CN112695025A

CN112695025A - 一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用

Info

Publication number: CN112695025A
Application number: CN202110053832.XA
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 刘展志; 张颖
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2041-01-15
Also published as: CN112695025B

Abstract

本发明公开了一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明通过对嗜热厌氧菌Dictyoglomusthermophilum来源的纤维二糖差向异构酶进行定向进化，得到突变体能仍然具备将乳糖转化为乳果糖的性能，且酶活和底物转化率显著提升，在相同加酶量的条件下，乳果糖转化率最高可达58.2％，较野生型提高了35.35％，具有良好的工业应用性能。

Description

一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用

技术领域

本发明公开了一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

乳果糖(4-O-β-D-galactopyranosyl-D-fructose，Lactulose)又名异构乳糖、乳酮糖或半乳醣果糖，是半乳糖和果糖通过β-1,4-糖苷键结合而成。乳果糖分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，与乳糖是同分异构体。乳果糖成品为淡黄色澄明粘稠体，微甜，其结晶体为白色不规则粉末，密度为1.32g/cm³，在水中溶解度76.4％(30℃)，折射率为1.45-1.47。乳果糖甜度相当于乳糖，是蔗糖的48％-60％，口感清凉，粘度较低，热值低，较安全，较稳定，不易发生美拉德反应。

乳果糖由于其特殊的生理功效，被广泛的应用于药品、食品工业以及饲料工业中。主要包括以下几个方面：

(Ⅰ)乳果糖在医学中的应用。自1960年开始，乳果糖就已被批准作为治疗便秘的药物，且各年龄段人群均可使用。乳果糖类药物还会刺激肠炎病人小肠内低分子量有机酸的合成，降低环境pH，促进有益菌种乳酸菌等生长，抑制感染类细菌的滋生，为治疗肠道感染提供了一种新型的治疗方式。乳果糖通过酸化结肠环境，将自由扩散的氨(NH₃)转化为铵离子(NH₄ ⁺)，使其不能扩散回血液，从而降低血氨值，降低肝性脑病的患病率。同时，乳果糖还可以增加人体对食物中矿物质的吸收。

(Ⅱ)乳果糖在食品中的应用。根据国标GB2760-86的规定，乳果糖可以添加到鲜乳、乳粉、奶油粉、饼干、婴幼儿配方食品以及饮料类产品中。乳果糖不会被人体肠道消化吸收，可用作糖尿病患者的甜味剂，也可以替代婴儿奶粉、烘焙产品、酸奶、乳制品种的传统糖分。有研究表明，在婴幼儿奶粉中添加2％乳果糖即可达到母乳喂养的效果。乳果糖还具有良好的保湿性，可防止糕点由于表面风干硬化影响其口感。还可以作为风味增强剂，在巧克力的生产中产生有利的褐变行为。

(Ⅲ)乳果糖在饲料中的应用。2011年，乳果糖被欧盟饲料和食品质量安全管理局(Quality and Safety of Feeds and Food for Europe；European Commission 2011)认定为一种新型饲料添加剂。它可以通过促进双歧杆菌和乳酸杆菌增殖，抑制沙门氏菌的生长，提高畜禽对肠道疾病的免疫力，从而减少抗生素在饲料中的使用。研究证明，向肉鸡食用的饲料中添加适量的乳果糖，肉鸡净增量、存活率都有一定的增加。

目前，商业化的乳果糖主要是由化学法合成。这一过程需要大量的化学催化剂，并产生大量副产物，涉及复杂的分离和纯化步骤。相对而言，酶法催化乳糖生成乳果糖条件比较温和，可以克服化学法生产乳果糖的一些缺点，适合低碳经济和绿色环保的要求。

目前用于催化乳糖生成乳果糖的酶主要有糖苷水解酶(glycosidehydrolase,EC3.2.1)和纤维二糖差向异构酶(Cellobiose 2-Epimerase,CE,EC5.1.3.11)。而在这其中，纤维二糖差向异构酶(CEs)能够直接催化单一乳糖生产乳果糖，是目前最高效的乳果糖制备用酶，因而受到了广泛的关注。但是目前的纤维二糖异构酶酶活较低、乳果糖转化率不高，阻碍了纤维二糖异构酶的工业化生产。

发明内容

针对目前存在的纤维二糖异构酶酶活较低、乳果糖转化率不高的问题，本发明通过对来源于嗜热链球菌Dictyoglomusthermophilum的纤维二糖差向异构酶(DtCE)进行改造，以获得酶活及乳果糖转化率提高的突变体，将突变体应用于乳果糖的生产，以提高乳果糖的产量。

本发明提供了纤维二糖差向异构酶突变体，以DtCE为亲本酶，将亲本酶第67位，或第143位，或第175位，或第180位，或第282位，或第284位，或第303位进行突变；亲本酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码亲本酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第67位氨基酸突变为N或E。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为F或I。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第175位氨基酸突变为S或I。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第180位氨基酸突变为K或D。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第282位氨基酸突变为G或A或I。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第284位氨基酸突变为G或A。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第303位氨基酸突变为E或R或V。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将亲本酶第67位氨基酸突变为N、第180位氨基酸突变为K、第282位氨基酸突变为G、第303位氨基酸突变为E。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将亲本酶第67位氨基酸突变为N、第180位氨基酸突变为D、第282位氨基酸突变为I、第303位氨基酸突变为V。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将亲本酶第180位氨基酸突变为K、第282位氨基酸突变为I、第303位氨基酸突变为V。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第67位氨基酸突变为E、第180位氨基酸突变为K、第282位氨基酸突变为I。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将亲本酶第67位氨基酸突变为E、第180位氨基酸突变为D、第282位氨基酸突变为A、第303位氨基酸突变为R。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为将亲本酶第67位氨基酸突变为E、第180位氨基酸突变为K、第282位氨基酸突变为I、第303位氨基酸突变为V。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为I、第175位氨基酸突变为S、第284位氨基酸突变为A。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为I、第175位氨基酸突变为S、第284位氨基酸突变为G。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为F、第175位氨基酸突变为S、第284位氨基酸突变为A。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为F、第175位氨基酸突变为S、第284位氨基酸突变为G。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为I、第175位氨基酸突变为I、第284位氨基酸突变为A。

在本发明的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为I、第175位氨基酸突变为I、第284位氨基酸突变为G。

本发明提供了编码所述突变的基因。

本发明提供了携带编码所述突变体的基因的重组表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC系列中的任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET-5a(+)质粒、pET-11b(+)质粒、pET-14b(+)质粒、pET-20b(+)质粒、pET-21b(+)质粒、pET-24a(+)质粒、pET-28a(+)质粒、pET-30c(+)质粒、pET-32b(+)质粒、pET-34b(+)质粒、pET-40b(+)质粒、pET-41b(+)质粒、pET-42c(+)质粒、pET-49b(+)质粒或pET-50b(+)质粒，pHY300PLK质粒，所述Duet系列载体包括pRSFDuet-1或pACYCDuet-1，所述pGEX系列载体包括pGEX-4T-2或pGEX-6P等。

本发明提供了表达所述突变体，或携带所述基因的微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为原核细胞或真核细胞，包括大肠杆菌，芽孢杆菌以及酵母。

本发明提供了一种生产乳果糖的方法，其特征在于，以乳糖为底物，利用所述突变体将乳糖转化为乳果糖。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的添加量不低于20U/g底物。

在本发明的一种实施方式中，在40℃～99℃、pH5.0～9.0下反应。

在本发明的实施方式中，乳糖浓度为200～500g/L，突变体添加量为10～80U/mL，反应温度40℃～90℃、pH为5.0～9.0、转速为100～250rpm，反应1-5h。

本发明提供了所述突变体，或所述基因，或所述重组表达载体，或所述微生物细胞，或所述方法在生产乳果糖中的应用。

本发明的有益效果：本发明通过对来源于嗜热链球菌Dictyoglomusthermophilum的纤维二糖差向异构酶进行改造，从中筛选到性能优良的突变体，得到突变体能仍然具备将乳糖转化为乳果糖的性能，且酶活和底物转化率显著提升，在相同加酶量的条件下，乳果糖转化率最高可达58.2％，较野生型提高了35.35％，具有良好的工业应用性能。

附图说明

图1为目的基因和载体双酶切验证图；M₁为5000bp，M₂为2000bp，1为pET-20b(+)双酶切结果，2为目的基因dtce(1167bp)双酶切结果。

图2为DtCE及突变体摇瓶发酵结果的SDS-PAGE电泳图；1为空载体，2为DtCE，3为突变体1，4为突变体2，所有样品都经过超滤浓缩。

图3为酶转化产物的HPLC色谱图。

具体实施方式

1、LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl。

2、TB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K₂HPO₄·3H₂O 16.43，KH₂PO₄ 2.31。

3、酶活测定：

将0.9mL乳糖溶液(100g/L)、0.1mL酶液(50mmol/L pH 7.5PIPES缓冲液)混合均匀，于80℃下反应20min，然后沸水煮15min终止反应后，HPLC法测定乳果糖含量。以等量50mmol/L pH 7.5PIPES缓冲液代替酶液作为空白对照。

HPLC色谱条件为：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，Polaris NH₂150×4.6mm³色谱柱，Agilent示差检测器流，流动相采用78％(v/v)乙腈和22％的磷酸盐的混合溶液，柱温设定为40℃，流速为0.8mL·min^-1。采用外标法，根据峰的保留时间和峰面积来确定乳果糖的产量(详见王鑫淼等，噬热网球菌纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化，中国生物工程杂志，2019,39(7)：24-31)。

酶活力单位(U)定义为每分钟催化产生1 μmol乳果糖所需的酶量。

实施例1：重组质粒pET-20b(+)-dtce的构建与转化

通过PCR(引物F：GATATACATATGGATCTTAAACAT，R：GGTGCTCGAGAATGCGACGAATGACTTCAAGATA)扩增DtCE的编码基因dtce(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，经过NdeI和XhoI双酶切后连接至pET-20b(+)上，得到重组质粒pET-20b(+)-dtce。以pET-20b(+)-dtce重组质粒为模板对dtce基因进行易错PCR，产物通过Megaprimer PCR ofWholePlasmid(MEGAWHOP)(具体可见参考文献：Miyazaki K,MEGAWHOP cloning:a method ofcreating random mutagenesis via megaprimer PCR of whole plasmids,MethodsEnzymol.2011；499:399-406)将其连接到质粒pET-20b(+)上，构建突变体基因文库，将其转化至E.coliBL21(DE3)。

实施例2：优势突变体的筛选

将平板上的单克隆转化子挑取到96孔板中，37℃，700rpm培养6-12h，转至含有800μL TB的96孔板，37℃，700rpm，4h，调至25℃，0.1-5mM IPTG，700rpm，24h。离心取菌体，破壁取100μL上清，加入50μL 2500g/mL乳糖溶液，80℃反应70min。取50μL的反应液，再加入75 μL显色剂(2.5％半胱氨酸盐酸盐和0.08％色氨酸用75％硫酸溶解)，46℃，70min，518nm处检测吸光值。选取吸光值比野生型大的单克隆，测序并进行下一步的验证。

实施例3：DtCE及突变体摇瓶发酵

分别将DtCE以及实施例2中筛选的乳果糖得率高的突变体接种于LB培养基中，在37℃下培养6～12h后以5％接种量转接至50～2000mL TB发酵培养基中，先放至37℃、200rpm恒温培养2h，在菌体OD₆₀₀在0.5-1.0时转至25℃、200rpm，添加0.1mM-5mM IPTG进行摇瓶诱导发酵24h。发酵结束后，将发酵液经超声破碎后离心，上清即为重组酶。

测得DtCE酶活为7.9U/mL，突变体酶活为8.6-18.0U/mL，蛋白电泳结果显示在43kDa处有一条与理论分子量一致的条带(图2)。

表1突变体发酵酶活

实施例4：DtCE及其突变体在制备乳果糖中的应用

在初始反应温度80℃，起始pH 7-9，乳糖为400g/L的情况下，加酶量控制为20U/mL反应体系。设置水浴摇床转速150r/min，反应4h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡，测定乳果糖产量。

在上述条件下进行酶转化反应，CE当反应进行到4h后乳果糖转化率最高可达到43％，突变体反应4h乳果糖转化率可达到43.3-58.2％。

表2突变体乳果糖转化率

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用

<130> BAA200866A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 389

<212> PRT

<213> Dictyoglomus thermophilum

<400> 1

Met Asp Leu Lys His Pro Lys Asp Glu Ile Phe Glu Gln Leu Asn Asn

1 5 10 15

Lys Ile Ile Pro Phe Trp Glu Asn Leu Lys Asp Glu Asn Asn Gly Gly

20 25 30

Tyr Ile Ser Tyr Val Gly Phe Asp Leu Lys Pro Asp Pro Tyr Ala Pro

35 40 45

Lys Gly Leu Val Leu Thr Ser Arg Ile Leu Trp Phe Phe Ser Arg Leu

50 55 60

Tyr Asn Gln Leu Arg Lys Glu Glu Phe Ile Glu Phe Ala Asp His Ala

65 70 75 80

Tyr Glu Phe Leu Thr Asp Lys Leu Leu Asp Lys Glu Asn Gly Gly Phe

85 90 95

Phe Trp Ile Val Asp Tyr Lys Gly Asp Pro Leu Asp Lys Arg Lys His

100 105 110

Leu Tyr Gly Gln Ala Phe Ala Leu Tyr Gly Leu Ser Glu Tyr Tyr Lys

115 120 125

Ala Thr Lys Lys Lys Glu Ser Leu Glu Leu Ser Leu Glu Leu Tyr Lys

130 135 140

Thr Ile Glu Glu Arg Cys Lys Asp Asn Ile Gly Tyr Lys Glu Glu Phe

145 150 155 160

Asp Glu Lys Trp Thr Pro Lys Glu Asn Ile Ile Val Ser Glu Tyr Gly

165 170 175

Ile Ile Cys Glu Lys Ser Met Asn Thr Leu Leu His Leu Leu Glu Ala

180 185 190

Tyr Thr Asn Leu Phe Thr Ala Thr Tyr Asp Leu Lys Val Arg Lys Glu

195 200 205

Leu Glu Asn Leu Ile Ile Leu Phe Lys Glu Lys Ile Tyr Asn Pro Lys

210 215 220

Thr Asp His Leu Tyr Val Phe Phe Asp Asn Lys Met Lys Pro Ile Ile

225 230 235 240

Asp Ala Ile Ser Tyr Gly His Asp Ile Glu Ala Thr Trp Leu Ile Asp

245 250 255

Glu Ala Leu Arg Tyr Ile Glu Asn Asn Thr Leu Ile Lys Asp Met Thr

260 265 270

Glu Ile Asn Leu Arg Ile Ala Glu Arg Val Leu Glu Glu Ala Phe Glu

275 280 285

Asn Asn Ser Leu Leu Asn Glu Lys Val Arg Gly Glu Val Asn Lys Asp

290 295 300

Arg Val Trp Trp Val Gln Ala Glu Ala Leu Leu Gly Phe Leu Asn Ala

305 310 315 320

Tyr Gln Lys Thr Lys Ser Asp Lys Phe Leu Lys Ala Val Leu Ser Leu

325 330 335

Trp Glu Phe Ile Asn Asn Phe Leu Leu Asp Lys Arg Pro Asn Gly Glu

340 345 350

Trp Phe Asn Lys Leu Asp Glu Asn Cys Ile Pro Phe Pro Met Pro Glu

355 360 365

Val Asp Leu Trp Lys Cys Pro Tyr His Asn Gly Arg Met Tyr Leu Glu

370 375 380

Val Ile Arg Arg Ile

385

<210> 2

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggatctta aacatcctaa agatgaaatc tttgaacaac ttaataacaa aatcattccg 60

ttttgggaaa atctgaaaga tgaaaacaat gggggctata ttagctatgt cggctttgat 120

cttaaacccg atccgtatgc acctaaagga cttgtcctga cgtctcgcat cctgtggttc 180

ttcagccggt tgtataatca actgcgcaaa gaagagttta tcgaatttgc ggatcatgcg 240

tatgaatttc tgacagataa actgctggat aaagaaaatg gcggcttctt ctggattgtc 300

gattataagg gagatccgtt agataaacgc aaacatctgt atggccaagc gtttgcgctg 360

tatggccttt cagaatatta caaggcgacg aagaaaaagg aatctctgga actgagcctt 420

gaactttaca aaacaatcga agaacggtgc aaagataata tcggctataa ggaagaattt 480

gatgaaaagt ggacacctaa agaaaatatt attgtctcag aatatggcat tatttgcgaa 540

aaatctatga atacgttact tcatctgctt gaagcgtata cgaatttgtt tacagcaact 600

tacgatctta aagttcgcaa agaactggaa aatctgatca tcctgtttaa agaaaaaatc 660

tataatccta aaacggatca tctgtatgtg ttcttcgata acaagatgaa accgattatc 720

gatgcgatta gctatggcca tgatattgaa gcgacgtggt tgattgatga agcacttcgg 780

tatatcgaaa ataacacact tatcaaagat atgacggaaa tcaacttacg catcgcggaa 840

cgggtcctgg aagaagcgtt tgaaaataac tcactgctta acgaaaaagt tcggggcgaa 900

gtcaacaaag atagagtgtg gtgggtccaa gcagaagcgc tgttgggctt tcttaatgca 960

tatcaaaaaa cgaaatcaga taaatttctt aaagcagtgc tgagcctgtg ggagtttatc 1020

aacaactttc tgttagataa acgccctaat ggcgaatggt ttaacaaact ggatgaaaat 1080

tgcattccgt ttccgatgcc ggaagtcgat ttgtggaaat gcccgtatca taatggccgc 1140

atgtatcttg aagtcattcg tcgcatt 1167

Claims

1.纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.1为亲本酶，对亲本酶的第67位，或第143位，或175位，或第180位，或第282位，或第284位，或第303位中的一个或多个氨基酸突变。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，将亲本酶第67位氨基酸突变为天冬酰胺或谷氨酸；将亲本酶第143位氨基酸突变为苯丙氨酸或异亮氨酸；将亲本酶第175位氨基酸突变为丝氨酸或异亮氨酸；将亲本酶第180位氨基酸突变为赖氨酸或天冬氨酸；将亲本酶第282位氨基酸突变为甘氨酸或丙氨酸或异亮氨酸；将亲本酶第284位氨基酸突变为甘氨酸或丙氨酸；将亲本酶第303位氨基酸突变为谷氨酸或精氨酸或缬氨酸。

3.编码权利要求1或2所述突变的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC系列中的任意一种。

6.表达权利要求1或2所述突变体，或携带权利要求3所述基因的微生物细胞。

7.一种生产乳果糖的方法，其特征在于，以乳糖为底物，利用权利要求1或2所述突变体将乳糖转化为乳果糖。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述突变体的添加量不低于20U/g底物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在40℃～99℃、pH5.0～9.0下反应。

10.权利要求1或2所述突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4～5所述重组表达载体，或权利要求6所述微生物细胞，或权利要求7～9任一所述方法在生产乳果糖及在食品、饲料或制药领域中的应用。