 00,60
Vitamine E acétate 00,30
Phase 3
Eau déminéralisée 10,00
POMACTIV HFV ou HDH 05,00
Phase 4
NOVEMER EC-1 01 ,00
Huile de pépins de pomme 00,50
Phase 5
YELLOW 6 00,20
Fragrance 00,40
Sodium hydroxyde (20%) 00,13
Préparation de la composition
- préparer la solution de NaOH 20% dans de l'eau déminéralisée
- Préparer les phases 2, 3 et 4
- Saupoudrer le CARBOPOL dans l'eau (les 65,33 g), lorsqu'il est bien hydraté, le mélanger à faible vitesse.
- Neutraliser avec NaOH
- Ajouter la phase 2 à la phase 1
- Ajouter la phase 3 en agitant lentement jusqu'à uniformisation
- Ajouter la phase 4 en agitant jusqu'à uniformisation
- Ajouter les ingrédients de la phase 5 dans l'ordre en agitant jusqu'à uniformisation.
Exemple 22 : Gel corps amincissant anti-cellulite
L'extrait de pomme utilisé est POMACTIV HFV tel que décrit dans l'exemple 1
INGREDIENTS PROPORTIONS
Phase 1
Eau déminéralisée 96,25
Tetrasodium EDTA 00,10
Propylène glycol 02,00
Pyrus Malus (Apple) Fruit Extract Pomactiv HFV 00,40 Methylchoroisothiazolinone (and) Methylisothiazolinone 00,05
Phase 2
Acrylates/C 10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer 00,50 Phase 3
Triéthanolamine 00,60
Phase 4
Parfum (Poma SA 24300) 00, 10
TOTAL 100,00
MODE OPERATOIRE
° Placer la phase 1 sous agitation ° Peser la phase 2 et le laisser s'hydrater au repos ° Mettre les phases 1 +2 sous agitation puis neutraliser à pH=6,5 avec la phase 3
° Ajouter la phase 4 et agiter jusqu'à homogénéisation
Exemple 23 : Crème de visage anti-rides
L'extrait de pomme utilisé est POMATIV HFV tel que décrit dans l'exemple 14
INGREDIENTS PROPORTIONS
(% en poids)
Phase 1
Macadamia integrifolia 06,00
Jojoba esters 06,00
Polyacrylate 13 (and) polyisobutene (and)
Polysorbate 20 02,00
Phenoxyethanol (and) Methylparaben (and)
Butylparaben (and) Ethylparaben (and)
Propylparaben 01 ,00
Parfum (Manzana Mix 24730) 00,20 Phase 2
Eau déminéralisée 82,30
Tetrasodium EDTA 00,10
Propylène Glycol 02,00
Pyrus Malus (Apple) Fruit extract (Pomactiv HFV) 00,40
TOTAL 100,00
Préparation de la composition
° Placer la phase 1 sous agitation
° Préparer la phase 2 et l'ajouter à 1 sous agitation
° Agiter jusqu'à homogénéisation et régler si besoin le pH vers 5,5-6,5
Exemple 24: Agent cosmétique pour le traitement capillaire
L'extrait de pomme utilisé ici est POMACTIV WAP tel que décrit dans l'exemple 14.
INGREDIENTS PROPORTIONS
(% en poids)
Eau déminéralisée 60,55
Cocoamidopropyl betaine (35%) 15,00
Alkyl ether sulfates 12,00
Caprylyl/capryl glucoside 02,00
Cocoamide MEA 02,00
Glycerol 02,00
PEG-120 Methyl glucose dioleate 02,50
Fragrance 00,40
PHENONIP 00,50
EDTA 00,05
POMACTIV WAP 03,00 Exemple 25 : Lotion corporelle huile/eau
Les extraits de pomme utilisés dans cette formule sont POMACTIV WAP tel décrit dans l'exemple 14 et l'huile de pépins de pomme telle qu'obtenue par le procédé d'obtention d'un extrait végétal.
INGREDIENTS PROPORTIONS
(% en poids)
Phase 1
Huile de pépins de pomme 05,00
TWEEN 60 .RTM. 01 ,00
Glyceryl stéarate 02,00
Stearic acid 01 ,50
Paraffin liquid 10,00
Phase 2
Triethanolamine 00,80
Phase 3
CARBOPOL 940 .RTM. 00,20
Eau déminéralisée contenant
0,4% d'agent conservateur 50,00
Phase 4
POMACTIV WAP 01 ,00
Fragrance 00,30 Eau déminéralisée contenant
0,4% d'agent conservateur 28,20
Exemple 26 : Crème de protection
INGREDIENTS
PROPORTIONS
(% ei poids)
Préparation de cire et d'huile
Cire de pomme 20,00
Extrait de pomme riche en acide ursolique 10,00
Cire animale ou végétale ou minérale du commerce 20,00
Huile de pépins de pomme 50,00
Préparation de la crème
Phase cire/huile ci-dessus 05,00
Glycerin stéarate 08,00
Stéarine 01 ,50
Paraffin Liquid 08,00
POMACTIV WAP 01 ,50
P-hydroxybenzoic acid propyl ester 00,15
P-hydroxybenzoic acid methyl ester 00,35
Allantoin 00,20
Fragrance 00,30
Eau déminéralisée 75,00
Exemple 27 : Huile de massage
L'extrait de pomme utilisé est l'huile de pépins de pomme telle qu'obtenue par le procédé d'obtention d'un extrait végétal.
INGREDIENTS PROPORTIONS
(% en poids)
Polydecene 57,50
Phenyl Trimethicone 07,50
PEG-6 Isostearate 18,00
Huile de pépins de pomme 10,00 Huile d'amande douce 05,00
Tocopheryl acétate 00,50
V-Tonic (mélange huiles essentielles) 01 ,50
Les ingrédients sont mélangés à froid dans l'ordre
Exemple 28 : Capsules de complément alimentaire amincissant anti-cellulite ou anti-ostéoporose
Les extraits de pomme utilisés dans cette formule sont POMACTIV HDH ou POMACTIV HFV tels que décrits dans l'exemple 14.
INGREDIENTS PROPORTIONS
POMACTIV HDH ou HFV 75,00 mg
Vitamine D (cholécalciférol) 70,00
IU
Isoflavones de soja (poudre titrée à 30%) 60,00 mg
Magnésium stéarate 05,00 mg
POMELITE (poudre fibres solubles de pomme) QSP
400 mg
Exemple 29 : Capsules anti-âge ou anti-stress oxydatif
L'extrait de pomme utilisé est POMACTIV HFV tel que décrit dans l'exemple 14
INGREDIENTS PROPORTIONS
POMACTIV HFV 150 mg
Bêta carotène naturel (titré à 10%) 20 mg
Vitamine C (acide ascorbique poudre) 50 mg Vitamine E (poudre titrée à 50%) 15 mg
Sélénium (sodium sélénate) 12 μg
POMELITE LV (fibres solubles de pomme) 100 mg
Lactose anhydre 65 mg
TOTAL 400 mg
Exemple 30 : Capsules anti-âge
L'extrait utilisé est POMACTIV HFV tel que décrit dans l'exemple 14.
INGREDIENTS PROPORTIONS
POMACTIV HFV 200 mg
POMELTE LV (fibres solubles de pomme) 215 mg
Silice colloïdale 10 mg
Carboxyméthyl cellulose 20 mg
Magnésium stéarate 5 mg
TOTAL 450 mg
Exemple 31 : Tablettes enrobées
L'extrait utilisé est POMACTIV HFV tel que décrit dans l'exemple 14.
INGREDIENTS PROPORTIONS
POMACTIV HFV 80 mg
POMELITE LV (fibres solubles de pomme) 20 mg
Calcium phosphate dibasique 20 mg
Lactose anhydre 18 mg
Sodium Carboxyméthyl cellulose 10 mg
Magnésium stéarate 2 mg
TOTAL 150 mg
Préparation de l'enrobape
Hydroxypropyl méthyl cellulose 5 mg
Polyéthylène glycole 1 mg
Dioxyde de titane 1 mg Talc 1 mg
TOTAL 8 mg
Exemple 32 : Comprimé effervescent anti-âge ou anti-stress oxydatif
L'extrait de pomme utilisé est POMACTIV WAP tel que décrit dans l'exemple 14
INGREDIENTS PROPORTIONS
POMACTIV WAP 200 mg
B carotène (poudre titrée à 10%) 144 mg
Vitamine C (poudre d'acide ascorbique) 440 mg
Acide citrique 1000 mg
Vitamine E (poudre titrée à 50%) 100 mg
Polyéthylène glycol (poudre) 90 mg
Aspartame 20 mg
Acesulfame K 10 mg
Mannitol MG 1066 mg
Sodium bicarbonate 800 mg
Sodium carbonate 80 mg
Colorant anthocyane P 10 mg
Arôme Pomme (poudre) 25 mg
Arôme citron 15 mg
TOTAL 4000 mg
EXEMPLE 33 : Test clinique d'évaluation de l'efficacité anti-rides et anti-cellulite, de l'acceptabilité et de la tolérance d'une crème cosmétique sur le relief cutané.
L'extrait de pomme testé était HFV incorporé dans des formules cosmétiques telles que présentées dans les exemples 22 et 23, sur 20 individus volontaires ; Protocole :
Les formules ont été testées sur un panel de 20 femmes, âgées de 35 à 60 ans, pendant un mois, sous contrôle d'un dermatologue.
Des critères d'inclusion et de non inclusion sont établis pour sélectionner les personnes participant au test clinique.
Pour les effets anti-rides, les participants faisaient deux applications par jour le matin et le soir sur l'ensemble du visage. Pour les effets anti-cellulite, les participants font deux applications par jour le matin et le soir sur les cuisses, fesses, hanches et taille.
Les évaluations sont faites au cours de visites au centre de test, au début du test (JO), après 14 jours (J14) puis 28 jours (J28) d'utilisation des produits.
L'évaluation de l'efficacité des produits est faite à travers les données ci-après :
- Données objectives au niveau du visage, évolution de la profondeur des rides au niveau des pattes d'oie et de la rugosité de la peau au niveau des pommettes.
Données objectives au niveau des cuisses, évolution du tour de cuisse et du tour de taille.
Données de tolérance à travers l'examen dermatologique.
- Données subjectives par autoévaluation, efficacité perçue et acceptabilité des formules à l'essai.
A. MATERIELS ET METHODES
1. Volontaires
1. 1. Principe de recrutement
Une procédure de recrutement et de sélection des volontaires est élaborée pour garantir afin de leur garantir une information claire et précise sur l'étude un entretien préalable au cours duquel l'objectif, le protocole de l'étude, le planning sont expliqués - la signature d'un formulaire de consentement éclairé à l'étude : les volontaires donnent leur accord en toute liberté par rapport aux conditions proposées
1. 2. Critères d'inclusion
- personne ayant donné un consentement libre, éclairé et exprimé par écrit
- personne coopérante, avertie de la nécessité et de la durée des contrôles
- femme âgée de 35 à 60 ans
- femme ayant des rides et ridules visibles au niveau des pattes d'oie
- phototype II, III ou IV
- femme ayant une cellulite visible et bien installée au niveau des cuisses
- personne ayant un poids stable depuis au moins 3 mois
1. 3. Critères de non inclusion personne présentant des antécédents connus d'allergies à des cosmétiques personne enceinte ou susceptible de l'être pendant l'étude
- personne en période d'allaitement
- personne atteinte d'une maladie grave ou évolutive
- personne utilisant une crème ayant une action sur le relief cutané ou sur l'aspect de l'épiderme ou ayant arrêté ce type de traitement depuis moins de 1 mois personne ayant fait un lifting personne ayant eu des injections de collagène
personne ayant une pathologie cutanée - personne suivant un traitement contre l'acné à base de rétinoïdes ou arrêté ce type de traitement depuis moins de 1 mois personne ayant changé ou arrêté un traitement hormonal ou contraceptif depuis moins de 3 mois
- personne ayant tout autre traitement susceptible d'influencer les paramètres mesurés
1. 4. Traitements associés
En cas de présence d'une pathologie associée, non gênante pour la poursuite de l'étude, le traitement en cours doit être poursuivi durant l'étude, si possible sans changement de posologie. Si au cours de l'étude, un événement intercurrent, c'est-à-dire lié à cette pathologie, nécessitait une thérapeutique, celle-ci devait être mise en œuvre.
1. 5. Perdus de vue et exclusion en cours d'étude
Les données relatives aux sujets perdus de vue ou exclus en cours d'étude pour non respect du protocole ne sont pas utilisées pour le traitement statistique. Elles sont reportées séparément dans le rapport d'étude. La justification de chaque sortie d'étude est indiquée. Les personnes perdues de vue ou exclues en cours d'étude ne sont pas remplacées.
2. Critères d'évaluation
L'évaluation de l'efficacité des produits est faite au cours de visite dans le centre de réalisation de l'étude au début du test (JO), après 14 jours (J14) puis 28 jours (J28) d'utilisation du produit à l'essai. Les paramètres évalués étaient les suivants :
1 ) évaluation de l'état de la peau au niveau du visage et des cuisses par le dermatologue à JO et J28
2) évaluation de la profondeur des rides au niveau des pattes d'oie à JO, J14 et J28
3) évaluation de la rugosité de la peau au niveau des pommettes à JO, J14 et J28
4) évaluation du tour de cuisses et du tour de taille à JO, J14 et J28
5) données d'un questionnaire sur l'efficacité perçue et l'acceptabilité du produit à l'essai
2. 1. Contrôle dermatologique au niveau du visage et des cuisses
A JO et J28, un médecin dermatologue évalue l'état de la peau au niveau du visage et des cuisses. Les paramètres évalués étaient :
- érythème,
- prurit,
- œdème,
- vésicules.
Ces paramètres permettaient d'évaluer également la tolérance du produit à l'essai en fin de test.
2.2. Mesures objectives au niveau du visage
La profondeur des rides était évaluée par profils de lignes au niveau des pattes d'oie droites et gauches. Il était alors possible de comparer la profondeur des rides entre JO, J14 et J28. La profondeur des rides a été mesurée par profilométrie, comme décrit dans les articles suivants : ZAHOUANI M. et al. (Etude tridimensionnelle du relief cutané. ITBM 1985 Vol. 6, N°4, pp 447-460), LAGARDE J. M. (Le microrelief cutané Keratin 2001 ; pp 4 : 11-18), et DARDOUR O. et al. (Le vieillissement cutané. Eds FLASH M EDIAS 1998. pp 1-104).
Les indices de rugosité permettaient de quantifier l'état de la peau à JO, J14 et J28. Les deux paramètres analysés étaient Ra (rugosité moyenne) et Rt (hauteur maximale de la surface).
L'appareil utilisé pour l'ensemble de ces mesures était un 3D Skin Analyser
2. 3. Paramètres anthropométriques
Les paramètres mesurés à JO, J14 et J28 étaient les suivants :
- le poids (en kg)
- la taille (en cm) le tour de taille (en cm) le tour de cuisses (en cm)
Le poids et la taille permettent de déterminer l'indice de masse corporelle = poids/taille2 (en kg/m2). Cet indice devait rester stable durant tout l'essai.
2. 4. Auto-évaluation de l'aspect cutané au niveau du visage et des cuisses
L'état de la peau est évalué à JO, J14 et J28 à travers une liste d'items cotés sur une échelle de 0 à 7 selon l'intensité ressentie par le volontaire. Au niveau du visage :
- la fermeté cutanée
- l'élasticité cutanée
- l'éclat du teint,
- l'uniformité du teint,
- la peau lisse
- l'hydratation de la peau,
- la présence et la profondeur des rides
Au niveau des cuisses
- la fermeté cutanée
- l'élasticité cutanée
- la peau d'orange (à l'œil nu)
- la peau d'orange (au pincement)
- la peau lisse
- l'hydratation de la peau
2.5. Efficacité perçue au niveau du visage et des cuisses
Un questionnaire d'évaluation de l'efficacité perçue était distribué aux volontaires à JO, J14 et J28. Il permettait d'évaluer l'efficacité des produits testés sur la diminution des rides et sur l'amélioration de l'aspect cellulite à travers une liste d'affirmations.
Au niveau du visage :
- l'atténuation des rides
- le raffermissement et la tonicité de la peau
- l'amélioration du grain de la peau
- l'hydratation de la peau
- la sensation d'une peau revitalisée, d'un visage plus jeune,
- l'amélioration de l'éclat du teint Au niveau des cuisses l'amélioration du grain de la peau le raffermissement et la tonicité de la peau la réduction de la peau d'orange l'amélioration du ventre plat
- l'amélioration de la silhouette
- l'hydratation de la peau
2. Traitements statistiques
Les données quantitatives ont été traitées à l'aide de tests de Student sur données appariées (comparaison des mesures avant et après traitement).
Si le degré de significativité p est inférieur à 0,05, le test est significatif et il y a une évolution significative entre les mesures effectuées avant et après traitement.
Si 0,05<p<0,10, on admet une tendance significative ou un effet léger du produit
Les données qualitatives sont rapportées en pourcentage et à l'aide d'illustrations graphiques.
Le logiciel utilisé pour le traitement statistique était le logiciel SPSS version 12.0
B. Principaux résultats obtenus :
- Les formules sont tolérées par 100% des femmes volontaires. Diminution de la profondeur des rides au niveau des pattes d'oie de 18% en moyenne après 14 jours et de 20% en moyenne après 28 jours.
- Diminution de la rugosité de la peau au niveau des pommettes de 8% en moyenne après 14 jours et de 16% en moyenne après 28 jours. L'aspect peau d'orange au niveau des cuisses, avec et sans pincement est nettement amélioré après 28 jours.
L'efficacité au niveau du visage est perçue par plus de 50% des femmes en termes d'hydratation, d'éclat du teint et de lissage du grain de la peau.
L'efficacité au niveau des cuisses est perçue par plus de 50% des femmes en termes d'hydratation de la peau.
Les formules ont été très appréciées et jugées pratiques, faciles à appliquer, avec une texture et une odeur agréables.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour l'obtention d'un extrait végétal de fruits à pépins enrichi en une ou plusieurs substances végétales d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) séparer, à partir des fruits à pépins de départ, ou d'un marc de départ obtenu à partir desdits fruits à pépins, à l'état sec, respectivement les fractions suivantes :
(i) une fraction de matière enrichie en peaux,
(ii) une fraction de matière enrichie en pulpe,
(iii) une fraction de matière enrichie en pépins entiers, ou une fraction choisie parmi les fractions suivantes :
- (iii-1 ) une fraction de matière enrichie en amandes de pépins,
- (iii-2) une fraction de matière enrichie en coques de pépins, b) préparer, à partir d'au moins l'une des fractions (i), (ii), (iii), (iii- 1 ) et (iii-2) obtenues à l'étape a), un extrait enrichi en une ou plusieurs substances végétales d'intérêt.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que, à l'étape a), les fractions (i), (ii), (iii), (iii-1 ) et (iii-2) sont obtenues à la suite d'une ou plusieurs étapes de séparation des constituants de la matière de départ selon au moins l'une des caractéristiques suivantes :
- la forme des constituants,
- les propriétés d'adhésion des constituants sur un support,
- la taille des constituants,
- la densité des constituants, ou une combinaison de plusieurs des caractéristiques ci-dessus.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'étape a) comprend l'étape suivante : ai) séparation de trois fractions par tamisage avec double tamis de, respectivement :
- une fraction enrichie en peaux ;
- une fraction enrichie en pulpe ;
- une fraction enrichie en pépins
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la fraction enrichie en pépins obtenue à la fin de l'étape ai ) est soumise à l'étape de séparation additionnelle suivante : a1a) séparation des constituants selon leur densité, pour obtenir les fractions suivantes :
- une fraction enrichie en pépins,
- une fraction enrichie en peaux et pulpe.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'à l'étape a1a), la séparation est réalisée avec un dispositif à table densitométrique à flux d'air.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'à l'étape a1a), la séparation est réalisée avec un dispositif séparateur à flux d'air conique.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape a1a) est suivie d'une étape additionnelle a1a1) de séparation des constituants selon leur densité, afin d'obtenir :
- une fraction enrichie en pépins,
- une fraction enrichie en pulpe
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la fraction riche en pépins est soumise à une étape de séparation en les deux fractions suivantes :
- une fraction enrichie en amandes de pépins,
- une fraction enrichie en coques de pépins.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce l'étape de séparation en une fraction enrichie en amandes de pépins et en une fraction enrichie en coques de pépins est réalisée selon les étapes suivantes :
- décorticage des pépins,
- tamisage des pépins décortiqués, - séparation des amandes et des coques.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce l'étape de décorticage est réalisée sur un dispositif décortiqueur à double cylindre.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'à l'étape b), on extrait les polyphénols à partir de l'une des fractions suivantes obtenues à l'étape a) :
- une fraction de matière enrichie en peaux,
- une fraction de matière enrichie en pulpe,
- une fraction de matière enrichie en pépins,
- une fraction de matière enrichie en coques de pépins.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'à l'étape b), on extrait de l'huile à partir de l'une des fractions suivantes :
- la fraction enrichie en pépins,
- la fraction enrichie en amandes de pépins.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'à l'étape b), on prépare de la cire à partir de la fraction enrichie en peaux.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en que les fruits à pépins sont choisis parmi les pommes, les coings, les nèfles, les poires, les cormes et les kiwis.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en que les fruits à pépins sont des pommes, de préférence des pommes à cidre.
16. Fraction enrichie en pulpe de fruits à pépin caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 60 % en poids de pulpe, et de préférence au moins 80 % en poids de pulpe, par rapport au poids total de ladite fraction.
17. Fraction enrichie en peaux de fruits à pépins, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 50 % en poids de peaux, et de préférence au moins 70 % en poids de peaux, par rapport au poids total de ladite fraction.
18. Fraction enrichie en pépins de fruits à pépins, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 50 % en poids de pépins, et de préférence au moins 90 % en poids de pépins, par rapport au poids total de ladite fraction.
19. Fraction enrichie en coques de pépins de fruits à pépins, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 70 % en poids de coques, et de préférence au moins 90 % en poids de coques, par rapport au poids total de ladite fraction.
20. Fraction enrichie en amandes de pépins de fruits à pépins, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 80 en poids d'amandes, et de préférence au moins 90 % en poids d'amandes, par rapport au poids total de ladite fraction.
21. Extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en pulpe selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10% en poids de polyphénols totaux, et de préférence au moins 40% en poids de polyphénols totaux, par rapport au poids total dudit extrait..
22. Extrait selon la revendication 21 , caractérisé en ce qu'il comprend :
- de 5% à 10% en poids de catéchines et polymères catéchiques (procyanidols)
- de 5% à 15% en poids d'acides hydroxycinnamiques (acide chlorogénique)
- de 5% à 10% en poids de dihydrochalcones (phloridzine).
- de 5% à 15% en poids de flavonols (quercétine), par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ledit extrait.
23. Extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en peaux selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10% en poids de polyphénols totaux, et de préférence au moins 40% en poids de polyphénols totaux, par rapport au poids total dudit extrait.
24. Extrait selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il comprend :
- 5 à 20% en poids de flavonols (quercétine), plus préférentiellement de 15 à 20% de quercétine
- de 5 à 20% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), plus préférentiellement 10 à 20% de phloridzine, par rapport au poids total des polyphénols contenus dans ledit extrait.
25. Extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en peaux selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins 10% en poids de cires brutes, de préférence au moins 50 de cires brutes,
- au moins 5% en poids d'acide ursolique, de préférence au moins 20% d'acide ursolique, par rapport au poids total dudit extrait.
26. Extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en peaux selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins 60% en poids, et de préférence au mois 80% en poids, de fraction de cires ;
- au moins 50% en poids d'acide ursolique, par rapport au poids total dudit extrait.
27. Extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en coques à pépins selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10% en poids de polyphénols totaux, préférentiellement au moins 40% en poids de polyphénols totaux, par rapport au poids total dudit extrait.
28. Extrait selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 15% en poids, de préférence au moins 35% en poids, de phloridzine, par rapport au poids total dudit extrait.
29. Extrait obtenu à partir de la fraction enrichie en amandes de pépins de fruits à pépins selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 5% en poids, de préférence au moins 20% en poids d'huile vierge comprenant essentiellement des acides gras insaturés, par rapport au poids total dudit extrait.
30. Extrait selon la revendication 29, caractérisé en ce que les acides gras insaturés sont essentiellement l'acide linoléique et l'acide oléique.
31. Extrait selon l'une des revendications 22 à 30, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une poudre.
32. Composition alimentaire, nutraceutique, cosméceutique, ou diététique, caractérisé en ce qu'il comprend un extrait selon l'une des revendications 22 à 30.
33. Composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait selon l'une des revendications 22 à 30.
34. Composition de substrat pour l'obtention de colorants jaunes naturels et hydrosolubles, caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait selon l'une des revendications 22 à 30.
35. Extrait de pomme selon la revendication 23 comprenant de 20% à 60% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait, et comprenant :
- de 5 à 15% en poids de dihydrochalcones (phloridzine) ;
- de 5 à 20% en poids de flavonols (quercétine) ;
- de 2 à 20% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et
- de 1 à 10% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
36. Extrait selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il comprend de 8% à 15%, mieux de 10% à 15% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
37. Extrait selon l'une des revendications 35 et 36, caractérisé en ce qu'il comprend de 10% à 20%, mieux de 15% à 20% en poids de flavonols (quercétine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
38. Extrait selon l'une des revendications 35 à 37, caractérisé en ce qu'il comprend de 3% à 15%, mieux de 4% à 7% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
39. Extrait selon l'une des revendications 35 à 38, caractérisé en ce qu'il comprend de 2% à 8% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
40. Extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 39, caractérisé en ce qu'il comprend de 30% à 50% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
41. Extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 39, caractérisé en ce qu'il comprend de 35% à 45% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
42. Composition alimentaire, diététique ou cosmétique comprenant un extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 41 , en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
43. Composition cosmétique contre le vieillissement de la peau comprenant un extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 41 , en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
44. Composition cosmétique pour la protection de la peau contre le rayonnement solaire, comprenant un extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 41 , en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
45. Composition alimentaire ou cosmétique amincissante ou anticellulite, comprenant un extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 41 , en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
46. Composition cosmétique anti-rides comprenant un extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 41 , en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement acceptables.
47. Composition pharmaceutique comprenant un extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 41 , en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
48. Extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 41 , pour son utilisation en tant que médicament.
49. Utilisation d'un extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 41 , pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de l'ostéoporose.
50. Utilisation d'un extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 41 , pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des états inflammatoires.
51. Utilisation d'un extrait de pomme selon l'une des revendications 35 à 41 , pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un excès pondéral.
52. Extrait de pomme selon la revendication 27 comprenant de 20% à 60% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait, et comprenant :
- de 10 à 40% en poids de dihydrochalcones (phloridzine) ; - de 0,1 à 10% en poids de flavonols (quercétine) ;
- de 0,1 à 10% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols) ; et
- de 0,1 à 10% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
53. Extrait selon la revendication 52, caractérisé en ce qu'il comprend de 25% à 40%, mieux de 27% à 35% en poids de dihydrochalcones (phloridzine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
54. Extrait selon l'une des revendications 52 et 53, caractérisé en ce qu'il comprend de 0,2% à 5%, mieux de 0,5% à 5% en poids de flavonols (quercétine), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
55. Extrait selon l'une des revendications 52 à 54, caractérisé en ce qu'il comprend de 0,2% à 5%, mieux de 0,5% à 5% en poids de flavan-3-ols (catéchine et procyanidols), par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
56. Extrait selon l'une des revendications 52 à 55, caractérisé en ce qu'il comprend de 0,2% à 5%, mieux de 0,5% à 5% en poids d'acides hydroxycinnamiques, par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
57. Extrait de pomme selon l'une des revendications 52 à 56, caractérisé en ce qu'il comprend de 30% à 50% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
58. Extrait de pomme selon l'une des revendications 52 à 57, caractérisé en ce qu'il comprend de 30% à 45% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
59. Composition alimentaire, diététique ou cosmétique comprenant un extrait de pomme selon l'une des revendications 52 à 58, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
60. Composition alimentaire ou cosmétique amincissante ou anticellulite, comprenant un extrait de pomme selon l'une des revendications 52 à 58, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
61. Composition pharmaceutique comprenant un extrait de pomme selon l'une des revendications 52 à 58, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
62. Extrait de pomme selon l'une des revendications 52 à 58, pour son utilisation en tant que médicament.
63. Utilisation d'un extrait de pomme selon l'une des revendications 52 à 58, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de l'ostéoporose.
64. Utilisation d'un extrait de pomme selon l'une des revendications 52 à 58, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'un excès pondéral.
65. Extrait de pomme selon la revendication 21 comprenant de 20% à 60% en poids de polyphénols par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait, et comprenant :
- de 10% à 20% en poids de flavan-3-ols ;
- de 2% à 10% en poids de flavonols ;
- de 5% à 10% en poids d'acides hydroxycinnamiques ; et
- de 2% à 10% en poids de dihydrochalcones,
par rapport au poids total de matière sèche dudit extrait.
66. Composition alimentaire, diététique ou cosmétique comprenant un extrait de pomme selon la revendication 65, en combinaison avec un ou plusieurs véhicules physiologiquement compatibles.
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