CN109576246B

CN109576246B - 一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN109576246B
Application number: CN201910026579.1A
Authority: CN
Inventors: 陈晟; 吴敬; 任莉琼
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-01-11
Also published as: CN109576246A

Abstract

本发明涉及一种α‑葡萄糖苷酶突变体及其应用，具体涉及一种α‑葡萄糖苷酶突变体及其在生产低聚异麦芽糖和抗性糊精中的应用，属于基因工程技术领域。本发明通过将来源于构巢曲霉的α‑葡萄糖苷酶突变体基因转入毕氏酵母中表达，将重组α‑葡萄糖苷酶用于制备低聚异麦芽糖和抗性糊精，在45℃、pH 5.5、加酶量5U/g、底物浓度300g/L条件下，低聚异麦芽糖的产量达216g/L，转化率为72％。以焦糊精为底物时，采用分支酶，α‑CGT酶，α‑葡萄糖苷酶三酶复配来提高抗性糊精成分，可以使焦糊精的抗性成分从原先的44％提高至70％。此方法有效提高了生产效率，降低了生产成本。

Description

一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶突变体及其在生产低聚异麦芽糖和抗性糊精中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

α-葡萄糖苷酶在工业上可应用于低聚异麦芽糖(IMOs)的生产。低聚异麦芽糖又称分支低聚糖，是一种以淀粉为原料采用全酶法工艺生产的糖浆，由2-10个葡萄糖残基构成，分子中至少有1个α-1,6糖苷键，其他为α-1,4糖苷键。低聚异麦芽糖是世界上功能性低聚糖中生产和销售量很高的产品，它主要具有促进人体肠道内有益菌群增殖，抑制许多病原菌和腐败菌的生长，增强人体免疫力降低血清胆固醇、甘油三酯及游离脂肪酸的含量，消除心血管疾患的病因；抗龋齿性甚佳，很难或不被人体消化吸收，提供的能量很低或根本没有，可作为糖尿病人、肥胖病人和低血糖病人的保健甜味剂。

目前工业化生产的低聚异麦芽糖是由黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶发酵生成的，虽然其转苷能力较强，其转化率能达到60％左右，但水解能力也很强，最终生成的葡萄糖仍然很多，限制了含α-1,6键的低聚糖含量。其次，黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶生成的低聚异麦芽糖中的异麦芽糖含量较高，而异麦芽糖属于二糖，目前被认为不属于膳食纤维，降低了该低聚异麦芽糖产品的保健价值。

抗性糊精由淀粉经过高温酸热降解，然后加工提纯而制成，它含有α-1,2与α-1,3键，还含有α-1,4和α-1,6键，甚至在某些还原末端上含有β-1,6键的结构。其中α-1,3，α-1,2，α-1,6键不能被存在于人体内的各种消化酶分解，而且进入到人体消化道之后也不能被小肠消化和吸收，所以能够进入到人体内大肠，被存在于人体大肠内的各种益生菌作为养料所发酵，可以发挥膳食纤维的各种生理作用。抗性糊精还可以让人们感觉到饱腹感，适合患有肥胖病的人使用，抗性糊精没有甜味，能够保持原味，且极易溶于水呈中性，不仅能够增加如饮料等的口感风味，作为食品添加剂添加到食品中也具有独特的优势。抗性糊精还有许多益处，比如血糖反应较低，释放热量的时间也较长，还有它对肠道的蠕动和健康也非常有益，利于排便；2012年期间我国卫生部门第16号公告中明确表示已经将抗性糊精视为普通食品，这将使得抗性糊精在食品行业中的应用越来越广阔。

目前抗性糊精的生产工艺一般为：淀粉-高温酸热水解-焦糊精-酶水解-提纯-喷雾干燥。一般淀粉经过高温酸热水解后的焦糊精中抗性含量可以达到50％，工业生产中用糖化酶处理后，可形成抗性成分80％以上的成品，但此生产方法反应条件剧烈、操作复杂、不利于环保。

因此，提供一种成本低、操作简单且环保的低聚异麦芽糖和抗性糊精生产方法，对于工业制备低聚异麦芽糖和抗性糊精有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种α-葡萄糖苷酶突变体，含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。以构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的α-葡萄糖苷酶(NCBI:XP_682222.1)为野生酶，该酶突变体是将第85位的缬氨酸突变为亮氨酸，第230位的缬氨酸突变为色氨酸，第291位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第403位的亮氨酸突变为缬氨酸，第543位的亮氨酸突变为缬氨酸，第594位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，第675位的丝氨酸突变为丙氨酸，第778位的天冬氨酸突变为谷氨酸，第835位的异亮氨酸突变为亮氨酸，第848位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，第893位的异亮氨酸突变为缬氨酸，突变位点包括V85L、V230W、Y291F、L403V、L543V、M594L、S675A、D778E、I835L、E848Q和I893V。

本发明的第二个目的是提供编码上述α-葡萄糖苷酶突变体的基因，含SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含上述基因的载体或细胞。

本发明的第四个目的是提供一种重组毕赤酵母，表达上述α-葡萄糖苷酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，以Pichia pastoris KM71为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，以pPIC9K为表达载体。

所述重组毕氏酵母的构建方法如下：

(1)将来源于构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的α-葡萄糖苷酶基因AgdB基因进行11个氨基酸的突变(V85L、V230W、Y291F、L403V、L543V、M594L、S675A、D778E、I835L、E848Q和I893V)，合成目的基因AgdB(-)，在基因的5'和3'末端分别引入EcoRΙ和NotΙ酶切位点。

(2)将合成的目的基因SEQ ID NO.2连接到pMD19T，称作pMD19T-AgdB(-)，转化E.coli JM109进一步克隆，酶切后将目的基因连接表达载体pPIC9K，命名为AgdB(-)-pPIC9K。

(3)将重组质粒AgdB(-)-pPIC9K通过电转进入毕氏酵母Pichia pastoris KM71，获得毕氏酵母α-葡萄糖苷酶基因工程菌。

本发明的第五个目的是提供一种生产α-葡萄糖苷酶的方法，应用了上述重组毕赤酵母进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，是挑取重组毕赤酵母单菌落接种到YPD培养基中，28-32℃、200-220rpm，培养20-30h；将培养液按5-10％的接种量接种到BMGY培养基中，先于28-32℃、200-220rpm，培养20-30h，离心，弃上清，收集菌体，用BMGY培养基重悬菌体，加入甲醇诱导诱导产酶，28-32℃、200-220rpm，培养110-130h，发酵液经超声破碎后离心，上清即为重组α-葡萄糖苷酶。

本发明的第六个目的是提供上述α-葡萄糖苷酶突变体或表达α-葡萄糖苷酶突变体的细胞在制备低聚异麦芽糖中的应用。

所述利用重组α-葡萄糖苷酶以麦芽糖为底物，制备低聚异麦芽糖的具体方法如下：在初始反应温度42-50℃，起始pH 5-6，麦芽糖为200-300g/L的情况下，加酶量控制为5-10U/g麦芽糖；设置温度为42-50℃、转速150-200r/min。从2h开始每隔2h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。产物用HPLC进行检测。

本发明的第七个目的是提供上述α-葡萄糖苷酶突变体或表达α-葡萄糖苷酶突变体的细胞在制备抗性糊精中的应用。

所述利用重组α-葡萄糖苷酶以焦糊精为底物，提高抗性含量的具体方法如下：以15-30％(w/v)焦糊精为底物时，采用分支酶，α-CGT酶，α-葡萄糖苷酶三酶复配来提高抗性成分，先在38-42℃下，pH 6-7，加入1200-2000U/g分支酶作用10-15h后pH调至5-6后同时加入5-10U/gα-CGT酶和5-10U/gα-葡萄糖苷酶反应20-30小时。从2h开始每隔2h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。抗性含量根据国标GB/T 22224-2008食品中膳食纤维的测定酶重量法和酶重量法-液相色谱法中的第二法进行检测。

本发明的第八个目的是提供上述α-葡萄糖苷酶突变体或表达α-葡萄糖苷酶突变体的细胞在食品、饲料或制药领域中的应用。

本发明通过将来源于构巢曲霉的α-葡萄糖苷酶突变体基因转入毕氏酵母中表达，获得一种重组α-葡萄糖苷酶。将重组α-葡萄糖苷酶用于制备低聚异麦芽糖和抗性糊精，在酶反应条件(45℃、pH 5.5、加酶量5U/g、底物浓度300g/L)下，重组α-葡萄糖苷酶催化麦芽糖生成低聚异麦芽糖的产量达216g/L，转化率为72％。以20％(w/v)焦糊精为底物时，采用分支酶，α-CGT酶，重组酶三酶复配来提高抗性糊精成分，酶反应条件为，先在40℃下，pH6.5，加入1500U/g分支酶，作用12h后pH调至5.5后同时加入5U/gα-CGT酶和5U/gα-葡萄糖苷酶反应24小时，可以使焦糊精的抗性成分从原先的44％提高至70％。此方法有效提高了生产效率，降低了生产成本。

附图说明

图1：AgdB(-)-pPIC9K重组菌摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图，M：GENEray SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中分子量标准蛋白；1：摇瓶发酵后表达的重组α-葡萄糖苷酶。

图2：构巢曲霉α-葡萄糖苷酶催化生成IMOs的HPLC色谱图。

图3：构巢曲霉α-葡萄糖苷酶不同反应时长催化生成IMOs的产量。

图4：构巢曲霉α-葡萄糖苷酶不同反应时长催化生成抗性糊精的产量。

图5：黑曲霉α-葡萄糖苷酶催化IMOs的HPLC色谱图。

具体实施方式

(一)培养基

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L。

MD固体培养基：葡萄糖20g/L，YNB 13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，琼脂粉20g/L。

YPD培养基：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基添加琼脂粉20g/L。

BMGY培养基：YNB 13.4g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，甘油10g/L，生物素4×10^-4g/L。

BMMY培养基：YNB 13.4g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，生物素4×10^-4g/L。

(二)酶活的定义及测定方法

酶活测定方法：利用α-葡萄糖苷酶可以麦芽糖为底物生成异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖来检测α-葡萄糖苷酶转苷酶活，反应体系为：以3％麦芽糖为底物，在40mM乙酸钠缓冲液pH 5.5，45℃下反应5min后煮沸10min灭活，反应液离心后过0.22μm滤膜过滤后，用HPLC检测产物的生成量。

一个酶活单位定义为酶每分钟催化转苷1μmol葡萄糖基,即每生成1μmol异麦芽糖就有1μmol葡萄糖基发生转苷，生成1μmol潘糖也是1μmol葡萄糖基发生转苷，而生成1μmol异麦芽三糖有2μmol葡萄糖基发生转苷，通过HPLC计算各产物的生成量计算酶活。

α-葡萄糖苷酶转苷酶活定义：以麦芽糖为底物1mL发酵液每分钟转苷1μmol葡萄糖苷为一个酶活力单位(U/mL)。

酶活计算公式：酶活(U/mL)＝稀释倍数×转苷葡萄糖苷(μmol/ml)/转化时间(min)。

(三)HPLC检测产物含量

采用HPLC检测最终反应体系中的葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的含量。

色谱条件为：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱NH2P-50 4E(4.6mm×250mm)，示差检测器为安捷伦G1362A；流动相采用75％(v/v)乙腈和水的混合溶液，流速为0.8mL/min，柱温设定为30℃。采用外标法，根据保留时间和峰面积确定相应糖的浓度。

(四)抗性含量根据国标GB/T 22224-2008食品中膳食纤维的测定酶重量法和酶重量法-液相色谱法中的第二法进行检测。

实施例1：构巢曲霉来源的α-葡萄糖苷酶基因的克隆及表达载体的构建

将合成的目的基因AgdB(-)(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)与克隆载体pMD19T连接，称作pMD19T-AgdB(-)，转化E.coli JM109进一步克隆，酶切回收目的基因将其与表达载体pPIC9K于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，涂布含有kana(30μg/mL)抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即AgdB(-)-pPIC9K。

实施例2：重组质粒AdgB(-)-pPIC9K的转化

将质粒AdgB(-)-pPIC9K电转到提前制备好的Pichia pastoris KM71感受态中，得到基因工程菌Pichia pastoris KM71/AgdB(-)-pPIC9K，在30℃下MD平板上培养3-4天，长出转化子后挑至不同浓度的G418/YPD平板上进行阳性克隆子的筛选，经30℃培养24h。挑选单菌落至10mL的YPD液体培养基中，30℃培养24h，保存甘油管，贮存于-80℃冰箱。验证正确后进行摇瓶发酵产酶。

实施例3：摇瓶发酵产酶

将实施例2中得到的重组毕氏酵母菌株接种于YPD培养基中，在30℃下培养24h后以5％接种量转接到50mL BMGY培养基中于30℃恒温摇床中培养24h，然后5000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，用25mL BMMY培养基垂悬菌体，加入1.5％的甲醇诱导菌体产酶，于30℃恒温摇床中培养120h，每24h补加1.5％甲醇进行诱导发酵结束后，5000rpm离心20min，上清即为重组α-葡萄糖苷酶。测得上清液中α-葡萄糖苷酶酶活力可达16U/mL，提高至野生酶的1.58倍。摇瓶发酵至OD₆₀₀为40的蛋白含量为0.4g/L。蛋白电泳结果显示在74kDa和55kDa各处有一条与理论分子量一致的条带(图1)。

实施例4：酶转化生成低聚异麦芽糖

在初始反应温度45℃，起始pH 5.5，麦芽糖为300g/L的情况下，加酶量控制为5U/g麦芽糖。设置水浴摇床温度为45℃、转速150r/min，从2h开始每隔2h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。产物用HPLC进行检测，色谱峰图见图2。

在此条件下进行酶转化反应，如图3所示，当反应进行到2h后转化率可达到72％，低聚异麦芽糖的产量达216g/L，其中异麦芽糖含量为18.7％。

转化率(％)＝100﹣DP1-DP2-DP3

DP1：反应液中最后葡萄糖占总糖的含量；

DP2：反应液中最后麦芽糖占总糖的含量；

DP3：反应液中最后麦芽三糖占总糖的含量。

实施例5：酶转化提高焦糊精中抗性含量

即在20％(w/v)焦糊精底物浓度下，首先反应条件调控在40℃，pH 6.5，分支酶加酶量1500U/g焦糊精，反应12小时后，重新调整pH至5.5，同时加入α-葡萄糖苷酶3.4U/g，加入5U/g的CGT酶，在45℃下反应24h。而用上述条件可以使抗性含量由原先的44％左右提高至70％，如图4所示。

对比例1：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中重组表达

以黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶基因(Genbank ID:4991096)为目的基因，在毕赤酵母中重组表达。其余条件同实施例1-5。如图5所示，反应24h后，重组酶催化生成低聚异麦芽糖的转化率为60％，产量为180g/L，其中异麦芽糖含量为24.4％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种α-葡萄糖苷酶突变体及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 939

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Glu Phe Ser Gln Ala Gly Val Asp Pro Leu Asp Arg Pro Gly Asn Asp

1 5 10 15

Leu Tyr Val Lys Asp Leu Ser Asn Cys Thr Gly Tyr Lys Val Thr Lys

20 25 30

His Trp Lys Thr Arg Ser Gly Phe Tyr Ala Asp Leu Ala Leu Ala Gly

35 40 45

Pro Ala Cys Asn Val Tyr Gly Ile Asp Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu

50 55 60

Val Glu Tyr Gln Thr Asp Glu Arg Leu His Val Lys Ile Leu Asp Thr

65 70 75 80

Asn Asn Thr Val Tyr Gln Leu Pro Asp Ser Val Phe Pro Arg Pro Gly

85 90 95

Phe Gly Gln Trp Cys Ser Pro Lys Asn Ser Lys Leu Lys Phe Asp Phe

100 105 110

Lys Pro Asp Pro Phe Ser Phe Thr Val Ser Arg Thr Asp Thr Gly Glu

115 120 125

Val Leu Phe Asp Thr Thr Gly Thr Lys Leu Val Phe Glu Asn Gln Tyr

130 135 140

Leu Tyr Leu Lys Thr His Leu Pro Gln Asn Pro His Leu Tyr Gly Leu

145 150 155 160

Gly Glu His Ser Asp Ser Phe Met Leu Asn Thr Thr Asn Tyr Thr Arg

165 170 175

Thr Ile Tyr Thr Arg Asp Ala Tyr Gly Thr Pro Gln Gly Gln Asn Leu

180 185 190

Tyr Gly Ala His Pro Ile Tyr Phe Asp His Arg Gln Asp Gly Thr His

195 200 205

Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Gly Met Asp Ile Tyr Ile Asp Asn

210 215 220

Glu Gly Gly Gln Phe Leu Glu Ser Asn Ile Ile Gly Gly Val Phe Asp

225 230 235 240

Phe Tyr Phe Ile Ala Gly Pro Ser Pro Gln Asp Val Ala Arg Gln Tyr

245 250 255

Ala Glu Ile Val Gln Pro Pro Leu Met Val Pro Tyr Trp Gly Leu Gly

260 265 270

Phe His Gln Cys Arg Tyr Gly Tyr Gln Asp Val Tyr Glu Val Ala Ala

275 280 285

Val Thr Ala Phe Tyr Ser Val His Asp Ile Pro Leu Glu Thr Ile Trp

290 295 300

Thr Asp Ile Asp Tyr Met Asp Arg Arg Arg Ile Phe Thr Leu Asp Pro

305 310 315 320

Glu Arg Phe Pro Pro Glu Leu Val Lys Asp Leu Val Asp Thr Leu His

325 330 335

Ala Arg Asp Gln His Tyr Ile Val Met Val Asp Pro Ala Val Tyr Tyr

340 345 350

Ser Glu Pro Asn Pro Ala Leu Asp Ala Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Phe

355 360 365

Met Lys Glu Leu Asn Gly Thr His Tyr Gln Gly Val Val Trp Ala Gly

370 375 380

Pro Ser Tyr Phe Pro Asp Trp Phe His Pro Asn Ala Gln Glu Tyr Trp

385 390 395 400

Thr Glu Gln Phe Val Asn Phe Phe Asp Gly Val Asn Gly Pro Asp Ile

405 410 415

Asp Ala Leu Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ala Asn Phe Tyr Asn Arg

420 425 430

Pro Tyr Pro Gly Asn Asn Thr Thr Pro Glu Glu Phe Ala Glu Ala Asn

435 440 445

Asp Asn Pro Pro Glu Pro Pro Ala Val Arg Asp Gly Pro Asp Ala Pro

450 455 460

Ile Pro Gly Phe Pro Asp Ser Leu Gln Pro Asn Phe Ala Ser Gly Gln

465 470 475 480

Thr Asn Glu Lys Arg Ala Val Val Thr Val Glu Arg Arg Ala Arg Ser

485 490 495

Gln Ser His Arg Gln Leu Gly Ala Gly Arg Trp Arg Ser Ala Val Arg

500 505 510

His Trp Pro Arg Asp Pro Lys Ala Gly Trp Gln His Gly Arg Lys Ser

515 520 525

Gly Ser Gly Cys Gly Pro His Glu Cys Arg Gly Leu Pro Asn Arg Glu

530 535 540

Val Ile Arg Pro Pro Tyr Met Ile Gln Asn Gly Ala Gly Pro Thr Leu

545 550 555 560

Ala Asp Asn Thr Ala Asp Thr Asp Ile Val Gln Ser Gly Gly Tyr Val

565 570 575

Gln Tyr Asp Thr His Ser Leu Tyr Gly Ala Met Met Ser Thr His Ser

580 585 590

His Asn Ala Leu Arg Ala Arg Arg Pro Asp Asp Arg Ala Leu Val Ile

595 600 605

Thr Arg Ser Thr Phe Ala Gly Ser Gly Lys Asp Val Ser His Trp Leu

610 615 620

Gly Asp Asn Ile Ser Asp Trp Leu Ser Tyr Arg Leu Ser Ile Ser Gln

625 630 635 640

Ile Leu Gln Phe Ala Ser Leu Tyr Gln Ile Pro Val Val Gly Pro Asp

645 650 655

Val Cys Gly Phe Gly Gly Asn Val Thr Glu Thr Leu Cys Ala Arg Trp

660 665 670

Ala Thr Leu Gly Ala Phe Tyr Thr Phe Phe Arg Asn His Ala Glu Ile

675 680 685

Phe Ala Asn Pro Gln Glu Phe Tyr Arg Trp Pro Ile Val Ala Glu Ala

690 695 700

Ala Arg Asn Gly Ile Ala Ile Arg Tyr Gln Leu Leu Asp Tyr Ile Tyr

705 710 715 720

Thr Ala Ile Tyr Lys Gln Thr Gln Thr Gly Thr Pro Ser Leu Asn Pro

725 730 735

Leu Phe Phe Asn Tyr Pro Phe Asp Gln Asn Thr Tyr Gly Ile Asp Leu

740 745 750

Gln Phe Phe Tyr Gly Pro Gly Ile Leu Val Ser Pro Val Thr Glu Glu

755 760 765

Asn Ser Thr Ser Val Ser Tyr Tyr Leu Pro Asp Glu Ile Phe Tyr Glu

770 775 780

Trp Gly Thr Gly Lys Pro Val Arg Gly His Gly Glu Tyr Val Ser Ala

785 790 795 800

Glu Val Asp Val Thr His Ile Thr Val His Tyr Lys Gly Gly Leu Val

805 810 815

Tyr Pro Gln Arg Ile Glu Ser Ala Asn Thr Thr Thr Ala Leu Arg Gln

820 825 830

Lys Gly Phe Asn Leu Val Ile Ala Pro Gly Leu Asp Gly Ser Ala His

835 840 845

Gly Gln Leu Tyr Leu Asp Asp Gly Leu Ser Gln Val Gln Asp Lys Val

850 855 860

Ser Glu Ile Asp Phe Ser Tyr Val Asp Gly Val Phe Glu Met Lys Gly

865 870 875 880

Ser Phe Glu Tyr Asp Pro Gly Val Gly Ile Glu Arg Ile Thr Val Leu

885 890 895

Gly Val Gly Ala Lys Pro Glu Val Ala Ala Glu Asp Ala Glu Val Glu

900 905 910

Tyr Asp Glu Glu Asn Gln Lys Leu Val Leu His Val Asp Val Pro Leu

915 920 925

Thr Arg Lys Ser Ser Ile Lys Ile Ala Ala Ala

930 935

<210> 2

<211> 2822

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gaattctctc aggctggtgt tgatcctttg gatagaccag gtaacgattt gtacgttaag 60

gatttgtcta actgtactgg ttataaggtt actaagcatt ggaagactag atccggtttt 120

tacgccgatt tggctttggc tggtcctgct tgcaacgtgt acggtattga tttgccaaag 180

ttgaagctgg aagttgagta ccaaactgat gaaagattgc acgttaagat tttggatacc 240

aacaacactg tttaccaact tcctgattct gtctttccaa gacccggttt tggtcagtgg 300

tgctctccaa agaactctaa attgaagttt gatttcaagc cagatccctt ttcttttact 360

gtctctagaa ccgatactgg tgaggtttta tttgatacca ctggtactaa gttggttttt 420

gaaaaccagt acctttactt gaagactcat ttgccacaaa atccccatct ttacggattg 480

ggtgaacact ctgatagttt tatgttgaac actaccaact ataccagaac tatttacaca 540

agagatgcct acggtactcc acaaggtcag aacctttacg gtgctcatcc catttacttt 600

gatcacagac aagatggtac ccatggtgtt tttttgctga actctaacgg tatggacata 660

tatattgata acgaaggtgg tcaattctta gaatccaaca ttatcggtgg tgtttttgat 720

ttttacttca ttgctggacc aagtccacag gatgttgcta gacaatacgc tgagatcgtt 780

cagccaccac tgatggttcc atactggggt ttgggttttc atcaatgtag atacggttac 840

caagatgttt acgaagttgc cgctgttact gctttttaca gtgttcatga tattccattg 900

gaaactattt ggactgatat tgattacatg gatagaagaa gaatcttcac tttggatcct 960

gagagatttc cacctgaatt ggttaaggat ttggtggata ctttgcatgc tagagatcaa 1020

cattacattg ttatggttga tcctgctgtt tactactctg aaccaaaccc agctcttgat 1080

gccggtctta agtacgatgc ttttatgaag gaattgaacg gtactcatta ccaaggtgtt 1140

gtttgggctg gaccatctta ctttcctgac tggtttcatc caaatgccca agaatactgg 1200

actgaacaat ttgtgaattt cttcgacggt gttaacggtc cagacattga tgctttgtgg 1260

atcgatatga acgaacccgc caacttttac aacagacctt atcctggtaa caacactact 1320

ccagaagagt ttgctgaggc caacgataat ccaccagaac cacccgctgt tagagacgga 1380

ccagacgccc caattccagg ttttcccgac tcccttcaac ctaacttcgc ctccggtcaa 1440

acaaacgaaa aacgtgctgt cgttactgtt gaaagaagag ctagatccca atctcataga 1500

caacttggtg ctggtagatg gagatccgct gtcagacatt ggccaagaga tccaaaggcc 1560

ggttggcaac atggaagaaa gtctggtagt ggttgtggtc cacatgaatg tagaggttta 1620

ccaaatagag aagtaatcag accaccttat atgatacaaa acggagctgg tccaactttg 1680

gctgataaca ctgcagatac tgatatagtt caaagtggtg gatatgttca atacgatact 1740

cactcattgt acggtgccat gatgtctacc cactctcaca atgctttgag agccagaaga 1800

ccagatgaca gagctttggt aatcactaga tccacttttg ccggttccgg taaggatgtt 1860

tctcattggt taggtgacaa catttctgac tggctttcct acagattgtc tatatcccag 1920

attttgcagt ttgctagttt gtaccagatt cctgttgttg gtcctgatgt ttgtggtttt 1980

ggtggtaacg ttacagagac cttgtgtgct agatgggcta ctttgggtgc tttttacact 2040

ttttttagaa accacgctga gatttttgct aatccacaag aattttacag atggcctatt 2100

gtggctgagg ctgctagaaa cggtattgcc attagatacc agttgttgga ttacatttac 2160

actgctattt acaagcaaac ccaaactggt actccatctt tgaaccccct tttttttaat 2220

tacccatttg atcagaacac ctacggtatt gatcttcaat ttttttacgg tcccggtatt 2280

ttggtttctc cagtcactga agaaaactct acctctgttt cttactactt gcctgatgaa 2340

attttttacg aatggggtac tggtaagcca gttagaggtc acggtgaata tgtttcagct 2400

gaggttgatg ttacccatat tactgttcat tacaagggtg gtttggttta cccacaaaga 2460

attgaatctg ctaatactac taccgccttg agacaaaagg gttttaactt agttatcgca 2520

ccaggtttgg atggttctgc ccatggtcaa ttgtatttgg atgatggtct ttctcaagtt 2580

caagataaag tctccgaaat tgatttttcc tacgtcgatg gtgtctttga gatgaagggt 2640

tcttttgagt atgatccagg tgttggtatt gagagaatta ctgttttggg tgtaggtgcc 2700

aagccagaag ttgctgctga ggatgctgag gttgagtatg atgaggagaa tcagaagttg 2760

gtgttgcatg ttgatgtgcc tttgactaga aagtcctcta ttaagattgc ttaagcggcc 2820

gc 2822

Claims

1.一种α-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体的基因。

3.含权利要求2所述基因的载体或细胞。

4.一种重组毕赤酵母，其特征在于，表达权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体。

5.如权利要求4所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以Pichia pastoris KM71为表达宿主，以pPIC9K为表达载体。

6.一种生产α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，应用了权利要求4或5所述重组毕赤酵母进行发酵。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，是挑取重组毕赤酵母单菌落接种到YPD培养基中，28-32℃、200-220 rpm，培养20-30 h；将培养液按5-10%的接种量接种到BMGY培养基中，先于28-32℃、200-220 rpm，培养20-30 h，离心，弃上清，收集菌体，用BMGY培养基重悬菌体，加入甲醇诱导产酶，28-32℃、200-220 rpm，培养110-130 h，发酵液经超声破碎后离心，上清即为重组α-葡萄糖苷酶。

8.权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体或表达权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体的细胞在制备低聚异麦芽糖中的应用。

9.权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体或表达权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体的细胞在制备抗性糊精中的应用。

10.权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶突变体或表达权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体的细胞在食品、饲料或制药领域中的应用。