CN111118068A - 一种α-葡萄糖苷酶在发酵生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于发酵领域，具体涉及一种α‑葡萄糖苷酶在发酵生产中的应用，特别是添加agdBα‑葡萄糖苷酶在酒精发酵过程中的应用。

Description

一种α-葡萄糖苷酶在发酵生产中的应用

技术领域

本发明涉及生产发酵工艺，具体涉及一种α-葡萄糖苷酶在发酵生产酒精中的应用。

背景技术

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，简称AGD酶，EC 3.2.1.20)，又名α-D-葡萄糖苷水解酶，它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖；或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物上形成α-1,6糖苷键，从而形成具有非发酵性的功能性低聚糖——低聚异麦芽糖(简称IMOs，主要包括异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖等)。

生产AGD酶的微生物种类有细菌、曲霉、古细菌等。由于能分泌AGD酶的野生菌株的生产能力普遍较低，为了克服野生菌株的低生产能力，国内外研究者通过构建基因工程菌生产重组AGD酶。在国内，对α-葡萄糖苷酶的研究还主要在α-葡萄糖苷酶的生产菌种选育和酶学性质方面，虽然有通过RT-PCR方法扩增得到Aspergillus niger α-葡萄糖苷酶cDNA，构建重组质粒并尝试在大肠杆菌中表达，但酶表达量偏低，而且重组蛋白是胞内酶，分离纯化的成本相对高。

丝状真菌表达的α-葡萄糖苷酶可以水解麦芽糖及其他寡糖，从而生成葡萄糖。研究发现构巢曲霉中有5至7个α-葡萄糖苷酶(Takashi NAKAMURA等，Biosci.Biotechnol.Biochem., 70(10),2363–2370,2006)，而黑曲霉中的同源物至少有5个(Takashi NAKAMURA等Mol Genet Genomics(2008)279:545-561)，分别为agdA，agdB，agdE，agdF，agdG。在商业上，大量表达产生的黑曲霉agdA，以商品形式如TransglucosidaseL-500(丹尼斯科)出售，以应用于异麦芽低聚糖生产，但其它的α-葡萄糖苷酶却未有商业化产品及应用的开发。

玉米等农作物的深加工可以优化产业结构、延长产业链、增加产品附加值，是解决三农问题的一个重要措施。比如可以生产乙醇(燃料和可饮用的)、平台化学制剂酸(如柠檬酸、乳酸、氨基酸)、醇(1,3丙二醇、丁醇)、酮、酯等。燃料酒精主要采用发酵法生产，一般的生产过程为：1)原料进行预处理，获得可发酵糖；2)酿酒酵母利用可发酵糖生成酒精；3)发酵液经蒸馏-精馏-脱水等过程获得成品燃料酒精。由于在酒精发酵过程，可发酵糖除了被酿酒酵母利用生成主产品酒精外，还会合成细胞结构物质和其他代谢副产物，另外发酵液中还会残留一部分非发酵糖，而不能够被酿酒酵母完全利用。这就造成发酵过程的淀粉转化率降低，影响出酒率。若能利用糖苷水解酶水解这些非发酵型糖使得更多的糖用于酒精的合成，则可显著提高酒精生产企业的利润。

发明内容

为解决上述问题，本发明一方面提供了一种生产发酵酒精的方法，所述方法包括酒精生产原料在适于酒精发酵的条件下生产发酵酒精，其特征在于，在生产过程中添加具有α-葡萄糖苷酶活性的多肽，所述多肽选自下组中的一种或多种：

(a)具有与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列至少95％同一性的多肽；

(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高严格条件下与以下杂交：(i)SEQID NO:3 的多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体。

在一些实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶活性多肽具有与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的多肽。在一个优选实施方案中，所述α- 葡萄糖苷酶活性多肽具有与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶活性的多肽是由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在非常严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:3的多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或 (iii)(i)或(ii)的全长互补体。

在一些实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶活性多肽为SEQ ID NO:4所示氨基酸序列，来源于Aspergillus niger。

在一些实施方案中，所述添加具有α-葡萄糖苷酶活性多肽的生产过程选自：糖化步骤；发酵步骤；同时的糖化和发酵步骤；任选地，预糖化步骤。在一个优选地实施方案中，所述添加具有α-葡萄糖苷酶活性多肽的生产过程选自：发酵步骤或同时的糖化和发酵步骤。

本发明所述生产发酵酒精的方法中，所述生产发酵步骤包括：

(a)加入淀粉酶使酒精发酵原料液化；

任选在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；

(b)使所液化原料糖化；

(c)加入酵母进行发酵；

(d)发酵结束后收获发酵液；

其中，所述α-葡萄糖苷酶活可在下述步骤中存在和/或添加：

糖化步骤(b)；

发酵步骤(c)；

同时的糖化和发酵步骤；

任选在步骤(b)之前的预糖化步骤。

在一些实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量为0.1-10U/g DS，优选为0.5-5U/g DS，更优选为0.8-1.5U/g DS。

在一些实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量为0.1-10U/g DS。在一些实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量为0.5-5U/g DS。在一些实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量选为0.8-1.5U/g DS。在一些实施方中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5U/g DS。在一个实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量选为0.8U/g DS。在一个实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量选为0.9U/g DS。在一个实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量选为1.0U/g DS。在一个实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量选为1.1U/g DS。在一个实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量选为1.2U/g DS。在一个实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量选为1.3U/g DS。在一个实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量选为1.4U/g DS。在一个实施方案中，所述α-葡萄糖苷酶的加入量选为1.5U/g DS。

在一些实施方案中，所述步骤(a)中加入的淀粉酶为高温淀粉酶；所述步骤(b)中加入糖化酶；所述步骤(c)中加入氮素。

在一个实施方案中，所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶，添加量为1～200U/gDS；所述步骤(b)中糖化酶加入量为20-600U/g DS；所述步骤(c)中酵母为加入量为0.01％-0.3％；所述氮源为尿素，加入量为0-1000ppm。

在一个实施方案中，所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶，添加量为1～200U/gDS，优选为10～100U/g DS。

在一个实施方案中，所述步骤(b)中糖化酶加入量为20-600U/g DS，优选为50-500U/g DS。

在一个实施方案中，所述步骤(c)中酵母加入量为0.01％-0.3％，优选为0.05％-0.2％；所述氮源为尿素，加入量为0-1000ppm，优选为600ppm。

在一个实施方案中，所述步骤(a)加入10～100U/g DS高温淀粉酶对酒精发酵原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同步进行，原料液化液调节pH酸性，添加50-500U/g DS糖化酶、0.05％-0.2％活性酵母、600ppm尿素以及0.8-1.5U/g DSα-葡萄糖苷酶，在28℃-36℃条件下发酵48-96h。

在另一个实施方案中，所述步骤(a)加入10～100U/g DS高温淀粉酶对酒精发酵原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同步进行，原料液化液调节pH酸性，添加50-500U/g DS糖化酶、0.1％活性干酵母、600ppm尿素以及1U/g DSα-葡萄糖苷酶，在28℃-36℃条件下发酵48-96h。

本发明提供一种生产发酵酒精的方法，所述发酵步骤包括：

(a)加入淀粉酶使酒精发酵原料液化；

任选在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；

(b)使所液化原料糖化；

(c)加入酵母进行发酵；

(d)发酵结束后收获发酵液；

其中，所述方法包括在下述步骤中存在和/或添加α-葡萄糖苷酶：

糖化步骤(b)；

发酵步骤(c)；

同时的糖化和发酵；

任选在步骤(b)之前的预糖化步骤；

其中，所述α-葡萄糖苷酶具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，上述生产发酵酒精的方法，所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶；所述步骤(b)中加入糖化酶；所述步骤(c)中加入氮素。

在一个实施方案中，上述生产发酵酒精的方法，所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶，添加量为1～200U/g DS；所述步骤(b)中糖化酶加入量为20-600U/g DS；所述步骤(c)中酵母为活性酵母，加入量为0.05％-0.2％；所述氮源为尿素，加入量为100-1000ppm。

在一个实施方案中，上述生产发酵酒精的方法，所述步骤(a)加入10～100U/g DS高温淀粉酶对酒精发酵原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同步进行，将原料液化液调节pH酸性，添加50-500U/g DS糖化酶、0.1％活性酵母、600ppm尿素以及1U/g DSα-葡萄糖苷酶，在28℃-36℃条件下发酵48-96h。

α-葡萄糖苷酶的制备方法：

包含编码酶的核酸的DNA构建体可被构造成在宿主细胞中表达。因为遗传编码中熟知的简并性，所以编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸可被设计并且利用常规技能制备。优化用于特定宿主细胞的密码子也是本领域中熟知的。编码酶的核酸可结合到载体中。

α-葡萄糖苷酶表达质粒的构建：选择质粒载体，示例的质粒为pUC19、pUC57；编码酶的核酸能够可操作地连接至合适的启动子，从而允许在宿主细胞中转录，表达载体还可包含合适的转录终止子；载体还可包含选择性标记，例如其产物补充分离的宿主细胞中的缺陷的基因，载体可包含曲霉属选择标记诸如amdS、argB。载体还可包含使得载体在宿主细胞中复制的DNA序列，此类序列的示例序列为质粒pUC19、pUC57或pUB110的复制起点。

在一个实施方案中，α-葡萄糖苷酶表达质粒的构建包括以下部分：

(1)将pUC57质粒通过vector-F与vector-R引物进行PCR得到线性化载体片段；

(2)选择标记amdS表达盒，序列为SEQ ID NO.1；

(3)含有黑曲霉糖化酶基因gla启动子和终止子的DNA片段，序列为SEQ ID NO.2；

(4)α-葡萄糖苷酶表达盒，其中α-葡萄糖苷酶基因分别来源于Aspergillus niger(核苷酸序列为 SEQ ID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.4)。

首先分别用引物amdS-F与amdS-R、gla-F与gla-R通过PCR扩出带有重组臂的amdS基因和含有gla启动子和终止子的DNA片段，通过Gibson Master Mix Kit(E2611，NewEngland Biolabs)将上述线性化pUC57载体、amdS基因和gla启动子与终止子DNA片段进行重组得到pGla-amdS质粒。该质粒可通过AflII位点线性化后用于α-葡萄糖苷酶基因的插入。

α-葡萄糖苷酶表达载体agdB构建如下：用引物agdB-F与agdB-R通过PCR扩出带有重组臂的agdB基因，再通过Gibson Master Mix Kit(E2611，New England Biolabs)将agdB基因与线性化的pGla-amdS质粒进行重组得到pagdB-amdS质粒。

α-葡萄糖苷酶表达盒的转化整合：采用原生质体转化法分别将三种α-葡萄糖苷酶表达盒导入黑曲霉CICC2462菌株中，包括如下步骤：(1)本领域常规的原生质体的制备；(2)原生质体的转化，用ApaI线性化得到的含α-葡萄糖苷酶表达盒的DNA片段混合转化，在乙酰胺培养基中挑选阳性转化子。

通过将α-葡萄糖苷酶表达盒agdB-amdS分别转化到黑曲霉菌株中，得到α-葡萄糖苷酶阳性转化子。

α-葡萄糖苷酶表达：通过摇瓶发酵培养α-葡萄糖苷酶黑曲霉重组表达菌株，获得α-葡萄糖苷酶发酵液。可通过常规的提纯方法，获得α-葡萄糖苷酶。

术语解释

α-葡萄糖苷酶：α-glucosidase，简称AGD酶，EC 3.2.1.20，又名α-D-葡萄糖苷水解酶，它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖；或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物上形成α-1,6糖苷键，从而形成具有非发酵性的功能性低聚糖——低聚异麦芽糖(简称IMOs，主要包括异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖等)。优选地α-葡萄糖苷酶来自曲霉菌属，例如黑曲霉(Aspergillus niger)；更优选地所述的α-葡萄糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们被称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母密码或三字母密码，其中氨基酸序列以标准氨基至羧基末端取向(即，N→C)呈现。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。当以预设参数使用CLUSTALW算法比对时，具体序列具有与指定参考序列的氨基酸残基至少一定百分比相同的氨基酸残基。参见Thompson等人(1994)NucleicAcids Res.22:4673-4680。CLUSTALW算法的预设参数为：缺失计数为与参考序列相比不相同的残基。包括在任何末端发生的缺失。例如，缺失C末端的五个氨基酸残基的变体500个氨基酸残基多肽具有相对于亲本多肽的99％(495/500个相同残基×100)的序列同一性百分比。此类变体由语言“具有与亲本至少99％序列同一性的变体”涵盖。

高严格条件：意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准Southern印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

术语“酒精发酵原料”是指基于期望的发酵产物(酒精即乙醇)来选择起始材料。适用于本发明的方法的含淀粉起始材料的实例包括谷类、块茎或谷物。具体地，含淀粉材料可为玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯(tapioca)、高粱、燕麦、水稻、豌豆、豆类、或甘薯、或它们的混合物。还涵盖糯型与非糯型(waxy and non-waxytypes) 的玉米与大麦。在一个实施方案中，酒精发酵原料为玉米。在另一个实施方案中，酒精发酵原料为小麦。

术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指尤其能够催化降解淀粉的酶。包括但不限于α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC3.2.1.20；α-D-葡糖苷水解酶)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3；α -D-(1→4)-葡聚糖水解酶)和特定产物淀粉酶如麦芽糖四苷酶(maltotetraosidases,EC3.2.1.60)和麦芽糖六苷酶。高温淀粉酶是指暴露在较高的温度中保持活性的淀粉酶，通常也指该酶具备热稳定性或者热稳定的。

术语“糖化酶”：又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)]，能将淀粉从非还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵，还大量用于生产各种规格的葡萄糖，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。

短语“边糖化边发酵(SSF)”是指产生生物化学品的过程，其中在相同处理步骤期间存在微生物有机体诸如产乙醇微生物和至少一种酶诸如淀粉酶。SSF包括将淀粉底物(颗粒状的、液化的或增溶的)同期水解成糖类包括葡萄糖，并且在相同反应器容器中将糖类发酵成醇或其它生物化学品或生物材料。

术语“干固体含量(DS)”是指以干重百分比计，浆液的总固体。

术语“约”指引用值的±10％。

附图说明

图1：pagdB-amds质粒图谱。

具体实施方式

实例1.α-葡萄糖苷酶表达质粒的构建，包含以下几个部分：

(1)将pUC57质粒通过vector-F与vector-R引物进行线性化；

(2)选择标记amdS表达盒，由GenScript公司合成，序列见SEQ ID NO.1；

(3)含有黑曲霉糖化酶基因gla启动子和终止子的DNA片段，由GenScript公司合成，序列见SEQ ID NO.2；

(4)α-葡萄糖苷酶表达盒，其中α-葡萄糖苷酶基因来源于Aspergillus niger(核苷酸序列为 SEQ ID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.4)。

首先分别用引物amdS-F与amdS-R、gla-F与gla-R通过PCR扩出带有重组臂的amdS基因和含有gla启动子和终止子的DNA片段，通过Gibson Master Mix Kit(E2611，NewEngland Biolabs) 将上述线性化pUC57载体、amdS基因和gla启动子与终止子DNA片段进行重组得到pGla-amdS 质粒，测序确认序列正确。该质粒可通过AflII位点线性化后用于α-葡萄糖苷酶基因的插入。

α-葡萄糖苷酶表达载体agdB构建如下：用引物agdB-F与agdB-R PCR扩出带有重组臂的 agdB基因，再通过Gibson Master Mix Kit(E2611，New England Biolabs)将agdB基因与线性化的pGla-amdS质粒进行重组得到pagdB-amdS质粒，经测序确认序列，构建好的质粒图谱见图1。该质粒可通过ApaI位点线性化后用于原生质体转化。

相关引物序列如下：

表1本发明中的引物

实施例2.α-葡萄糖苷酶表达盒的转化整合

采用原生质体转化法将α-葡萄糖苷酶表达盒导入黑曲霉CICC2462菌株中(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC)，具体操作步骤如下：

(1)原生质体的制备：在营养丰富的TZ液体培养基(牛肉膏粉0.8％、酵母浸膏0.2％、蛋白胨0.5％、NaCl 0.2％、蔗糖3％，pH 5.8)中接种黑曲霉菌丝体，培养48h后采用Mira-cloth(Calbiochem公司)过滤收集菌丝体并用0.7M NaCl(pH 5.8)洗涤；待菌丝体滤干后转移至含纤维素酶1％(Sigma)、蜗牛酶1％(Sigma)和溶壁酶(Sigma)0.2％的酶解液(pH 5.8)中，在 30℃、65rpm酶解3h；然后将含有原生质体的酶解液置于冰上并用四层擦镜纸过滤，得到的滤液经3000rpm、4℃温和离心10min后，弃上清，将附着在管壁上的原生质体用STC溶液(1M D-Sorbitol、50mM CaCl₂、10mM Tris，pH 7.5)洗涤一次，最后把原生质体重悬于适量的STC 溶液中。

(2)原生质体转化：将10μl(浓度为：1000ng/μl)用ApaI线性化得到的含α-葡萄糖苷酶表达盒的DNA片段加入到100μl原生质体悬浮液中混匀后室温放置25min，然后分3次共加入 900μl PEG溶液，混匀后室温放置25min，然后在室温离心10min、3000rpm，弃上清，将附着于管壁上的原生质体重悬于1ml STC溶液中，与预先降温至45℃左右的乙酰胺培养基(蔗糖3％、KCl 0.05％、K₂HPO₄·3H₂O 0.1％、FeSO₄ 0.001％、MgSO₄ 0.0244％、乙酰胺0.06％、 CsCl 0.34％)混合并铺平板，待平板凝固后放入34℃培养箱中培养4-5天，将转化子挑至新的乙酰胺培养基平板中放入34℃培养箱中再培养4-5天，长出的转化子称为阳性转化子。

α-葡萄糖苷酶agdA序列为SEQ ID NO.5，参照专利US 2016/0257977。根据实施例1和2 的方法在黑曲霉中表达的α-葡萄糖苷酶agdA作为正对照，与本发明中的α-葡萄糖苷酶agdB进行了比较。

实施例3.α-葡萄糖苷酶agdB黑曲霉重组表达菌株的摇瓶培养及酶活测定

本发明中α-葡萄糖苷酶酶活定义为在温度37℃，pH4.8条件下，每2h生成1μmol潘糖即为 1个酶活力单位，以U/g(或U/ml)表示。

试剂配置：

0.05M乙酸-乙酸钠缓冲液：称取无水乙酸钠4.92g溶于去离子水，加入冰乙酸4ml，用蒸馏水定容至1L，充分混匀，用乙酸或氢氧化钠校正pH为4.8，装入试剂瓶中室温保存使用，有效期6个月。

麦芽糖(20％)：准确称取21.05g一水麦芽糖，用pH 4.8缓冲液定容至100ml即可。

实验方法:

在试管中加入1.92ml pH 4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液缓冲液，再加入80μl用缓冲液稀释好的酶液混匀，加入2ml 20％麦芽糖底物混匀，与37℃反应2h后与沸水浴10min，用0.22μm膜过滤，以添加灭活酶液的反应体系作为空白对照。反应结束高效液相进行潘糖生成量的测定。

将实施例2中α-葡萄糖苷酶agdB以及对照菌株α-葡萄糖苷酶agdA的阳性转化子分别接种至50ml YPM培养基(酵母提取物0.2％，蛋白胨0.2％，麦芽糖2％)的摇瓶中，34℃、220rpm 摇床培养6天，离心收集发酵液上清，分别测定α-葡萄糖苷酶酶活。检测结果显示α-葡萄糖苷酶agdB的摇瓶酶活为4600U/ml，对照菌株α-葡萄糖苷酶agdA的摇瓶酶活为2930U/ml。

实施例4.α-葡萄糖苷酶agdB对酒精发酵的影响

1.本发明的实验方法

原料液化：取一定量的全磨玉米粉(购自某酒精厂)配制料水比为1：2.3的料液。配制完成后调节pH为5.6左右，添加适量的高温淀粉酶(如

X5，添加量10～100U/g DS)进行液化。液化条件：温度95℃，时间120min。

边糖化边发酵：将液化好的料液及时降至30℃并调节pH为4.3，将其均匀分装至摇瓶中，添加适量糖化酶(如百斯杰糖化酶50～500U/g DS)、1U/g DSα-葡萄糖苷酶agdB(百斯杰自产) 以及0.1％活性酵母(购自安琪酵母股份有限公司)与600ppm氮源尿素。发酵条件：温度32℃，时间72h。

醪液pH调节方式：用1mol/L的盐酸或3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH。

结果检测：发酵结束的料液，取部分离心获取上清液用于高效液相色谱、离子色谱分析与残还原糖、过滤总糖分析；另取部分料液直接用于总糖测量。

2.对照组实验方法

原料液化：取一定量的全磨玉米粉(购自某酒精厂)配制料水比为1：2.3的料液。配制完成后调节pH为5.6左右，添加适量的高温淀粉酶((如

X5，添加量10～100U/g DS)进行液化。液化条件：温度95℃，时间120min。

边糖化边发酵：将液化好的料液及时降至室温并调节pH为4.3，将其均匀分装至摇瓶添加，添加适量糖化酶(如百斯杰糖化酶50～500U/g DS)，添加0.1％活性酵母(购自安琪酵母股份有限公司)与600ppm氮源尿素，正对照组添加实施例3中得到的α-葡萄糖苷酶agdA，添加量1U/g DS；负对照组不添加α-葡萄糖苷酶。发酵条件：温度32℃，时间72h。

醪液pH调节方式：用1mol/L的盐酸或3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH。

结果检测：发酵结束的料液，取部分离心获取上清液用于高效液相色谱分析与残还原糖、过滤总糖分析；另取部分料液直接用于总糖测量。

3.分析方法：

高效液相色谱分析方法：仪器：岛津LC-20A，色谱柱：Aminex HPX-87H柱子，流动相为5mmol/L硫酸，流速为0.6ml/min，检测器为RID-20A。

离子色谱分析方法：仪器：Thermo ICS-5000，色谱柱：1.CarbonPac PA 10(4×250mm)，仪器参数：柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样体积：10-25uL；流动相：A：纯水；B：250mM NaOH溶液；C：250mM NaAc溶液；

洗脱梯度：0～5min，25mmol/L NaOH；

5～35min，25-100mmol/L NaOH；

35～45min，100mmol/L NaOH；125mmol/L NaAc

45～50min，25mmol/L NaOH。

残余碳水化合物(残还原糖、残糊精、残淀粉)的测定：菲林定糖法

(1)还原糖测定

量取发酵液50毫升定容到250毫升，用脱脂棉过滤，取滤液10毫升，加入盛有斐林氏甲、乙液各5毫升和水20毫升的三角瓶中，按一般定糖法测糖，再用0.25％葡萄糖按同样条件做空白试验。

结果计算：

式中：A-滴入10毫升斐林氏液所用葡萄糖液毫升数

B-滴定加10毫升试液后耗用的葡萄糖液毫升数

50-吸取样品毫升数

(2)总糖的测定

量取发酵液50毫升，加入水40毫升，加20％盐酸10毫升，塞口具有1.0米长玻璃管的橡胶塞，在沸水浴中转化60分钟，取出冷却，以20％氢氧化钠中和至微酸性，转移250毫升容量瓶中加水至刻度，摇匀后，用脱脂棉过滤，吸取滤液10毫升加入盛有斐林氏甲、乙液各5毫升和水20毫升的三角瓶中，以0.25％的葡萄糖液滴定，然后以0.25％葡萄糖滴定10毫升斐林氏液做空白试验。

结果计算：

式中：A-空白试验用葡萄糖液毫升数

B-滴定加10毫升试液后耗用葡萄糖液毫升数

(3)过滤总糖的测定

取测还原糖的发酵醪稀释过滤液100毫升，加20％盐酸10毫升，塞口具有1.0米长玻璃管的橡胶塞，在沸水浴中转化60分钟，取出冷却，以20％氢氧化钠中和至微酸性，转移250 毫升容量瓶中加水至刻度，摇匀后，用脱脂棉过滤，吸取滤液10毫升加入盛有斐林氏甲、乙液各5毫升和水20毫升的三角瓶中，以0.25％的葡萄糖液滴定，然后以0.25％葡萄糖滴定10 毫升斐林氏液做空白试验。

(4)糊精及残余淀粉的计算

残糊精＝(过滤总糖-还原糖)×0.9克糊精/100毫升

残淀粉＝(残总糖-过滤总糖)×0.9克糊精/100毫升

4.实验结果

根据高效液相结果，添加α-葡萄糖苷酶agdB后可提高酒度，同时降低四糖、三糖、二糖以及甘油的含量，且比正对照组(添加α-葡萄糖苷酶agdA)提高酒精量更多。根据残糖的结果可知添加α-葡萄糖苷酶agdB可以降低残还原糖、过滤总糖以及总糖含量，且比正对照组降低的效果更好。而根据离子色谱结果可知，添加α-葡萄糖苷酶agdB可以水解曲二糖、龙胆二糖、黑曲霉糖等非发酵二糖，水解效果远优于正对照组，特别是对海藻糖、黑曲霉糖的水解效果更优。综上，在玉米酒精发酵中添加α-葡萄糖苷酶agdB可以降低残糖含量、提高原料利用率，同时改变了酵母代谢，使副产物甘油有所降低，最终酒精产量提高了1.7％，产生了显著的经济效益。

表2高效液相色谱分析结果

表3残还原糖、过滤总糖、总糖结果

表4离子色谱分析结果

本实验也尝试用传统的预糖化再发酵步骤，在发酵的预糖化过程中(开始，中间，结束) 添加α-葡萄糖苷酶agdB，在酵母发酵的过程中(开始，中间，结束)或在边糖化边发酵的过程中(开始，中间，结束)添加α-葡萄糖苷酶agdB都能达提高酒精产率，且降低发酵结束时残总糖浓度的效果。

序列表

<110> 南京百斯杰生物工程有限公司

<120> 一种α-葡萄糖苷酶在发酵生产中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2724

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctagatctac gccaggaccg agcaagccca gatgagaacc gacgcagatt tccttggcac 60

ctgttgcttc agctgaatcc tggcaatacg agatacctgc tttgaatatt ttgaatagct 120

cgcccgctgg agagcatcct gaatgcaagt aacaaccgta gaggctgaca cggcaggtgt 180

tgctagggag cgtcgtgttc tacaaggcca gacgtcttcg cggttgatat atatgtatgt 240

ttgactgcag gctgctcagc gacgacagtc aagttcgccc tcgctgcttg tgcaataatc 300

gcagtgggga agccacaccg tgactcccat ctttcagtaa agctctgttg gtgtttatca 360

gcaatacacg taatttaaac tcgttagcat ggggctgata gcttaattac cgtttaccag 420

tgccgcggtt ctgcagcttt ccttggcccg taaaattcgg cgaagccagc caatcaccag 480

ctaggcacca gctaaaccct ataattagtc tcttatcaac accatccgct cccccgggat 540

caatgaggag aatgaggggg atgcggggct aaagaagcct acataaccct catgccaact 600

cccagtttac actcgtcgag ccaacatcct gactataagc taacacagaa tgcctcaatc 660

ctgggaagaa ctggccgctg ataagcgcgc ccgcctcgca aaaaccatcc ctgatgaatg 720

gaaagtccag acgctgcctg cggaagacag cgttattgat ttcccaaaga aatcggggat 780

cctttcagag gccgaactga agatcacaga ggcctccgct gcagatcttg tgtccaagct 840

ggcggccgga gagttgacct cggtggaagt tacgctagca ttctgtaaac gggcagcaat 900

cgcccagcag ttagtagggt cccctctacc tctcagggag atgtaacaac gccaccttat 960

gggactatca agctgacgct ggcttctgtg cagacaaact gcgcccacga gttcttccct 1020

gacgccgctc tcgcgcaggc aagggaactc gatgaatact acgcaaagca caagagaccc 1080

gttggtccac tccatggcct ccccatctct ctcaaagacc agcttcgagt caaggtacac 1140

cgttgcccct aagtcgttag atgtcccttt ttgtcagcta acatatgcca ccagggctac 1200

gaaacatcaa tgggctacat ctcatggcta aacaagtacg acgaagggga ctcggttctg 1260

acaaccatgc tccgcaaagc cggtgccgtc ttctacgtca agacctctgt cccgcagacc 1320

ctgatggtct gcgagacagt caacaacatc atcgggcgca ccgtcaaccc acgcaacaag 1380

aactggtcgt gcggcggcag ttctggtggt gagggtgcga tcgttgggat tcgtggtggc 1440

gtcatcggtg taggaacgga tatcggtggc tcgattcgag tgccggccgc gttcaacttc 1500

ctgtacggtc taaggccgag tcatgggcgg ctgccgtatg caaagatggc gaacagcatg 1560

gagggtcagg agacggtgca cagcgttgtc gggccgatta cgcactctgt tgagggtgag 1620

tccttcgcct cttccttctt ttcctgctct ataccaggcc tccactgtcc tcctttcttg 1680

ctttttatac tatatacgag accggcagtc actgatgaag tatgttagac ctccgcctct 1740

tcaccaaatc cgtcctcggt caggagccat ggaaatacga ctccaaggtc atccccatgc 1800

cctggcgcca gtccgagtcg gacattattg cctccaagat caagaacggc gggctcaata 1860

tcggctacta caacttcgac ggcaatgtcc ttccacaccc tcctatcctg cgcggcgtgg 1920

aaaccaccgt cgccgcactc gccaaagccg gtcacaccgt gaccccgtgg acgccataca 1980

agcacgattt cggccacgat ctcatctccc atatctacgc ggctgacggc agcgccgacg 2040

taatgcgcga tatcagtgca tccggcgagc cggcgattcc aaatatcaaa gacctactga 2100

acccgaacat caaagctgtt aacatgaacg agctctggga cacgcatctc cagaagtgga 2160

attaccagat ggagtacctt gagaaatggc gggaggctga agaaaaggcc gggaaggaac 2220

tggacgccat catcgcgccg attacgccta ccgctgcggt acggcatgac cagttccggt 2280

actatgggta tgcctctgtg atcaacctgc tggatttcac gagcgtggtt gttccggtta 2340

cctttgcgga taagaacatc gataagaaga atgagagttt caaggcggtt agtgagcttg 2400

atgccctcgt gcaggaagag tatgatccgg aggcgtacca tggggcaccg gttgcagtgc 2460

aggttatcgg acggagactc agtgaagaga ggacgttggc gattgcagag gaagtgggga 2520

agttgctggg aaatgtggtg actccatagc taataagtgt cagatagcaa tttgcacaag 2580

aaatcaatac cagcaactgt aaataagcgc tgaagtgacc atgccatgct acgaaagagc 2640

agaaaaaaac ctgccgtaga accgaagaga tatgacacgc ttccatctct caaaggaaga 2700

atcccttcag ggttgcgttt ccag 2724

<210> 2

<211> 997

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccattggcg gaggggtccg gacggtcagg aacttagcct tatgagatga atgatggacg 60

tgtctggcct cggaaaagga tatatgggga tcatgatagt actagccata ttaatgaagg 120

gcatatacca cgcgttggac ctgcgttata gcttcccgtt agttatagta ccatcgttat 180

accagccaat caagtcacca cgcacgaccg gggacggcga atccccggga attgaaagaa 240

attgcatccc aggccagtga ggccagcgat tggccacctc tccaaggcac agggccattc 300

tgcagcgctg gtggattcat cgcaatttcc cccggcccgg cccgacaccg ctataggctg 360

gttctcccac accatcggag attcgtcgcc taatgtctcg tccgttcaca agctgaagag 420

cttgaagtgg cgagatgtct ctgcaggaat tcaagctaga tgctaagcga tattgcatgg 480

caatatgtgt tgatgcatgt gcttcttcct tcagcttccc ctcgtgcaga tgaggtttgg 540

ctataaattg aagtggttgg tcggggttcc gtgaggggct gaagtgcttc ctccctttta 600

gacgcaactg agagcctgag cttcatcccc agcatcatta cacctcagca cttaagacta 660

gtacgcgtct cgagatctag agggtgactg acacctggcg gtagacaatc aatccatttc 720

gctatagtta aaggatgggg atgagggcaa ttggttatat gatcatgtat gtagtgggtg 780

tgcataatag tagtgaaatg gaagccaagt catgtgattg taatcgaccg acggaattga 840

ggatatccgg aaatacagac accgtgaaag ccatggtctt tccttcgtgt agaagaccag 900

acagacagtc cctgatttac ccttgcacaa agcactagaa aattagcatt ccatccttct 960

ctgcttgctc tgctgatatc actgtcattc aatgcat 997

<210> 3

<211> 2909

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 3

atgttggggt ctttgctttt actcttaccc cttgtgggcg ctgctgtcat tggacccagg 60

gcaaacagtc agagttgccc agggtataag gcgtccaacg tccaaaagca ggctaggtca 120

ctgactgcgg atctgactct agctggtacg ccttgtaata gctatggcaa ggatttggaa 180

gacctcaagc tgcttgtgga atatcagact ggtgagtgtt ggcttgtgtg aatcaagagt 240

tcctgactaa atgcttgctc agatgaacgg ttacatgtta tgatctacga tgccgacgag 300

gaagtctatc aagttcctga atcagtcctt cctcgcgtgg gtagtgacga ggactctgag 360

gacagtgttt tggaatttga ctatgtggaa gaaccgtttt cattcaccat ctccaaggga 420

gatgaggtcc tgtttgactc ttcggcatca ccactagttt ttcagtcgca atatgtgaac 480

cttcgcacct ggttgcccga tgatccctat gtgtatggtc tcggagagca ttctgaccct 540

atgcgcttgc caacatacaa ttacacgcgg accctttgga accgcgacgc gtatggcact 600

ccaaacaaca ccaacttgta cggtagtcat cctgtctact atgatcaccg tggaaagtcc 660

ggaacttatg gagtcttcct gctgaactct aatggtatgg acatcaagat caaccaaacg 720

acagatggaa agcagtactt ggaatacaat cttctcggcg gtgttctgga cttctacttc 780

ttctacggag aagatcctaa gcaagcgagc atggaatact caaagattgt cggtctcccg 840

gcaatgcaga gttactggac tttcggcgta tgccccccac cccctaatcc cataacagtc 900

cgagttgtat gctgactctt cagttccatc aatgccgtta tggataccgc gatgtgtatg 960

aacttgccga ggtggtctac aactacagcc aggcaaagat tcctctggag acgatgtgga 1020

cagatatcga ctacatggac aagagaaggg tgtttaccct tgatcctcag aggttcccgc 1080

tcgaaaagat gcgggagttg gtaacctacc tgcacaatca tgatcagcat tacattgtca 1140

tggttgaccc ggctgtgagc gtaagcagtg agtgacttga cgattcccca tccttgcaac 1200

tttcagctaa tggatacttt ctagataaca cggcatatat caccggcgtg agagacgatg 1260

ttttccttca caatcagaac ggtagcctat acgagggtaa gtatatacac atctcatatc 1320

tctcaacacg agctaaacta tgcaggtgct gtttggcctg gtgtcactgt tttcccagac 1380

tggttcaatg agggtactca ggattactgg actgcgcaat ttcaacagtt ctttgatccc 1440

aagtccggag tcgatattga cgccctgtgg attgacatga acgaagcctc caatttctgc 1500

ccttatcctt gtctggaccc agcggcatac gcgatctccg ccgacctccc accggcagca 1560

ccacctgttc ggccaagcag cccgatccca ctgcccggat tccccgcgga ctttcagcct 1620

tcgtctaagc gatctgttaa aagagcgcaa ggagataaag ggaagaaggt tgggttgccc 1680

aatcgcaacc tcactgaccc gccctacacc attcggaatg ccgcaggtgt ccttagtatg 1740

agcactatcg agacggatct cattcatgcg ggtgaagggt atgccgagta tgatactcac 1800

aatctctatg gaacaagtaa gtctttcaaa tatttgcata gatgatttgc cattgacagg 1860

gttagtgatg agctctgctt cccgcacggc tatgcaggcc cgccgtcccg atgtgaggcc 1920

tttggtcatc actcgcagta cgtttgcagg cgctggagca cacgtaggac actggtaagt 1980

tgaccgatag ccttcgctag cacatcgctg attcgtacag gctgggcgac aactttagcg 2040

attgggttca ctaccggatc tccatcgcgc agatcctctc cttcgcgtcc atgttccaga 2100

ttccaatggt cggggctgac gtgtgtgggt ttggtagcaa cacgacggag gaattgtgtg 2160

cccgatgggc gtcacttggt gccttctata cgttctaccg caatcataac gagctgggcg 2220

acatatcgca agagttctac cgctggccta cggttgccga gtccgcgcgt aaggccattg 2280

acatccggta caagctcctc gattatatct acactgctct tcaccggcaa agccagaccg 2340

gcgagccatt cctgcagcct caattctacc tgtaccctga ggattcgaac acctttgcga 2400

acgaccggca gttcttctat ggtgacgccc ttcttgtcag ccccgtgttg aatgagggat 2460

ccacctcagt cgacgcatac ttcccggacg acatcttcta cgattggtac acaggggcag 2520

tggtgcgtgg gcacggagaa aacatcacgc tcagcaacat caacatcacc cacatccctc 2580

tgcacatccg cggtggaaat atcatacctg tcaggacatc cagcggcatg acaaccactg 2640

aggttcgtaa gcagggcttc gagctgatca tcgcgccaga cttggatgac accgcatcgg 2700

gcagtctata tttggatgat ggagactcgt tgaacccgtc atctgtgaca gagctcgagt 2760

tcacgtacag caaaggggag ttgcacgtga agggtacatt cggacagaag gccgtcccca 2820

aggtggagaa atgtaccttg ctggggaagt cagcacggac gttcaagggc tttgcactcg 2880

atgcgccggt gaactttaag ctgaagtag 2909

<210> 4

<211> 865

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 4

Met Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Gly Ala Ala Val

1 5 10 15

Ile Gly Pro Arg Ala Asn Ser Gln Ser Cys Pro Gly Tyr Lys Ala Ser

20 25 30

Asn Val Gln Lys Gln Ala Arg Ser Leu Thr Ala Asp Leu Thr Leu Ala

35 40 45

Gly Thr Pro Cys Asn Ser Tyr Gly Lys Asp Leu Glu Asp Leu Lys Leu

50 55 60

Leu Val Glu Tyr Gln Thr Asp Glu Arg Leu His Val Met Ile Tyr Asp

65 70 75 80

Ala Asp Glu Glu Val Tyr Gln Val Pro Glu Ser Val Leu Pro Arg Val

85 90 95

Gly Ser Asp Glu Asp Ser Glu Asp Ser Val Leu Glu Phe Asp Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Pro Phe Ser Phe Thr Ile Ser Lys Gly Asp Glu Val Leu Phe

115 120 125

Asp Ser Ser Ala Ser Pro Leu Val Phe Gln Ser Gln Tyr Val Asn Leu

130 135 140

Arg Thr Trp Leu Pro Asp Asp Pro Tyr Val Tyr Gly Leu Gly Glu His

145 150 155 160

Ser Asp Pro Met Arg Leu Pro Thr Tyr Asn Tyr Thr Arg Thr Leu Trp

165 170 175

Asn Arg Asp Ala Tyr Gly Thr Pro Asn Asn Thr Asn Leu Tyr Gly Ser

180 185 190

His Pro Val Tyr Tyr Asp His Arg Gly Lys Ser Gly Thr Tyr Gly Val

195 200 205

Phe Leu Leu Asn Ser Asn Gly Met Asp Ile Lys Ile Asn Gln Thr Thr

210 215 220

Asp Gly Lys Gln Tyr Leu Glu Tyr Asn Leu Leu Gly Gly Val Leu Asp

225 230 235 240

Phe Tyr Phe Phe Tyr Gly Glu Asp Pro Lys Gln Ala Ser Met Glu Tyr

245 250 255

Ser Lys Ile Val Gly Leu Pro Ala Met Gln Ser Tyr Trp Thr Phe Gly

260 265 270

Val Cys Pro Pro Pro Pro Asn Pro Ile Thr Val Arg Val Val Val Tyr

275 280 285

Asn Tyr Ser Gln Ala Lys Ile Pro Leu Glu Thr Met Trp Thr Asp Ile

290 295 300

Asp Tyr Met Asp Lys Arg Arg Val Phe Thr Leu Asp Pro Gln Arg Phe

305 310 315 320

Pro Leu Glu Lys Met Arg Glu Leu Val Thr Tyr Leu His Asn His Asp

325 330 335

Gln His Tyr Ile Val Met Val Asp Pro Ala Val Ser Val Ser Asn Asn

340 345 350

Thr Ala Tyr Ile Thr Gly Val Arg Asp Asp Val Phe Leu His Asn Gln

355 360 365

Asn Gly Ser Leu Tyr Glu Gly Ala Val Trp Pro Gly Val Thr Val Phe

370 375 380

Pro Asp Trp Phe Asn Glu Gly Thr Gln Asp Tyr Trp Thr Ala Gln Phe

385 390 395 400

Gln Gln Phe Phe Asp Pro Lys Ser Gly Val Asp Ile Asp Ala Leu Trp

405 410 415

Ile Asp Met Asn Glu Ala Ser Asn Phe Cys Pro Tyr Pro Cys Leu Asp

420 425 430

Pro Ala Ala Tyr Ala Ile Ser Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Pro Pro

435 440 445

Val Arg Pro Ser Ser Pro Ile Pro Leu Pro Gly Phe Pro Ala Asp Phe

450 455 460

Gln Pro Ser Ser Lys Arg Ser Val Lys Arg Ala Gln Gly Asp Lys Gly

465 470 475 480

Lys Lys Val Gly Leu Pro Asn Arg Asn Leu Thr Asp Pro Pro Tyr Thr

485 490 495

Ile Arg Asn Ala Ala Gly Val Leu Ser Met Ser Thr Ile Glu Thr Asp

500 505 510

Leu Ile His Ala Gly Glu Gly Tyr Ala Glu Tyr Asp Thr His Asn Leu

515 520 525

Tyr Gly Thr Arg Leu Val Met Ser Ser Ala Ser Arg Thr Ala Met Gln

530 535 540

Ala Arg Arg Pro Asp Val Arg Pro Leu Val Ile Thr Arg Ser Thr Phe

545 550 555 560

Ala Gly Ala Gly Ala His Val Gly His Trp Leu Gly Asp Asn Phe Ser

565 570 575

Asp Trp Val His Tyr Arg Ile Ser Ile Ala Gln Ile Leu Ser Phe Ala

580 585 590

Ser Met Phe Gln Ile Pro Met Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Gly

595 600 605

Ser Asn Thr Thr Glu Glu Leu Cys Ala Arg Trp Ala Ser Leu Gly Ala

610 615 620

Phe Tyr Thr Phe Tyr Arg Asn His Asn Glu Leu Gly Asp Ile Ser Gln

625 630 635 640

Glu Phe Tyr Arg Trp Pro Thr Val Ala Glu Ser Ala Arg Lys Ala Ile

645 650 655

Asp Ile Arg Tyr Lys Leu Leu Asp Tyr Ile Tyr Thr Ala Leu His Arg

660 665 670

Gln Ser Gln Thr Gly Glu Pro Phe Leu Gln Pro Gln Phe Tyr Leu Tyr

675 680 685

Pro Glu Asp Ser Asn Thr Phe Ala Asn Asp Arg Gln Phe Phe Tyr Gly

690 695 700

Asp Ala Leu Leu Val Ser Pro Val Leu Asn Glu Gly Ser Thr Ser Val

705 710 715 720

Asp Ala Tyr Phe Pro Asp Asp Ile Phe Tyr Asp Trp Tyr Thr Gly Ala

725 730 735

Val Val Arg Gly His Gly Glu Asn Ile Thr Leu Ser Asn Ile Asn Ile

740 745 750

Thr His Ile Pro Leu His Ile Arg Gly Gly Asn Ile Ile Pro Val Arg

755 760 765

Thr Ser Ser Gly Met Thr Thr Thr Glu Val Arg Lys Gln Gly Phe Glu

770 775 780

Leu Ile Ile Ala Pro Asp Leu Asp Asp Thr Ala Ser Gly Ser Leu Tyr

785 790 795 800

Leu Asp Asp Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ser Ser Val Thr Glu Leu Glu

805 810 815

Phe Thr Tyr Ser Lys Gly Glu Leu His Val Lys Gly Thr Phe Gly Gln

820 825 830

Lys Ala Val Pro Lys Val Glu Lys Cys Thr Leu Leu Gly Lys Ser Ala

835 840 845

Arg Thr Phe Lys Gly Phe Ala Leu Asp Ala Pro Val Asn Phe Lys Leu

850 855 860

Lys

865

<210> 5

<211> 3124

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 5

atggtgaagt tgacgcatct ccttgccaga gcatggcttg tccctctggc ttatggagcg 60

agccagtcac tcttatccac cactgcccct tcgcagccgc agtttaccat tcctgcttcc 120

gcagatgtcg gtgcgcagct gattgccaac atcgatgatc ctcaggctgc cgacgcgcag 180

tcggtttgtc cgggctacaa ggcttcaaaa gtgcagcaca attcacgtgg attcactgcc 240

agtcttcagc tcgcgggcag gccatgtaac gtatacggca cagatgttga gtccttgaca 300

ctgtctgtgg agtaccagga ttcggatcga ctgaatattc agattctccc cactcatgtt 360

gactccacaa acgcttcttg gtactttctt tcggaaaacc tggtccccag acccaaggct 420

tccctcaatg catctgtatc ccagagcgac ctttttgtgt catggtcaaa tgagccgtcg 480

ttcaatttca aggtgatccg aaaggctaca ggcgacgcgc ttttcagtac agaaggcact 540

gtgctcgtat atgagaatca gttcatcgaa tttgtgaccg cgctccctga agaatataac 600

ttgtatggcc ttggggagca tatcacgcaa ttccgcctcc agagaaatgc taatctgacc 660

atatatcctt cggatgatgg aacacctatt gaccagtgag tactgatatc ccgcccgtat 720

cttctggttc tactcttgaa acttactcgt cctagaaacc tctacggcca acatcccttc 780

tatctggata caagatatta caaaggagat aggcagaatg ggtcttatat tcccgtcaaa 840

agcagcgagg ctgatgcctc gcaagattat atctccctct ctcatggcgt gtttctgagg 900

aactctcatg gacttgagat actcctccgg tctcaaaaat tgatctggcg gaccctaggt 960

ggaggaatcg atctcacctt ctactcaggc cccgccccgg ccgatgttac caggcaatat 1020

cttaccagca ctgtgggatt accggccatg cagcaataca acactcttgg attccaccaa 1080

tgtcgttggg gctacaacaa ctggtcggat ctggcggacg ttgttgcgaa ctttgagaag 1140

tttgagatcc cgttggaata tatctggtgc gtattgtact ggtttatggt atctcaaaac 1200

agtctaacag gcacttagga ccgatattga ctacatgcac ggatatcgca actttgacaa 1260

cgatcaacat cgcttttcct acagtgaggg cgatgaattt ctcagcaagc tacatgagag 1320

tggacgctac tatgtaccca ttgttgatgc ggcgctctac attcctaatc ccgaaaatgc 1380

ctctgatgcg taagtgtcta gtgacaaatt atattactgc ctgtatgcta attagcgata 1440

cagatacgct acgtatgaca gaggagctgc ggacgacgtc ttcctcaaga atcccgatgg 1500

tagcctctat attggagccg tttggccagg atatacagtc ttccccgatt ggcatcatcc 1560

caaggcagtt gacttctggg ctaacgagct tgttatctgg tcgaagaaag tggcgttcga 1620

tggtgtgtgg tacgacatgt ctgaagtttc atccttctgt gtcgggagct gtggcacagg 1680

taacctgact ctgaacccgg cacacccatc gtttcttctc cccggtgagc ctggtgatat 1740

catatatgat tacccagagg ctttcaatat caccaacgct acagaggcgg cgtcagcttc 1800

ggcgggagct tccagtcagg ctgcagcaac cgcgaccacc acgtcgactt cggtatcata 1860

tctgcggaca acgcccacgc ctggtgtccg caatgttgag cacccaccct atgtgatcaa 1920

ccatgaccaa gaaggccatg atctcagtgt ccatgcggtg tcgccgaatg caacgcatgt 1980

tgatggtgtt gaggagtatg atgtgcacgg tctctacgga catcaaggat tgaacgctac 2040

ctaccaaggt ctgcttgagg tctggtctca taagcggcgg ccatttatta ttggccgctc 2100

aaccttcgct ggctctggca aatgggcagg ccactggggc ggcgacaact attccaaatg 2160

gtggtccatg tactactcca tctcgcaagc cctctccttc tcacttttcg gcattccgat 2220

gtttggtgcg gacacctgtg ggtttaacgg aaactccgat gaggagctct gcaaccgatg 2280

gatgcaactg tccgcattct tcccattcta ccgaaaccac aatgagctct ccacaatccc 2340

acaggagcct tatcggtggg cttctgttat tgaagcaacc aagtccgcca tgagaattcg 2400

gtacgccatc ctaccttact tttatacgtt gtttgacctg gcccacacca cgggctccac 2460

tgtaatgcgc gcactttcct gggaattccc taatgaccca acattggctg cggttgagac 2520

tcaattcatg gttgggccgg ccatcatggt ggtcccggta ttggagcctc tggtcaatac 2580

ggtcaagggc gtattcccag gagttggaca tggcgaagtg tggtacgatt ggtacaccca 2640

ggctgcagtt gatgcgaagc ccggggtcaa cacgaccatt tcggcaccat tgggccacat 2700

cccagtttat gtacgaggtg gaaacatctt gccgatgcaa gagccggcat tgaccactcg 2760

tgaagcccgg caaaccccgt gggctttgct agctgcacta ggaagcaatg gaaccgcgtc 2820

ggggcagctc tatctcgatg atggagagag catctacccc aatgccaccc tccatgtgga 2880

cttcacggca tcgcggtcaa gcctgcgctc gtcggctcaa ggaagatgga aagagaggaa 2940

cccgcttgct aatgtgacgg tgctcggagt gaacaaggag ccctctgcgg tgaccctgaa 3000

tggacaggcc gtatttcccg ggtctgtcac gtacaattct acgtcccagg ttctctttgt 3060

tggggggctg caaaacttga cgaagggcgg cgcatgggcg gaaaactggg tattggaatg 3120

gtag 3124

Claims (13)

1.一种生产发酵酒精的方法，所述方法包括酒精生产原料在适于酒精发酵的条件下生产发酵酒精，其特征在于，在生产过程中添加具有α-葡萄糖苷酶活性的多肽，所述多肽选自下组中的一种或多种：

(a)具有与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列至少95％同一性的多肽；

(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ IDNO:3的多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体。

2.根据权利要求1的方法，所述α-葡萄糖苷酶活性多肽具有与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。

3.根据权利要求1的方法，所述α-葡萄糖苷酶活性多肽是由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在非常严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:3的多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体。

4.根据权利要求1的方法，所述添加具有α-葡萄糖苷酶活性多肽的生产过程选自：糖化步骤；发酵步骤；同时的糖化和发酵步骤；任选地，预糖化步骤；优选地，发酵步骤或同时的糖化和发酵步骤。

5.根据权利要求1的方法，所述生产发酵酒精的方法中，所述生产发酵步骤包括：

(a)加入淀粉酶使酒精发酵原料液化；

任选在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；

(b)使所液化原料糖化；

(c)加入酵母进行发酵；

(d)发酵结束后收获发酵液；

其中，所述α-葡萄糖苷酶活可在下述步骤中存在和/或添加：

糖化步骤(b)；

发酵步骤(c)；

同时的糖化和发酵步骤；

任选在步骤(b)之前的预糖化步骤。

6.根据权利要求5的方法，所述α-葡萄糖苷酶的加入量为0.1-10U/g DS，优选为0.5-5U/g DS，更优选为0.8-1.5U/g DS。

7.根据权利要求5的方法，所述步骤(a)中加入的淀粉酶为高温淀粉酶；所述步骤(b)中加入糖化酶；所述步骤(c)中加入氮素。

8.根据权利要求7的方法，所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶，添加量为1～200U/gDS；所述步骤(b)中糖化酶加入量为20-600U/g DS；所述步骤(c)中酵母为加入量为0.01％-0.3％；所述氮源为尿素，加入量为0-1000ppm。

9.根据权利要求7的方法，所述步骤(a)加入10～100U/g DS高温淀粉酶对酒精发酵原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同步进行，将原料液化液调节pH酸性，添加50-500U/g DS糖化酶、0.05％-0.2％活性酵母、600ppm尿素以及0.8-1.5U/g DSα-葡萄糖苷酶，在28℃-36℃条件下发酵48-96h。

10.根据权利要求9的方法，所述步骤(b)和(c)同步进行，原料液化液调节pH酸性，添加50-500U/g DS糖化酶、0.1％活性干酵母、600ppm尿素以及1U/g DSα-葡萄糖苷酶，在28℃-36℃条件下发酵48-96h。

11.一种生产发酵酒精的方法，所述发酵步骤包括：

(a)加入淀粉酶使酒精发酵原料液化；

任选在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；

(b)使所液化原料糖化；

(c)加入酵母进行发酵；

(d)发酵结束后收获发酵液；

其中，所述方法包括在下述步骤中存在和/或添加α-葡萄糖苷酶：

糖化步骤(b)；

发酵步骤(c)；

同时的糖化和发酵；

任选在步骤(b)之前的预糖化步骤；

其中，所述α-葡萄糖苷酶具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

12.根据权利要求11所述的方法，所述步骤(a)中淀粉酶为高温淀粉酶；所述步骤(b)中加入糖化酶；所述步骤(c)中加入氮素。

13.根据权利要求12所述的方法，所述步骤(a)加入10～100U/g DS高温淀粉酶对酒精发酵原料进行液化；所述步骤(b)和(c)同步进行，将原料液化液调节pH酸性，添加50-500U/g DS糖化酶、0.1％活性酵母、600ppm尿素以及1U/g DSα-葡萄糖苷酶，在28℃-36℃条件下发酵48-96h。

Images