CN114214304A

CN114214304A - GOS转化率提升的β-半乳糖苷酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN114214304A
Application number: CN202111219626.8A
Authority: CN
Inventors: 夏伟; 吴敬; 许俊勇; 黄燕; 陈晟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-10-20
Filing date: 2021-10-20
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2041-10-20
Also published as: CN114214304B

Abstract

本发明公开了GOS转化率提升的β‑半乳糖苷酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明中所使用的野生型β‑半乳糖苷酶已经具备良好的GOS合成能力，在此基础上，对其进行改造，得到的突变体在制备GOS的总转化率上相较于野生型有着一定的提升，其中突变体Y406F、R441K和Y563F的转化率分别为63.80％、64.27％以及64.02％，此转化率已属于行业内领先水平。同时，在本发明中，野生型生产的GOS中具有1,6键型的异乳糖产率为23.33％，突变体Y406F和Y563F生产的GOS中具有1,6键型的异乳糖的产率较野生型有进一步的提升。长链GOS产率也较野生型有了显著提升，增加了GOS的益生作用。

Description

GOS转化率提升的β-半乳糖苷酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及GOS转化率提升的β-半乳糖苷酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)是一类在乳糖的半乳糖基一侧连接上1个或多个半乳糖分子的结合寡糖，半乳糖之间可以β(1→3、4、6)等键相结合，以β(1→4)键为主。结构式为Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n为0-6)。GOS最早在动物乳汁中被发现，是一种天然的益生低聚糖。GOS稳定性比较高，在120℃能够保存30min，具有较高的耐热性，同时，能够在酸性环境下保存，因此能够在人体消化道保持较高的稳定性，促进双歧杆菌的生长。另外，其口感清爽，甜度较低，热量也只为蔗糖的一半，是极优的低热值食物配料。

GOS可以通过多种方式获得，目前市场上最主要的生产方式是由乳糖通过β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)制备获得。β-半乳糖苷酶，也称乳糖酶，具有水解乳糖的作用，能够将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，通常在乳制品行业中用来降低乳制品中乳糖含量，解决乳糖不耐症；除了水解乳糖外，β-半乳糖苷酶还具有转苷能力，可以利用乳糖合成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶在自然界中广泛存在，不仅存在于细菌、真菌、霉菌等常见微生物中，而且在动物的皮肤和肠道组织、植物的叶茎种子也广泛存在。其中，对微生物来源的β-半乳糖苷酶研究最为广泛。

尽管不同来源的β-半乳糖苷酶性质各异，能够从不同方面应用于食品工业，同时在食品、保健品以及医药行业有很大的应用，具有重要的工业价值。然而，仅有的自然界的野生型酶并不能满足现有的需求，某些性质的短板则限制了β-半乳糖苷酶的应用，因此，通过分子手段对β-半乳糖苷酶进行改造，通过定向进化的方式来改良其性质，获得满足工业应用需求的基因，可以使其更好的应用于工业化生产。

发明内容

发明人在前期获得一种GOS合成能力非常好的β-半乳糖苷酶，此β-半乳糖苷酶制备GOS的总转化率达到60％以上，已经为目前合成GOS转化率的较高标准，发明人在此基础上，通过对其突变，以期能进一步提升GOS转化率。

本发明首先提供了β-半乳糖苷酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的β-半乳糖苷酶的第406位、441位或是563位取代得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶突变体为：将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的β-半乳糖苷酶的第406位由酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶的第441位由精氨酸突变为赖氨酸得到的；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶的第563位由酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的。

本发明还提供了一种编码所述β-半乳糖苷酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的载体。

本发明还提供了携带上述基因或者所述载体的微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞包括细菌细胞或真菌细胞。

在本发的一种实施方式中，所述微生物细胞优选为毕赤酵母、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了一种制备低聚半乳糖的方法，所述方法为将所述的β-半乳糖苷酶突变体添加至含有乳糖的反应体系中进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶突变体的加酶量不低于2.5U/g乳糖。

在本发明的一种实施方式中，底物乳糖的浓度为300～500g/L，优选为400g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，pH为5.0±0.1

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，温度为50～60℃，优选为50℃。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，反应的时间不少于8h，优选为8-12h，更优选为8h。

本发明提供了所述突变体、所述基因和/或所述微生物细胞在制备低聚半乳糖中的应用。

[有益效果]

本发明中使用的野生型β-半乳糖苷酶已具备良好的GOS合成能力，在此基础上，本发明对其进行改造，获得的突变体在GOS的总转化率上相较于野生型有着进一步的提升，其中WT的总转化率为61.59％，突变体Y406F、R441K和Y563F的转化率分别为63.80％、64.27％以及64.02％，相较于野生型分别提高了3.59％、4.35％和3.95％，已经接近于目前所报道的最高转化率。同时，在GOS中1,6键型以及长链GOS(链长≥3)具有更好的益生效果已有报道证明，在本发明中，野生型生产的GOS中具有1,6键型的异乳糖产率为23.33％，而突变体Y406F和Y563F的异乳糖产率为25.57％和26.58％，较野生型提高了9.60％和13.93％。野生型的长链GOS产率为34.40％，突变体R441K的产率为39.30％，较野生型提高了14.24％，提升了GOS的益生作用。

附图说明

图1为野生型和突变体β-半乳糖苷酶的摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白分子量标准；1，野生型WT；2，突变体Y406F；3，突变体R441K；4，突变体Y563F。

图2为β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的邻硝基苯基β-D-半乳糖苷(oNPG)、乳糖购自国药化学试剂有限公司。

下述实施例中涉及的培养基：

LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L。

LB固体培养基：在LB液体培养基基础上，添加琼脂：20g/L。

TB培养基：酵母粉24g/L，甘油5g/L，胰蛋白胨12g/L，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L。

下述实施例中涉及的检测方法：

β-半乳糖苷酶酶活力的测定：

反应体系为3mL，pH 5.0的磷酸缓冲液1.8mL，加入适度稀释(以反应终止时反应液420nm吸光值在0.2-1.2范围为宜)的粗酶液100μL，再加入100μL 20mmol/L的oNPG，在50℃恒温水浴中反应10min，10min后立即加入1mL的1mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，冰浴5min，于420nm处测光吸收值。以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。

酶活单位定义：每毫升酶液每分钟水解oNPG产生1μmol的邻硝基苯酚的酶活力为一个酶活单位。

相对酶活计算方法：酶活＝(0.223*A₄₂₀+0.00007)*反应体系*稀释倍数/(反应时间*加酶量)

低聚半乳糖含量的检测方法：

低聚半乳糖长链多糖为转移三糖、转移四糖和转移五糖的总和。

各产物组分使用HPLC进行检测，具体如下：

二糖的检测：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱Thermo Aps-2 HYPERSIL(4.6mm×250mm)，示差检测器Agilent 2410；流动相体积分数为80％(v/v)乙腈/水溶液，流速和柱温分别设置为0.8mL/min和35℃。

低聚半乳糖中的三糖、四糖、五糖以及乳糖和单糖的检测：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱Hi-PlexNa(300mm×7.7mm)，示差检测器Agilent 2410；流动相为纯水，流速和柱温分别为0.5mL·min^-1和80℃。

产物转化率的计算：产率(％)＝产物中的低聚半乳糖长链多糖的质量/产物中所有糖的质量×100％。

实施例1：野生型β-半乳糖苷酶基因的表达

野生型酶利用化学合成的方法核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码β-半乳糖苷酶的基因合成到载体pET-24a(+)上，直接获得重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有40μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行测序验证，验证正确即获得重组质粒pET-24a(+)-β-Gal-II。

实施例2：β-半乳糖苷酶单突变体的构建及表达

(1)突变体的制备

根据合成公司所给的优化后的β-半乳糖苷酶的基因序列，分别设计并合成Y406F、Y406W、R441K、R444F、R444S、R444T、Y563F、Y563W突变的引物，对β-半乳糖苷酶β-Gal-II进行定点突变，分别测序确认β-半乳糖苷酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌BL21中进行表达，得到单突变β-半乳糖苷酶。在后续的实验中，Y406F、R441K、Y563F的突变体在GOS合成上表现出强于野生型的能力，而其余突变体均不如野生型，故后续选择这三个突变体进行实验。

定点突变体编码基因的PCR扩增：利用快速PCR技术，以携带编码β-半乳糖苷酶基因的表达载体pET-24a(+)-β-Gal-II为模板。

引入Y406F突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-GGCAATGAAATCTTCGACACCACATCC-3’(下划线为突变碱基)，

反向引物：5’-GGATGTGGTGTCGAAGATTTCATTGCC-3’(下划线为突变碱基)；

引入R441K突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-GAAGATAAGACCAAGGGCGACAAAGTC-3’(下划线为突变碱基)，

反向引物：5’-GACTTTGTCGCCCTTGGTCTTATCTTC-3’(下划线为突变碱基)；

引入Y563F突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CCTACACCATATTTTGACAGCTACCCAG-3’(下划线为突变碱基)，

反向引物：5’-CTGGGTAGCTGTCAAAATATGGTGTAGG-3’(下划线为突变碱基)。

PCR反应体系均为：2x pfx mix 25μL，正向引物(10μmol·L^-1)1μL，反向引物(10μmol·L^-1)1μL，模板DNA 1μL，加入蒸馏水至50μL。

PCR扩增程序设定为：首先，98℃预变性4min；然后进入30个循环：98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸8min；最后72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

在验证正确的PCR产物中加入Dpn I，37℃，水浴2h，降解模板，之后转化E.coliJM109感受态细胞，将转化产物涂布于含有含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养10～12h，挑取阳性克隆，LB液体培养基培养8-10h。测序正确的突变体，从甘油管接种至LB培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21感受态细胞，得到能够表达突变体Y406F、R441K、Y563F的重组菌株。

(2)突变体的表达

接种突变体Y406F、R441K、Y563F于LB液体培养基(含30mg/L卡纳抗生素)生长8h，按5％(5mL/100mL)接种量将种子接入TB液体发酵培养基(含30mg/L卡纳抗生素)。大肠杆菌BL21在37℃培养2h，加入终浓度为20μg/mL的IPTG诱导剂，再转入25℃摇床继续培养发酵24h后，将一定体积发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，向菌体中加入50mL的50mM pH 5.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液，充分重悬菌体后，使用高压匀浆机破壁，10000rpm离心20min后，收集破壁上清液即为粗酶液，分别检测突变体Y406F、R441K、Y563F在OD₆₀₀为5时的粗酶液酶活为4.05U/mL、2.34U/mL、3.50U/mL，三株突变体均成功表达。

实施例3：突变体酶的酶学性质

在一定的pH下(pH分别为4、5、6、7、8)及温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)梯度下检测了野生型及突变体的酶活，最终确定了突变体及野生型的最适pH及温度分别均为5.0和60℃，但在进行酶转化实验中发现，60℃下的产物得率略低于50℃下的产物得率，故后续酶转化条件均在50℃下进行。

实施例4：野生型和突变体酶的转苷/水解比(R_s/R_h)

以乳糖为底物测定酶的转苷/水解比(R_s/R_h)，反应产物组分中半乳糖含量为水解反应产物，GOS为转苷反应产物，转苷/水解比(R_s/R_h)为GOS生成量与半乳糖生成量的比值。

酶转化反应体系(10mL)：用pH5.0的磷酸缓冲液溶解底物乳糖，使终浓度为400g/L，加入野生型及突变体酶各300μL，在各自的转苷最高点，通过HPLC检测各组分含量，结果如表1，发现在不考虑二级水解的情况下，突变体Y406F、R441K、Y563F的转苷/水解比率(R_s/R_h)与野生型相比均有一定增加。

表1突变体酶的转苷/水解比

实施例5：β-半乳糖苷酶突变体在低聚半乳糖制备中的应用

具体步骤如下：

以乳糖为底物，分别向反应体系中加入底物终浓度为400g/L乳糖、β-半乳糖苷酶野生酶或分别是突变体Y406F、R441K、Y563F，β-半乳糖苷酶野生酶和突变体的加酶量均为0.2mg/mL，相对应的酶活加量为：β-半乳糖苷酶野生酶的酶活为3U/mL、突变体为Y406F2.5U/mL(6.25U/g乳糖)、R441K 1.1U/mL(5U/g乳糖)、Y563F 2U/mL(2.75U/g乳糖)。在水浴摇床中，以150rpm、pH 5.0、50℃反应条件下反应8h制备低聚半乳糖，检测野生型酶WT和突变体Y406F、R441K、Y563F生产低聚半乳糖的产率。

实验结果如表2所示，野生型制备低聚半乳糖产率为61.59％，突变体Y406F、R441K、Y563F生产低聚半乳糖的产率分别为63.80％、64.27％、64.02％，分别比野生型提高了3.59％、4.35％和3.95％，已经接近于目前所报道的最高转化率。同时，野生型异乳糖产率为23.33％，突变体Y406F和Y563F的产率为25.57％和26.58％，较野生型提高了9.60％和13.93％。野生型的长链GOS产率为34.40％，突变体R441K的产率为39.30％，较野生型提高了14.24％。

表2突变体酶制备低聚半乳糖产率

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> GOS转化率提升的β-半乳糖苷酶突变体及其应用

<130> BAA211285A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 807

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Arg Arg Ile Asn Phe Asn Asp Asn Trp Arg Phe Gln Arg Glu Ile

1 5 10 15

Ser Thr Ser Leu Arg Glu Ala Gln Lys Pro Ser Phe Asn Asp His Ser

20 25 30

Trp Arg Gln Leu Ser Leu Pro His Asp Trp Ser Ile Glu Leu Asp Phe

35 40 45

Asn Lys Asp Ser Leu Ala Thr His Glu Gly Gly Tyr Leu Asp Gly Gly

50 55 60

Val Gly Trp Tyr Arg Lys Thr Phe Thr Val Pro Ser Ala Met Glu Gly

65 70 75 80

Lys Arg Ile Ser Leu Asp Phe Asp Gly Val Tyr Met Asn Ser Thr Thr

85 90 95

Tyr Leu Asn Gly Glu Glu Leu Gly Thr Tyr Pro Phe Gly Tyr Asn Ala

100 105 110

Phe Ser Tyr Asp Ile Thr Asp Lys Leu Phe Met Asp Gly Arg Glu Asn

115 120 125

Val Leu Ala Val Lys Val Asp Asn Thr Gln Pro Ser Ser Arg Trp Tyr

130 135 140

Ser Gly Ser Gly Ile Tyr Arg Asn Val Tyr Leu Thr Val Thr Asn Pro

145 150 155 160

Val His Val Ala Arg Tyr Gly Thr Phe Val Thr Thr Pro Asp Leu Glu

165 170 175

Ser Ala Tyr Ala Ala Arg Lys Ala Glu Val Asn Ile Lys Thr Lys Ile

180 185 190

Asn Asn Asp Ser Asp Ala Ala Val Gln Val Lys Val Lys Ser Thr Ile

195 200 205

Tyr Asp Thr Asp Gly Lys Glu Val Ala Ser Val Val Ser Gln Glu Lys

210 215 220

Thr Ala Ala Ala Gly Thr Thr Ala His Phe Glu Asp Asn Thr Val Ile

225 230 235 240

Glu Asn Pro Glu Leu Trp Ser Leu Asp Asn Pro Tyr Arg Tyr Lys Leu

245 250 255

Val Thr Asp Val Leu Ile Gly Gly Glu Thr Val Asp Thr Tyr Glu Thr

260 265 270

Arg Phe Gly Ala Arg Phe Phe Lys Phe Asp Ala Asn Glu Gly Phe Ser

275 280 285

Leu Asn Gly Lys Pro Met Lys Leu Tyr Gly Val Ser Met His His Asp

290 295 300

Leu Gly Ala Leu Gly Ala Ala Thr Asn Ala Arg Ala Val Glu Arg Gln

305 310 315 320

Leu Gln Ile Met Lys Asp Met Gly Val Asn Ala Ile Arg Gly Thr His

325 330 335

Asn Pro Val Ser Pro Glu Phe Leu Glu Ala Val Asn Asn Leu Gly Leu

340 345 350

Leu Leu Ile Glu Glu Ala Phe Asp Cys Trp Ser Gln Ser Lys Lys Thr

355 360 365

Tyr Asp Tyr Gly Arg Phe Phe Thr Arg Trp Ala Glu His Asp Val Lys

370 375 380

Glu Met Val Asp Arg Gly Lys Asn Glu Pro Ser Ile Ile Met Trp Ser

385 390 395 400

Ile Gly Asn Glu Ile Tyr Asp Thr Thr Ser Pro Ser Gly Val Glu Thr

405 410 415

Ala Arg Asn Leu Val Arg Trp Ile Lys Glu Ile Asp Thr Thr Arg Pro

420 425 430

Thr Thr Ile Gly Glu Asp Lys Thr Arg Gly Asp Lys Val Asn Val Thr

435 440 445

Pro Ile Asp Pro Asn Ile Leu Glu Ile Phe His Thr Val Asp Val Val

450 455 460

Gly Leu Asn Tyr Ser Glu Asn Asn Tyr Val Gly Tyr His Glu Gln His

465 470 475 480

Pro Asn Trp Lys Leu Tyr Gly Ser Glu Thr Ser Ser Ala Thr Arg Ser

485 490 495

Arg Gly Val Tyr Thr His Pro Tyr Glu Tyr Asn Leu Gly Thr Lys Tyr

500 505 510

Asp Asp Leu Gln Gln Ser Ser Tyr Asp Asn Asp Tyr Val Pro Trp Gly

515 520 525

Arg Thr Ala Glu Asp Ala Trp Lys Ser Asp Arg Asp Leu Lys His Phe

530 535 540

Ala Gly Gln Phe Ile Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Ile Gly Glu Pro Thr

545 550 555 560

Pro Tyr Tyr Asp Ser Tyr Pro Ala Lys Ser Ser Tyr Phe Gly Ala Val

565 570 575

Asp Thr Ala Gly Phe Pro Lys Asp Ile Phe Tyr Tyr Tyr Gln Ser Gln

580 585 590

Trp Lys Lys Glu Pro Met Val His Leu Leu Pro His Trp Asn Trp Thr

595 600 605

Glu Gly Glu Pro Val Arg Val Leu Ala Tyr Thr Asn Ala His Gln Val

610 615 620

Glu Leu Phe Leu Asn Gly Lys Ser Leu Gly Val Arg Gly Tyr Glu Asn

625 630 635 640

Lys Lys Thr Ser Trp Gly Ala Pro Tyr Lys Glu Thr Lys Asp Gly Lys

645 650 655

Thr Tyr Leu Glu Trp Ala Val Pro Phe Lys Ala Gly Thr Leu Glu Ala

660 665 670

Val Ala Met Asp Glu Asn Gly Lys Glu Ile Ala Arg Asp Gln Val Thr

675 680 685

Thr Ala Gly Ala Pro Ala Ala Val Lys Leu Thr Ala Asp Arg Lys Val

690 695 700

Ile Lys Ala Asp Gly Thr Asp Leu Ser Phe Ile Thr Ala Glu Ile Val

705 710 715 720

Asp Ser Lys Gly Asn Val Val Pro Asn Ala Asp His Leu Ile Gln Phe

725 730 735

His Leu Ser Gly His Gly Glu Leu Ala Gly Val Asp Asn Gly Asp Ala

740 745 750

Ala Ser Val Glu Arg Tyr Lys Asp Asn Lys Arg Lys Ala Phe Ser Gly

755 760 765

Lys Ala Leu Ala Ile Val Gln Ser Asn Lys Leu Asp Gly Asn Ile Thr

770 775 780

Leu His Ala Ser Ala Glu Gly Leu Ser Ser Gly Asn Val Thr Ile Phe

785 790 795 800

Thr Thr Ala Ser Ala Asp Gln

805

<210> 2

<211> 2442

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcgtcgta ttaactttaa cgataactgg cgttttcagc gcgagattag taccagttta 60

cgcgaagcac agaagcccag cttcaatgac cactcttggc gtcaattaag tttgccgcac 120

gactggtcta tcgagctgga ctttaacaag gattcattag ccactcatga aggtggatac 180

ttagatggag gagttgggtg gtatcgcaaa acgttcacag tcccatcggc aatggagggt 240

aagcgcatct ccttagattt tgatggtgtt tatatgaact caactactta tctgaacgga 300

gaagagcttg gcacgtatcc attcgggtat aatgcgttca gctacgatat cactgataaa 360

ttgttcatgg acggccgtga gaacgtgctg gcggtcaagg tagataacac ccaaccatct 420

tctcgttggt atagtgggag tgggatctat cgcaacgtct acctgactgt aacgaaccct 480

gtccatgtcg cacgctatgg cacctttgta accaccccgg acttggagag tgcatacgcg 540

gcccgcaagg ctgaagtcaa tattaagact aaaatcaaca acgatagtga tgcagcggtt 600

caagttaagg tcaaaagcac gatttatgat acagatggta aagaagttgc gagtgtcgtt 660

tcgcaggaaa aaacagcggc agcgggcaca actgcgcatt tcgaagacaa cacggtcatt 720

gaaaatcccg agttgtggag tttagataat ccttaccgtt acaaattggt gacggacgtg 780

ttaattgggg gcgagacagt agacacttat gaaacacgct tcggggcacg cttcttcaaa 840

ttcgatgcta acgaggggtt tagtttaaat ggaaagccaa tgaagctgta cggagtaagt 900

atgcaccacg acttgggagc cctgggggca gccacgaacg cacgtgctgt tgagcgtcaa 960

cttcagatta tgaaggatat gggagtaaat gcaattcgtg gtacgcacaa tccggtatcc 1020

ccagagttcc ttgaagccgt taataatttg gggttactgc tgatcgaaga ggcttttgat 1080

tgctggtcgc agtccaaaaa aacctatgac tatggccgtt tctttacacg ttgggccgaa 1140

cacgatgtga aagagatggt tgaccgcggc aaaaatgaac caagtatcat catgtggtcg 1200

attggcaatg aaatctacga caccacatcc ccatctggag tggaaaccgc tcgcaactta 1260

gtacgttgga tcaaagagat tgatacgacg cgcccgacaa ccattggaga agataagacc 1320

cgtggcgaca aagtcaatgt gacaccgatt gacccaaaca ttttagagat tttccataca 1380

gtagatgtag ttggattaaa ttacagcgag aataattatg tgggatacca cgaacagcac 1440

cctaactgga agttatacgg ctcagagacg tcgagtgcta ctcgctctcg cggtgtatat 1500

acacacccct acgagtataa cctggggact aagtatgacg acttgcaaca aagctcctac 1560

gataatgact acgttccgtg gggacgtaca gcagaagatg cgtggaagtc agatcgtgat 1620

ttgaagcact ttgcaggcca gtttatttgg actggctttg actacattgg agaacctaca 1680

ccatattatg acagctaccc agccaagagt tcgtactttg gggccgttga tacagcgggc 1740

tttcctaagg atattttcta ctactatcaa tcgcagtgga aaaaagaacc tatggtacac 1800

ttattgcccc attggaattg gactgagggt gaacccgtgc gcgtattagc ttatactaac 1860

gcgcatcagg tagaactgtt cctgaatggc aagagtcttg gtgtccgcgg atatgagaat 1920

aagaaaacat cttggggtgc tccctataag gaaactaagg acggtaaaac ttacctggaa 1980

tgggcagtgc cattcaaggc tgggactttg gaggcagttg cgatggatga aaacggtaag 2040

gaaatcgcgc gtgaccaagt cacgacagcc ggggcaccgg ccgcggtaaa gttaacagct 2100

gatcgcaaag tcattaaggc cgacggaacc gatttatctt ttatcacagc agagatcgta 2160

gatagtaagg gcaatgttgt ccccaatgct gatcacttaa ttcagtttca tttgtcaggc 2220

cacggggagt tggccggtgt agacaatggt gatgccgcaa gcgtcgagcg ctataaggac 2280

aataaacgta aggcttttag cggtaaggct ttggcgattg tacagtcgaa taaattggat 2340

ggtaatatta ctttgcacgc ctcggcagag gggctttcta gtggcaacgt aacaatcttt 2400

acgacggcct ctgctgatca gcaccaccat caccatcact ga 2442

Claims

1.β-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶的第406位、441位或是563位取代得到的。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，第406位的酪氨酸被取代为苯丙氨酸；第441位的精氨酸被取代为赖氨酸；第563位的酪氨酸被取代为苯丙氨酸。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的载体。

5.携带权利要求3所述基因或权利要求4所述载体的微生物细胞。

6.一种制备低聚半乳糖的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1或2所述的β-半乳糖苷酶突变体添加至含有乳糖的反应体系中进行反应。

7.如权利要求6所述的一种制备低聚半乳糖的方法，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶突变体的加酶量为不低于2.5U/g乳糖。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述底物乳糖的浓度为300～500g/L，在pH5.0±0.1，温度为50～60℃的条件下反应。

9.如权利要求6～8任一所述方法，其特征在于，反应时间不少于8h。

10.权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的基因和/或权利要求5所述的微生物细胞在制备低聚半乳糖中的应用。